JP2006514824A - 活性に基づくプローブ，およびその製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は，複数の蛋白質を含む組成物において触媒的に活性な酵素のプロファイルを評価するための組成物および方法を提供する。好ましい態様においては，酵素はヒドロラーゼであり，最も好ましくはシステインプロテアーゼである。本明細書に記載される方法は，活性に基づくプローブ（"ＡＢＰ"）を使用する。これは，ＡＢＰを１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素に結合させるためのアフィニティー成分，標的酵素の活性部位において共有結合を形成するための反応性基，およびＴＡＧ（例えば，検出可能な標識，好ましくは蛍光団）を有する。１またはそれ以上のＡＢＰを，ＡＢＰをサンプル中に存在する標的酵素と結合および反応させる条件下で蛋白質含有サンプルと組み合わせることができる。次に，得られた生成物を用いて，サンプルの活性な酵素プロファイルを評価することができ，および元の複雑な蛋白質混合物中に存在する１またはそれ以上の標的酵素の存在，量，または活性と関連づけることができる。

Description

本発明は一般に，触媒的に活性な酵素，より好ましくはヒドロラーゼ，最も好ましくはシステインプロテアーゼのアフィニティー標識に関する。

蛋白質分解酵素は，広範な種類の生理学的プロセスに関与している。プロテアーゼは一般にその触媒メカニズムにしたがって分類される。セリンプロテアーゼ，システインプロテアーゼ，アスパラギン酸プロテアーゼ，およびメタロプロテアーゼを含む，少なくとも４つの機械的分類が認識されている。システインプロテアーゼは少なくとも３０種類の蛋白質ファミリーの群に分類することができ，例えば，植物プロテアーゼ，例えばパパイン，アクチニジンまたはブロメレイン，いくつかの哺乳動物リソソームカテプシン，細胞質カルパイン（これらはカルシウムにより活性化される），ならびにいくつかの寄生虫プロテアーゼ（例えば，Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａのもの）等が含まれる。カスパーゼ−１（インターロイキン−１−ベータ変換酵素としても知られる）のＸ線構造は，システインプロテアーゼの新たなタイプのフォールディングを明らかにした。システインプロテアーゼの触媒作用は，共有結合中間体の形成を介して進行し，システインおよびヒスチジン残基（Ｃｙｓ２５およびＨｉｓ１５９，パパインの番号付けによる）が関与する。求核基はチオラートイオンであり，これは隣接するＨｉｓ１５９のイミダゾリウム基とのイオン対の形成により安定化される。いずれの工程においても，攻撃求核基はチオラート−イミダゾリウムイオン対である。

システインプロテアーゼは，医療分野で非常に興味が持たれている。パパインファミリーに属するシステインプロテアーゼには，哺乳動物酵素，例えばカテプシンＢおよびＬ（癌の成長および転移に関与する），およびカテプシンＫ（骨の分解および骨粗鬆症における関与が重要である）が含まれる。他のシステインプロテアーゼ，例えば，Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉからのシャーガス病を引き起こすクルジパイン，およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからのマラリアを引き起こすファルシパインは，寄生虫と宿主との相互作用に必須であり，したがって，阻害の魅力的な標的であるため，寄生虫と戦うのに重要な酵素である。他のシステインプロテアーゼ，例えば，レグマインファミリーに属するものは，抗原提示において鍵となる役割を果たすことが示されている。カスパーゼファミリーのシステインプロテアーゼはまた，アポトーシスの鍵となるメディエータとして非常に興味が持たれている。病原性細菌のいくつかのシステインプロテアーゼ，例えば，Ｐｏｒｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからの歯周炎に重要なギンギパイン，およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのストレプトパインは，毒性因子であり，感染した宿主に重篤な問題を引き起こす。

したがって，システインプロテアーゼは，治療薬の同定のための重要な標的であると考えられてきた。

発明の概要
本発明は，複数の蛋白質を含む組成物における１またはそれ以上の触媒的に活性な酵素のプロファイルを評価するための組成物および方法を提供する。好ましい態様においては，酵素は１またはそれ以上のヒドロラーゼであり，特に好ましい態様においては，ヒドロラーゼは１またはそれ以上のシステインプロテアーゼである。本明細書に記載される方法は，活性に基づくプローブ（"ＡＢＰ"）を用いる。これは，ＡＢＰが１またはそれ以上のシステインプロテアーゼと結合することを指示するアフィニティー成分，ＡＢＰが結合した後に標的酵素と共有結合を形成するための反応性基，およびタグ（例えば，検出可能な標識，好ましくは蛍光団）を有する。１またはそれ以上のＡＢＰを，ＡＢＰとサンプル中に存在する標的酵素とが結合し反応するための条件下で，蛋白質含有サンプルと組み合わせる。好ましい態様においては，反応性基は，標的酵素のアミノ酸と反応して，コンジュゲート（すなわち，共有結合したＡＢＰ−標的酵素複合体）を形成する。次に，得られた生成物を用いて，サンプルの活性な酵素プロファイルを評価し，元の複雑な蛋白質混合物中に存在する１またはそれ以上の活性な標的システインプロテアーゼ，および／または他の標的酵素の存在，量または活性と関連づけることができる。

“ヒドロラーゼ”とは，共有結合の加水分解を触媒する酵素を意味する。そのような酵素は，ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ｊｃｂｎ／）の，ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＥＣ３．Ｘにより分類されている。本明細書において用いる場合，“プロテアーゼ”および“蛋白質分解酵素”との用語は，蛋白質およびペプチド中のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を表す。

本明細書において用いる場合，“システインプロテアーゼ”との用語は，システイン残基を触媒活性に利用する蛋白質分解酵素を表す。蛋白質分解反応における求核基はチオラートイオンであり，これはヒスチジン（例えばパパインの場合にはＨｉｓ１５９）のイミダゾリウム基とのイオン対の形成により安定化される。両方の工程において，攻撃求核基はチオラート−イミダゾリウムイオン対である。パパインは，原型であり，ファミリーのメンバーで最もよく研究されているものである。

システインプロテアーゼには，限定されないが，パパイン，カスパーゼ，およびいくつかのカテプシン，例えば，カテプシンＢ，Ｈ，Ｌ，Ｋ，Ｏ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，およびＸ，アナナイン，パパイン，キモパパイン，および果実ブロメラインが含まれる。カスパーゼもまたシステインヒドロラーゼである。カスパーゼ−１はシステインヒドロラーゼであり，いくつかの他の名前，例えば，インターロイキン１β−変換酵素，プロテアーゼＶＩＩ，プロテアーゼＡ，インターロイキン１β前駆体プロテアーゼ，インターロイキン１変換酵素，インターロイキン１β変換エンドペプチダーゼ，インターロイキン−１βコンベルターゼ，インターロイキン−１β変換酵素，インターロイキン−１β前駆体プロテアーゼ，プロインターロイキン１βプロテアーゼ，前駆体インターロイキン−１β変換酵素，プロ−インターロイキン１βプロテアーゼとしても知られる。

第１の観点においては，本発明は，複雑な蛋白質混合物における酵素プロファイルを決定する方法および組成物に関する。これらの方法は，複雑な蛋白質混合物を，ＡＢＰと触媒的に活性な標的酵素，好ましくは触媒的に活性なヒドロラーゼ，最も好ましくは触媒的に活性なシステインプロテアーゼと反応する条件下で，１またはそれ以上の異なるＡＢＰと接触させ，このことにより，ＡＢＰと活性な標的酵素との１またはそれ以上のコンジュゲートが形成されることを含む。好ましい態様においては，それぞれのＡＢＰは１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素（以下に定義される）と特異的に反応する。それぞれのＡＢＰは，好ましくは，ＴＡＧにコンジュゲート化されたアフィニティー成分，例えば検出可能な標識，およびＡＢＰがその標的酵素と結合したときに標的酵素と反応する反応性基を含む。次に，以下に記載されるスクリーニングおよび／または同定方法により酵素プロファイルを分析することができる。特に好ましいＡＢＰも下記に説明される。

好ましい態様においては，標的酵素は，システインプロテアーゼ，例えば，カスパーゼ，またはいずれかのカテプシン，例えば，Ｂ，Ｈ，Ｌ，Ｋ，Ｏ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，またはＸである。カテプシンＬはリソソームシステインプロテアーゼであり，ヒト黒色腫細胞におけるその過剰発現は，その腫瘍原性を高め，その表現型を非転移性から高度に転移性にスイッチさせる。リソソームシステインプロテアーゼであるカテプシンＢは，腫瘍の進行に関与し，正常な骨格筋細胞分化の制御に重要な役割を果たすと考えられている。カテプシンＳはリソソームシステインプロテアーゼであり，多くの炎症性疾病において役割を有すると考えられている。カテプシンＫは，システインプロテアーゼのパパインファミリーのメンバーであり，骨粗鬆症における骨の変性に役割を有すると考えられている。カテプシンＶは胸腺および精巣特異的システインプロテアーゼであり，免疫系および癌において中心的な役割を果たすと考えられている。Ｄ．Ｂｒｏｍｍｅ，Ｚ．Ｌｉ，Ｍ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．Ｍｅｈｌｅｒ（１９９９）“Ｈｕｍａｎ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｖ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：２３７７−２３８５。当業者は，多くのカテプシンが単離され，特性決定され，その機能が決定されていることを理解するであろう。これらの他のカテプシンもまた，本発明における好ましい標的プロテアーゼとして企図される。

