CN117230039A - 一种无机焦磷酸酶分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域。本发明提供了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，本发明依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析，采用三步层析，其中阳离子交换层析和疏水层析采用流穿的模式，工艺简单，更好地保持蛋白的结构，从而保持活性等；本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法，步骤简单、收率高、成本低，可以为重组或天然的无机焦磷酸酶纯化提供参考，所制备的蛋白无标签，便于结构分析及酶学性质分析，易于工业化放大生产，该纯化方法得到的无机焦磷酸酶纯度高于95％，酶的比活性高于500U/mg，内毒素含量及宿主DNA残留极低，能够很好的运用于DNA扩增以及RNA体外转录实验。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种无机焦磷酸酶分离纯化方法。
背景技术
无机焦磷酸酶(Inorganic Pyrophosphatase，PPase)是一种自然界普遍存在的酶，PPase是主要以焦磷酸为底物的水解酶，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸(Inorganic pyrophosphate，PPi)(P207 4-)的水解。PPase催化焦磷酸水解为正磷酸，即P207 4-+H20→2HP04 2-。这个过程是一个高放能的过程，将多种代谢过程中产生的PPi水解，防止其过度积累，因此该反应可以偶联到一些不利于生物转化的过程中，从而促进热力学平衡向生物合成方向进行。
PPase用于各种各样的生物技术应用基于这些酶推动反应向前发展的能力并产生易于分析的产物，在DNA测序反应、PCR和单碱基延伸反应中防止PPi的积累造成的反应抑制；在体外转录过程，通过增加RNA的产量以及通过酶促合成增加GDP修饰糖的产量。此外，PPase还常用于量化释放PPi作为副产物的反应速率，例如单核苷酸多态性基因分型反应、病毒RNA依赖性RNA聚合酶的RNA合成和氨酰-tRNA合成酶活性。
在这些应用中，PPase需要具有低内毒素、无RNase污染，低HCD残留的性质，否则会降低PPase的作用效率，影响产物的合成速率。此外PPase作为mRNA疫苗生产的工具酶，在原料工具酶中占比达14％，需求量较大，亟需能满足工业化的纯化工艺。
据现有专利报道，无机焦磷酸酶的纯化主要通过分子构建时加入融合标签如His标签等，从而利用亲和层析进行纯化得到高纯度的目的蛋白。但是为了提高收率对目的蛋白进行过表达时，亲和标签可能会干扰蛋白质的功能、结构以及后续的检测，所以往往需要接近天然的无标签蛋白。去除标签可以使用酶切的方式，再进行亲和层析，操作繁琐且蛋白收率降低，活性降低，同时切口附近容易产生多余的氨基酸残基。现有技术公开了一种分离纯化无机焦磷酸酶的方法，就是利用亲和层析、阴离子和体积排阻的组合进行纯化。该方法主要是通过目的蛋白上带有的His标签进行富集，用阴离子和体积排阻的方式进行纯化及提纯。在利用His标签蛋白进行纯化时，宿主蛋白中还含有半胱氨酸及其它天然组氨酸丰富的区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致非目标蛋白的非特异性结合，导致最终成品纯度不达预期；金属螯合层析伴随的金属离子脱落，可能造成对目标蛋白性能的影响，同时也是mRNA工艺过程中的污染物；同时，在蛋白的结构解析研究或体外诊断试剂的应用中，亲和标签可能会给研究带来潜在干扰。而体积排阻放大不易，工艺成本较高，通常不做为产业化工艺的优先选择，投入与收益不成正比。
因此建立无机焦磷酸酶纯化方法且同时具备可放大，产品无RNase/DNase污染，HCD和内毒素低，金属残留低，能够广泛应用于mRNA疫苗等生物制剂的生产过程中，具有很好的经济价值和社会意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，以解决现有技术中存在的技术问题。
第一方面，本发明提供了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，包括以下步骤：
取PPase粗酶液；
向所述PPase粗酶液中加入阳离子聚合物，过滤，得到上清液；
将所述上清液进行阴离子交换层析，得到阴离子层析洗脱液；
将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，得到阳离子层析洗脱液；
将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，得到疏水层析洗脱液；
对所述疏水层析洗脱液进行超滤置换，得到PPase成品。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，所述阳离子聚合物包括聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚氨基酯、壳聚糖、聚丙烯胺、二乙氨乙基葡聚糖、聚氨树枝状聚合物中的至少一种。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，将所述上清液进行阴离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Q强阴离子交换剂和/或DEAE弱阴离子交换剂；
所述Q强阴离子交换剂包括Q Sepharose BB、Q Sepharose FF、Q Sepharose HP、QSepharose XL中的至少一种；
所述DEAE弱阴离子交换剂包括DEAE Sepharose FF、DEAE Sephacel、Capto DEAE中的至少一种；
和/或，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括SP强阳离子交换剂和/或CM弱阳离子交换剂；
所述SP强阳离子交换剂包括SP Sepharose BB、SP Sepharose FF、SP SepharoseHP中的至少一种；
所述CM弱阳离子交换剂包括CM Sepharose BB、CM Sepharose FF、CM SepharoseHP中的至少一种；
