CN102977160A - 一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用；先将β-D-吡喃半乳糖所有羟基用包括但不限于甲酸和乙酸的短链羧酸生成酯，再与HBr的甲酸或乙酸溶液反应得α-溴代半乳糖多羧酸酯，进一步在碱性条件下与4-硝基-1-萘酚或其衍生物在丙酮中反应得糖苷酯，在甲醇或乙醇中脱酰化得4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷即为显色底物；此类显色底物经β-半乳糖苷酶作用释放4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色产物，适于在较宽pH范围内测定显色产物吸收跟踪反应过程确定β-D-半乳糖苷酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及β-半乳糖苷酶新型显色底物合成方法及在测定β-半乳糖苷酶活性中的应用，包括但不限于检测β-D-半乳糖苷酶活性和基于检测β-半乳糖苷酶活性的免疫分析；此类新型显色底物用于中性或偏酸性连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程，在测定显色产物吸收灵敏度方面明显优于用4-硝基苯酚类显色团制备的显色底物。
背景技术
光度法测定β-半乳糖苷酶活性主要有终点法和连续跟踪过程法；在自动化分析领域，连续跟踪酶反应过程测定酶活性有明显优势；适合连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程的显色底物包含对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷[Biochemical Zeitschrift，1960，333：209]、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷[J Organ Chem，1962，27：1074]、氯酚红基-β-D-半乳糖苷等。这些显色底物在pH＜7时对应显色产物消光系数都很低，都不适合在pH＜7的缓冲液中连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程；而4-硝基-1-萘酚在pH5.5以上消光系数都很高(图1)，显著高于4-硝基苯酚(pNP)和邻硝基苯酚(oNP)，用于合成这类显色底物在测定显色产物灵敏度上更有优势。
发明内容
本发明用4-硝基-1-萘酚类显色团制备β-半乳糖苷酶的新型显色底物；这些显色底物被酶水解释放的显色产物吸收峰在460nm附近，且在pH5.5到pH7.0之间的摩尔消光系数比4-硝基苯酚高1倍以上，在偏酸性的条件下连续跟踪β-半乳糖苷酶的反应过程具有明确优势，便于高灵敏度自动化分析；在pH＞7.0以上缓冲液中，此类新型显色底物所得显色产物的摩尔消光系数也显著高于4-硝基苯酚。
4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷也有合成方法报道，如文献[Tetrehedron Letter，2007，48(6)：993-996]、[Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(4)：1405-1410]、[CarbonhydrateResearch，2009，344(4)：511-515]、[Carbonhydrate Research，2009，344(16)：2245-2249]所述；主要有三种方法合成β-D-半乳糖苷：
方法1：β-D-吡喃半乳糖在碱催化或酸催化下与短链酰化剂在有或无溶剂条件下反应制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；中间体1与HBr乙酸溶液反应生成α-溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯为中间体2；中间体2与酚类显色团在碳酸钾的丙酮溶混悬液中反应生成酚类对应的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3；此中间体3在碱催化下甲醇溶液中脱乙酰基得目标显色底物β-D-吡喃半乳糖苷；所用酰化剂主要是乙酰氯或乙酸酐、甲酰氯或甲酸酐。
方法2：上述中间体2与4-硝基-1-萘酚或其衍生物在相转移催化剂如四丁基溴化胺(TBAB)和无机碱包括但不限于氢氧化钠作用下反应制得新型β-D-半乳糖苷类显色底物。
方法3：中间体1在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化锡催化下，在苯中与4-硝基-1-萘酚直接反应得到β-半乳糖苷酶的新型β-D-半乳糖苷类显色底物。
