CN106754777A

CN106754777A - 一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106754777A
Application number: CN201611239150.3A
Authority: CN
Inventors: 石利平; 陈峻青; 蔡进; 漆志文; 张维冰; 叶银梅; 徐春涛; 何义; 陈晓佩; 刘思琪
Original assignee: ALPHA PHARMACEUTICAL CO LTD JIANGSU PROVINCE
Current assignee: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN106754777B

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。葡萄糖脱氢酶突变体基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌。并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组葡萄糖脱氢酶的制备。本发明提供一种催化活性、pH及热稳定性、有机溶剂耐受性较好的葡萄糖脱氢酶突变体，可用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。

Description

一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

氧化还原酶被广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸等药物中间体，绝大多数氧化还原反应都需要辅酶NAD(P)H的参与。因辅酶价格昂贵，稳定性差、难以重复利用，严重限制了氧化还原酶的工业化应用，构建高效、经济的辅酶再生体系对于解除辅酶含量对反应的限制、降低生产成本极为重要。

辅酶再生的方法可分为全细胞法、光化学法、化学法、电化学法和酶法等。酶法再生还原态辅酶由于对辅酶的选择性及再生效率高，且再生系统与合成系统兼容性好，因而最受青睐。

葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH，EC 1.1.1.47)属于短链醇脱氢酶家族，由4个相同的亚基组成，广泛存在于原核与真核生物中。葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅酶可分为三种类型：吡咯喹啉醌依赖型、FAD依赖型及NAD(P)⁺依赖型。其中NAD(P)⁺依赖型葡萄糖脱氢酶可特异性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，同时将NAD(P)⁺转化为NAD(P)H，从而解决NADH以及更为昂贵的NADPH的再生问题。由于其对辅酶NAD(P)⁺的比活高，对还原性辅酶NAD(P)H的再生能力强，且既可用于NADH的再生，又可用于NADPH的再生，NAD(P)⁺依赖型葡萄糖脱氢酶得到了广泛的应用。该酶可从多种微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等中获得。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种葡萄糖脱氢酶突变体。

本发明的另一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法。

本发明的又一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

葡萄糖脱氢酶突变体基因，其野生型基因其来源为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis T1(GenBank:KU682779.1)，根据易错PCR方法对其进行突变，从而获得该氨基转移酶突变体目的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒pUC18，pUC19，pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-28a。

一种生产所述的葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或本发明所述的重组载体。

所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

所述基因工程菌优选保藏号为CCTCC M 2016059的E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。

一种葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的基因工程菌，获得重组表达的葡萄糖脱氢酶突变体。

所述的方法，优选包括在发酵条件下，制备所述葡萄糖脱氢酶的步骤。

本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体在氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生中的应用。

有益效果：

本发明提供一种催化活性、pH及热稳定性、有机溶剂耐受性较好的葡萄糖脱氢酶突变体，可用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。

生物材料保藏信息

大肠杆菌G06Escherichia coli G06，已于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2016059。

具体实施方式

实施例1基因工程菌的建立

根据NCBI收录的葡萄糖脱氢酶基因GDH(GenBank:KU682779.1)，人工合成该葡萄糖脱氢酶基因片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加NdeⅠ和BamHⅠ内切酶片段)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入pET-28a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脱氢酶基因工程菌。其中PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因的引物为：上游引物为F1:5'-GGGCCATATGATGGACATGT ATCCGGATT-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物为R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGCC TGCCTGGAA T-3'(SEQ ID NO.5)。

实施例2葡萄糖脱氢酶突变体基因的获得

本研究利用易错PCR方法对葡萄糖脱氢酶进行了蛋白质工程改造。

50μl PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg²⁺2mmol/L，加双蒸水至50μl。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；于72℃下继续延伸5min，冷却至4℃，结束反应。

实验流程

化学合成葡萄糖脱氢酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET-28a质粒中，作为基因突变模板；易错PCR扩增葡萄糖脱氢酶的基因，扩增后基因片段链接至pET-28a载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脱氢酶基因突变体库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a质粒为载体，表达扩展葡萄糖脱氢酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性葡萄糖脱氢酶基因进行鉴定。筛选出的高活性葡萄糖脱氢酶突变体基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的高活性葡萄糖脱氢酶突变体基因可以通过化学合成方式获得。

葡萄糖脱氢酶基因的引物为：上游引物为F1:5'-GGGCCATATGATGGACATGTATCCGGATT-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物为R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGC CTGCCTGGAA T-3'(SEQ ID NO.5)。

