CN110218228A - 用于固定蛋白的化合物和固定蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
用于固定蛋白的化合物和固定蛋白的方法。所述化合物具有式I的结构,其能够通过位置选择性共价键合的方式共价固定蛋白,特别是sjGST‑标签化的蛋白。(式I)其中,R1是C1‑C12亚烷基,优选C3‑C6亚烷基;R2是C1‑C10烷基,优选C1‑C3烷基;R3是H或CH≡C‑(C0‑C10)烷基,优选CH≡C‑(C0‑C2)烷基,更优选CH≡C‑。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于固定蛋白的化合物以及一种用于固定蛋白的方法。
背景技术
将蛋白固定到如微阵列、芯片和珠等固体载体上是一种用于阐明蛋白-蛋白或蛋白-配体相互作用以及用于以高处理量的方式探测新蛋白功能的强大方法。不同于DNA微阵列的情况,由于在实现将蛋白选择性地且均匀取向地分布到固体表面中的固有困难,实施用于蛋白固定的通用方法存在着挑战。
常规固定方法主要依赖三种机理:物理连接、共价键合和生物亲和性固定。然而非选择性的物理连接或共价键合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白变性。通过重组融合标签和所偶联蛋白的共表达进行固定可以相应保证蛋白的确切取向并且提供了微调生物结合物拓扑结构的灵活性。例如,将sjGST标签固定到GSH-结合的聚合物珠或将His-标签固定到Ni-NTA芯片或将生物素-标签结合到链霉亲和素涂布的固体载体上已经被广泛地选作非共价蛋白固定方法用于保持所标签蛋白的活性。
因此开发一种有效且稳定的固定蛋白的策略,能够最大限度地保持活性,是有着显著意义和应用价值。位置选择性共价固定蛋白最近引起很多关注,因为它能够稳定地、均匀地且高密度地固定各种蛋白。其方法是将所关注的蛋白与标签蛋白共表达,再利用后者与其被固定的底物分子共价地且选择性地反应。比如,Kindermann等报道了一种通过不可逆地将O6-苄基鸟嘌呤衍生物的烷基连接到hAGT半胱氨酸残基之一来固定hAGT-标签的共价方法。
GST-标签蛋白具有高底物亲合性,然而,已知的GST标签固定方法仍然基于可逆的GSH-GST结合,限制了它们的应用。
仍然亟需一类这样的小分子物质,其能够通过位置选择性共价键合的方式共价固定蛋白,特别是sjGST-标签化的蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具有氟膦酸酯基团和炔基端基的小分子物质,其能够通过位置选择性共价键合的方式共价固定蛋白,特别是sjGST-标签化的蛋白。
本发明的目的还在于提供一类能够以相对简单的方法合成的具有氟膦酸酯基团和炔基端基的小分子物质,当用它们处理sjGST-标签化的蛋白时能够共价地、选择性地、不可逆地标记sjGST。
具体来说,本发明提供了下述技术方案:
技术方案1.式I的化合物:
(式I)
其中,
R1是C1-C12亚烷基,优选C3-C6亚烷基;
R2是C1-C10烷基,优选C1-C3烷基;
R3是H或CH≡C-(C0-C10)烷基,优选CH≡C-(C0-C2)烷基,更优选CH≡C-。
技术方案2. 技术方案1的化合物,其中所述式I的化合物选自:
和。
技术方案3. 一种固定蛋白的方法,包括下述步骤:
步骤1:通过共价或非共价相互作用,将技术方案1或2的化合物接枝到固体表面;和
步骤2:通过在酪氨酸残基的共价键,将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上;
或者
步骤1:通过在酪氨酸残基的共价键,使技术方案1或2的化合物与蛋白反应;和
步骤2:通过共价或非共价相互作用,将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。
技术方案4. 技术方案3的方法,其中所述固体表面包括玻璃、金属、聚合物或纳米材料的表面。根据本发明,固体表面的例子包括但不限于多糖珠,多糖珠包括但不限于聚氨基葡糖珠,几丁质珠、琼脂糖珠、壳聚糖珠。关于多糖珠的更多信息,可以参考CN102504312A、CN103739857A、CN101715364A、CN1939582A和CN1226900A。
技术方案5. 技术方案3的方法,其中所述共价或非共价相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。
技术方案6. 技术方案3的方法,其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-111残基。
附图说明
图1:(a)重组sjGST蛋白的PF-alkyne的标记(每个条带0.5μg sjGST):荧光扫描(FS,上部);银染色(SS,下部);(b)重组sjGST蛋白的竞争性标记(PF先PF-alkyne后,每个条带0.5μg sjGST):荧光扫描(FS,上部);银染色(SS,下部);(c)重组sjGST蛋白的竞争性标记(PF-alkyne先PF后,每个条带0.5μg sjGST):荧光扫描(FS,上部);银染色(SS,下部)。