和/或，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Phenyl强疏水交换剂和/或Butyl弱疏水交换剂；
所述Phenyl强疏水交换剂包括Phenyl Sepharose 6FF、Phenyl Sepharose HP中的至少一种；
所述Butyl弱疏水交换剂包括Butyl Sepharose 4FF、Butyl Sepharose 6FF、Butyl SepharoseHP、Octyl Sepharose 4FF中的至少一种。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，将所述上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
洗杂：采用Buffer B1缓冲液冲洗柱床；
洗脱：采用Buffer B2缓冲液洗脱柱床；
CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
其中，所述Buffer A1缓冲液包括Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
所述Buffer B1缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
所述Buffer B2缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
上样：调节所述阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
所述Buffer A1缓冲液包括Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A2缓冲液平衡柱床；
上样：向所述阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，随后进行疏水柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A2缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用H2O和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
所述Buffer A2缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4或NaCl或KCl中的任一种的混合物。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，将所述上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110～220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后110-220cm/h的流速进行离子柱上样；其中，采用Tris或盐酸调节上清液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对上清液进行稀释以调节上清液电导率；
再平衡：继续采用5～10倍柱体积Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
洗杂：采用5～10倍柱体积Buffer B1缓冲液以110-220cm/h的流速冲洗柱床；
洗脱：采用5～10倍柱体积Buffer B2缓冲液以110-220cm/h的流速洗脱柱床；
CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以240-450cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速平衡柱床；
上样：调节所述阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后以240-450cm/h的流速进行离子柱上样；其中，采用Tris或盐酸调节阴离子层析洗脱液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释以调节阴离子层析洗脱液电导率；
再平衡：继续采用3～5倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110-220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用3～5倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
上样：向所述阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，随后以110-220cm/h的流速进行疏水柱上样；所述电解盐包括(NH4)2SO4、NaCl、KCl中的任一种；
再平衡：继续采用2～3倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用H2O和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，所述Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5；
和/或，所述Buffer B1缓冲液中NaCl的浓度为0.05～0.15M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer B1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0；
和/或，所述Buffer B2缓冲液中NaCl的浓度为0.2～0.4M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer B2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0；
和/或，所述Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、(NH4)2SO4的浓度为0.5～1M、NaCl或KCl的浓度均为1～1.5M，所述Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，对所述疏水层析洗脱液进行超滤置换得到PPase成品，具体包括：