アポトーシス（“プログラムされた細胞死”とも称される）は，種々の刺激，例えば，リガンド／レセプター相互作用（例えば，ＦＡＳレセプター／ＦＡＳリガンド），ストレスに対するミトコンドリア応答，および細胞毒性Ｔ細胞により誘発される。カスパーゼは，アポトーシスに関与するいくつかの酵素を含むシステインプロテアーゼの群である。カスパーゼは，蛋白質分解カスケードにおいてアポトーシスシグナルを伝達する。カスパーゼは，他のカスパーゼを切断および活性化し，次にこれは他の細胞標的を分解し，このことは細胞死につながる。カスパーゼ１−１０が同定され，配列決定され，クローニングされている。カスケードの上流側のカスパーゼには，カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９が含まれる。カスパーゼ−８はＦＡＳ等のデスドメインを有するレセプターとの応答に関与する最初のカスパーゼである。ミトコンドリアのストレス経路はミトコンドリアからのチトクロームｃの放出により開始し，次にこれはＡｐａｆ−１と相互作用して，カスパーゼ−９の自己切断および活性化を引き起こす。カスパーゼ−３，−６および−７は，上流のプロテアーゼにより活性化される下流のカスパーゼであり，それ自身に作用して細胞標的を切断する。これらのおよび他のカスパーゼもまた，本発明において好ましい標的プロテアーゼとして企図される。

好ましい態様においては，ＡＢＰ−酵素コンジュゲートは，１またはそれ以上のコンジュゲートを隔離することにより（例えば，ＡＢＰのタグ部分に結合するレセプターに結合することにより，または“つなげられた”ＡＢＰ）を用いることにより，クロマトグラフィー法により，質量分析法により，および／または他の手段，例えば電気泳動により，複雑な蛋白質混合物の他の成分から分離することができる。

さらに別の態様においては，複雑な蛋白質混合物と１またはそれ以上のＡＢＰとの反応の後に，得られたＡＢＰ−標的酵素コンジュゲートを蛋白質分解的に消化して，ＡＢＰ−標識ペプチドを得ることができる。この消化は，コンジュゲートが固相に隔離されているときに生じてもよく，または溶液中で遊離しているときに生じてもよい。好ましい態様においては，１またはそれ以上のＡＢＰは，各標的酵素が，最も好ましくは標的酵素中の単一の別々の場所で，単一のＡＢＰとコンジュゲートを形成するように選択される。すなわち，各コンジュゲートから単一のＡＢＰ標識ペプチドが生ずる。１またはそれ以上のＡＢＰ−標識ペプチドの濃縮，分離，または同定は，液体クロマトグラフィーおよび／または電気泳動を用いて行うことができる。さらに，質量分析を利用して，フラグメントを分離するか，および／または分子量および／またはアミノ酸配列により１またはそれ以上のＡＢＰ−標識ペプチドを同定することができる。特に好ましい態様においては，ＡＢＰ−標識ペプチドから得られた配列情報を用いて，ペプチドが由来する元の酵素を同定することができる。これらの観点の変形には，例えば，異なるタグを有するＡＢＰを用いて，または，分析が質量分析を含む場合には異なる同位体組成を有するＡＢＰを用いて，２またはそれ以上のプロテオームを比較することが含まれうる。

好ましい態様においては，ＡＢＰおよび反応条件は，触媒的に活性な標的酵素が標識される相対的能力がその標的酵素の触媒活性の相対的レベルに依存するように選択される。そのような標識から得られるシグナルは，プロテオーム混合物中の標的酵素の触媒活性と相関しうる。あるいは，ＡＢＰは，特定の標的酵素の触媒活性のレベルに関わらず，すべての触媒的に活性な形の１またはそれ以上の標的酵素が標識されるような条件下で用いてもよい。例えば，反応時間は，標識反応が実質的に完了するように延長することができる。そのような標識から得られるシグナルは，プロテオーム混合物中の種々の活性な標的酵素の相対的触媒活性とは無関係であろう。

さらに別の観点においては，本発明は，本明細書に記載される方法および組成物を用いて，好ましくは２またはそれ以上の複雑な蛋白質混合物において，１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素の存在，量，および／または相対的触媒活性を比較する方法に関する。種々の態様においては，これらの方法は，以下の工程の１またはそれ以上を含む：１またはそれ以上の複雑な蛋白質混合物を１またはそれ以上のＡＢＰと接触させ，ここで，ＡＢＰは，それぞれの複雑な蛋白質混合物中に存在する１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素，好ましくは触媒的に活性な標的ヒドロラーゼ，最も好ましくは触媒的に活性な標的システインプロテアーゼに特異的に結合し；この接触工程の次に，複雑な蛋白質混合物を組み合わせて，組み合わせられた複雑な蛋白質混合物を形成し；この組み合わせの前および／または後に，複雑な蛋白質混合物の１またはそれ以上の隔離されていない成分を除去する。次に，以下に記載されるスクリーニングおよび／または同定方法により分析することにより，標的酵素プロファイルを決定することができる。

好ましい態様においては，本明細書に記載される方法および組成物は，調べるべき疾病組織の１またはそれ以上のサンプルを採取し，本明細書に記載される方法および組成物を用いて組織サンプルのそれぞれのプロファイルを決定することにより，疾病組織の触媒的に活性な標的酵素プロファイル，好ましくは触媒的に活性な標的ヒドロラーゼプロファイル，最も好ましくは触媒的に活性な標的システインプロテアーゼプロファイルを決定するために適用される。特に好ましい態様においては，疾病組織の触媒的に活性な標的酵素プロファイルを正常なサンプルのものと比較して，２つのサンプルのプロファイルの相違を決定することができる。好ましい態様においては，疾病組織は骨組織サンプル，腫瘍組織，または胸腺組織である。別の態様においては，標的寄生虫生物の触媒的に活性な標的酵素プロファイルを決定することができる。例えば，生きている生物（例えば，哺乳動物または植物）において，または環境中において，ＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの触媒的に活性な標的システインプロテアーゼプロファイルを決定し，これを用いてこれらの寄生虫と最もよく戦う方法についての情報を提供することができる。次に，得られたプロファイルに基づいて，特定の酵素阻害剤を選択することができる。

さらに別の観点においては，本発明は，試験サンプルにおいて疾病を検出する方法および組成物に関する。好ましい態様においては試験サンプルは細胞または組織サンプルである。特に好ましい態様においては，組織サンプルは新生物サンプルであり，疾病は癌である。この方法は，試験サンプルの触媒的に活性な標的酵素プロファイル，好ましくは触媒的に活性な標的ヒドロラーゼプロファイル，最も好ましくは触媒的に活性な標的システインプロテアーゼプロファイルを決定し；試験サンプルのプロファイルを既知の非疾病サンプルおよび／または既知の疾病サンプルの適当なプロファイルと比較し；そして，試験サンプルプロファイルが疾病状態を示すか否かを判定することを含む。“非疾病”サンプルとは，目的とする特定の疾病を示さないとして識別される細胞または組織のサンプルである。これは好ましくは細胞または組織の正常な健康なサンプルである。

別の観点においては，本発明は，試験化合物の１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素に対する阻害能力を決定する方法を提供する。この方法は，１またはそれ以上のＡＢＰを試験化合物および標的酵素を含む試験サンプルと接触させ；ＡＢＰが試験サンプル中に含まれる標的酵素と反応するようにし；そしてＡＢＰが試験サンプル中の標的酵素と共有結合する能力を示すシグナルを検出することを含む。好ましい態様においては，この共有結合する能力は，試験サンプル中の標的酵素の活性のレベルを示す。

好ましい態様においては，この活性のレベルを試験化合物の非存在下における標的酵素の活性のレベルと比較する。そのような方法により，試験化合物の標的酵素に対する阻害および／または刺激能力を決定することができる。“阻害能力（ｐｏｔｅｎｃｙ）”とは化合物の存在が標的酵素触媒活性の阻害を引き起こす程度であり，“刺激能力”とは，化合物の存在が標的酵素触媒活性の増加を引き起こす程度である。

さらに別の観点においては，本発明は，記載される方法を実施するためのキットを提供する。キットは，本発明の方法を実施するために記述される材料の１またはそれ以上を含む。キットは，パッケージ中で固相および／または液相（例えば，提供される緩衝液）中に１またはそれ以上のＡＢＰを含むことができる。キットはまた，本発明の方法を実施するための溶液を調製するための緩衝液および液体を１つの容器から別の容器に移すためのピペットを含むことができる。“パッケージ”とは，ＡＢＰを含む容器を包む材料を意味する。好ましい態様においては，パッケージは箱または包装であってもよい。キットはまた，パッケージ中には含まれないがパッケージの外側に貼付けられた部材，例えばピペットを含んでいてもよい。

