CN105503879A - 一种固定化蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于固定蛋白的方法。本发明还涉及一种用于固定蛋白的化合物。所述化合物具有氟磺酰基，能够特异性地且共价地在酪氨酸残基处来标记蛋白。

Description

一种固定化蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种用于固定蛋白的化合物以及一种用于固定蛋白的方法。
背景技术
将蛋白固定到如微阵列、芯片和珠等固体载体上是一种用于阐明蛋白-蛋白或蛋白-配体相互作用以及用于以高处理量的方式探测新蛋白功能的强大方法。不同于DNA微阵列的情况，由于在实现将蛋白选择性地且均匀取向地分布到固体表面中的固有困难，实施用于蛋白固定的通用方法存在着挑战。
常规固定方法主要依赖三种机理：物理连接、共价键合和生物亲和性固定。然而非选择性的物理连接或共价键合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白变性。通过重组融合标签和所偶联蛋白的共表达进行固定可以相应保证蛋白的确切取向并且提供了微调生物结合物拓扑结构的灵活性。例如，将sjGST标签固定到GSH-结合的聚合物珠或将His-标签固定到Ni-NTA芯片或将生物素-标签结合到链霉亲和素涂布的固体载体上已经被广泛地选作非共价蛋白固定方法用于保持所标签蛋白的活性。
因此开发一种有效且稳定的固定蛋白的策略，能够最大限度地保持活性，是有着显著意义和应用价值。位置选择性共价固定蛋白最近引起很多关注，因为它能够稳定地、均匀地且高密度地固定各种蛋白。其方法是将所关注的蛋白与标签蛋白共表达，再利用后者与其被固定的底物分子共价地且选择性地反应。比如，Kindermann等报道了一种通过不可逆地将O6-苄基鸟嘌呤衍生物的烷基连接到hAGT半胱氨酸残基之一来固定hAGT-标签的共价方法。
GST-标签蛋白具有高底物亲合性，然而，已知的GST标签固定方法仍然基于可逆的GSH-GST结合，限制了它们的应用。
Viswanathan等报道了通过铜(I)-催化的Huisgen[3+2]环加成反应(“click”反应)将在C-末端半胱氨酸残基上，用炔改性的GST蛋白共价固定到玻璃表面上的策略。尽管实现了共价和定向结合，但是铜催化剂可引起某些不稳定的蛋白的变性或沉淀，因此有可能在固定后降低了蛋白活性。另外，相比于传统的GSH-GST方法，将炔基团引入GST蛋白是耗时的且高成本的。
发明内容
本发明的目的在于提供一类小分子物质，其能够通过位置选择性共价键合的方式共价固定蛋白，特别是sjGST-标签化的蛋白。
本发明的目的还在于提供一类能够以相对简单的方法合成的具有氟磺酰基的小分子，当用它们处理sjGST-标签化的蛋白时能够共价地、选择性地、不可逆地标记sjGST。
具体来说，本发明提供了下述技术方案：
技术方案1.式I的化合物：
其中，
R1是苯基的任选取代基；
R2是Ar的任选取代基；
m是0、1、2、3、4；
n是0、1、2、3、4；
连接基团是任选被取代的，并且是由下述A组中的0-15个和下述B组中的一个组成的三价基团，
A组：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1-10亚烷基─、─C3-10亚环烷基─、与─(3-10)元亚杂环烷基─，
B组：─N═、─C1-10次烷基═、─C3-10次环烷基═、与─(3-10)元次杂环烷基═；
Ar是苯、萘、单环杂芳基、双环杂芳基；
R选自：
可与固体表面反应的基团，包括但不限于氨基(NH2)，羟基(OH)，巯基(SH)，羧基(COOH)；
荧光团(fluorophore)；
生物素部分；
-C0-10亚烷基-C≡CH；和
氢。
技术方案2：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述式I是下述式II：
技术方案3：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述连接基团选自：
技术方案4：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述-Ar-(R2)n是
技术方案5：选自下列的化合物：
技术方案6.一种固定蛋白的方法，包括下述步骤：
步骤1：通过共价或非共价相互作用，将权利要求1-N中任一项的化合物接枝到固体表面；和
步骤2：通过在酪氨酸残基的共价键，将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上；
或者
步骤1：通过在酪氨酸残基的共价键，使权利要求1-N中任一项的化合物与蛋白反应；和
步骤2：通过共价或非共价相互作用，将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。
技术方案7：根据技术方案6的方法，其中所述固体表面包括金属、聚合物或纳米材料的表面。
技术方案8：根据技术方案6或7的方法，其中所述共价或非共价相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。