将所述疏水层析洗脱液使用截留分子量不大于10KD超滤膜包进行超滤浓缩、置换，得到超滤置换半成品；
向所述超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA，过滤，得到PPase成品；
其中，所述置换所用置换缓冲液包括Tris-HCl和NaCl的混合物，所述置换缓冲液中Tris-HCl浓度为0.02～0.06M、pH为7.3～7.9，NaCl浓度为0.1～0.3M。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，向所述超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA的步骤中，所述甘油与超滤置换半成品的体积比为(1～3):(1～3)；加入DTT后DTT的浓度为0.1～1mM；加入EDTA后EDTA的浓度为0.1～1mM。
优选的是，所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，所述PPase粗酶液的配制方法包括：
取表达重组PPase基因的细胞发酵液或细胞裂解液进行离心获得上清液，即为PPase粗酶液；
向所述PPase粗酶液中加入阳离子聚合物的步骤中，所述阳离子聚合物的质量为所述PPase粗酶液质量的0.05～3％。
本发明的一种无机焦磷酸酶分离纯化方法现有技术具有以下有益效果：
本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法，依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析，采用三步层析，其中阳离子交换层析和疏水层析采用流穿的模式，工艺简单，更好地保持蛋白的结构，从而保持活性等；本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法，步骤简单、收率高、成本低，可以为重组或天然的无机焦磷酸酶纯化提供参考，所制备的蛋白无标签，便于结构分析及酶学性质分析，易于工业化放大生产，该纯化方法得到的无机焦磷酸酶纯度高于95％，酶的比活性高于500U/mg，内毒素含量及宿主DNA残留极低，能够很好的运用于DNA扩增以及RNA体外转录实验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中的无机焦磷酸酶分离纯化方法的流程示意图；
图2为实施例1中10g级菌泥分离纯化过程SDS-PAGE图；
图3为实施例2中100g级菌泥分离纯化过程SDS-PAGE图；
图4为实施例3和实施例1中最终分离纯化得到的PPase成品的SDS-PAGE图；
图5为实施例1～2中得到的PPase成品的SDS-PAGE图；
图6为实施例1～2中得到的PPase成品的RNase的检测结果图；
图7为不同的无机焦磷酸酶稳定性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
本申请实施例提供了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、取PPase粗酶液；
S2、向PPase粗酶液中加入阳离子聚合物，过滤，得到上清液；
S3、将上清液进行阴离子交换层析，得到阴离子层析洗脱液；
S4、将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，得到阳离子层析洗脱液；
S5、将阳离子层析洗脱液进行疏水层析，得到疏水层析洗脱液；
S6、对疏水层析洗脱液进行超滤置换，得到PPase成品。
需要说明的是，本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法，步骤S2中通过向PPase粗酶液中加入阳离子聚合物，阳离子聚合物以沉淀的方式除去PPase粗酶液中大量酸性蛋白以及大量核酸，离心过滤后得到上清液，目的蛋白位于上清液中；步骤S3中将上清液进行阴离子交换层析富集目的蛋白，提升比活力，降低内毒素含量以及DNA残留；步骤S4中将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，以进一步纯化PPase；步骤S5中将阳离子层析洗脱液进行疏水层析，进一步精纯PPase，再次去除宿主DNA；本发明中通过阳离子聚合物等絮凝剂沉淀能够去除绝大部分酸性蛋白以及宿主DNA，进行阴阳离子层析纯化能够快速提升目的蛋白的纯度，去除大部分污染物的同时去除宿主DNA，接着进行疏水层析进一步去除宿主DNA，最终通过层析串联能够获得纯度95％以上，且符合生产工艺要求的目的蛋白；使用本方法得到的无机焦磷酸酶酶活高，纯度高，催化效率高，内毒素残留低，RNase无检出，可很好地应用于mRNA疫苗生产，以及后续的核酸扩增、体外转录等应用中，避免亲和标签对蛋白的结构解析研究或体外诊断试剂的应用中带来的潜在干扰。
本发明依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析，采用三步层析，其中阳离子交换层析和疏水层析采用流穿的模式，工艺简单，更好地保持蛋白的结构，从而保持活性等；本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法，步骤简单、收率高、成本低，可以为重组或天然的无机焦磷酸酶纯化提供参考，所制备的蛋白无标签，便于结构分析及酶学性质分析，易于工业化放大生产，该纯化方法得到的无机焦磷酸酶纯度高于95％，酶的比活性高于500U/mg，内毒素含量及宿主DNA残留极低，能够很好的运用于DNA扩增以及RNA体外转录实验。
在一些实施例中，由于PPase粗酶液中杂蛋白过多以及含有大量的宿主核酸，选择使用阳离子聚合物沉淀，去除杂蛋白以及大部分核酸，提纯重组PPase；具体的，阳离子聚合物有聚丙烯酰胺(CPAM)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨基酯(PBAE)、壳聚糖(Chitosan)、聚丙烯胺(PAH)、二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)、聚氨树枝状聚合物(PAMAM)，优选为PEI。
在一些实施例中，超滤置换为本领域常规蛋白质的分离提纯方式，超滤置换的具体实施方式包括采用超滤膜材质的超滤管、超滤膜包等进行蛋白质的分离提纯。
在一些实施例中，将上清液进行阴离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Q强阴离子交换剂或DEAE弱阴离子交换剂；