上述した本発明の概要は，限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の詳細な説明，ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

本発明の方法および組成物は，複雑な蛋白質混合物中に存在する１またはそれ以上の酵素の変化の同定において，向上した簡便性および正確性を提供することができる。これらの方法および組成物は，触媒的に活性な標的酵素，好ましくは触媒的に活性な標的ヒドロラーゼ，および最も好ましくは触媒的に活性な標的システインヒドロラーゼに結合する，活性に基づくプローブ（"ＡＢＰ"）に関連する。本明細書に記載されるプロファイリング方法は，複雑な蛋白質混合物中における触媒的に活性な標的酵素の同定につながる多数の工程を有することができる。複雑な蛋白質混合物，好ましくは２またはそれ以上の複雑な蛋白質混合物，例えば，サンプルおよび対照は，天然起源から取得したままで用いてもよく，あるいは加工して，例えば，妨害成分を除去するか，および／または触媒的に活性な標的酵素成分を濃縮して用いてもよい。分析すべきそれぞれの複雑な蛋白質混合物を，反応条件下で少なくとも１つのＡＢＰと組み合わせて，１またはそれ以上の触媒的に活性な標的酵素とのコンジュゲートを生成する。２またはそれ以上の複雑な蛋白質混合物において用いられるＡＢＰは，標識された複雑な蛋白質混合物を直接比較するために（例えば，キャピラリー電気泳動装置の同じキャピラリーまたは電気泳動ゲルの同じレーン，または質量分析器において），タグ成分および／または同位体組成物の選択において種々のものでありうる。本明細書に記載される分析プラットフォームは，同定および定量のために，液体クロマトグラフィーおよび／または電気泳動，および／または質量分析を用いて濃縮および分析する方法に関して種々のものでありうる。プラットフォームの選択は，サンプルのサイズ，サンプルのスループットの速度，同定のモード，および定量の必要性およびそのレベルにより影響される。

本明細書に記載される組成物および方法は，大部分は生物学的サンプルを用いて使用することができ，これは，ＡＢＰと反応させる前に加工してもよい。“生物学的サンプル”とは，細胞，組織，または生物から得られるサンプルを意味する。生物学的サンプルの例としては，細胞（例えば，哺乳動物細胞，細菌細胞，培養細胞，ヒト細胞，植物細胞等）から特に溶解物として得られるもの，生物学的液体（例えば，血液，血漿，血清，尿，胆汁，唾液，涙，脳脊髄液，水性または硝子体液，または任意の身体分泌物），漏出液または滲出液（例えば，感染または炎症の膿瘍または他の部位から得られる液体），関節から得られる液体（例えば，正常な関節または疾病，例えば，慢性関節リウマチ，変形性関節症，痛風または敗血症性関節炎に罹患した関節から得られる滑液）から得られる蛋白質が挙げられる。

生物学的サンプルは，任意の臓器または組織（生検または解剖標本を含む）から得ることができ，細胞（初代細胞，継代または培養した初代細胞，細胞株，特定の培地でコンディションした細胞）または細胞によりコンディションされた培地を含んでいてもよい。好ましい態様においては，生物学的サンプルは無傷の細胞を含まない。所望の場合には，生物学的サンプルは，溶解，抽出，亜細胞分画等により予め加工してもよい。Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．１４７−２３８を参照。

特に興味深いものは，“複雑な蛋白質混合物”であるサンプルである。本明細書において用いる場合，この句は，蛋白質（またはその活性）の特定の分布に興味が持たれる，少なくとも約２０種類，より一般的には少なくとも約５０種類，好ましくは少なくとも約１００種類またはそれ以上の異なる蛋白質を有する蛋白質混合物を表す。そのような複雑な蛋白質混合物の例はプロテオームであり，これは以下に定義される。複雑な蛋白質混合物は，特に正常または異常な細胞から得ることができ，ここで，異常性は，治療，状態，疾病等に関する情報を与えるものであり，本発明の方法を用いて分析することができる。

本明細書において用いる場合，“プロテオーム”との用語は，生物学的サンプルから得られる複雑な蛋白質混合物を表す。好ましいプロテオームは，生物学的サンプル（例えば，細胞，組織，臓器，または溶解物を得た生物；血清または血漿等）中に存在する蛋白質の全レパートリーの少なくとも約５％，好ましくは少なくとも約１０％，より好ましくは少なくとも約２５％，さらにより好ましくは約７５％，および一般には９０％またはそれ以上，あるいは，生物学的サンプルから得ることができる蛋白質の全レパートリーを含む。すなわち，プロテオームは，無傷の細胞，溶解物，ミクロソーム画分，オルガネラ，部分的に抽出された溶解物，生物学的液体，組織，臓器等から得ることができる。プロテオームは，一般に少なくとも約２０種類の異なる蛋白質，通常は少なくとも約５０種類の異なる蛋白質，およびほとんどの場合１００種類またはそれ以上の異なる蛋白質を有する蛋白質の混合物であろう。

一般に，サンプルは，少なくとも約１ｘ１０^-11ｇの蛋白質を有し，１ｇまたはそれ以上の蛋白質を，好ましくは約０．１−５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で有するであろう。スクリーニングの用途のためには，サンプルは，典型的には，約１ｘ１０^-11ｇの蛋白質から約１ｘ１０^-3ｇの蛋白質，好ましくは約１ｘ１０^-6ｇの蛋白質から１ｘ１０^-4ｇの蛋白質であろう。ＡＢＰ標識標的酵素の同定のためには，サンプルは，典型的には約１ｘ１０^-9ｇの蛋白質から約１ｇの蛋白質，好ましくは約１ｘ１０^-4ｇの蛋白質から１ｘ１０^-1ｇの蛋白質であろう。この文脈において，“約”との用語は，示される量の＋／−１０％を表す。

サンプルは，所望により，適当な緩衝液濃度およびｐＨに調節することができる。次に，１またはそれ以上のＡＢＰを，それぞれ約１ｎＭ−２０ｍＭ，好ましくは１０ｎＭ−１ｍＭ，最も好ましくは１０ｎＭ−１００μＭの範囲の濃度で加えることができる。反応混合物を，約５−４０℃の範囲，好ましくは約１０℃−約３０℃，最も好ましくは約２０℃の温度で，一般に反応が実質的に完了するような時間，通常は約０．１１−６０分間インキュベートした後，反応を停止することができる。

本発明の１つの観点においては，本発明の方法は，生物学的液体，細胞または組織において，触媒的に活性な酵素，好ましくは触媒的に活性なヒドロラーゼ，最も好ましくは触媒的に活性な標的システインヒドロラーゼを定量的に測定する方法を提供する。さらに，同じ一般的戦略を広げて，異なる標的特異性を有するＡＢＰを用いることにより，標的酵素の量および／または活性のプロテオームワイドの定性的および定量的分析を達成することができる。本発明の方法および組成物を用いて，複雑な蛋白質混合物中に存在する少量の触媒的に活性な標的酵素を同定することができ，特定の群またはクラスのシステインプロテアーゼ，例えば，膜または細胞表面システインプロテアーゼ，またはオルガネラ，亜細胞画分，または成果化学的画分，例えば免疫沈殿物中に含まれるシステインプロテアーゼを選択的に分析することができる。さらに，これらの方法は，異なる状態の細胞において発現される触媒的に活性な標的酵素の相違を分析するために適用することができる。例えば，本明細書に開示される方法および試薬は，疾病状態，例えば，癌，骨の変性または脱石灰，または他の疾病状態を示す１またはそれ以上の触媒的に活性なシステインプロテアーゼの存在または非存在の検出のための診断アッセイに用いることができる。

本発明の方法は，種々の目的に用いることができる。この方法は，疾病の診断，薬剤等の外部の物質に対する細胞の応答，新生物等の疾病段階の判定，細胞の分化および成熟の識別，新規蛋白質の同定，薬剤の副作用の判定，薬剤の選択性の判定，ある種の遺伝子型に特異的な薬剤に対する応答の同定（例えば，個体におけるアレルの相違），コンビナトリアルライブラリからの有用なＡＢＰの同定等において用いることができる。

ある態様においては，このシステムは触媒的に活性な形の酵素または酵素の群に特異的な，通常はそのような標的酵素上の活性部位に向けられたＡＢＰを用い，活性に基づくＡＢＰの特異性およびアッセイすべき蛋白質の群の中における多様性によって，１つのＡＢＰまたはＡＢＰの混合物を組み合わせる。