按实施例1所述方法构建表达该葡萄糖脱氢酶多肽突变体的基因工程菌，并将其命名为E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2016059。

实施例3重组大肠杆菌的摇瓶培养

将实施例1、实施例2所得的重组大肠杆菌分别接种至装有5mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养4-8小时。取1mL菌体培养液转接至装有50mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，于22-26℃、200rpm诱导表达8-12小时后，离心(8000rpm，15min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.5，10mmol/L)清洗两次，分散于同样的预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破碎。离心(10000rpm，15min，4℃)，弃菌体碎片，得到葡萄糖脱氢酶及其突变体粗酶液。

实施例4葡萄糖脱氢酶活力的测定

将含有0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，2.0mmol/L NADP⁺和0.1mol/L D-葡萄糖的总体积为200μL的反应体系于37℃保温5min后，加入适量粗酶液，测定340nm处的吸光值。

酶活力定义：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的NAD(P)H所需的酶量定义为一个酶活单位。

重组葡萄糖脱氢酶突变体的比活为612.9U/mg，比突变之前提高了82％。

实施例5温度对酶稳定性的影响

将重组葡萄糖脱氢酶分别加入不同温度(20～70℃，温度间隔5℃)的pH8.0磷酸盐缓冲液中，保温60min后于冰浴中冷却，测定残余酶活。残余酶活为原始酶活的80％以上为稳定，从而确定重组葡萄糖脱氢酶的温度稳定性。重组葡萄糖脱氢酶突变体的最适温度为40℃，60℃下保温60min后残余酶活80％以上，说明该酶可在较高温度下保持稳定。

实施例6pH对酶稳定性的影响

将重组葡萄糖脱氢酶突变体粗酶液分别加入不同pH(pH 4.0-10.5，pH间隔0.5)的缓冲液中，37℃保温60min后于冰浴中冷却，测定残余酶活。残余酶活为原始酶活的80％以上为稳定，从而确定重组葡萄糖脱氢酶的pH稳定性。

所用缓冲液为100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0-6.0)，100mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0-8.0)，100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0-9.0)，100mmol/L硼酸-NaOH缓冲液(pH8.5-10.5)。

重组葡萄糖脱氢酶突变体的最适pH为8.0。pH7.5-8.5范围内，37℃保温60min后残余酶活80％以上。

实施例7有机溶剂稳定性

将重组葡萄糖脱氢酶突变体粗酶液与不同有机溶剂(叔丁醇，丙酮，丁烷，戊烷，异丙醇，石油醚，叔丁基醚，二甲基亚砜，异戊酸乙酯，戊酸乙酯，辛酸乙酯，丁酸乙酯，二甲基甲酰胺)等体积混合，于25℃、200r/min的摇床中振荡60min，测定残余酶活性。从而确定葡萄糖脱氢酶对不同有机溶剂的耐受性。

重组葡萄糖脱氢酶突变体在叔丁醇、丙酮、戊烷、石油醚及丁烷中放置60min后，酶活仍保持90％以上；在叔丁基醚、二甲基亚砜和异戊酸乙酯中的残留酶活力都在50％以上；在戊酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯及二甲基甲酰胺中的残留酶活分别为52.1％、60.2％、28.2％、34.5％，说明该酶对部分有机溶剂具有耐受性。

实施例8葡萄糖脱氢酶的发酵制备

发酵培养基成分为：蛋白胨18g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，NH₄Cl 3.8g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 12.0g/L，KH₂PO₄ 2.8g/L，NaCl 0.4g/L，MgSO₄ 0.3g/L，EDTA1.9g/L，CaCl·2H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 1.1g/L，CuSO₄·5H₂O 0.5g/L，MnCl·4H₂O1.0g/L，ZnSO₄·7H₂O0.5g/L。将种子液按8％的接种量加入含有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵液通过加入氨水维持pH 7.2-7.5，罐温37℃，搅拌转速600rpm，发酵过程中控制DO35％以上，空气流量1:1.5vvm。发酵10小时后加入终浓度为1mmol/L的IPTG以诱导葡萄糖脱氢酶的表达，此后继续发酵12-18小时，罐温30℃。发酵过程中通过加入含葡萄糖800g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄4.5g/L，EDTA 0.1g/L的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。

将保存的发酵液经离心、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到葡萄糖脱氢酶多肽冻干粉并于-80℃保存。

