CN116064724A

CN116064724A - 一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法

Info

Publication number: CN116064724A
Application number: CN202310360983.9A
Authority: CN
Inventors: 孟翔宇; 柴成程; 李瑞琦; 李华珍; 章家泉
Original assignee: Baikuiri Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Baikuiri Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-06
Filing date: 2023-04-06
Publication date: 2023-05-05

Abstract

本发明提供了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法，应用优化后的裂解液对大肠杆菌胞内表达蛋白进行裂解，并将充分裂解的裂解液上清采用磁珠法进行纯化，最后得到了高通量的测定苯丙氨酸酶比酶活的筛选方法。本发明发展了一种快速且稳定的PAL比酶活高通量的筛选方法，传统的PAL比酶活筛选耗时5天，并且最多可获得3~4突变体的比酶活数据，然而经过改良后的PAL比酶活筛选工艺实际耗时2天，并且可获得大量的比酶活数据，简化了传统工艺中多步酶活测定和放大工艺过程。保证了PAL酶活的准确性且具有一定的平行性，从而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。

Description

一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法。

背景技术

苯丙氨酸酶（phenylalaninammo－nialyase，PAL）是人体内苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）转化成酪氨酸的关键酶。PAL催化 L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。该酶在不同生物体中具有不同的氨基酸编码、组织分布和催化活性。研究苯丙氨酸酶基因，对相关代谢通路认知、反式肉桂酸生产有着重要的意义。

通常情况下，定义苯丙氨酸酶在1分钟(min)内转化苯丙氨酸生成1μmol反式肉桂酸所需的酶量为1酶活单位，即1U；定义单位质量(1mg)的酶所具有的酶活为比酶活，单位U/mg。由于苯丙氨酸和反式肉桂酸具有不同的吸光特性，在290nm下，肉桂酸具有苯丙氨酸不具备的强烈吸收峰，因此可以通过测量290nm处的吸光值增加量计算苯丙氨酸酶酶活。

传统的PAL比酶活筛选步骤包括：PAL突变体的胞内蛋白表达、总酶活测定、蛋白纯化、PAL纯酶酶活测定以及比酶活计算；从PAL组合突变库挑选不同的突变体，利用96深孔板进行蛋白表达，收集菌体，使用常规裂解方法对细胞进行裂解，离心后获得的PAL粗酶液；进一步测定PAL总酶活，达到对PAL的初步筛选；选择PAL总酶活高于野生型总酶活的菌株进行摇瓶扩大培养，收集菌体；利用超声破碎仪破碎细胞，收集破碎上清；进一步使用蛋白纯化仪对破碎上清液进行镍柱纯化，收集目的蛋白，目的蛋白超滤脱盐处理；利用A280法对蛋白进行定量，测定PAL纯酶的酶活，从而计算PAL比酶活。然而，传统的PAL比酶活筛选中，应用常规的裂解液（含有DTT）裂解细胞，不同批次处理获得的PAL酶稳定性较差；而且基于总酶活进行初步筛选，不能判断是否是由于蛋白表达量的不同而造成比酶活不同的差异；传统工艺中会采用超声破碎进行细胞裂解，由于仪器等的不稳定性，会造成粗酶液制备的差异性，导致后期比酶活计算的差异，并且传统工艺中，蛋白纯化时很难进行通量纯化，导致蛋白长时间放置，影响PAL酶活。传统工艺步骤冗杂，需要进行多次PAL酶活测定。

为了克服上述问题，本发明提供一种基于快速且大量裂解PAL酶的裂解液配方，一种结合磁珠进行蛋白高通量纯化方法，结合使用吸光值测定反式肉桂酸的浓度获得纯酶的酶活，保证了PAL酶活的准确性且具有一定的平行性，从而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。同时，由于所需菌体及试剂量少且磁珠可以方便的分离，该方法能够很好的借助自动移液工作站或自动化磁吸式核酸提取仪实现极高通量的全自动化筛选。

发明内容

为解决现有技术中对苯丙氨酸酶酶活性的测定的不足，本发明涉及一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法。提供了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法，应用优化后的裂解液对大肠杆菌胞内表达蛋白进行裂解，并将充分裂解的裂解液上清采用磁珠法进行纯化，最后得到了高通量的测定苯丙氨酸酶比酶活的筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化及其比酶活的测定方法，包括如下步骤：