“活性に基づくプローブ”（"ＡＢＰ"）との用語は，触媒的に不活性な酵素と比較して触媒的に活性な標的酵素と特異的に反応する分子を表す。ＡＢＰは，コンビナトリアルケミストリおよび／または合理的設計法を用いて設計し合成することができる。蛍光成分がリガンドとして作用しうるＡＢＰの設計戦略の詳細な説明は，ＰＣＴ出願，ＰＣＴ／ＵＳ０２／０３８０８，標題"Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｂｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ"（代理人書類番号０６３３９１−０２０２），２００２年２月５日出願，ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１８７，ＷＯ０１／７７６８４，標題"Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ"およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６７，ＷＯ０１／７７６６８，標題"Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ"（それぞれ，すべての表，図面および請求の範囲を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。これらに記載されるように，設計戦略の目的は，非特異的ターゲティングを最少にしながら，標的とする活性な蛋白質の群と共有結合的に反応しうるＡＢＰを提供することである。活性に基づくプローブはライブラリとして存在してもよい。ライブラリとは，特定の個々のサンプルを分析するために提供される複数のそのようなＡＢＰを表す。そのようなライブラリは，同時にまたは続けてサンプルと接触させてもよく，あるいは，ライブラリの１またはそれ以上のメンバーと接触させるためにサンプルを別々のアリコートに分けてもよい。ライブラリはまた，"つなげられた"ＡＢＰとして，１またはそれ以上の固体表面上に存在していてもよく，これは以下に説明する。

本発明においては，ＡＢＰと非標的蛋白質（または不活性な標的蛋白質）との反応がないことは必要ではない。そうではなく，ＡＢＰが，同等の量の非標的（または触媒的に不活性な）標的蛋白質と比較したときに，標的酵素（好ましくは触媒的に活性な標的システインプロテアーゼ）のＡＢＰ標識から少なくとも約２倍の量のシグナルを与える場合に，ＡＢＰは，標的酵素“に特異的である”，“と特異的に反応する”，または“に特異的に結合する”ものとして定義される。好ましくは，標的酵素から得られるシグナルは，同等の量の非標的（または不活性）蛋白質から得られるものより，少なくとも約５倍，好ましくは１０倍，より好ましくは２５倍，さらにより好ましくは５０倍，最も好ましくは１００倍またはそれ以上高いであろう。

本明細書において用いる場合，"標的酵素"との用語は，ＡＢＰが標的酵素に結合したときにその活性部位が１またはそれ以上のＡＢＰで標識される酵素を表す。システインプロテアーゼ，特にＥｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ 番号３．４．２２．として分類されるものは好ましい標的酵素である。ＡＢＰは，触媒的に活性なシステインプロテアーゼに特異的であるように，すなわち，システインプロテアーゼではない触媒的に活性な酵素がＡＢＰと特異的に反応しないように，提供することができる。あるいは，ＡＢＰは，より広い反応性を有するように，すなわち，触媒的に活性なシステインプロテアーゼと特異的に反応するが，他の触媒的に活性な酵素，例えば他のヒドロラーゼとも反応するように，提供することができる。特に好ましい標的システインプロテアーゼには，カスパーゼおよびカテプシン，例えば，カテプシンＢ，Ｌ，Ｋ，Ｓ，Ｔ，またはＸが含まれる。

“触媒的に活性な標的酵素”，“触媒的に活性な標的ヒドロラーゼ”または“触媒的に活性な標的システインプロテアーゼ”との用語は，その天然のコンフォメーションをとっており，その触媒機能を実行するために，それが通常相互作用する物質，例えば，酵素と基質および／または補因子等と相互作用することができる，それぞれ標的酵素，ヒドロラーゼ，またはシステインプロテアーゼを表す。

本明細書において用いる場合，“不活性化された”との用語は，元のサンプル中で触媒的に活性であった標的酵素の少なくとも一部が不活性化されるように処理されたサンプルを表す。“不活性な酵素”は，種々のメカニズム，例えば，変性，阻害剤の共有的または非共有的な結合，変異，二次的プロセシング，例えば，リン酸化または脱リン酸化等から生じうる。本明細書において記載されるような，ヒドロラーゼまたはシステインプロテアーゼ等の酵素の機能的状態は，同じ酵素の大部分のレベルと区別することができる。不活性化サンプルを用いて，本明細書において記載されるように，ＡＢＰの活性特異的な結合を評価することができる。

本明細書において用いる場合，“未処理”との用語は，１またはそれ以上の条件に曝露されていないサンプルを，そのような条件に曝露されていない第２のサンプルと比較して表す。未処理サンプルは，不活性化されていないサンプルでありうる。あるいは，未処理サンプルは，スクリーニングアッセイにおいて１またはそれ以上の分子（例えば薬剤リード化合物）に曝露されていないものである。すなわち，本明細書に記載される組成物および方法を用いて，１またはそれ以上の化合物（例えば，薬剤発見におけるリード化合物）で処理した細胞，組織，または生物から得た複雑な蛋白質混合物を，そのように処理されていない細胞，組織，または生物から得た複雑な蛋白質混合物と比較することができる。２つのサンプルからのＡＢＰ標識蛋白質および／またはペプチドを，相対的シグナル強度について比較することができる。そのような方法は，治療計画による活性な蛋白質含量の変化を示すことができる。さらに，そのような方法はまた，特定の蛋白質の直接阻害により作用する治療（“一次的効果”）と，例えば蛋白質の発現を変更することにより上流の活性な蛋白質成分に影響を及ぼす治療（“二次的効果”）とを区別することができる。

蛋白質の“活性部位”とは，蛋白質，例えば，結合分子，例えば，基質またはレシプロリガンドが結合して，蛋白質，基質，および／またはリガンドが変化する，酵素分子または表面膜レセプターの表面上の領域を表す。レセプターについては，コンフォメーションが変化する場合もあり，蛋白質がリン酸化または脱リン酸化または他のプロセシングに感受性となる場合もある。ほとんどの場合，活性部位は，基質および／または補因子が結合する部位，基質と補因子との触媒反応が進行する部位；２つの蛋白質が複合体を形成する部位，例えば，Ｇ蛋白質が表面膜レセプターに結合する部位，２つのクリングル構造が結合する部位，転写因子が他の蛋白質に結合する部位；または蛋白質が特定の核酸配列に結合する部位，等の酵素の部位であろう。

ＡＢＰの標的酵素に対するアフィニティーに関しては，ＡＢＰが標的酵素と共有結合するときに，無視しうるオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が存在するため，ＡＢＰと標的酵素とのオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）に関心がもたれるであろう。１またはそれ以上のＡＢＰの全量と比較して標的酵素を化学量論的量より少なくし，次にＡＢＰのそれぞれに対するコンジュゲートの相対的な量を測定することにより，ＡＢＰ間の相対的オンレートを決定することができる。このようにして，ＡＢＰのそれぞれから活性な標的プロテアーゼに向けられる相対的活性の測定値を得ることができ，これは，ＡＢＰの標的プロテアーゼに対する結合アフィニティーでないとしても，本発明の目的にとっては，アフィニティーであると考えられる。

活性に基づくプローブの構造
本発明の活性に基づくプローブは，リンカー成分によりタグに連結された頭部（ｗａｒｈｅａｄ）を含む。以下に説明されるように，頭部，リンカー成分（“Ｌ”），およびタグ（“ＴＡＧ”）のそれぞれは，独立して，異なる標的酵素特異性を与えるように選択される。ＡＢＰのこれらの成分のそれぞれは，以下に詳細に説明される。好ましい態様においては本発明は，サンプルにおいて触媒的に活性なシステインプロテアーゼを検出および／または測定するためのＡＢＰを提供する。

特に好ましいＡＢＰは以下の構造：

［式中，
各Ｒ₁およびＲ₂は，独立して，水素またはアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリールまたはアルキルアリール基であり，任意に，Ｎ，Ｏ，またはＳからなる群より選択される１またはそれ以上の複素原子を含んでいてもよく；
ＲＧは，触媒的に活性な標的酵素と共有結合することができる反応性基であり，好ましくは，ＡＢＰと標的酵素との間に共有結合が形成されるときに失われる脱離基"ＬＧ"を含み；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
Ｌはリンカー成分であり；
ｎは０−４の整数である］
を有するか，またはその薬学的に許容しうる塩または複合体である。

Ｒ₁およびＲ₂は，独立して，水素または任意のアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，またはアルキルアリール基であることができ，これは任意にＮ，Ｏ，またはＳからなる群より選択される１またはそれ以上の複素原子を含んでいてもよい。種々の態様においては，Ｒ₁およびＲ₂は，１−１００個の原子，１−５０個の原子，または１−２０個の原子を有するであろう。最も好ましくは，Ｒ₁およびＲ₂は，約１−６０個の原子，通常は１−３０個の原子を有し，ここで，原子は，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ等，特にＣ，ＮおよびＯを含み，これは一般に約１−１２個の炭素原子および約０−８個，通常は０−６個の複素原子を有する。上述した原子の数は，特に示さない限り，基中の原子の数に関しては水素が除かれている。Ｒ₁およびＲ₂は，好ましくは，独立して，水素または直鎖または分枝鎖のＣ_1-6アルキルであり，Ｎ，Ｏ，またはＳからなる群より選択される１−３個の複素原子を含んでいてもよく；または，Ｃ_0-6アルキルアリール，Ｃ_0-6アルキルヘテロアリール，またはＣ_0-6アルキルフェニルである。最も好ましくは，Ｒ₁およびＲ₂は，独立して，２０個の一般的なα−アミノ酸の側鎖から選択される：