技术方案9：根据技术方案6、7或8的方法，其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-111残基。
附图说明
图1：通过融合的GST标签蛋白的位置选择性共价固定，其中sjGST，PDBID：1M9A。
图2：(A)G1-H和G1-炔的化学结构；(B)重组sjGST蛋白的G1-炔标记(每个条带0.5μg)：荧光扫描(FL，上部)；考马斯蓝着色(CBB，下部)；(C)在(B)中的荧光带的密度测定。
图3：添加不同浓度的G1-H的竞争试验：(A)在G1-炔处理前和(B)在G1-炔处理后(sjGST，每个条带0.5μg)。
图4：MALDI-TOF-MS显示酪氨酸-111作为G1化合物的结合位点。(A)在胰蛋白酶消化后在G1-H和G1-炔处理的sjGST肽之间检测出52道尔顿的质量偏移。(B)MS/MS分析，在1093和1145处的峰。(C)Y111FsjGST突变体消灭了G1-炔所造成的标记。
图5：(A)G1-生物素的化学结构。(B)在G1-生物素预处理的、链霉亲和素-涂布的96-孔微板上的GST-eGFP固定。(C)用渐增量的G1-生物素捕获GST-eGFP的结果(更多GST-eGFP被捕获)。(D)用渐增量的G1-H预培养GST-eGFP逐渐使固定减弱。
图6：(A)G1-H固定的琼脂糖凝胶珠的结构。(B)和(C)可溶性(青色，位置靠上)和固定的(绿色，位置靠下)激酶ITK和EGFR的基于HTRF的酶活性实验结果。
具体实施方案
缩略语：
ACN乙腈
ATP三磷酸腺苷
Beads珠/高分子球
Biotin生物素
Boc叔丁基氧羰基
DCM二氯甲烷
DEAD偶氮二甲酸二乙酯
DMF二甲基甲酰胺
DMSO二甲基亚砜
EDTA乙二胺四乙酸
eGFP增强绿色荧光蛋白
EGFR表皮生长因子受体
G1-AlkyneG1-炔
G1-biotinG1-生物素
GFP绿色荧光蛋白
GSH谷胱甘肽
GST谷胱甘肤S-转移酶
1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓
HATU3-氧化物六氟磷酸盐,
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]
pyridinium3-oxidhexafluorophosphate
HEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸
His(多聚)组氨酸
HTRF均匀时间分辨荧光
IAYSK
ITK可诱导的T细胞激酶
MALDI-TOF-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
MS
MeCN乙腈
NsCl邻硝基苯磺酰氯
2-Nitrobenzenesulfonylchloride
NTA次氮基三乙酸
PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS磷酸盐缓冲液
Ph苯基
PhSH硫代苯酚
SDS十二烷基硫酸钠
SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
sjGST日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶
TAMRA四甲基罗丹明
TAMRA-N3四甲基罗丹明-叠氮
Tetramethylrhodamine5-Carboxamido-(6-Azidohexanyl)
TBTA叔丁基2,2,2-三氯亚氨逐乙酸酯
TEA三乙胺
TFA三氟乙酸
THF四氢呋喃
TKT细胞激酶
TLC薄层色谱法
TMS四甲基硅烷
定义
根据本发明，R1和R2是任选的取代基，其彼此独立地选自卤素如F-、Cl-、Br-和I-，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、单环或双环杂芳基-、芳基-二价连接基团-芳基-、单环或双环杂芳基-二价连接基团-单环或双环杂芳基-、单环或双环杂芳基-二价连接基团-芳基-、芳基-二价连接基团-单环或双环杂芳基-，其中二价连接基团的例子有─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1-10亚烷基─、─C3-10亚环烷基─、─(3-10)元亚杂环烷基─等，芳基如苯基、萘基，单环杂芳基如5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基，双环杂芳基是由两个彼此独立的单环杂芳基，或一个苯基与一个单环杂芳基稠合而成。
根据本发明，连接基团是任选被取代的，取代基选自卤素如F-、Cl-、Br-和I-，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、单环或双环杂芳基-；其中芳基-如苯基、萘基；单环杂芳基如5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基；双环杂芳基是由两个彼此独立的单环杂芳基，或一个苯基与一个单环杂芳基稠合而成。
根据本发明，亚烷基和次烷基中的烷基可以是直链的或分支的。
根据本发明，亚环烷基和次环烷基中的环烷基可以是单环或双环的。