Q强阴离子交换剂包括Q Sepharose BB、Q Sepharose FF、Q Sepharose HP、QSepharose XL中的至少一种；
DEAE弱阴离子交换剂包括DEAE Sepharose FF、DEAE Sephacel、Capto DEAE中的至少一种。
在一些实施例中，将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括SP强阳离子交换剂和/或CM弱阳离子交换剂；
SP强阳离子交换剂包括SP Sepharose BB、SP Sepharose FF、SP Sepharose HP中的至少一种；
CM弱阳离子交换剂包括CM Sepharose BB、CM Sepharose FF、CM Sepharose HP中的至少一种。
在一些实施例中，将阳离子层析洗脱液进行疏水层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Phenyl强疏水交换剂或Butyl弱疏水交换剂；
Phenyl强疏水交换剂包括Phenyl Sepharose 6FF、Phenyl Sepharose HP中的至少一种；
Butyl弱疏水交换剂包括Butyl Sepharose 4FF、Butyl Sepharose 6FF、ButylSepharose HP、Octyl Sepharose 4FF中的至少一种。
在一些实施例，将上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
S31、再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
S32、平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
S33、上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，此样品为阴离子层析上样液，随后进行离子柱上样，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；
S34、再平衡：继续Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
S35、洗杂：采用Buffer B1缓冲液冲洗柱床；
S36、洗脱：采用Buffer B2缓冲液洗脱柱床，得到阴离子层析洗脱液；
S37、CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
其中，Buffer A1缓冲液包括Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
Buffer B1缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
Buffer B2缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物。
在一些实施例中，将所述上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
S31、再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110～220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
S32、平衡：10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
S33、上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，此样品为阴离子层析上样液，随后以110-220cm/h的流速进行离子柱上样，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；其中，采用Tris或盐酸调节上清液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对上清液进行稀释以调节上清液电导率；
S34、再平衡：继续采用5～10倍柱体积Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
S35、洗杂：采用5～10倍柱体积Buffer B1缓冲液以110-220cm/h的流速冲洗柱床；
S36、洗脱：采用5～10倍柱体积Buffer B2缓冲液以110-220cm/h的流速洗脱柱床，得到阴离子层析洗脱液；
S37、CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
具体的，上清液经过阴离子交换层析，使用高盐梯度洗脱，收集目的蛋白峰；步骤S31中采用NaOH溶液以110-220cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；步骤S32中，采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床，直至流出液pH为8.5，电导与平衡缓冲液电导相差1mS/cm以内；步骤S33中，上清液离心后用0.45μm滤膜过滤，然后调节pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样，具体以110-220cm/h的流速将上清液上样于阴离子层析柱，一步上样载量控制在每mL填料不超过0.2g菌。
具体的，步骤S33中调节上清液pH至7.0～8.5，若上清液pH低于7.0-8.5，则采用2MTris进行调节，若上清液pH高于7.0-8.5，采用稀盐酸(质量浓度为5％)进行调节。
具体的，步骤S33中，调节上清液电导率低于5ms/cm，通过使用Buffer A1缓冲液对上清液进行稀释，使其电导率低于5ms/cm。
具体的，步骤S37中，先采用NaCl溶液对层析柱进行CIP清洗、再采用NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
在一些实施例中，将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
S41、再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
S42、平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