图2:(a) 使用PF-alkyne标记sjGST的LC/MS-MS分析结果;(b) PF-aklyne标记sjGST和sjGSTY111F(Y111变性的sjGST)蛋白的结果(每个条带0.5μg):荧光扫描(FS,上部);银染色(SS,下部)。
图3:PF-aklyne标记不同蛋白的结果(每个条带0.5μg):荧光扫描(FS,上部);银染色(SS,下部)。
图4(a)和图4(b):固定蛋白于小珠上的结果。其中线条1表示没有经历捕获/洗脱过程的GSTA1,线条2表示经过PF-alkyne捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且煮沸洗脱的GSTA1,线条3表示通过DMSO处理捕获的GSTA1,线条4表示先用PF、后用PF-alkyne处理的GSTA1,线条5表示先用PF-alkyne、后用PF处理的GSTA1,线条6表示先用浓GSH、后用PF-alkyne处理的GSTA1,线条7表示先用PF-alkyne、后用浓GSH处理的GSTA1,线条8表示经过PF-alkyne捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且用结合缓冲液洗脱的GST-eGFP,线条9表示经过PF捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且用结合缓冲液洗脱的GST-eGFP,线条10表示通过煮沸,线条8中的洗脱的GST-eGFP,和线条11表示通过煮沸,线条9中的洗脱的GST-eGFP。
图5:固定蛋白于玻璃板上的示意过程。
图6:固定蛋白于玻璃板上的结果。
具体实施方案
在以下的实施例中,所有实验用到的试剂均购置于试剂公司并且不再进行一步的处理。二氯甲烷用氢化钙干燥去水,四氢呋喃用钠块干燥去水。所有反应都通过0.25毫米厚薄层色谱硅胶板和紫外光进行监测。快速柱色谱法采用的硅胶为200-300目硅胶粉。氢谱碳谱收集采用的布鲁克400兆,500兆核磁仪,以三甲基硅(δH 0.00 和 δC 0.00)作为参照。19F谱采用布鲁克400兆核磁仪,以一氟三氯甲烷(δF 0.00)作为参照。32P谱采用布鲁克400兆核磁仪,以85%的磷酸(δP 0.00)作为参照。高分辨质谱数据收集采用的是四极杆飞行时间串联质谱仪。化合物纯化所用的高效液相色谱仪为岛津公司的高效液相色谱仪1260。胶带扫描使用Pharos FX成像系统。
合成实施例1:化合物PF的制备
。
化合物2的制备
216毫克化合物1,180毫克化合物5以及281毫克三苯基膦(PPh3)首先溶于3毫升无水四氢呋喃(THF)中,待降温至零摄氏度后,慢慢的滴加0.16毫升偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)。将反应液慢慢的升温至室温,搅拌过夜。用水淬灭后,乙酸乙酯萃取三次,收集有机相,然后用饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物324毫克(产率92%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.31(dd, J = 20.8, 12.7 Hz, 2H), 7.18-6.98 (m, 5H), 6.19 (s, 2H), 4.40 (t, J =6.9 Hz, 2H), 4.14-3.92 (m, 4H), 2.12-1.89 (m, 2H), 1.85-1.69 (m, 2H), 1.62(td, J = 15.5, 8.9 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C25H31N5O4P+的计算值: 496.2108; 实测值: 496.2104。
化合物PF的制备
80毫克化合物2首先溶于1毫升乙醇(EtOH)中,然后加入1毫升1M 氢氧化钠(NaOH)。反应在100摄氏度回流四个小时,待冷却后,用1M盐酸调pH至1,乙酸乙酯萃取三次,合并有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,直接进行下一步的反应。
将上一步的产物溶于1.5毫升二氯甲烷(DCM),待反应液冷却至负七十八摄氏度,慢慢的滴加63微升二乙胺基三氟化硫(DAST),然后将反应液慢慢的升温至室温继续反应三十分钟,加入5毫升水淬灭,乙酸乙酯萃取三次,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物31毫克(产率41%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.34 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.37(t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.22-7.10 (m, 3H), 7.07 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 5.89 (s,2H), 4.45 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.32-4.09 (m, 2H), 2.14-2.03 (m, 2H), 2.04-1.84 (m, 2H), 1.70 (dt, J = 15.6, 7.7 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C23H26FN5O3P+的计算值:470.1752; 实测值:470.1754。