根据本发明，亚杂环烷基与次杂环烷基中的杂环可以是完全饱和的单环杂环或完全饱和的双环杂环，其环成员的数目是3-10个，其中除碳原子外，还可以含有1-4个选自O、N和S的杂原子。
根据本发明，单环杂芳基是由单环杂芳环中带有氢原子的环原子失去一个氢原子所形成的基团，其中所述单环杂芳环是含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5或6元单环杂芳环。
根据本发明，双环杂芳基是由双环杂芳环中带有氢原子的环原子失去一个氢原子所形成的基团，其中所述双环杂芳环是由苯与一个含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5或6元单环杂芳环稠合形成的，或者是由两个彼此独立的含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5或6元单环杂芳环稠合形成的。
根据本发明，荧光团(fluorophore)的实例包括但不限于衍生自二苯乙烯类、香豆素类、荧烷类(氧杂蒽)、苯并噁唑类(如咪唑，噻唑)、萘二甲酰亚胺类、噻吩二羧酸酰胺类、稠环芳烃类、苝四甲酰亚胺类的基团，其实例包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、CY5、LCRED705。有关荧光团的更多的信息可以参看http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore。
根据本发明，固体表面的例子包括但不限于多糖珠，多糖珠包括但不限于聚氨基葡糖珠，几丁质珠、琼脂糖珠、壳聚糖珠。关于多糖珠的更多信息，可以参考CN102504312A、CN103739857A、CN101715364A、CN1939582A和CN1226900A。
实施例
在以下的实施例中，全部试剂是市售可得的并且在使用时没有进一步提纯。无水DMF是用氢化钙处理过的。盐水是指氯化钠在蒸馏水中的饱和溶液。
通过TLC监控反应，所述TLC在0.25毫米Jiangyou硅胶板(HSGF254)上进行，使用紫外光作为可视化试剂。快速柱色谱是使用Puke二氧化硅(ZCX-II)进行的。
1H-NMR和13C-NMR谱是在BrukerAdvance400上记录的(1H：400MHz，13C：100MHz)其中化学位移值(单位ppm)是相对于下述内标的：TMS(δH0.00和δC0.00),残余氯仿(δH7.26和δC77.16),二甲亚砜(δH2.50和δC39.52),丙酮(δH2.05和δC29.92,206.68)，或甲醇(δH3.31和δC49.00)。19F-NMR谱是在BrukerAdvance400上记录的，以CFCl3(δF0.00)作为内标。HR-MS是使用BrukerApexIVRTMS获得的。
化合物的纯度是通过在Agilent1200HPLC上获得的HPLC色谱确定的。在10分钟内，通过AgilentPN959990-902EclipsePlusC18250mm×4.6mm柱进行分析，其中使用水-MeCN梯度，包含0.1％三氟乙酸和由30％至98％的MeCN。在254nm下检测，使用平均峰面积来确定纯度。全部原料化合物的纯度高于95％。
G1-H、G1-炔、G1-生物素的合成方案
方案1.合成G1-H
G1-H的合成路线由市售可得的化合物1开始。用N-Boc-乙醇胺进行的Mitsunobu反应得到化合物2。在脱保护后，所获得的化合物与4-(氟磺酰基)苯甲酰氯反应而得到期望的化合物G1-H。
方案2.合成G1-炔
通过化合物2的保护基交换可以获得化合物3，化合物3与3-丁炔醇的Mitsunobu反应可以获得化合物4。然后，通过在K2CO3/MeCN的催化下，通过PhSH除去2-硝基苯磺酰基得到化合物5。所获得的仲胺化合物5与4-(氟磺酰基)苯甲酰氯反应而得到化合物G1-炔。
方案3.G1-生物素的合成
为得到生物素化探针，通过化合物3和N-Boc-乙醇胺的Mitsunobu反应得到被保护的胺6。在Boc基团的脱保护后，通过酰胺偶联试剂HATU引入生物素得到化合物7。然后，除去2-硝基苯磺酰基得到化合物8，再引入氟磺酰基得到最终的化合物G1-生物素。
方案4.G1-珠的合成
为获得固定的G1，首先将前体化合物6脱保护，并且制备成在DMF和TEA中的溶液形式，浓度为100mM。将该溶液与活化的CH-琼脂糖凝胶(Sigma)珠(珠-1)反应而得到珠-2。在PhSH的MeCN溶液中除去4-硝基苯磺酰基而得到珠-3。珠-3与4-(氟磺酰基)苯甲酰氯在无水DCM和TEA中反应而得到G1-珠。
化合物2的制备
将1.2克化合物1(1当量)、0.8克N-Boc-乙醇胺(1.2当量)和1.4克三苯膦(1.4当量)溶解在40毫升THF中并且用冰浴冷却至0℃。在0℃将0.9毫升DEAD(1.4当量)添加到该溶液中。然后将混合物升温至室温并且搅拌过夜。在完成后，将反应物用水急速冷却，在真空条件下蒸发溶剂。通过快速色谱柱提纯得到1.5克的期望产物(84.1％)。
1H-NMR(400MHz,MeOD-d4)δH1.30(9H,s),3.54(2H,t),4.46(2H,t),7.06-7.18(5H,m),7.39(2H,t),8.22(1H,s).