S43、上样：调节阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，此样品为阳离子层析上样液，随后进行离子柱上样，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；
S44、再平衡：继续采用Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到阳离子层析洗脱液；
S45、CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
在一些实施例中，将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
S41、再生：采用0.5～1M NaOH溶液以240-450cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
S42、平衡：采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速平衡柱床；
S43、上样：调节所述阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，此样品为阳离子层析上样液，随后以240-450cm/h的流速进行离子柱上样，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；其中，采用Tris或盐酸调节阴离子层析洗脱液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释以调节阴离子层析洗脱液电导率；
S44、再平衡：继续采用3～5倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到阳离子层析洗脱液；
S45、CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
具体的，将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，收集流穿获得目的蛋白峰；步骤S41中，采用NaOH溶液以240-450cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；步骤S42中，采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速平衡柱床，直至流出液为pH8.5；步骤S43中，调节阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样，具体以240-450cm/h的流速上样，二步载量控制在每mL填料上样量不超过20mL上样液；步骤S44中，继续采用3～5倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡洗杂，用无热源的广口瓶收集流穿以及Buffer A1缓冲液。
具体的，步骤S43通过使用Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释，使其电导率低于5ms/cm；步骤S43中，调节阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5，若阴离子层析洗脱液pH低于7.0-8.5，则采用2M Tris进行调节，若阴离子层析洗脱液pH高于7.0-8.5，采用稀盐酸(质量浓度为5％)进行调节。
具体的，步骤S45中先采用NaCl溶液对层析柱进行CIP清洗，再采用NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
在一些实施例中，将阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
S51、再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
S52、平衡：采用Buffer A2缓冲液平衡柱床；
S53、上样：向阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，此样品为疏水层析上样液，随后进行疏水柱上样，样品经过疏水层析柱后流出的液体为流穿液；
S54、再平衡：继续采用Buffer A2缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到疏水层析洗脱液；
S55、CIP：依次采用H2O和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
Buffer A2缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4或NaCl或KCl中的任一种的混合物。
在一些实施例中，将阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
S51、再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110-220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
S52、平衡：采用3～5倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
S53、上样：向所述阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，此样品为疏水层析上样液，随后以110-220cm/h的流速进行疏水柱上样，样品经过疏水层析柱后流出液体为流穿液；所述电解盐包括(NH4)2SO4、NaCl、KCl中的任一种；
S54、再平衡：继续采用2～3倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到疏水层析洗脱液；
S55、CIP：依次采用H2O和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