合成实施例2:化合物PF-alkyne的制备
。
化合物5的制备
2毫升化合物3(市购)和3.6毫升亚磷酸三乙酯(P(OEt)3)混合,然后160摄氏度回流4.5小时,将温度降至100摄氏度,加入5毫升饱和碳酸氢钠继续搅拌三十分钟,冷却至室温,乙酸乙酯萃取三次,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,直接进行下一步反应。
将上述产物溶于30毫升甲醇(MeOH)中,加入一勺氢氧化钯/碳,在氢气气氛中搅拌过夜,然后用硅藻土过滤,将滤液旋干,快速色谱柱分离得到目标产物1.9克(两步产率87%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.15-3.91 (m, 4H), 3.61 (t, J = 6.0 Hz, 2H),2.85 (s, 1H), 1.81-1.51 (m, 6H), 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C8H20O4P+的计算值:211.1094; 实测值:211.1099。
化合物7的制备
将10克无水4埃 分子筛分别装入两个干燥的圆底烧瓶,然后各加入200毫升无水二氯甲烷(DCM)。在其中一个烧瓶中加入7.1克醋酸铜(Cu(OAc)2),13.9毫升三乙胺(TEA)和12.1克4-羟基苯硼酸频那醇酯,另外一个烧瓶中加入10克3-溴苯硼酸和3.9毫升吡啶。两个烧瓶在氮气保护下室温下搅拌4小时,然后用注射器吸取3-溴苯硼酸/吡啶反应液注入到另外一烧瓶里,混合液在室温搅拌16小时后,用二氧化硅粉末过滤并用10:1 正己烷/乙酸乙酯冲洗几遍,将滤液真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物2.4克(产率13%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35-7.20 (m, 3H),7.08 (t, J = 9.2 Hz, 2H), 7.04 (ddd, J = 8.0, 2.2, 1.0 Hz, 1H), 1.43 (s,12H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C18H21BBrO3 +的计算值:375.0762; 实测值:375.0771。
化合物8的制备
1.0克化合物7溶于5毫升二甲基甲酰胺(DMF)中,然后加入2.9毫升N-甲基吗啉,2.4毫升三异丙基硅基乙炔(TIPS-乙炔),185毫克四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)和10毫克碘化亚铜(CuI)。用氩气换气几次,然后90摄氏度反应5小时。将反应液用乙醚稀释,水洗,收集有机相并用饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物1.0克(产率82%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 7.28-7.21 (m, 2H),7.14 (s, 1H), 7.01-6.90 (m, 3H), 1.33 (s, 12H), 1.11 (s, 18H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C29H42BO3Si+的计算值:477.2991; 实测值: 477.2983。
化合物10的制备
205毫克化合物9(市购)溶于4毫升四氢呋喃(THF)中,然后加入402毫克化合物5和498毫克三苯基膦(PPh3),待反应液冷却至零摄氏度后,慢慢向反应液滴加偶氮二甲酸二乙酯(DEAD),然后慢慢回温至室温并搅拌过夜。用水淬灭反应,然后乙酸乙酯萃取三次,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物405毫克(产率>99%)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.27-8.18 (m, 1H), 4.30 (t, J = 6.9 Hz, 2H),4.07-3.94 (m, 4H), 1.99-1.90 (m, 2H), 1.77-1.67 (m, 2H), 1.60-1.48 (m, 2H),1.23 (q, J = 7.0 Hz, 6H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C13H22BrN5O3P+的计算值:406.0638; 实测值: 460.0637。