13C-NMR(100MHz,MeOD-d4)δC158.49,158.41,156.65,156.50,155.30,154.33,144.52,129.87,129.66,127.43,123.67,119.12,118.49,97.82,78.62,46.62,39.55,27.26,27.04.
C24H27N6O3[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：447.2145；实测值：447.2134。
G1-H的制备
将223毫克化合物2溶解在5毫升DCM中，然后添加1.5毫升TFA。在搅拌两小时后，在真空条件下蒸发溶剂而得到白色固体。固体被溶解在5毫升无水DCM和180微升TEA(2.6当量)中。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃并且添加144毫克的4-(氟磺酰基)苯甲酰氯(1.3当量)。然后，将反应升温至室温并且保持搅拌。在完成后，将反应物用水急速冷却，用DCM提取，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，以及进行浓缩。通过快速色谱柱提纯得到白色固体状的180毫克的G1-H(67.7％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δH3.73(2H,dd),3.54(2H,t),4.54(2H,t),7.09-7.19(5H,m),7.17(2H,t),7.59(2H,d),8.03(2H,d),8.23(2H,d),8.99(1H,t).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δC165.20,158.58,157.55,156.66,156.15,155.09,143.76,141.90,130.58,130.42,129.43,129.01,128.36,124.28,119.48,119.28,97.82,46.19,34.82,30.85.
19F-NMR(400MHz,CDCl3)δF67.22.
C26H22N6O4FS[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：533.1407；实测值：533.1400.
化合物3的制备
将4.4克化合物2溶解在100毫升DCM中，然后添加30毫升TFA。在搅拌两小时后，在真空条件下蒸发溶剂而得到白色固体。将固体溶解在100毫升无水DCM中并且添加4.2毫升TEA(3当量)。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃并且添加2.4克的2-硝基苯磺酰氯(1.1当量)。搅拌该混合物过夜，用水急速冷却，在真空条件下浓缩。然后，将混合物溶解在乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩而得到黄色油。在通过快速色谱柱提纯后，获得3.4克的期望的产物(64.0％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δH3.52(2H,dd),4.41(2H,t),7.10-7.19(5H,m),7.42(2H,dt),7.62(2H,dd),7.70-7.76(2H,m),7.87(2H,dt),8.2(1H,s),8.30(1H,t).
13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δC158.52,157.57,156.70,156.02,154.97,147.75,143.88,137.82,134.30,133.31,133.05,130.58,130.46,129.65,128.26,125.35,124.84,124.26,119.46,119.35,79.61,46.72,42.36,30.85.
C25H22N7O5S[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：532.1403；实测值：532.1401.
化合物4的制备
将1.2克化合物3、0.2克3-丁炔醇(butynol)(1.2当量)、0.7克三苯膦(1.2当量)溶解在无水THF中。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃并且滴加0.4毫升DEAD。在完成后，将反应物用水急速冷却并且浓缩。通过快速色谱柱提纯得到850毫克的化合物4(63.4％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH1.95(1H,t),2.49(2H,dt),3.63(2H,t)3.99(2H,t),4.63(2H,t),7.06-7.18(5H,m),7.37(2H,dt),7.50-7.62(5H,m),7.93(1H,dd),8.28(1H,s).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC158.60,157.70,156.23,155.31,154.61,147.67,144.43,133.56,133.07,131.71,130.90,129.98,129.88,127.33,124.14,124.10,119.58,119.06,98.31,80.43,70.79,46.38,46.17,45.01,18.62.
C25H22N7O5S[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：584.1716；实测值：584.1713.
化合物5的制备
将850毫克化合物4溶解在14毫升MeCN中，添加638毫克K2CO3(2.4当量)。然后将385毫克(3.3当量)PhSH添加到该悬浮液。在搅拌3小时后，反应完成。在真空条件下除去MeCN，将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩而得到黄色油。在通过快速色谱柱提纯后，获得480毫克的白色粉末状化合物5(86.1％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH1.88(1H,t),2.35(2H,dt),2.82(2H,t),3.20(2H,t),4.55(2H,t),7.05-7.14(5H,m),7.36(2H,t),7.64(2H,d),8.31(1H,s).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC158.46,158.19,156.30,155.77,154.63,144.00,129.95,129.93,127.74,124.01,119.52,119.04,98.35,82.22,69.58,48.27,47.40,46.73,19.45.
C23H23N6O[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：399.1933；实测值：399.1929.
