CN102816787A - 利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶 - Google Patents
利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶 Download PDFInfo
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Abstract
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因saald,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,在E.coli BL21中用IPTG诱导表达,利用表达载体pET-28a上的6·His-Tag标签,选用Ni柱亲和层析纯化表达具有活性的α-乙酰乳酸脱羧酶。粗酶液的比酶活为56U/mg,纯化后比酶活达到469.85U/mg,纯化倍数达8.36倍,回收率为87.65%。
Description
技术领域
利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻,避免双乙酰的生成,它可以缩短啤酒熟化周期,提高生产效率,对啤酒工业来说极有经济价值。
α-乙酰乳酸脱羧酶主要应用于啤酒酿造工业。在啤酒酵母代谢过程中,α-乙酰乳酸是亮氨酸一缬氨酸生物合成过程的中间产物。大部分α-乙酰乳酸在酵母细胞内代谢形成缬氨酸和亮氨酸,小部分渗漏到细胞外,进入发酵液中,在胞外经非酶氧化生成双乙酰。在啤酒酿造过程中,双乙酰是影响啤酒质量的关键因素,也是决定啤酒成熟与否的重要指标,虽然双乙酰赋予了啤酒特殊的风味,但是其口味阈值比较低(0.02~0.10mg/L),当含量超过0.15mg/L时就会给啤酒带来不愉快的馊饭味,因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。α-乙酰乳酸脱羧酶能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻,从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。
酿酒酵母不含ALDC,很多细菌中含有该酶。Godtfredsen等测试的34个属79个种(325株)细菌中,有ALDC活性的占20个属40个种。α-乙酰乳酸脱羧酶首次于1952年从产气肠杆菌中分离得到,之后有关该酶在生物界中的分布及菌种选育得到了广泛研究。a-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)存在于多种细菌中,它参与α-乙酰乳酸代谢,将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。目前还未在真菌、海藻和原生动物等真核生物中发现该酶的存在。
细菌中天然存在的ALDC产量很低,要想将该酶应用于啤酒工业,研究ALDC的分子结构以及ALDC基因,进行基因的克隆和表达,提高酶的产量,是一种必然的选择。随着对ALDC分子水平研究的深入,α-乙酰乳酸脱羧酶基因已经从多种细菌中克隆得到,并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母中获得了不同程度的表达。
发明内容
本发明的主要研究内容:本发明利用分子技术克隆了来自金黄色葡萄球菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因在本发明中简称saald,构建重组表达载体pET-28a(+)-saald,并将其转化E.coliBL21,成功构建了基因工程菌pET-28a-saald/BL21,利用亲和层析法对表达的ALDC进行了纯化,得到了酶活可达到469.85U/mg的纯酶液,并对该酶的酶学性质进行了研究,以便为以后该酶的应用提供理论基础。将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中,初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。
本发明的技术方案:
1.α-乙酰乳酸脱羧酶引物设计
根据NCBI金黄色葡萄球菌的全基因组核酸序列中saald基因序列,设计α-乙酰乳酸脱羧酶的PCR引物P1和P2。
P1:5’-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(EcoR I)
P2:5’-TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Not I)
2.重组菌的构建
从金黄色葡萄球菌中抽提染色体DNA作为模板,根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度。采用下共同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产物进行双酶切,电泳检验酶切产物,并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接。取连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞进行转化,挑取阳性转化子于10mL的LB培养基中,37℃振荡培养过夜,提取质粒,酶切验证正确后,将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
3.重组菌α-乙酰乳酸脱羧酶的表达纯化
取冻管保藏的菌种接入10mL的LB培养基中,37℃振荡培养过夜,次日转接,诱导表达,将诱导液通过亲和层析纯化得到纯酶液。粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定,以BSA为标准蛋白。经测定粗酶液比酶活是56U/mg,纯酶液比酶活是469.85U/mg。纯酶液进行酶学性质的初步研究。