具体的，将阳离子层析洗脱液进行进一步疏水层析，收集流穿组分获得目的蛋白峰；步骤S51中，采用NaOH溶液以110-220cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；步骤S52中，采用3～5倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床，直至流出液pH为8.5±0.5；步骤S53中，向阳离子层析洗脱液中加入(NH4)2SO4或NaCl或KCl中的任一种以增加阳离子层析洗脱液的电导率，随后进行疏水柱上样，具体的，电导率增加60～130mS/cm；步骤S53中，阳离子层析洗脱液上样前用0.45μm滤膜进行过滤后上样，三步载量控制在每mL填料上样量不超过10mL上样液；步骤S54中，继续采用2～3倍柱体积BufferA2缓冲液以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡洗杂，用无热源的广口瓶收集流穿以及再平衡液(即Buffer A2缓冲液)。
步骤S55中，先采用H2O对层析柱进行CIP清洗，再采用NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
上述Buffer A2缓冲液包括(NH4)2SO4或NaCl或KCl中的任一种以及Tris-HCl的混合物。
在一些实施例中，上述Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5。
在一些实施例中，上述Buffer B1缓冲液中NaCl的浓度为0.05～-0.15M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，BufferB1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0。
在一些实施例中，上述Buffer B2缓冲液中NaCl的浓度为0.2～-0.4M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，Buffer B2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0；
在一些实施例中，上述Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、(NH4)2SO4的浓度为0.5～1M、NaCl或KCl的浓度均为1～1.5M，Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5。
在一些实施例中，对疏水层析洗脱液进行超滤置换得到PPase成品，具体包括：
S61、将疏水层析洗脱液使用截留分子量不大于10KD超滤膜包进行超滤浓缩、置换，得到超滤置换半成品；
S62、向超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA，过滤，得到PPase成品；
其中，置换所用置换缓冲液包括Tris-HCl和NaCl的混合物，置换缓冲液中Tris-HCl浓度为0.02～0.06M、pH为7.3～7.9，NaCl浓度为0.1～0.3M。
具体的，超滤膜包采用截留分子量为10KD的PES/HY材质超滤膜包。
在一些实施例中，向超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA的步骤中，甘油与超滤置换半成品的体积比为(1～3):(1～3)；加入DTT后DTT的浓度为0.1～1mM；加入EDTA后EDTA的浓度为0.1～1mM。
在一些实施例中，PPase粗酶液的配制方法包括：
取表达重组PPase基因的细胞发酵液或细胞裂解液进行离心获得上清液，即为PPase粗酶液；
在一些实施例中，向PPase粗酶液中加入阳离子聚合物的步骤中，阳离子聚合物的质量为所述PPase粗酶液质量的0.1～1％。
在一些实施例中，PPase粗酶液的配制方法包括：
S11、克隆酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)的无机焦磷酸酶PPase基因片段，构建带PPase基因片段的重组质粒，转化到宿主细胞中进行诱导表达培养，即得到重组PPase的细胞菌株；
S12、胞内表达的重组PPase上清获得方法为：取重组PPase的细胞菌株采用BufferA缓冲液按照1:8～1:20(质量体积比，即细胞菌株与Buffer A缓冲液的质量体积比为1g:(8～20)mL)进行重悬，采用高压均质机，于800-900Bar，破碎完全后离心获得上清液，即为PPase粗酶液；其中，Buffer A缓冲液包括Tris-HCl(pH7.0～8.5)、甘油和吐温20的混合物，Buffer A缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02～0.1M、甘油体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％。
在一些实施例中，对疏水层析洗脱液进行超滤置换得到PPase成品，具体包括：
S61、超滤膜包去热源：根据样品量取合适面积的超滤膜包，超滤膜包的截留分子量不大于10KD，采用0.5M NaOH冲洗超滤膜包至少30min进行灭菌和去除热原，随后用超纯水冲洗膜包至pH为中性；
S62、超滤膜包润洗：随后采用置换缓冲液润洗超滤膜包，直至滤出pH为7.6±0.5，准备开始浓缩；置换缓冲液包括Tris-HCl和NaCl的混合物，置换缓冲液中Tris-HCl浓度为0.02～0.06M、pH为7.3～7.9，NaCl浓度为0.1～0.3M；
S63、浓缩：将超滤膜包管道入口和截留端放入疏水层析洗脱液中进行浓缩；浓缩至原体积的1/4，浓缩过程随时采用nano测定蛋白浓度，要求蛋白浓度不超过5mg/mL，浓缩完成时记录样品体积为V1；
S64、置换：加入3～5倍V1置换缓冲液进行置换，体积浓缩至V1时为第一遍，置换次数为3-5次，优选4次，置换终点为pH7.6±0.5，电导与置换缓冲液之间偏差不大于1mS/cm；得到超滤置换半成品；
S65、调配：准确量取一定体积的超滤置换半成品，按照体积比例1:1加入甘油，然后加入DTT(二硫苏糖醇)、EDTA，使得DTT的终浓度为0.1～1mM、EDTA的终浓度为0.1-1mM，充分混匀后采用0.22μm过滤，即得到PPase成品。
具体的，甘油、DTT、EDTA均为蛋白质的稳定剂，其中甘油是作为蛋白的保护剂；DTT(二硫苏糖醇)是作为还原剂，防止蛋白被氧化从而导致失活；低浓度的EDTA是蛋白的抑制剂，防止其失活。对疏水层析洗脱液进行超滤置换(后处理)得到PPase成品，其主要目的是将目的蛋白置换到保存buffer中以及将蛋白终浓度进行统一。