4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团的β-半乳糖苷酶显色底物至今未见报道；理论上可用类似于4-硝基苯酚反应制备，故有上述方法1、方法2和方法3应都适用。
本发明所述β-半乳糖苷酶的新型显色底物合成方法及应用包括如下内容：
a本发明所涉及4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团的β-半乳糖苷酶显色底物为β-D-吡喃半乳糖苷，具有如下的结构通式：
R＝-COOH，-GOCH3，-NO2，-CI
其中，R基团为-H，-COOH，-COCH3，-NO2，-Cl或-Br，处于5，6，8中任一或多个位置；这些衍生物包括4-硝基-1-萘酚的单取代或多取代衍生物。
b制备β-半乳糖苷酶的上述新型显色底物，包括如下合成步骤(图2)：
b1β-D-吡喃半乳糖在碱或酸催化下与来自短链羧酸包括但不限于甲酸和乙酸的酰化剂在有或无溶剂条件下反应制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；此步骤中所用碱类催化剂包括但不限于碳酸和醋酸的无水钠盐和钾盐、吡啶和三乙胺；所用酸催化剂包括但不限于磷酸、硫酸、对甲苯磺酸；所用酰化剂包括但不限于甲酸酐或甲酰氯、乙酸酐或乙酰氯、丙酸酐或丙酰氯；所用溶剂包括但不限于丙酮或四氢呋喃或二者的混合物；
b2以甲酸或乙酸为溶剂吸收气体HBr制成对应溶液，再加入中间体1反应生成α-溴代-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体2；
b3在氢氧化钠或氢氧化钾或碳酸钾或碳酸钠或碳酸氢钾或碳酸氢钠为碱的丙酮或二甲基甲酰胺或水及其混合溶剂中，上述中间体2与4-硝基-1-萘酚或其衍生物以混悬液或溶液状态反应生成4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3；相转移催化剂适用于此步反应制备所述中间体3，这类相转移催化剂包括但不限于四丁基溴化铵；
b4在碱催化下，中间体3在甲醇或乙醇中脱酰基得目标化合物4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷为所述显色底物；
b5制备所述β-半乳糖苷酶显色底物所用4-硝基-1-萘酚及其衍生物包括但不限于4-硝基-1-萘酚、4，5-二硝基-1-萘酚、4，8-二硝基-1-萘酚、6-羧基4-硝基-1-萘酚、6-溴4-硝基-1-萘酚、6-乙酰基4-硝基-1-萘酚、6-氯-4-硝基-1-萘酚；
b6这类显色底物制备方法还包括用β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体，在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化锡催化下，用苯为溶剂与4-硝基-1-萘酚或其衍生物直接反应得到所述的β-D-吡喃半乳糖苷类显色底物。
c应用这类4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团的新型显色底物测定β-半乳糖苷酶活性，需要如下步骤或环节：
c1选择所用缓冲液，包括但不限于磷酸盐或马来酸盐缓冲液，所用缓冲液pH范围为在5.5以上；扫描这些显色底物在β-半乳糖苷酶作用下反应体系吸收光谱变化，确定显色产物吸收增加最快的波长为测量显色产物吸收的最适测量波长；
c2在上述最适测量波长附近30nm以内的某个波长下测定显色产物吸收随酶反应进程的变化连续跟踪酶反应进程，或者反应指定时间后加入碳酸钠或碳酸钾或碳酸氢钠或碳酸氢钾或氢氧化钾或氢氧化钠溶液终止反应后测定所释放的显色产物吸收；
c3据显色产物在测定条件下的消光系数计算其浓度并换算得到β-半乳糖苷酶活性；
d用β-半乳糖苷酶的上述新型显色底物测定β-半乳糖苷酶的活性，应用领域包括但不限于筛选其突变体、测定体液或生物样品中酶活性、测定作为免疫分析标记酶的活性或测定作为其它酶法分析所用β-半乳糖苷酶的活性。
A.本发明所述新型显色底物制备方法实施例1
1.β-D-半乳糖五乙酸酯即中间体1的合成：5.0g D-半乳糖、2.4g无水乙酸钠放入100mL单口烧瓶。室温下加入24mL乙酸酐，回流2.5h，反应液倒入提前冷却的200mL蒸馏水中，冰浴下搅拌2h，倒出上清液，加100mL水搅拌1h，弃去上清液，剩余固体减压抽滤，并用少量水洗，用乙醇重结晶，得白色固体，熔点145℃。
2.α-溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯即中间体2的合成：β-D-半乳糖五乙酸酯2g溶于7mL乙酸，冰浴条件下，缓慢滴加2mL 33％HBr的乙酸溶液，反应2h，加CH2Cl2稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗至中性，再用水洗2次，有机层经无水硫酸钠干燥除溶剂，残留物用乙醚-石油醚重结晶，得白色固体(不稳定)，熔点80℃。