4.α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的应用
将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中,初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。在冷麦汁中加入按照0.05mg/L的量添加所得的纯酶,经检测发现,发酵过程中双乙酰的峰值比不添加的情况下明显降低,且加速了双乙酰的还原,使发酵周期缩短了约3天。啤酒发酵结束后,其中的乙酰乳酸几乎完全生成双乙酰而得到还原,这样就有效避免了成品啤酒中双乙酰的回升现象。
本发明的有益效果:α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻,避免双乙酰的生成,它可以缩短啤酒熟化周期,提高生产效率,对啤酒工业来说极有经济价值。鉴于α-乙酰乳酸脱羧酶的应用价值,获得该酶的高表达和高酶活一直以来是研究的热点。因此,通过基因工程技术构建高表达载体达到α-乙酰乳酸脱羧酶的高效表达和比较高的酶活水平具有重要意义。以本实验室保藏的一株金黄色葡萄球菌为出发菌株,测得较为可观的α-乙酰乳酸脱羧酶活性,克隆其基因saald并在大肠杆菌中得以高效表达。此外,通过研究其酶学性质也为ALDC的应用打下了良好的理论基础。
附图说明
图1质粒pET-28a-saald的酶切验证。1:DNA Marker:λ-Hind III;2:pET-28a-saald/EcoR I+Not I;3:pET-28a-saald/EcoR I;4:pET-28a/EcoR I;5:saald/EcoR I;6:DNA Marker:DL-2000
图2α-乙酰乳酸脱羧酶的表达与纯化。1:E.coli BL21;2:purified ALDC;3:E.coli BL21 withrecombinant plasmid pET28a-saaldD/BL21with IPTG;4:E.coli BL21with recombinant plasmid pET28a-saald/BL21without IPTG;5:Protein Marker(kDa)
具体实施方式
实施例1:重组质粒pET-28a-saald的构建及转化
[1]从金黄色葡萄球菌抽提染色体DNA作为模板,抽提方法如下:用接种环从新鲜的金黄色葡萄球平板上挑取单菌落悬浮于0.5mL的灭菌双蒸水中,沸水煮5-10min,8000r/min离心10min,取上清装入一只干净的1.5mL离心管中,-20℃冰箱保存备用。
[2]以金黄色葡萄球菌总DNA为模板,利用实施例1提供的引物做PCR扩增,扩增条件为:94℃预变性,5min,一个循环;94℃变性,1min,56℃退火,1min,72℃延伸,1min30s,30个循环;72℃,10min,一个循环;15℃,10min,一个循环。PCR扩增体系:模板(金黄色葡萄球菌染色体DNA)2μL,上下游引物各0.5μL,dNTP Mix 4μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,灭菌的双蒸水37μL,Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中,-20℃冰箱保存备用。
[3]构建重组质粒pMD18-T-saald,导入感受态E.coli JM109。连接体系:PCR胶回收产物4.8L,solution I 5L,pMD18-T质粒0.5L,16℃过夜连接。转化方法:将连接好的10L pMD18-T-saald加入到1201感受态E.coil JM109中,于冰上放置45min,42℃热击90s,放置冰上2min,加入800 l LB液体培养基,37℃摇床培养1h,离心,倒掉大部分上清液,留150L与沉淀混匀,涂布到氨苄青霉素平板(Amp+LB)上,于37℃培养箱培养9h左右,挑去平板上的阳性菌落到10ml液体LB培养基中,37℃摇床过夜培养。提取质粒,经酶切验证连接成功后,将菌液加入终浓度17%(w/v)的甘油,-40℃冰箱保藏。
[4]将[3]中提取的质粒和质粒pET-28a分别用EcoR I和Not I进行双酶切,利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接,连接体系:目的基因酶切产物7.7L,pET-28a酶切产物0.3L,T4DNA连接酶buffer 1L,T4DNA连接酶1L,16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a-saald转化到感受态E.coil BL21,转化方法参照实施例2[3],用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒,酶切验证正确后加入甘油,-20℃冰箱保藏备用。
实施例2:α-乙酰乳酸脱羧酶表达及酶活测定
[1]将实施例1[4]冻管保藏的菌种接入10mL液体LB培养基中,37℃振荡培养过夜,次日按1%的接种量转接,37℃培养至OD600约0.6~0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG,置于30℃摇床过夜诱导表达。取所得菌液1mL于1.5mL离心管中,8000r/min离心2min,倒掉上清,加入100L pH6.8的Tris-HCl缓冲液将菌体混匀,加入30L蛋白胶上样缓冲液,沸水浴30min,使蛋白质变性,8000r/min离心2min,取上清进行SDS-PAGE检测,其中SDS-PAGE使用5%的分离胶和15%的浓缩胶,采用不连续垂直电泳,用考马斯亮蓝R250染色,以含有空载质粒pET-28a的E.coil BL21做空白对照。