进一步的，如图1所示，其显示了本发明的无机焦磷酸酶分离纯化方法一种具体实施方式的流程示意图。具体的，细胞裂解液(具体为表达重组PPase基因的细胞发酵液或细胞裂解液)经过离心后分离得到澄清粗酶液，经过阳离子聚合物如PEI沉淀、离心、过滤得到上清液(即对应图1中一步层析上样液)，经过阴离子交换层析后得到阴离子层析洗脱液，再经过阳离子交换层析后得到阳离子层析洗脱液，再经过疏水交换层析后得到疏水层析洗脱液，经过后处理，得到PPase成品。
本发明通过阴离子交换层析能够去除粗酶液中大部分宿主自身杂蛋白，提高PPase的纯度和活性；对一步层析线性放大后，洗脱液的蛋白回收率稳定，表明工艺放大稳定可行，其中盐浓度会影响酶活力，因此在测试带盐样品时，需进行取样脱盐检测活性；通过阳离子交换层析能够去除一步洗脱样品中大部分杂酶，减少RNase污染；对二步层析线性放大后，洗脱液的蛋白和酶活回收率稳定，表明工艺放大稳定可行。其中盐浓度会影响酶活力的测定，因此在测试含盐样品时，需将样品脱盐处理后方可检测活性。疏水层析能够去除二步流穿样品中的绝大部分目的蛋白，提高PPase的纯度和活性。对三步层析线性放大后，洗脱液的蛋白和酶活回收率稳定，表明工艺放大稳定可行。其中盐浓度会影响酶活力的测定，因此在测试含盐样品时，需将样品脱盐处理后方可检测活性。
以下进一步以具体实施例说明本申请的无机焦磷酸酶分离纯化方法及其制备方法。本部分结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。如未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
本申请实施例提供了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、收集获得重组PPase的上清(对应上文中取PPase粗酶液)，具体包括以下步骤：
克隆酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)的无机焦磷酸酶PPase基因片段，构建带PPase基因片段的重组质粒，转化到宿主细胞中进行诱导表达培养，即得到重组PPase的细胞菌株；取PPase的胞内表达菌泥(即上文重组PPase的细胞菌株收集的菌体，菌泥量级为10g级，即菌泥质量为10g)，采用Buffer A缓冲液按照质量体积比为1g:10mL进行重悬，采用高压均质机，于800Bar下，破碎10min，离心获得上清(即上文提到的PPase粗酶液)；Buffer A缓冲液包括Tris-HCl(pH8.5)、甘油和吐温20的混合物，Buffer A缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.05M、甘油体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S2、PEI沉淀(对应上文中向PPase粗酶液中加入阳离子聚合物)
向S1中破碎上清中添加终浓度(体积浓度)为0.4％的PEI，去除杂蛋白以及大部分核酸，提纯重组PPase，过滤，得到上清液；
S3、一步Q Sepharose FF层析(对应上文中将上清液进行阴离子交换层析，得到阴离子层析洗脱液，即以Q Sepharose FF为介质填料进行阴离子交换层析)，具体包括以下步骤：
S31、去热源：采用0.5M NaOH溶液，以180cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S32、平衡：采用15倍柱体积Buffer A1缓冲液以180cm/h的流速平衡柱床(柱高10cm，柱体积为60mL，Q Sepharose FF层析柱床)，直至流出液pH为8.5，电导与平衡缓冲液电导相差1mS/cm以内；Buffer A1缓冲液中Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S33、上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率为3ms/cm(使用Buffer A1缓冲液稀释以降低上清液电导率)，此样品为Q Sepharose FF层析上样液，随后以150cm/h的流速上样于阴离子层析柱，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液，一步上样载量控制在每mL填料不超过0.2g菌株；
S34、再平衡：继续采用5倍柱体积Buffer A1缓冲液以150cm/h的流速平衡柱床；
S35、洗杂：采用6倍柱体积Buffer B1缓冲液以150cm/h的流速用Buffer B1缓冲液冲洗柱床；Buffer B1缓冲液中NaCl的浓度为0.05M、Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S36、洗脱：采用5倍柱体积Buffer B2缓冲液以160cm/h的流速洗脱柱床，得到阴离子层析洗脱液；Buffer B2缓冲液中NaCl的浓度为0.3M、Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S37、CIP：分别依次采用2M NaCl溶液和0.8M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
S4、二步SP Sepharose FF层析(对应上文中将阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，得到阳离子层析洗脱液，即以SP Sepharose FF为介质填料进行阳离子交换层析)，具体包括以下步骤：
S41、去热源：采用0.5M NaOH溶液以240cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S42、平衡：采用15倍柱体积Buffer A1缓冲液以240cm/h的流速平衡柱床(柱高12cm，柱体积为25mL，SP Sepharose FF层析柱床)，直至流出液pH为8.5，电导与平衡缓冲液电导相差1mS/cm以内；Buffer A1缓冲液中Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S43、上样：向阴离子层析洗脱液中添加Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释使其电导率降低至3mS/cm，并调节pH至7.0～8.5，此样品为SP Sepharose FF层析上样液，随后以245cm/h的流速上样于阳离子层析柱，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；二步载量控制在每mL填料上样量不超过20mL上样液(即阴离子层析洗脱液)；