G1-炔的制备
将398毫克化合物5溶解在无水DCM中，添加45微升TEA(1.3当量)。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃并且添加72毫克的4-(氟磺酰基)苯甲酰氯(1.3当量)。在完成后，将反应物用水急速冷却并且用乙酸乙酯提取。将有机层用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，在真空条件下浓缩。通过快速色谱柱提纯得到白色粉末状的125毫克的G1-炔(85.6％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH1.98-2.07(1H,m),2.21(1H,s),2.66(1H,s),3.05(1H,t),3.73(1H,t),3.95(1H,t),4.07(1H,t),4.50(1H,t),4.80(1H,s),7.08-7.21(6H,m),7.37(2H,t),7.55-7.66(3H,m),7.79(1H,d),7.92(1H,d),8.15-8.36(1H,s).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC169.58,169.13,158.84,158.30,158.22,156.15,156.06,155.92,154.04,154.77,144.60,143.37,142.54,133.62,133.47,133.36,133.21,130.03,129.87,129.70,128.61,128.32,128.22,127.81,127,39,127.03,124.18,119.68,119.21,119.00,98.32,81.43,79.67,71.63,70.32,49.28,47.74,44.86,44.36,44.01,18.37,17.28.
19F-NMR(400MHz,CDCl3)δF67.06,67.13.
C30H26N6O4FS[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：585.1720；实测值：585.1714.
化合物6的制备
将1.0克化合物3，365毫克N-Boc-乙醇胺(1.2当量)，594毫克三苯膦(1.2当量)溶解在无水THF中。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃，然后滴加358微升DEAD。在完成后，将反应物真空浓缩，通过快速色谱柱提纯而得到1.2克化合物6(94.3％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH1.39(9H,s),3.37(2H,dd),3.52(2H,t),3.90(2H,t),4.60(2H,t),5.99(1H,t),7.04-7.15(5H,m),7.35(2H,dt),7.45-7.56(3H,m),7.61(2H,d),7.81(1H,d),8.29(1H,s).
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC158.46,158.10,156.28,156.16,155.77,154.69,147.72,144.30,133.52,132.61,131.64,130.74,129.95,129.91,127.54,124.03,119.53,119.02,98.38,79.32,77.47,77.35,77.15,76.83,48.50,47.58,45.47,38.65,28.39.
C32H35N8O7S[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：675.2349；实测值：675.2342.
化合物7的制备
将168毫克化合物6溶解在3毫升DCM中并添加1毫升TFA。搅拌该混合物两小时，在真空条件下除去溶剂。然后将残余物溶于无水DMF，添加73毫克生物素(1.2当量)和140微升TEA(4当量)。通过冰浴将溶液冷却至0℃并且添加144毫克的HATU(1.5当量)。搅拌反应过夜。然后，在真空条件下除去DMF，将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，用快速色谱柱提纯而得到180毫克化合物7(90.0％)。
1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δH1.38-1.71(6H,m),2.05(1H,dt),2.15(2H,m),2.68(1H,d),2.80(1H,dd),3.17-3.23(17H,m),3.47-3.64(4H,m),3.94-4.02(2H,m),4.33(1H,s),4.48(1H,t),4.61-4.67(2H,m),6.21(1H,s),6.70(1H,s),7.08-7.18(5H,m),7.40(2H,dt),7.65-7.77(6H,m),7.86(1H,d),8.27(1H,s).
13C-NMR(100MHz,丙酮-d6)δC205.97,205.78,173.36,163.93,158.49,157.99,156.66,155.79,154.69,147.84,144.06,134.09,132.19,132.09,130.21,130.14,130.04,128.10,124.14,123.85,119.21,118.93,98.00,61.73,60.08,55.64,48.11,47.59,45.41,40.19,37.29,35.69,25.54.
C37H41N10O7S[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：801.2601；实测值：801.2613.
化合物8的制备
将180毫克化合物7溶解在无水MeCN中，添加94毫克K2CO3(3当量)。然后，在搅拌下将75毫克PhSH添加到该悬浮液。在完成后，除去MeCN，将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，用快速色谱柱提纯而得到110毫克化合物8(77.8％)。
1H-NMR(400MHz,MeOD-d4)δH1.40-1.49(2H,m),1.51-1.70(4H,m),2.10(1H,t),2.67(1H,d),2.79(2H,t),2.88(1H,dd),3.11-3.19(3H,m),3.27-3.35(2H,m),4.27(1H,dd),4.44-4.53(3H,m),7.06-7.16(5H,m),7.38(2H,t),7.66(2H,d),8.24(1H,s).
13C-NMR(100MHz,MeOD-d4)δC174.81,164.65,158.52,158.47,156.43,155.51,154.15,144.59,129.89,129.73,127.35,123.75,119.17,118.59,97.82,61.94,60.19,55.57,45.91,39.70,38.35,35.34,28.37,28.09,25.34.
C31H38N9O3S[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：616.2818；实测值：616.2813.