3.4-硝基-1-萘-β-D-半乳糖四乙酸酯即中间体3的合成：在50mL单口烧瓶中加入溴代半乳糖四乙酸酯0.23g，4-硝基-1-萘酚0.11g，无水碳酸钾0.078g，丙酮5mL，搅拌回流5h，TLC监控反应完后冷却，减压蒸馏，残渣用二氯甲烷溶解，少量NaOH水溶液洗涤，有机层无水硫酸钠干燥后蒸干，得产物。
5.4-硝基-1-萘-β-D-半乳糖苷的合成：β-(4-硝基-1-萘基)-D-半乳糖四乙酸酯0.56g溶于3mL甲醇，加入200μL的1mol/L的甲醇钠溶液，室温搅拌30min，TLC监控反应完后，冰箱中放置过夜，大量固体析出，抽滤所得滤饼用3∶1的甲醇-水重结晶得产物。烘干后约0.15g，mp 225～228℃。
6.4-硝基-1-萘-β-D-半乳糖苷(4NNPG)结构：13C-NMR(图3)、1H-NMR(图4)和高分辨质谱(图5)数据表明，所得显色底物的结构符合预计；以下的应用实施例表明，用高纯度的β-半乳糖苷酶作用于所得显色产物，可将其全部水解到无显色底物残留。
B.本发明所述新型显色底物制备方法实施例2
1.β-D-半乳糖五乙酸酯即中间体1的合成：5.0g D-半乳糖、2.4g无水乙酸钠放入100mL单口烧瓶。室温下加入24mL乙酸酐，回流2.5h，反应液倒入提前冷却的200mL蒸馏水中，冰浴下搅拌2h，倒出上清液，加100mL水搅拌1h，弃去上清液，剩余固体减压抽滤，并用少量水洗，用乙醇重结晶，得白色固体，熔点145℃。
2.α-溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯即中间体2的合成：β-D-半乳糖五乙酸酯5g溶于CH2Cl2，冰浴条件下，缓慢滴加20mL 9％HBr的乙酸溶液，反应24h，加CH2Cl2稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗至中性，再用水洗2次，有机层经无水硫酸钠干燥除溶剂，残留物用乙醚-石油醚重结晶，得白色固体(不稳定)，熔点80℃。
3.4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯即中间体3的合成：在50mL单口烧瓶中加入溴代半乳糖四乙酸酯0.23g，4-硝基-1-萘酚0.11g，无水碳酸钾0.078g，丙酮5mL，搅拌回流5h，TLC监控反应完后冷却，减压抽滤除去滤饼，滤液减压蒸干得固体少量水冲洗后烘干，直接用于下一步反应。
4.4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成：β-(4-硝基-1-萘基)-D-半乳糖四乙酸酯0.56g溶于3mL甲醇，加入200μL 1mol/L的甲醇钠溶液，室温搅拌30min，大量固体析出，抽滤所得滤饼用大量四氢呋喃冲洗。烘干后约为0.15g，mp 225～228℃。
5.4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷：所得产物用HPLC检验与A应用实施例1所得一致。
C.本发明所述新型显色底物制备方法实施例3
1.β-D-半乳糖五乙酸酯中间体1的合成：5.0g D-半乳糖、2.4g无水乙酸钠放入100mL单口烧瓶。室温下加入24mL乙酸酐，回流2.5h，反应液倒入提前冷却的200mL蒸馏水中，冰浴下搅拌2h，倒出上清液，加100mL水搅拌1h，弃去上清液，剩余固体减压抽滤，并用少量水洗，用乙醇重结晶，得白色固体，熔点145℃。
2.4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯即中间体3的合成：在250mL单口烧瓶中加入苯25mL，三丁基氧化锡4.9mL，再加入4-硝基-1-萘酚3.6g，搅拌溶解回流1h。冷却至室温，溶液呈现红棕色，减压蒸出苯。残渣溶于100mL二氯甲烷，然后向烧瓶中加入β-D-半乳糖五乙酸酯5g，三氟化硼乙醚2.4mL，室温下搅拌5.5h后，4℃冰箱过夜，再室温搅拌6h，用1mol/L氢氧化钠洗一次，水洗2次。无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去二氯甲烷，残渣溶于乙腈中，用正己烷洗2次。减压蒸馏去除乙腈，残渣溶于无水乙醇，减压蒸馏除去乙醇得固体。
3.4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成：β-(4-硝基-1-萘基)-D-半乳糖四乙酸酯0.56g溶于3mL甲醇，加入200μL 1mol/L的甲醇钠溶液，室温搅拌30min，TLC监控反应完后，冰箱中过夜，大量固体析出，抽滤所得滤饼用3∶1的甲醇-水重结晶得产物。
4.所得产物用HPLC检测与应用实施例1中所得一致。