1）将不同的含有苯丙氨酸酶（PAL）突变体的大肠杆菌进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；

2）采用磁珠法对 PAL不同突变体蛋白进行高通量纯化，作为待测样品；

3）对所述待测样品进行蛋白定量获得酶浓度；

4）将所述待测样品与底物苯丙氨酸和缓冲液MES混合，记录290nm条件下，反应一段时间前后的吸光度的差值，计算酶活值，其中，

，

吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；

5）计算比酶活，其中，

。

优选的，步骤1）中的蛋白表达于96深孔板进行。

优选的，步骤1）中的所述细胞裂解采用的细胞裂解液配方为50 mM Tris-HCl，150mM NaCl，100 mM EDTA，10% Triton X-100，20 mg/ml溶菌酶。

优选的，步骤1）中的大肠杆菌是以苯丙氨酸酶（PAL）基因序列为模板，利用易错PCR手段构建。

优选的，步骤2）中的纯化操作包括：磁珠的清洗，磁珠活化，目的蛋白与磁珠的结合，磁珠的洗涤，目的蛋白的洗脱。

优选的，步骤2）中的纯化操作为：于新的96深孔板中，每孔加入50 μl磁珠，用纯化水清洗磁珠2次，用Buffer A进行磁珠活化，弃上清；将所述粗酶液100 μl分别加入含有磁珠的96孔板中，漩涡混合，磁珠分离，将含不同咪唑浓度的buffer A加入96孔板中，洗涤两次，磁珠分离；用150 μl含有300 mM咪唑浓度的buffer A洗脱目的蛋白，作为待测样品，所述Buffer A配方为20 mM PB， 500 mM NaCl，pH7.4。

优选的，步骤2）中的磁珠为镍磁珠。

优选的，所述不同咪唑浓度分别为10 mM、30 mM、60 mM咪唑浓度。

优选的，所述磁珠分离操作中采用磁铁放置孔板底部，倒扣式弃上清液。

优选的，步骤3）中的定量方法为Bradford法。

优选的，步骤3）中的定量方法中采用牛血清白蛋白制备标准曲线。

优选的，步骤4）中的MES的浓度为150mM，pH6.0。

本发明目的在于提供一种PAL比酶活的高通量测定方法。

本发明第一方面，提供一种对PAL酶进行比酶活的高通量筛选方法，所述方法包括：

（1）以苯丙氨酸酶（PAL）基因序列为模板，利用易错PCR手段构建PAL突变库，挑选不同突变体，应用96深孔板进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；

（2）采用磁珠法对 PAL不同突变体进行高通量纯化，并应用磁铁吸附技术改进了高通量纯化过程中蛋白均一性问题；

（3）应用Bradford法对PAL纯酶进行蛋白定量获得酶浓度；

（4）将所述待测样品与底物苯丙氨酸和缓冲液MES混合，记录290nm条件下，反应一段时间前后的吸光度的差值，计算酶活值，其中，

，

吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；

（5）计算比酶活，其中，

。

优选地，步骤（1）中，所述的蛋白为大肠杆菌胞内表达；

优选地，步骤（1）中，所述的细胞裂解中，裂解液配方是50 mM Tris-HCl，150 mMNaCl，100 mM EDTA，10% Triton X-100，20 mg/ml溶菌酶。

优选地，步骤（2）中，高通量纯化过程中包括96孔板，含有镍填料的磁珠，磁铁。

优选地，步骤（3）中，采用制作标准曲线的方法获得PAL纯酶的蛋白量。

优选地，为了获得PAL纯酶的蛋白量，标准曲线制作如下：将牛血清白蛋白（BSA）进行梯度稀释，之后显色反应，记录每一梯度BSA浓度的吸光度值。

优选地，获得PAL纯酶的蛋白量，取PAL纯酶进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的吸光度值，从标准曲线中获得相应的PAL酶的浓度，进而获得PAL蛋白量。

优选地，步骤（3）中，为了获得准确的PAL比酶活，分别使用纯化水和buffer A稀释BSA，之后显色反应，记录每一梯度BSA浓度的吸光度值。

本发明发展了一种快速且稳定的PAL比酶活高通量的筛选方法，传统的PAL比酶活筛选耗时5天，并且最多可获得3~4突变体的比酶活数据，然而经过改良后的PAL比酶活筛选工艺实际耗时2天，并且可获得大量的比酶活数据，简化了传统工艺中多步酶活测定和放大工艺过程；由于本发明中蛋白裂解纯化和酶活测定属于同时完成，大大提高了比酶活测定的准确性和及时性。