G1-生物素的制备
将110毫克化合物8溶解在2毫升无水DCM中，将38微升TEA(1.5当量)添加到溶液中。然后，通过冰浴将溶液冷却至0℃，添加48毫克的4-(氟磺酰基)苯甲酰氯(1.2当量)。在完成后，将反应物用水急速冷却并且用DCM提取。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，在真空条件下浓缩。通过快速色谱柱提纯而得到白色粉末状的100毫克的G1-生物素(69.4％)。
1H-NMR(400MHz,MeOD-d4)δH1.33-1.41(2H,m),1.46-1.66(4H,m),2.07(1H,t),2.21(1H,dt),2.65(1H,t),2.86(1H,dt),3.12-3.14(2H,m),3.35(1H,t),3.58(1H,dt),3.77-3.78(1H,m),3.91(1H,t),4.07(1H,t),4.20(1H,dq),4.46-4.47(2H,m),4.75(1H,t)7.09-7.19(6H,m),7.40(2H,t),7.51(1H,d),7.60-7.67(2H,m),7.81(1H,d),7.96(1H,d),8.07-8.31(1H,s).
13C-NMR(100MHz,MeOD-d4)δC175.03,174.59,170.19,169.98,164.63,158.68,158.48,158.34,156.39,156.33,155.70,155.54,154.51,154.26,144.79,144.75,143.15,142.20,133.42,133.28,133.18,133.03,129.91,129.77,129.72,128.41,128.05,127.98,127.80,127.24,126.90,123.84,123.77,119.33,119.26,118.65,118.44,97.88,97.82,61.92,61.83,60.15,55.51,48.77,48.47,44.73,44.50,44.02,39.68,36.91,36.60,35.51,35.19,28.40,28.34,28.04,25.35,25.13.
19F-NMR(400MHz,MeOD-d4)δF65.25.
C38H41N9O6FS2[M+H+]的HRMS-ESI的计算值：802.2605；实测值：802.2601.
G1-珠的制备
将168毫克化合物6溶解在3毫升DCM中并添加1毫升TFA。搅拌该混合物两小时，在真空条件下除去溶剂。将该中间体制备成在DMF和TEA中的溶液的形式，浓度为100mM。将1克活化的CH-琼脂糖凝胶(Sigma)珠悬浮在2毫升的上述溶液中并且保持搅拌过夜。然后，将珠过滤，用DCM洗涤若干次并真空干燥。
将珠悬浮在2毫升的MeCN中，然后添加77毫克K2CO3和45毫克PhSH。在搅拌过夜后，将珠过滤，用MeCN洗涤若干次并真空干燥。
然后，将珠分散在100μM的4-(氟磺酰基)苯甲酰氯/无水DCM和TEA的溶液中。在搅拌过夜后，将珠过滤，用MeCN洗涤若干次并真空干燥。
生物试验
重组sjGST蛋白标记
在反应缓冲液(50mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl，5mMMgCl2)中将重组sjGST蛋白稀释至0.1μg/μL的最后浓度并且在室温下用2μMG1-炔培养1小时。蛋白样品经受"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N3(10mM在DMSO中的储备液，Lumiprobe)、CuSO4(100mM在H2O中的储备液，Sigma)、TBTA(10mM在4:1的叔丁醇:DMSO中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在H2O中的储备液，Sigma)。将样品转移到96-孔板中并且在连续摇动下在室温下在黑暗中培养1小时。使混合物通过7-kDaZeba脱盐柱(Pierce)以除去过量的TAMRA和盐，然后通过添加30μL4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)(含1mMDTT)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE12％Bis-tris变性凝胶(SDS-PAGE,Invitrogen)并且用PharosFX成像系统(Bio-rad)进行凝胶内荧光扫描。
随着更多的G1-炔探针的使用，蛋白谱带的荧光增加，同时考马斯蓝着色结果指出在各带中重组蛋白的相等的加载数量。
根据凝胶密度测定法在约10μM的G1-炔下实现sjGST的最大标记。
结果显示G1-炔标记可以被0.1μM的G1-H完全阻断(图3中A)。然而，一旦被G1-炔探针标记，高浓度的G1-H不再能破坏该键接(图3中B)。这些实验表明sjGST是G1分子的特异性且不可逆的结合蛋白。
通过MALDI-TOF-MS谱证实结合位点
在反应缓冲液(50mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl，5mMMgCl2)中将重组sjGST蛋白稀释至0.1μg/μL的最后浓度并且在室温下用2μMG1-H或G1-炔培养1小时。使用20mM的NH4HCO3(pH＝8.0)作为平衡溶液通过7-kDaZeba脱盐柱(Pierce)纯化蛋白样品并且通过3-kDa分子量截留(MWCO)膜(Millipore)将纯化的蛋白样品浓缩。在37℃培养箱中在10％CH3CN，20mMNH4HCO3(pH＝8.0)中用0.02μg/μL的测序级修饰胰蛋白酶(Promega)培养溶于NH4HCO3中的蛋白样品。通过Zip-Tip脱盐柱(Millipore)纯化被消化的样品并且以反射方式通过ABI-4800MALDI-TOF-MS谱进行分析。
比较用G1-H和G1-炔处理的样品的质谱，观察到从1093.47至1145.53的峰位移，这与G1-H与G1-炔的分子量差别一致(52道尔顿)(图4中A)。因而，这两个峰被选作进一步MS/MS分析并且结果显示两化合物键合至IAYSK肽中的酪氨酸-111残基(图4中B)。通过用苯丙氨酸代替这个酪氨酸残基产生sjGST突变型(Y111F)，其完全消灭了G1-炔所带来的标记，这进一步指出酪氨酸-111是化合物的特定结合位点(图4中C)。
GST-eGFP固定
通过链霉亲和素-琼脂糖凝胶珠捕获G1-生物素(即G1的生物素化探针)(图5中A)。使用这些珠来展示基于G1类型探针共价固定蛋白的方法。