D.本发明所述新型显色底物应用实施例1：4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷水解过程吸收光谱
1.在一对1cm光径的石英比色皿中分别加入1.0ml磷酸盐缓冲液(0.10M pH7.4)，放入各自光路中，在250-800nm之间扫描基线再进行调零；测定温度25℃；
2.取出外侧光路中的比色皿，加入4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷(4NNPG)储备液至比色皿中底物终浓度为0.2mmol/L，按上述方法扫描确定底物吸收光谱；
3.再向该比色皿中加入5ulβ-半乳糖苷酶溶液(Sigma G4155)，比色杯加盖后倒置混匀启动酶反应后，以一定时间间隔扫描吸收，得硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷水解过程的吸收光谱(图6)，可见在458nh吸收增加最快而在399nm吸收基本不变，即399nm为显色产物和显色底物得等吸收波长。
E.本发明所述新型显色底物应用实施例2：β-半乳糖苷酶的动力学参数测定
1.β-半乳糖苷酶对4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷(4NNPG)的米氏常数(Km)测定双倒数法；
2.β-半乳糖苷酶(Sigma G4155)用量为原液经PBS(0.1M pH7.4)稀释100倍后取10ul，底物终浓度S分别为80，96，120，160，240μmol/L时，测定温度25℃，0.1M pH8.0PBS中连续检测反应(图7)，从反应曲线得反应的初速度Vi；
3.以1/Vi对1/S作图，回归直线与X轴交点负倒数即为Km(约0.064mM，图8)。
F.本发明所述新型显色底物应用实施例3：β-半乳糖苷酶为标记酶的酶联免疫吸附分析
1.配制缓冲液：按《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》(科学出版社，2000；第19页)所述配方配制100mmol/L且pH为7.4磷酸钠缓冲液；摄氏25度水浴恒温备用；每分钟生成1微摩尔显色产物β-半乳糖苷酶酶量为1活性单位。
2.配制底物溶液：底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷(4NNPG)用二甲亚砜配制成20mmol/L的储备液，用磷酸钠缓冲液稀释到0.20mmol/L为底物溶液。
3.青霉素G标记β-D-半乳糖苷酶：
(1)青霉素G活化：0.73g青霉素G(钠盐)溶于2.0ml N，N’-二甲基甲酰胺，加入0.40g 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺(缩写为EDC)盐酸盐，及0.30g 1-羟基苯并三唑(HOPT)反应30min直到反应液成深黄色；取4ul上述深黄色的N，N’-二甲基甲酰胺溶液用54ul稀释到58ul为活化青霉素G溶液；
(2)取上述稀释活化青霉素G溶液50ul，与用0.10mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)共0.50ml融解并稀释的β-D-半乳糖苷酶0.44mg混匀；摄氏4度反应120min；过Sephadex G25柱(高15cm内径10mm容积约10ml，pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液平衡)，用280nm吸收监测，收集相同磷酸盐缓冲液的第一个洗脱峰为青霉素G修饰的β-D-半乳糖苷酶，所得青霉素G修饰β-D-半乳糖苷酶溶液共2.0ml含有0.22mg蛋白质；
(3)标记后比活性：在pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液中，用终浓度为0.2mmol/L的4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷(4NNPG)时酶比活性约100U/mg，活性保留近70％；
(4)用量：应用时优化单抗用量后，逐步提高青霉素标记β-D-半乳糖苷酶溶液用量，直到结合的半抗原标记β-D-半乳糖苷酶活性达到饱和；在96孔板体系，用20ul稀释500倍的单抗时加入青霉素标记β-D-半乳糖苷酶溶液20ul，即可达到饱和。
4.在Pierce预包被羊抗小鼠IgG的多克隆抗体孔板上如下操作：(1)每孔加入100ul单抗与捕获多抗在25度孵育60min并维持低速震荡；(2)用含0.05％吐温-20的pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲液每孔每次加入0.20ml，每次洗涤3min后去洗涤液，共重复三次；(3)将纯牛奶在4度8000rpm离心30min去上层脂肪获得脱脂牛奶，用pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液稀释1倍，加入不同量的青霉素为样品；(4)用步骤(2)所用洗涤液洗涤3次；