附图说明

图1.传统裂解液裂解突变体胞内蛋白的SDS-PAGE结果图，其中1为1号突变体裂解液上清，2为1号突变体裂解液沉淀，3为2号突变体裂解液上清，4为2号突变体裂解液沉淀。

图2.优化裂解液配方及裂解条件后，裂解解突变体胞内蛋白的SDS-PAGE结果图，其中1为1号突变体裂解液上清，2为2号突变体裂解液上清。

图3.酶标仪记录得到的水溶液和buffer稀释的吸光度-BSA浓度标准曲线，以水稀释标准曲线方程为y = 0.7336x + 1.4634，R² = 0.962；以300 mM咪唑浓度的buffer稀释标准曲线方程为y = 0.7888x + 1.4362，R² = 0.9917。

图4.利用蛋白纯化仪纯化不同PAL突变体，SDS-PAGE结果图，其中1~5为不同突变体蛋白洗脱样品。

图5.优化前，PAL不同突变体进行磁珠高通量纯化后的SDS-PAGE结果图，其中1~22为不同突变体蛋白300 mM咪唑洗脱样品。

图6.优化后，PAL不同突变体进行磁珠高通量纯化后的SDS-PAGE结果图，其中1为10 mM咪唑洗脱样品，2、3为30 mM咪唑洗脱样品，4、5为60 mM咪唑洗脱样品，6~21为不同突变体蛋白300 mM咪唑洗脱样品。

图7.通过测定不同浓度反式肉桂酸在290nm下吸光度值，得到吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线，y=10.599x-0.0679，R² = 0.9991。

图8.通过HPLC检测，得到峰面积与产物反式肉桂酸浓度的标准曲线，y=43253x-802.02，R² = 0.9803。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1 常规方法筛选纯化PAL酶以及比酶活的测定

1）PAL突变体粗酶液的制备

首先以PAL基因为例，通过易错PCR手段获得突变体库，挑取不同突变体至含有LB培养基的96深孔板中进行活化，37℃培养，待生长至OD600为0 .8 左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃，1100 rpm培养过夜。将培养过夜的菌液4000 rpm，4℃条件下，离心5 min，弃上清，收集菌体。配置100 mL含50 mM Tris-HCl，150 mMNaCl，100 mM EDTA，10% Triton X-100，50mMDTT，20 mg/ml溶菌酶缓冲液（简称“裂解液1”），用裂解液1重悬细胞，在25℃ 200rpm条件下裂解2 h；将裂解细胞在4000 rpm，4℃条件下，离心5 min，获得上清作为PAL粗酶液，裂解后SDS-PAGE检测裂解情况如图1。

2）PAL总酶活测定及初筛

取180μl缓冲液（150 mM MES pH6.0），加入50μl反应底物（0.1M苯丙氨酸），充分混匀后，加入20 μl粗酶液，在290nm条件下，用酶标仪，测定15 min前后产物吸光度值，记录反应前后吸光度差值；

3）PAL比酶活测定

①PAL扩大培养。通过评价PAL总酶活，挑选3个PAL总酶活明显高于野生型的突变体菌株进行200 mL LB，37℃扩大培养，待生长至OD600为0.8 左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃条件下培养过夜，离心收集菌体。

②PAL蛋白纯化。配置10 g/mL的菌悬液，超声破碎，离心获得上清作为粗酶液，利用蛋白纯化仪进行镍亲和层析蛋白纯化，具体工艺过程是，配置1L 20 mM PB 500 mMNaCl，pH7.4（简称“BufferA”），1L 20 mM PB 500 mMNaCl，500 mM咪唑，pH7.4（简称“BufferB”），使用5ml Ni-NTA层析柱，用BufferA平衡层析柱，上样后再次用BufferA进行洗涤，采用线性方式进行蛋白洗脱，获得目的蛋白，纯化后目标蛋白检测如图4；通常在工艺中需要配置大量缓冲液且耗时长。