化合物11的制备
将152毫克化合物8, 108毫克化合物10,20毫克[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(PdCl2(dppf))和112毫克碳酸钾置于玻璃管中,然后溶于1.5毫升二甲基乙酰胺(DMF)和0.3毫升水的混合溶液中,将玻璃管充氩气密封,然后在120摄氏度温度下微波反应1小时。反应液用乙酸乙酯稀释,水洗,水相再用乙酸乙酯萃取两遍,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物120毫克(产率66%)。
将上述产物溶于1毫升四氢呋喃(THF)中,然后加入0.54毫升四丁基氟化铵(TBAF),室温搅拌三小时。反应液用乙酸乙酯稀释,水洗,水相再用乙酸乙酯萃取两遍,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物84毫克(产率90%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 (s, 1H), 7.71-7.63 (m, 2H), 7.37-7.26(m, 2H), 7.20-7.11 (m, 3H), 7.08 (ddd, J = 8.0, 2.4, 1.3 Hz, 1H), 5.61 (s,2H), 4.45 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.18-3.93 (m, 4H), 3.10 (s, 1H), 2.14-2.01 (m,2H), 1.88-1.74 (m, 2H), 1.72-1.57 (m, 2H), 1.31-1.24 (m, 6H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C27H31N5O4P+的计算值:520.2108; 实测值: 520.2102。
化合物PF-alkyne的制备
124毫克化合物11溶于1.5毫升乙醇(EtOH)中,然后加入1毫升1M 氢氧化钠。反应在100摄氏度回流四个小时,待冷却后,用1M盐酸调pH至1,乙酸乙酯萃取三次,合并有机相,无水硫酸镁干燥,真空旋干,直接进行下一步的反应。
将上一步的产物溶于2毫升二氯甲烷(DCM),待反应液冷却至负七十八摄氏度,慢慢的滴加95微升二乙胺基三氟化硫(DAST),然后将反应液慢慢的升温至室温继续反应四十分钟,加入5毫升水淬灭,乙酸乙酯萃取三次,收集有机相,饱和食盐水洗一次,无水硫酸镁干燥,真空旋干,快速色谱柱分离得到目标产物35毫克(两步产率30%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.31(dt, J = 15.3, 7.7 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.7 Hz, 3H), 7.08 (d, J = 7.9 Hz,1H), 5.58 (s, 2H), 4.47 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.31-4.15 (m, 2H), 3.10 (s, 1H),2.15-2.06 (m, 2H), 1.98 (ddd, J = 15.7, 12.5, 7.5 Hz, 2H), 1.71 (d, J = 7.5Hz, 2H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
HRMS (m/z): [M+H]+ C25H26FN5O3P+的计算值:494.1752; 实测值: 494.1757。
生物试验。
重组sjGST蛋白标记
重组sjGST蛋白(商购自SinoBiological)用磷酸盐缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.4,150 mM NaCl, 5 mM MgCl2)稀释到终浓度为0.1 微克/微升,然后用5 微摩尔 PF-alkyne(除非有其他说明,否则浓度不变)在室温孵育1.5小时。蛋白样品然后与TAMRA-N3通过亚铜催化的Huisgen[3+2] (一种Cu(I)-催化的叠氮-炔1,3-偶极环加成试剂,简称CuCAAC试剂)环加成("Click")反应进行连接。对于每个反应,5微升的蛋白样品加入TAMRA-N3 (10 mM在DMSO中的储备液,Lumiprobe)、硫酸铜(100 mM在H2O中的储备液,Sigma)、TBTA(10 mM在4:1的叔丁醇:DMSO中的储备液,Sigma)和抗坏血酸钠(100 mM在H2O中的储备液,Sigma)的混合液(0.2微升,每个试剂0.05微升),然后放置于避光处室温振摇1小时。待反应结束后,向反应液加入5微升(2x)上样缓冲液(含2%β-巯基乙醇),然后在100摄氏度将样品煮沸10分钟。然后将样品上样,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(10% Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶)并通过Pharos FX成像系统(Bio-rad)进行扫描。最后对胶进行银染处理。