作为对于半高-通过量筛选条件的模拟，重组GST-标签化增强绿色荧光蛋白(GST-eGFP)用G1-生物素培养并且被捕获在链霉亲和素-涂布的96-孔微板上。具体来说，在37℃在PBS中培养G1-生物素和GST-eGFP2小时。然后，通过7-kDaZeba脱盐柱(Pierce)将反应混合物脱盐而除去未反应的G1-生物素，并且在37℃用链霉亲和素涂布的96-孔微板(Thermoscientific)培养5小时。用PBS洗板三次并且通过PharosFX成像系统(Bio-rad)扫描以检测出固定的GFP蛋白。
用0.5μM的G1-生物素培养渐增量的GST-eGFP(图5中的B)或者用渐增量的G1-生物素培养GST-eGFP(1.5μg)(图5中的C)，荧光强度因此增加，这指出GFP蛋白的荧光性能在固定后很好地保持。通过用游离的G1-H预培养GST-eGFP可以阻断固定(图5中的D)。这些实验结果指出GST-eGFP可以剂量依赖地被G1化合物固定到固体载体上并且在固定后保持其天然荧光性能。
GST-激酶固定和激酶活性分析
GST-标签的激酶(ITK和EGFR)重组蛋白购自CarnaBiosceinces。为“固定”激酶，在10μL的激酶缓冲液(CisbioBiossays)中用0.6μg的GST-标签的重组ITK或EGFR蛋白在4℃培养0.5μL的G1-结合的CH-琼脂糖凝胶珠(Sigma)2小时。对于“可溶性”激酶分析，为补偿由聚合物珠引起的对激酶活性的可能影响，0.5μL的相同的G1-结合的CH-琼脂糖凝胶珠首先用5mg的sjGST培养；然后小心地用PBS洗涤，将这些GST-阻断的(blocked)珠添加到相同激酶缓冲液中，含有相同数量的重组激酶。根据由CisbioBioassays销售的KinEASETM分析中规定的规程进行激酶酶学分析。简单来说，在384-孔板中将2μL珠浆添加到6μL的TK-底物-生物素的工作液中。通过添加2μL的ATP溶液(最后浓度0.1mM)开始激酶反应并且在37℃培养1小时。然后通过添加10μL检测试剂(包含EDTA和链霉亲和素XL665结合物)终止该反应。在室温下再培养混合物1小时并且通过读板器(EnVisionPerkinElmer)读数。用GraphPadPrism5.0进行数据分析。
在固定前后，测定GST-标签化的激酶的酶活性。G1-H的衍生物被偶联到活化的CH-琼脂糖凝胶(Sigma)珠(图6中A)。各种数量的重组GST-标签化白介素-2可诱导的T细胞激酶(ITK)和GST-标签化表皮生长因子受体(EGFR)被固定到G1-结合珠并且通过基于HTRF的酶分析测量其激酶活性。相比于经受相同分析条件的可溶性GST-标签化激酶，固定化酶基本上保持了活性，在固定后保持了相当于在溶液中的约70％的激酶活性(图6中B和6中C)。因此，本发明的固定方法可以提供高收率的活性蛋白。
本发明的化合物特异性地且共价地在酪氨酸-111残基处标记sjGST蛋白。结合反应是快速的、适度的和有效的。通过将这类分子连接到固体载体，通过直接的、不可逆的且位置选择性结合融合标签sjGST，可以实现位点特异性的蛋白固定。通过这种标记策略，可以稳定地保持天然蛋白结构和活性。这种一步法可以容易地应用于蛋白芯片和需要有效固定的生物活性的蛋白的高-通过量筛选平台。

Claims (9)

1.式I的化合物：
其中，
R1是苯基的任选取代基，选自卤素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、芳基-O-芳基-、5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-、(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-；
R2是Ar的任选取代基，选自卤素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、芳基-O-芳基-、5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-、(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-；
m是0、1、2、3、4；
n是0、1、2、3、4；
连接基团是任选被取代的，并且是由下述A组中的0-15个和下述B组中的一个组成的三价基团，
A组：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1-10亚烷基─、─C3-10亚环烷基─、与─(3-10)元亚杂环烷基─，
B组：─N═、─C1-10次烷基═、─C3-10次环烷基═、与─(3-10)元次杂环烷基═；
Ar是苯、萘、单环杂芳基、双环杂芳基；
R选自：
可与固体表面反应的基团；
荧光团(fluorophore)；
生物素部分；
-C0-10亚烷基-C≡CH；和
氢。
2.权利要求1的化合物，其中所述式I是下述式II：
3.权利要求1的化合物，其中所述连接基团选自：
4.权利要求1的化合物，其中所述-Ar-(R2)n是
5.选自下列的化合物：
6.一种固定蛋白的方法，包括下述步骤：
步骤1：通过共价或非共价相互作用，将权利要求1-N中任一项的化合物接枝到固体表面；和
步骤2：通过在酪氨酸残基的共价键，将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上；
或者
步骤1：通过在酪氨酸残基的共价键，使权利要求1-N中任一项的化合物与蛋白反应；和
步骤2：通过共价或非共价相互作用，将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。
7.权利要求6的方法，其中所述固体表面包括金属、聚合物或纳米材料的表面。
8.权利要求6的方法，其中所述共价或非共价相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。
9.权利要求6的方法，其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-111残基。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109369654A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 山东大学 1，3-二取代-4-氨基吡唑并嘧啶类化合物及其制备方法和应用
CN110218228A (zh) * 2018-03-02 2019-09-10 北京大学深圳研究生院 用于固定蛋白的化合物和固定蛋白的方法