③PAL蛋白脱盐收集目的蛋白，利用5kDa离心式超滤管，在4℃条件下，4000 rpm离心，期间不断补充BufferA，使咪唑浓度低于0.5 mM，需耗时5h。

④利用紫外分光光度计测定蛋白溶液A280，计算酶蛋白浓度。

⑤使用HPLC测定总酶活，反应体系（500μL）：0.5mg/mL 纯酶，20mM苯丙氨酸，30mMMES，pH 6.0；室温下催化反应，150rpm反应30min后，加入500μL甲醇终止反应；离心，取上清进行HPLC检测酶解产物。

⑥HPLC检测PAL酶解反应产物-TCA方法如下，色谱柱：C18 (250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相： 1.5 %乙酸（A相）：乙腈（B相）；柱温：40 ℃；紫外检测波长：260 nm；流速：1mL/min；进样量：10 μL；

梯度洗脱条件如下表1。

表1：HPLC检测PAL酶解反应产物的洗脱条件。

同时绘制峰面积-反式肉桂酸TCA浓度标准曲线如图8，标准曲线为y=43253x-802.02，R² = 0.9803。

⑦在本实施例中，可以通过峰面积计算反式肉桂酸的生成量，进而计算PAL酶活，酶活及比酶活计算公式如下：

在本实施例中，反式肉桂酸生成量通过液相色谱标准曲线计算，反应时间为30min；

在本实施例中，酶浓度为0.5mg/ml，反应为0.5ml；

如此即可计算出酶活数值，本实施例中单批次获得的PAL比酶活见表2。

表2传统工艺中单批次筛选到PAL比酶活筛选数据

实施例2 磁珠法纯化PAL酶突变体以及比酶活的测定

1）PAL突变体粗酶液的制备

首先以PAL基因为例，通过易错PCR手段获得突变体库，挑取不同突变体至含有LB培养基的96深孔板中进行活化，37℃培养，待生长至OD600为0.8 左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃，1100 rpm培养过夜。将培养过夜的菌液4000 rpm，4℃条件下，离心5 min，弃上清，收集菌体。

配置100 mL含50 mM Tris-HCl / 150 mMNaCl，100 mM EDTA，10% Triton X-100，20 mg/ml溶菌酶缓冲液（简称“裂解液2”），使用裂解液2重悬细胞，在37℃ 200 rpm条件下裂解30min；将裂解细胞在4000 rpm，4℃条件下，离心5 min，获得上清作为PAL粗酶液，裂解后SDS-PAGE检测裂解情况如图2，可见相较于未优化过的方法，在蛋白溶出量上具有十分明显的提升。

2）磁珠法纯化PAL酶

在新的96深孔板中，每孔加入50μl镍磁珠，用纯化水清洗磁珠2次，用排枪吸取多余液体（下同）；用BufferA进行磁珠活化，弃上清；将粗酶液100 μl加入含有磁珠的96孔板中，漩涡混合30 min，磁珠分离后保存上清；将300 μl分别含有10、30、60 mM咪唑浓度的bufferA加入含磁珠的96孔板中，洗涤两次，磁珠分离后保存上清；用150 μl含有300 mM咪唑浓度的bufferA洗脱目的蛋白，磁珠分离后保存上清，进行SDS-PAGE检测，此法获得目的蛋白的纯度为85%，此过程优于传统工艺（如图5），并且仅需少量纯化缓冲液即可获得大量纯化样品，在准确性和经济性上都有相当的优势。

3）PAL纯酶定量

依据 Bradford 法，制备牛血清白蛋白的标准曲线，绘制的标准曲线如图3，标准曲线方程为y = 0.7888x + 1.4362，R² = 0.9917；根据标准曲线测定PAL纯酶的量，吸光度与酶浓度数据见表3。

4）绘制反式肉桂酸-A290标准曲线

配制0mM、0.05mM、0.10mM、0.15mM、0.20mM反式肉桂酸溶液，测量并纪录在290nm下的吸光值，绘制标准曲线如图7，吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线为y=10.599x-0.0679，R² = 0.9991。重复实验表明，反式肉桂酸-A290标准曲线具有很好的线性及批次间重复性，不需要在多次酶活测定实验中重复绘制。

5）PAL酶活测定

取180μl缓冲液（150 mM MES， pH6.0），加入50 μl反应底物（0.1M苯丙氨酸，充分混匀后，加入20 μl纯酶液，使用酶标仪，在290nm条件下，测定15 min前后产物吸光度值，记录反应前后吸光度差值，参见表3。