（注：プロリンは縮合側鎖および主鎖を有するため，側鎖だけではなく全体の構造が示されている）。

ＴＡＧは，好ましくは蛍光団であり，最も好ましくは蛍光団はローダミン，例えば，ＴＡＭＲＡ，または他の蛍光色素であるが，当業者は化学反応を進行させてシグナルを与える任意の検出可能なタグ（他の蛍光団を含む）が本発明において機能することを理解するであろう。

Ｌは，好ましくは，−Ｎ（Ｒ）−，−Ｏ−，−Ｓ−または−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−から選択される１−２０個の骨格原子のアルキルまたはヘテロアルキル鎖であり，ここで，各Ｒは，独立して，Ｈ，または直鎖または分枝鎖の−Ｃ_1-6アルキルである。リンカー成分Ｌは，好ましくは，１０個の炭素を有し，最も好ましくは約１０炭素の炭化水素鎖である。リンカー成分はまた，炭素以外の原子，例えば，酸素，窒素，リン，またはイオウを含んでいてもよい。特に好ましいリンカーＬは，１−５個のオキシアルキレン基のポリオキシアルキレン（例えば，ポリオキシエチレン：−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）鎖である。当業者は，ＡＢＰが反応および共有結合の形成のために反応性基を標的酵素上の反応性化学基の近くにもたらすことができるかぎり，リンカー成分は多くの態様を有しうることを理解するであろう。

最も好ましい態様においては，ｎ＝０または１である。

本明細書において用いる場合，“頭部（ｗａｒｈｅａｄ）”との用語は，標的酵素の活性部位に向けられ，これと結合するＡＢＰの部分を表す。頭部は，反応性基（“ＲＧ”）およびアフィニティー成分（“Ｒ”）を含む。アフィニティー成分（Ｒ）とは，反応性基とコンジュゲート化しているか，または蛋白質標的に対する結合アフィニティーを増強させるか，および／または頭部の結合プロファイルを変化させるリンカー成分と会合している化学基を表し，これは単一の原子であってもよい。アフィニティー成分は，好ましくは，１キロダルトン未満の質量である。

反応性基ＲＧは，ＡＢＰが標的酵素に結合するときに標的酵素と共有結合しうる任意の基であることができる。好ましくは，ＲＧは，ＡＢＰと標的酵素との間に共有結合が形成される際に失われる脱離基"ＬＧ"を含む。最も好ましくは，反応性基ＲＧはフェノキシまたはベンジルオキシ誘導体である。種々の好ましい態様においては，反応性基ＲＧは以下のいずれかの構造：

を有し，ここで，ＬＧは以下の構造：

のいずれかを有し，最も好ましくは以下の群：

から選択される。

本発明のＡＢＰにおいて用いられる例示的なＲＧには，フェノキシおよびベンジルオキシメチルケトン誘導体，アルファ−ハロケトン，およびアリールチオールメチルケトンが含まれる。

“リンカー成分”との用語は，１つの成分を別の成分に連結するために用いられ，２またはそれ以上の成分の間の共有結合として働く原子の結合または鎖を表す。多くの場合，合成戦略は連結のための官能化部位を含むことができるため，官能基は，連結成分の選択の利点を有することができる。リンカー成分の選択により，ＡＢＰの特異性および／または物理学的特性（例えば溶解性）が変わることが示されている。例えば，Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：４００５−１５を参照。例えば，アルキレンリンカー成分および繰り返しオキシアルキレン構造を含むリンカー成分（ポリエチレングリコール，すなわち“ＰＥＧ”）は，異なる特異性を有し，異なる蛋白質プロファイルを与える。すなわち，当業者は，特定の蛋白質または蛋白質クラスに対するＡＢＰの追加の特異性を得るために，ＡＢＰのリンカー成分を選択することができる。

リンカー成分としては，例えば，０−３個の不飽和脂肪族の部位を有する，エーテル，ポリエーテル，ジアミン，エーテルジアミン，ポリエーテルジアミン，アミド，ポリアミド，ポリチオエーテル，ジスルフィド，シリルエーテル，アルキルまたはアルケニル鎖（直鎖または分枝鎖，その一部は環状であってもよい），アリール，ジアリールまたはアルキル−アリール基が挙げられる。アミノ酸およびオリゴペプチドは通常は好ましくないが，これらを用いる場合には，通常は２−３炭素原子のアミノ酸，すなわち，グリシンおよびアラニンを用いる。リンカー成分中のアリール基は，１またはそれ以上の複素原子（例えば，Ｎ，ＯまたはＳ原子）を含むことができる。リンカー成分は，結合以外である場合には，約１−６０個の原子，通常は１−３０個の原子を有し，ここで，原子には，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ等，特にＣ，ＮおよびＯが含まれ，通常は約１−１２個の炭素原子および約０−８個，通常は０−６個の複素原子を有する。上述した原子の数については，特に記載しない限り，基中の原子の数に関して水素は含まれない。

リンカー成分は，その機能によって種々のものであることができ，例えば，アルキレンオキシおよびポリアルキレンオキシ基（アルキレンは２−３個の炭素原子のものである），メチレンおよびポリメチレン，ポリアミド，ポリエステル等が含まれる。ここで，各モノマーは，一般に，１−６個，より一般的には１−４個の炭素原子のものであろう。オリゴマーは，一般に約１−１０個，より一般的には１−８個のモノマーユニットを含む。モノマーユニットは，アミノ酸（天然に生ずるものおよび合成のもの），オリゴヌクレオチド（天然に生ずるものおよび合成のもの），縮合ポリマーモノマーユニットおよびこれらの組み合わせでありうる。

本明細書において用いる場合，“ＴＡＧ”との用語は，ＡＢＰの反応性成分と標的プロテアーゼとの反応のプロセスの間に保持されるようにＴＡＧに強く結合している他の任意の成分との組み合わせで，ＡＢＰを検出および／または捕獲するために用いることができる分子を表す。ＴＡＧは，標的酵素との反応の後に，頭部とリンカー成分との組み合わせに付加して，完全なＡＢＰを形成することができる。この目的のためには，頭部とリンカー成分との組み合わせは，通常は蛋白質中に見出されない，ＴＡＧ上のレシプロ官能基と反応する化学的に反応性の成分を含む。例えば，ビシナルジオールとボロン酸，光活性化基（例えば，ジアゾ亜硫酸水素，アジド）とアルケンまたはアルキン，ｏ−アルキルヒドロキシルアミンとケトンまたはアルデヒド等。次に，頭部リンカー成分をＴＡＧと反応させて，ＡＢＰを完成させる。ＴＡＧ部分は，標的酵素とＡＢＰとのコンジュゲートを捕獲することを可能とする。ＴＡＧは，置換用ＴＡＧ（遊離ＴＡＧであってもＴＡＧの誘導体であってもよい）を加えることにより，または，溶媒（例えば，溶媒タイプまたはｐＨ）または温度を変化させることにより，捕獲試薬からはずすことができ，あるいは，リンカーを化学的に，酵素的に，熱的にまたは光化学的に切断して，単離された物質を放出させてもよい（以下のリンカー成分の説明を参照）。

ＴＡＧの例としては，限定されないが，検出可能な標識，例えば，蛍光成分および電気化学的標識，ビオチン，ジゴキシゲニン，マルトース，オリゴヒスチジン，２，４−ジニトロベンゼン，ヒ酸フェニル，ｓｓＤＮＡ，ｄｓＤＮＡ，ポリペプチド，金属キレート，および／または糖類が挙げられる。タグおよび捕獲試薬の例にはまた，限定されないが，以下のものが含まれる：デチオビオチンまたは構造的に改変されたビオチン系試薬，例えば，デイミノビオチン（アビジン／ストレプトアビジンファミリーの蛋白質に結合し，例えば，ストレプトアビジン−アガロース，オリゴマー性−アビジン−アガロース，またはモノマー性−アビジン−アガロースの形で用いることができる）；任意のビシナルジオール，例えば，１，２−ジヒドロキシエタン（ＨＯ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ），および他の１，２−ジヒドロキシアルカン（環状アルカンを含む），例えば，アルキルまたはアリールボロン酸またはボロン酸エステルに結合する１，２−ジヒドロキシシクロヘキサン，例えば，フェニル−Ｂ（ＯＨ）₂またはヘキシル−Ｂ（Ｏエチル）₂（アルキルまたはアリール基を介してアガロース等の固体支持体材料に結合させることができる）；マルトース結合蛋白質（ならびに他の任意の糖／糖結合蛋白質対，またはより一般的には，上述した性質を有する任意のタグ／タグ結合蛋白質対）に結合するマルトース；これに対する抗体を生成することができるハプテン，例えばジニトロフェニル基；遷移金属に結合するタグ（例えば，オリゴマー性ヒスチジンはＮｉ（ＩＩ）に結合し，遷移金属捕獲試薬を樹脂結合キレート化遷移金属，例えば，ニトリロ三酢酸キレート化Ｎｉ（ＩＩ）またはイミノ二酢酸キレート化Ｎｉ（ＩＩ）の形で用いることができる）；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結合するグルタチオン。ほとんどの場合，ＴＡＧは天然に生ずるレセプターに結合するハプテン，例えば，ビオチンおよびアビジンまたは抗体であるか，または検出可能な標識（これもまたハプテンである）であろう。