实施例9重组酮还原酶催化5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的不对称还原

在5000L反应釜中，加入5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(化合物1)的水溶液(氰基含量1.95kmol)，NADPNa₂ 20kg，葡萄糖脱氢酶(1×10⁷U)12.8kg，葡萄糖60kg，异丙醇50L，控制温度在35-36℃，并用硫酸调节溶液的pH值至6.0-7.0，之后向釜内投加重组酮还原酶冻干粉(按照201210327416.5实施例2和5制备)(1×10⁷U)12.8kg，搅拌反应38小时。至底物含量降至1％以下时终止反应。反应终止后经脱色、离心、萃取等操作，得到产物(3R，5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(化合物1)(¹H-NMR(CDCl₃,400MHz/ppm)；1.47(9H,s),1.72(2H,dd),2.43(2H,dd),2.55(2H,dd),3.96(1H,dd),4.21(1H,bt),4.23-4.34(1H,m),4.25(1H,bs)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz/ppm)；25.8,28.1,40.8,41.9,67.9,68.7,82.1,117.4,172.1)。经气相色谱分析，确定底物转化率96.8％，还原产物的ee99.5％。

产物ee值的具体分析条件为：色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，FID检测器。色谱柱温度120℃，气化和检测温度均为280℃，载气为N₂。

<110> 江苏阿尔法药业有限公司

<120> 一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用

<160> 5

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖脱氢酶突变体基因

<400> 1

atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60

gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120

tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180

gaagctgttg tcgtccaagg agatgtcacg aaagaggaag atgtaaaaaa tatcgtgcaa 240

acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300

cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360

acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420

ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480

tatgcggcaa gtaaaggcgg gataaagaaa atgacagaaa cattagcgtt ggaatacgcg 540

ccgaagggca ttcgcgtcaa taatattggg ccaggtgcga tcaacacgcc aatcaatgct 600

gaaaaattcg ctgaccctaa acagaaagct gatgtagaaa gcatgattcc aatgggatat 660

atcggcgaac cggaggagat cgccgcagta gcagcctggc ttgagtcgaa ggaagccagc 720

tacgtcacag gcatcacgtt attcgcggac ggcttaatga cacaatatcc ttcattccag 780

gcaggccgct aa 792

<210> 2

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖脱氢酶突变体

<400> 2

Met Asp Met Tyr Pro Asp Leu Tyr Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr

5 10 15

Gly Ala Ala Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys

20 25 30

Glu Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro

35 40 45

Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val

50 55 60

Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln

65 70 75 80

Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp

100 105 110

Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg

115 120 125

Glu Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile

130 135 140

Asn Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His

145 150 155 160

Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Lys Met Thr Glu Thr Leu Ala

165 170 175

Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly

180 185 190

Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln

195 200 205

Lys Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro

210 215 220

Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Glu Ser Lys Glu Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Leu Met Thr Gln Tyr

245 250 255

Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg

260

<210> 3

<211> 792

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain T1

<220>

<223> 野生型葡萄糖脱氢酶编码基因

<400> 3

atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60

gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120

tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180

gaagctgttg tcgtccaagg agatgtcacg aaagaggaag atgtaaaaaa tatcgtgcaa 240

acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300

cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360

acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420

ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480

tatgcggcaa gtaaaggcgg gataaagctg atgacagaaa cattagcgtt ggaatacgcg 540

ccgaagggca ttcgcgtcaa taatattggg ccaggtgcga tcaacacgcc aatcaatgct 600

gaaaaattcg ctgaccctaa acagaaagct gatgtagaaa gcatgattcc aatgggatat 660

atcggcgaac cggaggagat cgccgcagta gcagcctggc ttgcttcgaa ggaagccagc 720

tacgtcacag gcatcacgtt attcgcggac ggcggtatga cacaatatcc ttcattccag 780

gcaggccgct aa 792

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F1

<400> 4

gggccatatg atggacatgt atccggatt 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物R1

<400> 5

gcggggatcc ttagcggcct gcctggaat 29

Claims

1.一种葡萄糖脱氢酶突变体基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。

4.一种生产权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

6.权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4～5中任一项所述的基因工程菌在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。

7.一种葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养权利要求4或5所述的基因工程菌，获得重组表达的葡萄糖脱氢酶突变体。

8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于包括在发酵条件下，制备所述葡萄糖脱氢酶的步骤。

9.权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶突变体在氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生中的应用。