6）在本实施例中，可以通过吸光值变化量ΔOD计算反式肉桂酸的生成量，进而计算PAL酶活，通过Bradford法测量吸光值获取酶酶蛋白浓度，从而进一步获取比酶活数值，酶活及比酶活计算公式如下：

在本实施例中，反应体系为0.25ml，吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数0.0106μM^-1，反应时间为15min；

在本实施例中，酶浓度由Bradford测得，酶添加量为0.02ml；

如此即可简单计算出酶活数值，本次磁珠法纯化工艺中单批次获得的PAL比酶活见表3。

表3磁珠法纯化工艺中单批次获得的PAL比酶活筛选数据

结合表2和表3数据，验证本发明与常规测定PAL比酶活方法相比，不仅可以获得与HPLC法测定比酶活准确性相当的数据，还可以单批次获得更多优质比酶活数据。

实施例3优化磁珠法纯化工艺过程

按照实施例2中进行高通量纯化，不同的是，对于2）磁珠法纯化PAL酶的弃上清步骤中，用排枪吸附更换为磁铁吸附，具体地：将磁铁放置孔板底部，吸附磁珠采用倒扣式弃上清液，保证了纯化过程中取样的均一性，最终得到目的蛋白纯度可达98%（如图6），可以明显观察到，与过程优化前相比，蛋白纯度有明显的提升，进一步提高了比酶活测量的精度。

为了排除蛋白样品中高浓度咪唑对蛋白定量的影响，本发明依据 Bradford 法，分别用纯化水和含有300 mM咪唑浓度的bufferA稀释牛血清白蛋白，绘制标准曲线。以野生型PAL蛋白为例，用实施例2和3的方法获得纯化后的PAL蛋白，分别用图3中两种标准曲线测定PAL酶蛋白浓度，重复3次实验。结果显示（参见表4），两种标准曲线计算的酶蛋白浓度差值结果低于0.1，因此排除蛋白中高浓度咪唑对蛋白定量的影响。

表4不同标准曲线对PAL蛋白定量的结果

将实施例3中纯化后得到的突变体5和6，各取500微升加入10 kDA超滤管中，在4℃、4000rpm条件下，离心，循环补充BufferA，直至蛋白中咪唑浓度低于5mM，取出样品，参照实施例2中步骤（3）和（4）方法进行比酶活测定，获得比酶活数据与纯化后获得的突变体5和6的比酶活数据对比，结果表明(参见表5)，利用本发明方法可以略去传统工艺中超滤脱盐步骤。

表5两种突变体脱盐前后的比酶活

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化及其比酶活的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将不同的含有苯丙氨酸酶突变体的大肠杆菌进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；

2）采用磁珠法对不同苯丙氨酸酶突变体进行高通量纯化，作为待测样品；

3）对所述待测样品进行蛋白定量获得酶浓度；

，

吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；

5）计算比酶活，其中，

。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1）中的蛋白表达于96深孔板进行。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1）中的所述细胞裂解采用的细胞裂解液配方为50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，100 mM EDTA，10% Triton X-100，20 mg/ml溶菌酶。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2）中的纯化操作包括：磁珠的清洗，磁珠活化，目的蛋白与磁珠的结合，磁珠的洗涤，目的蛋白的洗脱。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，步骤2）中的纯化操作为：于新的96深孔板中，每孔加入50 μl磁珠，用纯化水清洗磁珠2次，用Buffer A进行磁珠活化，弃上清；将100 μl所述粗酶液分别加入含有磁珠的96孔板中，漩涡混合，磁珠分离，将含不同咪唑浓度的buffer A加入96孔板中，洗涤两次，再次磁珠分离；用150 μl含有300 mM咪唑浓度的buffer A洗脱目的蛋白，作为待测样品，所述Buffer A配方为20 mM PB， 500 mM NaCl，pH7.4。

6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述不同咪唑浓度分别为10 mM、30mM、60 mM咪唑浓度。

7.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述磁珠分离的操作中采用磁铁放置孔板底部，倒扣式弃上清液。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3）中的定量方法为Bradford法。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，步骤3）中的定量方法中采用牛血清白蛋白制备标准曲线。

10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4）中的MES的浓度为150mM，pH6.0。