使用不同浓度的PF-alkyne,以类似的方法进行标记,结果显示于图1的(a)中。在用5微摩的PF-alkyne处理前/后使用不同浓度的PF对sjGST蛋白进行孵育,以类似的方法进行标记,进行竞争性实验,结果显示于图1的(b)和(c)中。
通过使用LC-MS/MS来确认PF-alkyne探针在sjGST上的确切结合位置。如图2的(a)所示,酪氨酸-111是PF-alkyne所标记的位置。使用5微摩的PF-alkyne对Y111变性的sjGST蛋白(sjGSTY111F)进行标记,结果显示于图2的(b)中;该结果证实了酪氨酸-111是PF-alkyne的特异性结合位置。
选择性标记其它人源GST蛋白
以类似于重组sjGST蛋白标记的方式,对其它人源GST蛋白进行选择性的标记,其中重组的人源GSTM1、GSTO1和GSTP1购置于Genecopoedia;重组的人源GSTA1购置于BioVision。结果显示于图3中。
固定GSTA1蛋白于小珠
GSTA1 (1 微克/微升) 稀释到终浓度为0.1微克/微升,然后用100微摩尔 PF-alkyne室温孵育1.5小时(每个样品的体积为20微升,12微升的GST-eGFP和8微升的PF-alkyne)。
对于竞争实验,首先将GSTA1用100微摩尔/升 PF 或者20毫摩尔/升谷胱甘肽孵育1.5小时,然后再用100微摩尔/升PF-alkyne 孵育1.5小时;或者先将GSTA1用100微摩尔/升PF-alkyne 孵育1.5小时,然后再用100微摩尔/升 PF 或者20毫摩尔/升谷胱甘肽孵育 1.5小时。
孵育结束后,将样品与N3-PEG4-biotin进行“点击(click)”反应1小时,然后将样品与链霉亲和素磁珠混合并在四摄氏度摇滚过夜。所用的链霉亲和素磁珠在使用前必须要用结合缓冲液进行平衡三次,样品与磁珠孵育结束后仍然要用结合缓冲液洗涤三次。然后向反应液加入5微升(2x)上样缓冲液(含2%β-巯基乙醇),100摄氏度将样品煮沸10分钟。然后将样品上样,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并通过Pharos FX成像系统进行扫描。最后对胶进行银染处理。
结果显示于图4a中,其中线条1表示没有经历捕获/洗脱过程的GSTA1,线条2表示经过PF-alkyne捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且煮沸洗脱的GSTA1,线条3表示通过DMSO处理捕获的GSTA1,线条4表示先用PF、后用PF-alkyne处理的GSTA1,线条5表示先用PF-alkyne、后用PF处理的GSTA1,线条6表示先用浓GSH、后用PF-alkyne处理的GSTA1,线条7表示先用PF-alkyne、后用浓GSH处理的GSTA1。
如线条1、2、3所示,与没有经受捕获/洗脱程序的GSTA1相比,大约1/3的GSTA1被PF-alkyne和小珠捕获,而在DMSO中没有捕获GSTA1。不出所料,当用PF或高浓度GSH(20mM)预处理GSTA1时,PF-alkyne不能捕获GSTA1,如线条4和6所示。当用PF-alkyne预先处理GSTA1时,PF-alkyne可以捕获蛋白而不受到PF的干扰(如线条5所示),但是高浓度的GSH让能中断这一过程(如线条7所示)。结果表明PF-alkyne能够成功固定GSTA1。
固定GST-eGFP蛋白于小珠
GST-eGFP (1 微克/微升) 稀释到终浓度为0.1微克/微升 ,然后用100微摩尔 PF-alkyne室温孵育1.5小时(每个样品的体积为20微升,12微升的GST-eGFP和8微升的PF-alkyne)。
孵育结束后,将样品用N3-PEG4-biotin进行“点击(click)”反应1小时,然后将样品与链霉亲和素磁珠混合并在四摄氏度摇滚过夜。所用的链霉亲和素磁珠在使用前必须要用结合缓冲液进行平衡三次,样品与磁珠孵育结束后仍然要用结合缓冲液洗涤三次。在洗涤后,磁珠首先用Pharos FX成像系统进行扫描(激发波长为488nm),然后再进行后续电泳分离及银染处理。
结果显示于图4b中,其中线条8表示经过PF-alkyne捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且用结合缓冲液洗脱的GST-eGFP,线条9表示经过PF捕获、N3-biotin点击、结合到小珠且用结合缓冲液洗脱的GST-eGFP,线条10表示通过煮沸,线条8中的洗脱的GST-eGFP,和线条11表示通过煮沸,线条9中的洗脱的GST-eGFP。结果表明PF-alkyne能够成功固定GST-eGFP。
固定GST-eGFP蛋白于玻璃板上