5.在96孔板中每孔加入底物200ul；中速震荡10min，在Biotek ELX 800酶标仪上用仪器配套软件控制测量450nh吸收变化，每隔5min读数跟踪反应过程，共记录30min；
6.响应曲线制作：将450nm吸收变化表观初速度V1扣除自发反应本底；以无外加标准品混合物时的酶活性为100％，计算加入青霉素标准品后的酶活性剩余率为青霉素标记酶结合率；此结合率在10％到85％之间对反应体系青霉素标准品浓度对数为线性响应(图9)；
7.用终浓度为6.0mM的4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNPG)为底物测定β-半乳糖苷酶活性，青霉素标记β-半乳糖苷酶用量为60ul，其余操作与用4NNPG时全同；大肠杆菌β-半乳糖苷酶水解0.20mM 4NNPG的比活性约为水解6.0mM的pNPG的3倍；
8.数据处理和结果报告：β-半乳糖苷酶标记、以4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷及4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷为显色底物的ELISA测定青霉素的定量限比较见表1、回收率比较见表2。
说明书附图
图1pH对4-硝基-1-萘酚(4NNP)、对硝基苯酚(pNP)、邻硝基苯酚(ONP)消光系数的影响
图2本发明所述β-半乳糖苷酶新型显色底物合成路线图
图3所得4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的13C-NMR图谱
图4所得4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的1H-NMR图谱
图5所得4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的高分辨质谱分析
图6β-D-半乳糖苷酶水解4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的吸收光谱变化过程
图7β-D-半乳糖苷酶水解4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷在450nm吸收变化曲线
图8β-D-半乳糖苷酶水解4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的米氏常数
图9用4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷及4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷为显色底物测定β-D-半乳糖苷酶进行竞争性ELISA测定青霉素的响应曲线比较
表1用4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷及4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷为显色底物测定β-D-半乳糖苷酶进行竞争性ELISA测定青霉素的定量限(n＝5)
表2用4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷及4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷为显色底物测定β-D-半乳糖苷酶进行竞争性ELISA测定青霉素的回收率(n＝5)
Claims (7)
1.一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用；具体涉及将β-D-吡喃半乳糖羟基全部酰化成酯并进一步转变成α-溴代半乳糖酯，再用4-硝基-1-萘酚或其衍生物类显色团取代溴得到β-D-吡喃半乳糖苷酯，将这类糖苷酯脱去酰基得β-D-吡喃半乳糖苷作为β-半乳糖苷酶的显色底物；这类显色底物在β-半乳糖苷酶作用释放4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色产物，用于通过测定显色产物吸收确定β-半乳糖苷酶活性。
2.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，所述β-D-吡喃半乳糖苷类显色底物结构如下：
R＝-GOOH，-COGH3，-NO2，-Cl