固相樹脂上で蛋白質を消化し，自動化を容易にしうる化学的アフィニティー樹脂，例えば，金属キレートを用いることができる。これの１つの例は，固定化ニッケル（ＩＩ）キレートを用いて６個の連続したヒスチジン残基（Ｈｉｓ−６タグ）を有するペプチドを精製することであり（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの製品案内に記載，ＰｒｏＢｏｎｄ（商標）Ｒｅｓｉｎ（精製）カタログ番号Ｒ８０１−０１，Ｒ８０１−１５ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｄ０００９１３２８−００７６），これは一連のイミダゾール含有成分を結合した非ペプチド性化学結合を含むように適合させることができる。別の化学的結合物としては，フェニルジボロン酸（Ｂｅｒｇｓｅｉｄ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０００）２９（５），１１２６−１１３３に記載），およびジスルフィド試薬（Ｄａｎｉｅｌ，Ｓ．Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）２４（３），４８４−４８９に記載）が挙げられる。さらに，コンビナトリアル合成において有用な化学的アフィニティータグを修飾ペプチド精製に適合させることができる（Ｐｏｒｃｏ，ＪＡ（２０００）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ３（２）９３−１０２に概説されている）。

“蛍光成分”（“Ｆｌ”）との用語は，電磁気的放射により励起されることができ，これに応答してアッセイにおいて検出されるのに十分な量の電磁気的放射を放出するＴＡＧを表す。当業者は，蛍光成分が“吸収スペクトル”および“放出スペクトル”と称される多数の波長で吸収および放出することを理解するであろう。蛍光成分は，そのピーク吸収波長より長い波長であるピーク放出波長を示すであろう。“ピーク”との用語は，吸収または放出スペクトルにおける最高点を表す。

蛍光成分Ｆｌは，用いるべきプロトコル，同じアッセイ中で用いられる異なるＡＢＰの数，電気泳動において単一のレーンまたは複数のレーンが用いられるか，励起および検出装置の能力等に依存して広範な範囲のものでありうる。ほとんどの場合，ＴＡＧとして用いられる蛍光成分は，紫外，赤外，および／または最も好ましくは可視の範囲で吸収し，紫外，赤外，および／または最も好ましくは可視の範囲で放出する。吸収は一般に約２５０−７５０ｎｍの範囲であり，放出は一般に約３５０−８００ｎｍの範囲である。例示的蛍光成分には，キサンテン染料，ナフチルアミン染料，クマリン，シアニン染料および金属キレート染料，例えば，フルオレセイン，ローダミン，ローサミン，ＢＯＤＩＰＹ染料（ＦＬ，ＴＭＲ，およびＴＲ），ダンシル，ランタニドクリプタート，エルビウム，テルビウムおよびルテニウムキレート，例えば，スクアレート等が含まれる。さらに，ある態様においては，１またはそれ以上の蛍光成分は，エネルギー転移染料，例えば，Ｗａｇｇｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，００８，３７３に記載されるものであってもよい。文献は，広範な種類のリンカー成分を介して蛍光成分を他の基に連結させる方法を詳細に記載する。使用しうる蛍光成分は，一般には２ｋＤａｌ以下，通常は１ｋＤａｌ以下である。

好ましい蛍光成分Ｆｌは，精緻化コンジュゲート化ピラン分子，例えばキサンテンを含むことができる。そのような分子には，エオシン，エリスロシン，フルオレセイン，オレゴングリーン，および種々の市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。そのような染料の構造の例は以下のとおりである：

特に好ましい蛍光成分は，ローダミン染料である。これらの分子は，典型的には，次の一般構造：

［式中，Ｋは，−ＣＯ₂Ｈ，または−ＳＯ₃Ｈであり；Ｙは，−Ｈ，−ＣＨ₃であるか，またはＲと一緒になって６員環を形成し；Ｚは−Ｈであるか，またはＲと一緒になって６員環を形成し；およびＲは，−Ｈ，−ＣＨ₃，−ＣＨ₂ＣＨ₃であるか，またはＹまたはＺと一緒になって６員環を形成する］
を有する。ローダミン分子，例えば，テトラメチルローダミン，５−カルボキシテトラメチルローダミン，６−カルボキシテトラメチルローダミン，カルボキシローダミン−６Ｇ，ローダミン−Ｂ塩化スルホニル，ローダミン−レッド−Ｘ，およびカルボキシ−Ｘ−ローダミンは当業者によく知られている。例えば，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，２００１（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）を参照。ローダミンの有利な特徴には，高い量子収率，約ｐＨ３から約ｐＨ８までのｐＨ範囲にわたる蛍光の低い感受性，有利な水溶性，優れた光安定性，および可視スペクトルの光の吸収が含まれる。特に好ましい蛍光剤は５−カルボキシテトラメチルローダミンおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンである。

別の好ましい蛍光成分Ｆｌには，４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン構造の精緻化物であるＢＯＤＩＰＹ染料がある。例示的な構造は以下に示される：

さらに別の好ましい蛍光成分には，シアニン染料，窒素原子で終わるポリメチン鎖を含むコンジュゲート化構造が含まれる。典型的には，窒素はそれ自身コンジュゲート化複素環の一部である。例示的な構造を以下に示す：

ＴＡＧとして用いるのに興味深い別のものは，米国特許６，１２７，１３４，（すべての表，図面および特許請求の範囲を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるマッチした染料である。この特許は，異なる放出を有するが，電気泳動分離における標識蛋白質の相対的移動にはほとんどまたは全く影響を及ぼさない染料で蛋白質を標識することに関するものである。特に興味深いものは，ここに開示されているシアニン染料であって，シアニン染料が結合するリジンと適合する正の荷電のために‘１３４において選択されているものである。さらに，より短いポリエン鎖染料中にアルキル基を導入してより長いポリエンを補うことにより，分子量をほぼ同じに保ちながら環状の末端の間のポリエンスペーサーを改変することが可能である。また記載されているものは，荷電を有しないＢＯＤＩＰＹ染料である。天然のおよび不活性化されたサンプルを比較する場合には，蛋白質の移動に同様に影響を及ぼす２つの染料を有することの利点が存在するであろう。ただし，この場合には，不活性化されたサンプルにおいて蛋白質の少なくとも一部が一置換されていることが必要である。

好ましいＴＡＧの上述の例のそれぞれにおいて，カルボキシル基は，リンカー成分用の便利な結合部位を提供することができる。特に好ましい５−および６−カルボキシローダミン分子において，５−または６−カルボキシルは，結合部位として特に好ましい：

一般に，上述した適合性の基準に合う，アフィニティー濃縮に慣用的に用いられている任意のアフィニティー標識−捕獲試薬を，本発明の方法において用いることができる。ビオチンおよびビオチン系アフィニティータグが特に好ましい。特に興味深いものは，構造的に改変されたビオチン，例えば，デイミノビオチンまたはデチオビオチンであり，これらは，アビジンまたはストレプトアビジン（ストレプト／アビジン）カラムから，ビオチンを用いて，またはＥＳＩ−ＭＳ分析に適合する溶媒条件下で，例えば１０−２０％の有機溶媒を含む希酸で溶出されるであろう。例えば，デイミノビオチンタグ付き化合物は，約ｐＨ４以下の溶媒で溶出されるであろう。

ある態様においては，１またはそれ以上のＡＢＰは，固相に固定化して，“つなげられた”ＡＢＰを形成することができる。つなげられたＡＢＰを得るのに有用な例示的な組成物および方法は，米国特許仮出願６０／３６３，７６２（標題"Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ"，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。好ましい態様においては，複数の異なるＡＢＰを１またはそれ以上の固相の異なる領域につなげて，パターン化されたアレイを形成することができる。構造および／または反応性が互いに異なるＡＢＰを含む２またはそれ以上の領域を有するそのようなパターン化されたアレイを用いて，複数の触媒的に活性な標的酵素の存在，量または活性を同時に測定することができる。本明細書において用いる場合，“固相”との用語は，分子を隔離するために当業者に典型的に用いられる広範な種類の材料を表し，例えば，固体，半固体，ゲル，フィルム，膜，メッシュ，フェルト，複合材料，粒子等が含まれる。固相は多孔質であっても多孔質でなくてもよい。適当な固相には，固相結合アッセイにおいて固相として開発され，および／または用いられているものが含まれる。例えば，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６の第９章（本明細書の一部としてここに引用する）を参照。適当な固相の例としては，膜フィルタ，セルロース系の紙，ビーズ（例えば，ポリマー性，ラテックス，ガラス，および常磁性の粒子），ガラス，シリコンウエハ，微粒子，ナノ粒子，テンタゲル，アガロゲル，ＰＥＧＡゲル，ＳＰＯＣＣゲル，およびマルチウエルプレートが挙げられる。例えば，Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：２９９７（１９９８）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：１６５（２００１）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｍｅｄ．１：３２６（１９９９）；Ｏｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４２：５１５（２００１）；Ｐａｐａｎｉｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：２１７６（２００１）；Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２９９７（２００１）を参照。