1克 N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和0.7毫升二异丙基乙胺溶于9.7毫升二甲基乙酰胺,然后加入放置有玻璃板(表面含有氨基)反应槽中,充氩气封闭,室温振摇(80-90转/分钟,下同)8小时,然后将反应液去除,二甲基乙酰胺清洗玻璃板两次。然后重新加入3毫升二甲基乙酰胺,并加入100毫克 N3-PEG-NH2 (分子量2000)和35 微升 二异丙基乙胺,充氩气封闭并振摇15小时,然后加入204微升乙醇胺(2mmol),35 微升二异丙基乙胺(2mmol),继续振摇4小时,二甲基乙酰胺清洗玻璃板三次然后吹干。4微升 GST-eGFP (1.4微克/微升)分别与4微升 PF(200微摩尔/升)和4微升 PF-alkyne(200微摩尔/升)室温孵育1.5小时,然后与修饰叠氮的玻璃板在湿润的反应槽进行“点击”化学反应1小时。图5示意了上述过程。玻璃板用PBST(磷酸盐缓冲液,含0.1%Tween 20, pH=7.4)清洗,然后用Pharos FX成像系统进行扫描(激发波长为488nm)。
结果显示在图6中。与PF组相比,PF-alkyne组中的斑点明显更亮,结果表明PF-alkyne被用于将蛋白固定玻璃板上。
将激酶固定到CH-琼脂糖4B珠和激酶活性测试
将42毫克市购的活化的CH-琼脂糖4B珠、8.4毫克N3-PEG-NH2(分子量2000)和5微升二异丙基乙胺添加到500微升二氯甲烷,然后在室温下振摇2小时。
用二氯甲烷洗小珠3遍,然后干燥。将2.1微克小珠添加到10微升PF-alkyne、90微升CH3CN和3微升CuCAAC试剂(“点击”试剂)并且在室温下振摇1小时,用CH3CN洗小珠3遍,然后干燥。将小珠用激酶缓冲液稀释至0.16纳克/微升。在4摄氏度用2微升不同浓度的激酶培养4微升的小珠2小时,然后在分离后,将上清液进行Western印迹分析。再将6微升的激酶缓冲液添加到小珠。作为对照,将相同数量的小珠(没有经过PF-alkyne处理)稀释到0.16纳克/微升。在4摄氏度用2微升不同浓度的激酶培养4微升的小珠2小时。在培养后,通过购自Cisbio Bioassays的基于均相时间分辨荧光(HTRF)的激酶分析来测量激酶活性(使用GraphPad™ Prism 5.0进行数据分析)。
在激酶分析实验中,使用两种GST-标记的激酶:B淋巴酪氨酸激酶(BLK)和淋巴特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK),并且测定其在固定到CH-琼脂糖4B珠后所保留的激酶活性,使用相同数量的未经处理的激酶活性作为参照。激酶活性试验表明固定的BLK在2纳克/微升和4纳克/微升负载浓度下具有约84%和约75%的表观酶活性,而Western印迹分析指出约89%和约96%激酶被固定。因此,在2纳克/微升和4纳克/微升负载浓度下被固定的BLK的保留活性分别为约94%和约78%。对于LCK激酶来说,在1纳克/微升和2纳克/微升负载浓度下被固定的LCK的保留活性分别为约48%和约66%。上述结果表明本发明能够保证提供高活性的被固定的激酶,但是对于每种激酶应用来说,需要进一步优化实验细节。
本发明的化合物特异性地且共价地标记蛋白(例如在酪氨酸-111残基处标记sjGST蛋白)。结合反应是快速的、适度的和有效的。通过将这类分子连接到固体载体,通过直接的、不可逆的且位置选择性结合融合标签如sjGST,可以实现位点特异性的蛋白固定。通过这种标记策略,可以稳定地保持天然蛋白结构和活性。这种一步法可以容易地应用于蛋白芯片和需要有效固定的生物活性的蛋白的高-通过量筛选平台。
Claims (6)
1.式I的化合物:
(式I)
其中,
R1是C1-C12亚烷基,优选C3-C6亚烷基;
R2是C1-C10烷基,优选C1-C3烷基;
R3是H或CH≡C-(C0-C10)烷基,优选CH≡C-(C0-C2)烷基,更优选CH≡C-。
2.权利要求1的化合物,其中所述式I的化合物选自:
和。
3.一种固定蛋白的方法,包括下述步骤:
步骤1:通过共价或非共价相互作用,将权利要求1或2的化合物接枝到固体表面;和
步骤2:通过在酪氨酸残基的共价键,将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上;
或者
步骤1:通过在酪氨酸残基的共价键,使权利要求1或2的化合物与蛋白反应;和
步骤2:通过共价或非共价相互作用,将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。
4.权利要求3的方法,其中所述固体表面包括玻璃、金属、聚合物或纳米材料的表面。
5.权利要求3的方法,其中所述共价或非共价相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。
6.权利要求3的方法,其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-111残基。
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