[2]将过夜诱导表达的菌液于8000r/min,4℃离心10min,用pH6.0的MES I缓冲液(2-马啉乙磺酸0.05mol/L,brij-350.05%,NaCl 0.6mol/L,pH6.0)洗涤两次,最后用pH6.0的MESI缓冲液悬浮菌体,超声波破碎(300W,工作1S停3S,工作4min),10000r/min离心30min,上清即为粗酶液。采用400L的酶活测定体系(200L酶液,200L底物),30℃反应10min, 用4.6mL显色剂终止,30℃显色30min。测得粗酶液的比酶活为56U/mg,其中,酶液的蛋白含量采用Bradford法测定,以BSA为标准蛋白。
实施例3:α-乙酰乳酸脱羧酶的纯化及酶学性质
[1]粗酶液经Ni-NTA柱纯化后得到纯的ALDC,纯化后的纯酶液的比酶活是469.85U/mg,纯化倍数达8.36倍,回收率为87.65%。
[2]最适pH及pH稳定性:用底物缓冲液MES II配制不同pH(2~12)的底物溶液,将酶液用MES I稀释一定倍数,然后将不同pH的底物380μL与稀释好的酶液20μL反应,测定不同pH条件下酶的活性,并进行比较,确定酶反应的最适pH值。配制不同pH(5~10)的酶活测定缓冲液MES I,用它们来稀释酶液得到不同pH的酶液。让酶处于不同pH环境中,每隔一定时间取样,测定酶的剩余活性,观察该酶在不同pH下的稳定性,反应体系为:20μL酶液,180μLMES I,200μL底物。
[3]最适温度和热稳定性:在20℃~80℃设置11个反应温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃,测定不同温度条件下酶的活力,确定酶合适的反应温度。将适当稀释的酶液分别在-20℃、0℃、30℃、35℃、45℃、55℃、65℃保温,每隔2h取样,测定不同温度下酶的剩余活力,从而研究该酶在不同温度下的热稳定性。
[4]不同金属离子以及EDTA对酶活的影响:分别在反应体系中加入终浓度为1mmol/L的Ca2+、Sn2+、Ni+、Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+离子以及EDTA,以不添加任何金属离子的酶活为100%,研究各金属离子对酶活的影响。
[5]Km值及Vmax的测定:配置不同浓度的底物,进行酶促反应,反应时间控制在2min。采用双倒数作图法确定ALDC的Km及Vmax值。
其中反应最适pH为6.0,在pH值7.0-9.0的范围内温度,反应最适温度为45℃,在35℃以下酶的稳定性较好。Sn2+、Zn2+对ALDC有明显的抑制作用,其中Zn2+和Fe3+的添加几乎使酶完全失去活性。而Ca2+、K+、Mg2+和EDTA对酶的影响非常小。没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子。酶动力学参数以α-乙酰乳酸为底物的Km值为0.0177mmol/L,Vmax为2.06μmol/(mL/min)。
Claims (4)
1.一种重组质粒pET-28a-saald,其特征是以Staphylococcus aureus基因组DNA为模板,扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-saald。
2.权利要求1所述的基因saald的扩增方法,其特征是基因的克隆根据saald基因的特异性设计引物,P1:5’-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(EcoR I);P2:5’-TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Not I);扩增条件:94℃预变性,5min,一个循环;94℃变性,1min,56℃退火,1min,72℃延伸,1min30s,30个循环;72℃,10min,一个循环;15℃,10min,一个循环。PCR扩增体系:金黄色葡萄球菌染色体DNA 2μL,上下游引物各0.5μL,dNTP Mix 4μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,灭菌的双蒸水37μL,Ex Taq DNA聚合酶1μL,扩增saald基因,大小为705bp。
3.一种高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶的重组菌E.coliBL21/pET-28a-saald,其特征是构建方法如下:
(1)将含saald基因的重组质粒pET-28a-saald通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌BL21中,在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证,得到重组菌E.coliBL21/pET-28a-saald;
(2)对上述重组菌进行诱导表达,超声波破碎后测定ALDC的酶活力,并与对照菌株进行比较,重组菌E.coli BL21/pET-28a-saald的酶活力相对较高,经测定其粗酶的比酶活可达56U/mg。
4.如权利要求3所述的重组菌,其特征在于该菌高效表达的α-乙酰乳酸脱羧酶具有如下酶学性质,该酶的最适反应pH为6.0;反应最适温度为45℃,在35℃以下酶的稳定性较好;Sn2+、Zn2+对ALDC有明显的抑制作用,其中Zn2+和Fe3+的添加几乎使酶完全失去活性,而Ca2+、K+、Mg2+和EDTA对酶的影响非常小,没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子;酶动力学参数以α-乙酰乳酸为底物的Km值为0.0177mmol/L,Vmax为2.06μmol/(mL/min)。
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