用いられるＡＢＰは，特定の活性部位に特異的であってもよく，複数の関連する蛋白質により一般に共有されていてもよい，活性部位に対するアフィニティーを有するであろう。アフィニティーは，反応性基，リンカー成分，結合成分，ＴＡＧ，またはこれらの組み合わせの選択により影響されうる。１またはそれ以上のＡＢＰは，単一の標的酵素に対する特異性を示すように，または構造的または機能的に関連していてもよい複数の標的に対する特異性を示すように設計することができる。

したがって，本発明は，異なるように発現されている蛋白質を比較定量するための組成物および方法を提供する。本発明により，大きな酵素ファミリー，例えば，システインプロテアーゼの機能的状態を直接モニターすることが可能となる。本発明のＡＢＰは，以下のことが可能である：１）好ましくは１またはそれ以上の触媒的に活性なヒドロラーゼ，より好ましくは１またはそれ以上の触媒的に活性なシステインヒドロラーゼを用いて，複雑なプロテオーム中に存在する広範な範囲の触媒的に活性な酵素と直接反応する；２）非標的蛋白質と最少の反応性を示す；および４）ＡＢＰ反応生成物の迅速な検出および単離のためのＴＡＧを有する。すなわち，本発明は，２またはそれ以上のプロテオーム中に存在する所定の種類の酵素の活性なメンバーを比較して測定し同定する方法を提供する。

以下の実施例は例示のためにのみ提供され，本発明を限定するものではない。

実施例１：カスパーゼ関連プローブの製造
以下の実施例は，本発明のＡＢＰを製造する方法のいくつかの態様を例示する。これらの態様のそれぞれについて，¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは，重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ₃；δ ＝７．２６ｐｐｍ）を溶媒として記録した（特に記載しない限り）。調製用ＨＰＬＣは，逆相Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８カラム（５μｍカラム；１５０ｍｍｘ２１ｍｍ；Ｍｅｔａｃｈｅｍ／Ａｎｓｙｓ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で，トリフルオロ酢酸を緩和剤として含む水とアセトニトリルとの二成分系（水０．１％，アセトニトリル０．０８％）を用いて行った。分析的ＬＣ−ＭＳはＰｏｌａｒｉｓ Ｃ１８カラム（５μカラム；５０ｍｍｘ４．６ｍｍ；Ｍｅｔａｃｈｅｍ／Ａｎｓｙｓ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）により，ＴＦＡを緩和剤として含む水とアセトニトリルとの二成分系（水０．０２５％，アセトニトリル０．０２％）を用いて行った。検出可能なＴＡＧは，５−（および６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ−ＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ），Ｂｏｃ−１１−アミノウンデカン酸，およびＣｂｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕｔ）−ＯＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）の混合スクシンイミジルエステルであった。

３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−５−ブロモ−４−オキソ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１）
乾燥丸底フラスコに磁気攪拌棒を備え，乾燥ＴＨＦおよび窒素ガスを入れた。Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕｔ）−ＯＨ（組成物１０，１．０ｇ，３．０９ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（０．５ｍＬ，４．６ｍｍｏｌ，１．５当量）をこの混合物に溶解し，得られた溶液を水氷浴中で０℃に冷却した。イソブチルクロロホルメート（０．４７ｍＬ，３．７ｍｍｏｌ，１．２当量）を，連続的に撹拌しながら１０分間かけて滴加した。反応液を０℃で１５分間撹拌した。磁気攪拌棒を備えた別の反応フラスコ中に１０ＮＫＯＨおよびエチルエーテルの二層混合物を調製し，氷浴中で冷却した。１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロスクアニジン（０．５４ｇ，３．７ｍｍｏｌ，３当量）を連続的に撹拌しながらゆっくり加えて，明るい黄色のエーテル層を得，次にこれをプラスチックのピペットで組成物１０を含むフラスコに移した。得られた溶液を０℃で１５分間撹拌し，ＨＢｒの濃縮溶液（１ｍＬ）を滴加した。反応液をさらに２０分間撹拌した。透明な二相混合物にＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加え，有機層をＨ₂Ｏ（１００ｍＬ），飽和ＮａＨＣＯ₃溶液（１００ｍＬ）で洗浄し，Ｎａ₂ＳＯで乾燥し，真空下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，２：１，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製して，１１（０．６２ｇ，１．５５ｍｍｏｌ，５１％収率）を無色透明油状物として得た。ＥＳＭＳ：３４４．２（Ｍ＋Ｈ⁺），３６６．２（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−オキソ−５−（２−，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２）
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（１５０ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ，１．０５当量）およびＫＦ（１００ｍｇ，１．７８ｍｍｏｌ，２当量）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。組成物１１（３５３ｍｇ，０．８８ｍｍｏｌ）を溶液に加え，反応液を一晩（１２時間）撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ₃溶液（約５０ｍＬ）を完了した反応液に加え，水性層をＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ，飽和ブライン溶液（５０ｍＬ）で洗浄し，Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し，真空下で濃縮して，透明油状物を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，２：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製して，１２を粘着性の灰白色固体（１８６ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ，４２％収率）として得た。ＥＳＭＳ：４８６．４（Ｍ＋Ｈ⁺），５０９．６（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１３）
磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに組成物１２（１８９ｍｇ，０．３８ｍＭ，１当量）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を加えた。連続的に撹拌しながらＮａＢＨ₄（８ｍｇ，０．２２８ｍｍｏｌ，０．６当量）を加えた。添加の際に気泡が生成し，得られた無色透明溶液を０℃で３０分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し，得られた固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，２：１，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して，１３を粘着性白色固体として得た（１６５ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ，８１％収率）。ＥＳＭＳ：４８８．２（Ｍ＋Ｈ⁺），５１０．８（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

３−アミノ−４−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１４）
組成物１３（１６３ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（約１５ｍＬ）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。フラスコをＮ₂で数回パージし，触媒量の１０％Ｐｄ担持Ｃを反応フラスコに注意深く加えた。得られた黒色異種混合物を真空下で排気し，連続的に撹拌しながら，Ｈ₂をゴム風船により２回充填した。反応液を室温で１．５時間撹拌し，完了後にセライトのパッドを通して濾過し，真空下で濃縮して，１４（１１５ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ，９９％収率）を粘着性灰白色固体として得た。ＥＳＭＳ：３５４．８（Ｍ＋Ｈ⁺），３７６．２（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

３−（１１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ウンデカノイルアミノ）−４−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１５）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＢｏｃ−１１−アミノ−ウンデカン酸（１１５ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ，１．２当量），ＥＤＡＣ（９１ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ，１．５当量），およびＨＯＢｔ（６５ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ，１．５当量）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。最少量のＤＭＦに溶解した組成物１４（１１５ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２回蒸留，０．１４ｍＬ，０．９６ｍｍｏｌ，３．０当量）を連続的に撹拌しながら加えた。無色溶液は反応が進行するにつれてゆっくり黄色に変化した。反応液を１８時間撹拌し，次にＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え，有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃（２０ｍＬ），Ｈ₂Ｏ（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し，Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し，真空下で濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，１：１，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して，１５（５６ｍｇ，０．０８８ｍｍｏｌ，２４％収率）を透明な粘稠油状物として得た。ＥＳＭＳ：６３７．６（Ｍ＋Ｈ⁺），６５９．２（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

３−（１１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ウンデカノイルアミノ）−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１６）
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の組成物１５（５６ｍｇ，０．０８８ｍｍｏｌ）およびデスマーチンペルイオジナン（４８ｍｇ，０．１１４ｍｍｏｌ，１．３当量）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。濁った白色懸濁液を２０分間反応させた。飽和ＮａＨＣＯ₃（２０ｍｌ）を加え，反応液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ₃で乾燥し，真空下で濃縮し，カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，１：１，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して，１６（２３ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ，６４％収率）を粘着性白色固体として得た。ＥＳＭＳ：６３５．４（Ｍ＋Ｈ⁺），６５７．２（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

［９−（２−カルボキシ−４−｛１０，［１−カルボキシメチル−２−オキソ−３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−プロピルカルバモイルアミノ−キサンテン−３−イリデン］−ジメチル−アンモニウム（１）
４ＭＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ）中の組成物１６（１４ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。この溶液に乾燥ＭｅＯＨ（０．２ｍＬ）を加え，得られた透明溶液を室温で３０分間撹拌し，次に溶媒を真空下で除去した。得られた固体を最少量のＤＭＦ中に取り出し，次にＤＭＦ（約０．２ｍＬ）中のＴＡＭＲＡ−ＳＥ（１４ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ，１．２当量）およびＤＩＥＡ（８μＬ，０．０４４ｍｍｏｌ，２．０当量）に室温でゆっくりと滴加した。２０分後，反応液をＴＦＡ（０．３ｍＬ）で希釈して，ｔｅｒｔ−ブチルエステル保護基を含む中間体を除去した。次に反応溶液をＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）で希釈し，調製用ＨＰＬＣを用いて流速３０ｍＬ／分間および０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ／水（２−９８％）の９０分間勾配で精製して，１を明るい紫色固体（６ｍｇ，０．００６７ｍｍｏｌ，３１％収率）として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ８．７６（ｓ，２Ｈ）８．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），８．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．８２（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０６（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），６．９８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈ），５．１８（ｍ，４Ｈ），４．７８（ｍ，２Ｈ），４．３４（ｍ，４Ｈ），３．４６（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｍ，３Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ），２．２３（ｍ，８Ｈ），１．６３（ｍ，１０Ｈ），１．２９（ｍ，３２Ｈ）．ＥＳＭＳ：８９２．３（Ｍ＋Ｈ⁺），９１４（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