WO2022214054A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Nanjing University Conjugate and the preparing method and use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4069224A (en) * 1973-12-26 1978-01-17 The Upjohn Company Novel benzamides
JP2007057477A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Tokyo Institute Of Technology 病原性大腸菌感染症の予防治療薬のスクリーニング法
CN1319946C (zh) * 2002-08-12 2007-06-06 拜尔农科股份有限公司 新型2－吡啶基乙基苯甲酰胺衍生物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4069224A (en) * 1973-12-26 1978-01-17 The Upjohn Company Novel benzamides
CN1319946C (zh) * 2002-08-12 2007-06-06 拜尔农科股份有限公司 新型2－吡啶基乙基苯甲酰胺衍生物
JP2007057477A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Tokyo Institute Of Technology 病原性大腸菌感染症の予防治療薬のスクリーニング法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.I.RAKHIMOV ET AL.: "synthesis of 2-alkyl(aralkyl)sulfanyl-6-methylpyrimidin-4(3H)-ones and 4-alkyl(aralky)oxy-2-alkyl(aralkyl)sulfanyl-6-methylpyrimidines", 《RUSSIAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY》 *
ANTHONY R.BEAUGLEHOLE ET AL.: "Fluorosulfonyl-substituted xanthenes as selective irreversible antagonists for the A1-adenosine receptor", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
B.R.BAKER ET AL.: "p-(2,6-diamino-1,2-dihydro-2,2-dimethyl-s-triazin-1-yl)phenylpropionyl", 《IRREVERSIBLE ENZYME INHIBITORS. CXXVII.》 *
CHRISTIAN GU ET AL.: "Chemical proteomics with sulfonyl fluoride probes reveals selective labeling of functional tyrosines in glutathione transferases", 《CHEMISTRY & BIOLOGY》 *
JAMES R.PIPER ET AL.: "Synthesis of potential inhibitors of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase for testing as antiprotozoal agents. 1.7-substituted 6-oxopurines", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
JAMES R.PIPER ET AL.: "Synthesis of potential inhibitors of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase for testing as antiprotozoal agents. 2.1-substituted hypoxanthines", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
KRISHNA C.AGRAWAL ET AL.: "potential antitumor agents.6.possible irreversible inhibitors of ribonucleoside diphosphate reductase", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
PETER J.SCAMMELLS ET AL.: "Substituted 1,3-dipropylxanthines as irreversible antagonists of A1 adenosine receptors", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
RAJESH VISWANATHAN ET AL.: "Regioselective covalent immobilization of catalytically active glutathione s-transferase on glass slides", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110218228A (zh) * 2018-03-02 2019-09-10 北京大学深圳研究生院 用于固定蛋白的化合物和固定蛋白的方法
CN110218228B (zh) * 2018-03-02 2021-11-23 北京大学深圳研究生院 用于固定蛋白的化合物和固定蛋白的方法
CN109369654A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 山东大学 1，3-二取代-4-氨基吡唑并嘧啶类化合物及其制备方法和应用
WO2022214054A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Nanjing University Conjugate and the preparing method and use thereof

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