当R不为H时则为但不限于为-COOH，-COCH3，-NO2，-Cl或-Br；这些取代基位于萘环的5，6，8中任一或多个位置，即有多个取代基的4-硝基-1-萘酚衍生物也适合作为显色团用于制备此类显色底物；这些适合的显色团包括但不限于4，5-二硝基-1-萘酚、4，8-二硝基-1-萘酚、6-羧基4-硝基-1-萘酚、6-溴4-硝基-1-萘酚、6-乙酰基4-硝基-1-萘酚、6-氯-4-硝基-1-萘酚。
3.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，β-半乳糖苷酶的这类显色底物合成过程涉及如下步骤：
(一)β-D-吡喃半乳糖在碱或酸催化下，用包括但不限于甲酸或乙酸短链羧酸对应的酰化剂在有或无溶剂条件下反应得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；所用碱催化剂包括但不限于碳酸和醋酸的无水钠盐和钾盐、吡啶和三乙胺；所用酸催化剂包括但不限于磷酸、硫酸、对甲苯磺酸；所用酰化剂包括但不限于甲酸酐、甲酰氯、乙酸酐及乙酰氯；所用溶剂包括但不限于丙酮或四氢呋喃或二者混合物；
(二)以甲酸或乙酸为溶剂吸收气体HBr制成对应溶液，再加入中间体1反应生成α-溴代-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体2；
(三)在无机碱和丙酮或二甲基甲酰胺或水及其混合物中，上述中间体2与4-硝基-1-萘酚或其衍生物以混悬液状态反应生成4-硝基-1-萘-β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3；所用无机碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸钠碳；相转移催化剂也适用于此步反应制备所述中间体3，这类相转移催化剂包括但不限于四丁基溴化铵、四苄基溴化铵；
(四)中间体3在碱催化下，在甲醇或乙醇或水中脱酰基得4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷，即为β-半乳糖苷酶的新型显色底物；所用碱催化剂包括但不限于甲醇钠、甲醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾。
4.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，这类显色底物制备方法还包括用权利要求3步骤(一)制备的中间体1，在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化锡或三甲基硅基三氟甲磺酸银催化下，用苯为溶剂与4-硝基-1-萘酚或其衍生物反应得所述β-D-吡喃半乳糖苷类显色底物。
5.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，其作为显色底物用于测定β-半乳糖苷酶作用释放的4-硝基-1-萘酚或其衍生物即显色产物吸收确定β-半乳糖苷酶活性，其应用特征如下：
(一)适用的缓冲液包括单不限于磷酸盐和马来酸盐缓冲液；
(二)扫描在β-半乳糖苷酶作用下反应体系吸收光谱随反应时间变化，显色产物吸收增加最快的波长为最适测量波长；用4-硝基-1-萘-β-D-吡喃半乳糖苷最适测量波长在450-465nm间；
(三)选择最适测量波长附近30nm以内某个波长测量显色产物吸收；
(四)有两种操作方式，第一种通过测定显色产物吸收连续跟踪反应过程，另一种加入碱溶液改变pH而终止反应再测定显色产物吸收，所用碱包括但不限于碳酸钠和氢氧化钾溶液；
(五)据显色产物在测定条件下消光系数计算其浓度换算得β-半乳糖苷酶活性；
(六)连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程时，所用缓冲液pH需满足β-半乳糖苷酶催化作用要求，还需在5.5以上以保障测定显色产物吸收的灵敏度；用碱终止反应再测定显色产物吸收时，只要求所用反应缓冲液的pH满足β-半乳糖苷酶催化作用的要求。
6.据权利要求1和5，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，以4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷为显色底物且反应不低于pH7.0时，显色底物和显色产物在400nm附近有消光系数相等的波长即等吸收波长。
7.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，以此类4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷为显色底物测定β-半乳糖苷酶活性，应用领域包括但不限筛选β-半乳糖苷酶的突变体和以β-半乳糖苷酶为标记酶的酶联免疫吸附测定。
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