図１はこの一連の反応を示す。当業者は，１と同様の方法で同じ原理を用いて追加のＡＢＰを製造することが可能であることを理解するであろう。上述したものと同じ原理を用いて，以下のＡＢＰも製造した。

実施例２：カテプシン関連プローブの製造
２，６−ビス−トリフルオロメチル−安息香酸−３−（２−アミノ−３−フェニル−プロピオニルアミノ）−２−オキソ−プロピルエステル（１８）
組成物１７（１５０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ），ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（７６ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ，２当量）およびＭｅＯＨ（１５ｍＬ）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。フラスコをＮ₂で数回パージし，触媒量の１０％Ｐｄ担持Ｃを反応液に加えた。得られた黒色異種混合物を排気し，連続的に撹拌しながらＨ₂をゴム風船により２回充填した。反応液を室温で１．５時間撹拌した。反応が完了したとき，混合物をセライトのパッドを通して濾過し，真空下で濃縮して，１８（９４ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，９９％収率）を粘着性の灰白色固体として得た。ＥＳＭＳ：４７７．８（Ｍ＋Ｈ⁺），４９９．１（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

２，６−ビス−トリフルオロメチル−安息香酸３−［２−（１１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１０−メチル−ウンデカノイルアミノ）−３−フェニル−プロピオニルアミノ］−２−オキソ−プロピルエステル（１９）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＢｏｃ−１１−アミノ−ウンデカン酸（８７ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ，１．２当量），ＥＤＡＣ（６９ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ，１．５当量），およびＨＯＢｔ（４９ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ，１．５当量）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。連続的に撹拌しながら，最少量のＤＭＦに溶解した組成物１８（９４ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２回蒸留，０．９ｍＬ，０．７２ｍｍｏｌ，３．０当量）を加えた。一晩（１８時間）の反応の経過の間に無色溶液はゆっくり黄色に変化した。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を反応液に加え，有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃（２０ｍＬ），Ｈ₂Ｏ（２０ｍＬ），およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し，Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し，真空下で濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，１：１，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して，１９（６３ｍｇ，０．０８４ｍｍｏｌ，２４％収率）を透明な粘稠油状物として得た。ＥＳＭＳ：７４６．３（Ｍ＋Ｈ⁺），７６８．１（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

［９−［４（１０−｛３−（２，６−ビス−トリフルオロメチル−ベンゾイルオキシ）−２−オキソ−プロピルカルバモイル］−２−フェニル−エチルカルバモイル｝−２−カルボキシ−フェニル］−６−ジメチルアミノ−キサンテン−３−イリデン｝−ジメチル−アンモニウム（２）
４ＭＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ）中の組成物１９（１３ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）を磁気攪拌棒を備えた乾燥丸底フラスコに加えた。乾燥ＭｅＯＨ（０．２ｍＬ）をこの溶液に加え，反応液を室温で３０分間撹拌し，次に溶媒を真空下で除去した。得られた固体を最少量のＤＭＦ中に取り出し，次にＤＭＦ（約０．２ｍＬ）中のＴＡＭＲＡ−ＳＥ（１４ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ，１．２当量）およびＤＩＥＡ（８ｕＬ，０．０４４ｍｍｏｌ，２．０当量）に室温で滴加した。２時間後，反応溶液をＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）で希釈し，調製用ＨＰＬＣを用いて，流速３０ｍＬ／分間および０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ／水（２−９８％）の９０分間の勾配で精製して，２を明るい紫色固体（５ｍｇ，０．００６７ｍｍｏｌ，３１％収率）として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ ８．９２（ｂｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，２Ｈ），８．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０９（ｍ，５Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），８．８７（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），７．０５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），６．９７（ｓ，４Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．３８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．４４（ｍ，５Ｈ），３．３６（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｍ，６Ｈ），１．３４（ｂ，１２Ｈ），１．２９（ｂ，３６Ｈ）．ＥＳＭＳ：１０７２．３（Ｍ＋Ｈ⁺），１０９４．１（Ｍ＋Ｎａ⁺）。

図２はこの一連の反応を示す。当業者は，２と同様の方法で同じ原理を用いて追加のＡＢＰを製造することが可能であることを理解するであろう。上述したものと同じ原理を用いて，以下のＡＢＰも製造した。

表１は，本発明の追加のＡＢＰを示す。
表１：

本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に開示される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

本明細書において言及されるかまたは引用される文献，特許および特許出願，および他のすべての書類および電子的に入手可能な情報の内容は，それぞれの文献が特定的にかつ個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，その全体が本明細書の一部として引用される。本出願人は，そのような文献，特許，特許出願，または他の書類からすべての材料および情報をこの出願中に物理的に取り込む権利を留保する。

本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，"含む"との用語は拡張的にかつ制限せずに読むべきである。さらに，本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に具体的に開示される本発明の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属から任意の主題を除く"ただし・・・"またはネガティブ限定を含む発明の一般的記載が含まれる。

さらに，本発明の特徴および観点がマーカッシュグループについて記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていることを認識するであろう。

他の態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。

図１は，本発明の活性に基づくプローブの例の合成の例を示す。 図２は，本発明の活性に基づくプローブの例の合成の例を示す。

Claims (12)

1. 次の構造：
   

   

   ［式中，
   各Ｒ₁およびＲ₂は，独立して，水素または，Ｎ，Ｏ，またはＳからなる群より選択される１−３個の複素原子を含んでいてもよい直鎖または分枝鎖のＣ_1-6アルキル，またはＣ_0-6アルキルアリール，Ｃ_0-6アルキルヘテロアリール，またはＣ_0-6アルキルフェニルであり；
   ＲＧは，触媒的に活性な標的酵素と反応して共有結合を形成する反応性基であり；
   Ｌは任意に存在し，−Ｎ（Ｒ）−，−Ｏ−，−Ｓ−または−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群より選択される１−２０個の骨格原子のアルキルまたはヘテロアルキル基であり，
   ここで，各Ｒは，独立して，Ｈまたは直鎖もしくは分枝鎖のＣ_1-6アルキルであり；
   ｎは１−４の整数である］
   を有する活性に基づくプローブまたはその薬学的に許容しうる塩または複合体。
2. ｎが１または２である，請求項１記載の活性に基づくプローブ。
3. 各Ｒ₁およびＲ₂が，独立して，
   

   

   からなる群より選択される，請求項１記載の活性に基づくプローブ。
4. ＲＧが，
   

   

   からなる群より選択され，
   ＬＧが，
   

   

   からなる群より選択される，請求項１記載の活性に基づくプローブ。
5. ＬＧが，
   

   

   からなる群より選択される，請求項４記載の活性に基づくプローブ。
6. ＴＡＧが，
   

   

   からなる群より選択される，請求項１記載の活性に基づくプローブ。
7. 以下の構造：
   

   

   からなる群より選択される構造を有する，活性に基づくプローブ。
8. 以下の構造：
   

   

   からなる群より選択される構造を有する，活性に基づくプローブ。
9. 請求項１−８のいずれかに記載の複数の活性に基づくプローブを含む，活性に基づくプローブのライブラリ。
10. 連結成分を介してＴＡＧに共有結合している１またはそれ以上の活性に基づくプローブ，および，前記活性に基づくプローブが標的酵素に結合したときに前記標的酵素のアミノ酸官能基と反応する反応性基を用いて，複雑な蛋白質混合物中の１またはそれ以上の標的酵素の酵素プロファイルを決定する方法であって，
    前記活性に基づくプローブが前記標的酵素と反応し，このことにより，前記活性に基づくプローブと前記標的酵素とのコンジュゲートが形成される条件下で，反応媒体中で，前記活性に基づくプローブと前記複雑な蛋白質混合物とを組み合わせ；そして
    これにより形成された１またはそれ以上のコンジュゲートからシグナルを生成することにより前記酵素プロファイルを決定する，
    ことを含み，ここで，前記活性に基づくプローブは，請求項１−８のいずれかに記載の活性に基づくプローブから選択される，上記方法。
11. 前記反応性基が，
    

    

    からなる群より選択され，
    ＬＧが，
    

    

    からなる群より選択される構造を有する，請求項１０記載の方法。
12. 前記活性に基づくプローブが１またはそれ以上のシステインプロテアーゼに特異的に結合する，請求項１０記載の方法。
    
    
    

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