S44、再平衡：继续采用5倍柱体积Buffer A1缓冲液以250cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到阴离子层析洗脱液；
S45、CIP：依次采用2M NaCl溶液和0.8M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
S5、三步Phenyl Sepharose 6FF层析(对应上文将阳离子层析洗脱液进行疏水层析，得到疏水层析洗脱液，即Phenyl Sepharose 6FF为介质填料进行疏水层析)，具体包括以下步骤：
S51、去热源：采用0.5M NaOH溶液以180cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S52、平衡：采用5倍柱体积Buffer A2缓冲液以150的流速平衡柱床(柱高10cm，柱体积50mL，Phenyl Sepharose 6FF层析柱床)；Buffer A2缓冲液中Tris-HCl(pH7.5)的浓度为0.02M、(NH4)2SO4的浓度为0.8M；
S53、上样：向阳离子层析洗脱液中加入电解盐(0.8M(NH4)2SO4)使其电导率增加95mS/cm，用0.45μm滤膜进行过滤，此样品为Phenyl Sepharose 6FF层析上样液，以160cm/h的流速进行疏水柱上样，样品经过疏水层析柱后流出液体为流穿液；三步载量控制在每mL填料上样量不超过10mL上样液(即阳离子层析洗脱液)；
S54、再平衡：继续采用3倍柱体积Buffer A2缓冲液以150cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到疏水层析洗脱液；
S55、CIP：依次采用H2O和1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。
S6、后处理(对应上文对疏水层析洗脱液进行超滤置换得到PPase成品)，具体包括以下步骤：
S61、超滤膜包去热源：根据样品量取合适面积的超滤膜包，超滤膜包的截留分子量不大于10KD，采用0.5M NaOH冲洗超滤膜包至少30min进行灭菌和去除热原，随后用超纯水冲洗膜包至pH为中性；
S62、超滤膜包润洗：随后采用置换缓冲液润洗超滤膜包，直至滤出pH为7.6±0.5，准备开始浓缩；置换缓冲液包括Tris-HCl和NaCl的混合物，置换缓冲液中Tris-HCl浓度为0.04M、pH为7.6，NaCl浓度为0.2M；
S63、浓缩：将超滤膜包管道入口和截留端放入疏水层析洗脱液中进行浓缩；浓缩至原体积的1/4，浓缩过程随时采用nano测定蛋白浓度，要求蛋白浓度不超过5mg/mL，浓缩完成时记录样品体积为V1；
S64、置换：加入4倍V1置换缓冲液进行置换，体积浓缩至V1时为第一遍，置换次数为4次，置换终点为pH7.6±0.5，电导与置换缓冲液之间偏差不大于1mS/cm；得到超滤置换半成品；
S65、调配：准确量取一定体积的超滤置换半成品，按照体积比例1:1加入甘油，然后加入DTT(二硫苏糖醇)、EDTA，使得DTT的终浓度为0.5mM、EDTA的终浓度为0.5mM，充分混匀后采用0.22μm过滤，即得到PPase成品。
实施例2
本申请实施例提供的无机焦磷酸酶分离纯化方法，同实施例1，不同在于，实施例2中所用的菌泥量级为100g级(即菌泥质量为100g)，且实施例2中一步Q Sepharose FF层析所用层析柱体积为612mL、二步SP Sepharose FF层析所用层析柱体积为150mL、三步PhenylSepharose 6FF层析所用层析柱体积为165mL。
实施例3
本申请实施例提供的无机焦磷酸酶分离纯化方法，同实施例1，不同在于，破碎絮凝后先采用阳离子SP层析进行提纯杂酶后再进行阴离子Q FF去除内毒素和绝大部分宿主杂蛋白，最后经过疏水phenyl层析精纯，后处理得到成品；
具体包括以下步骤：
本申请实施例提供了一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、收集获得重组PPase的上清；
S2、PEI沉淀；(S1～S2与实施例1完全相同)
S3、一步阳离子层析(以SP Sepharose FF为介质填料进行阳离子交换层析)，具体包括以下步骤：
S31、去热源：采用0.5M NaOH溶液以240cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S32、平衡：采用15倍柱体积Buffer A1缓冲液以240cm/h的流速平衡柱床(柱高12cm，柱体积为25mL，SP Sepharose FF层析柱床)，直至流出液pH为8.5，电导与平衡缓冲液电导相差1mS/cm以内；Buffer A1缓冲液中Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S33、上样：向上清液中中添加Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释使其电导率降低至3mS/cm，并调节pH至7.0～8.5，此样品为SP Sepharose FF层析上样液，随后以245cm/h的流速上样于阳离子层析柱，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液；一步载量控制在每mL填料上样量不超过0.5g菌株；
S34、再平衡：继续采用5倍柱体积Buffer A1缓冲液以250cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到阳离子层析洗脱液；
S35、CIP：依次采用2M NaCl溶液和0.8M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
S4、二步阴离子层析(即以Q Sepharose FF为介质填料进行阴离子交换层析)，具体包括以下步骤：
S41、去热源：采用0.5M NaOH溶液，以180cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S42、平衡：采用15倍柱体积Buffer A1缓冲液以180cm/h的流速平衡柱床(柱高10cm，柱体积为60mL，Q Sepharose FF层析柱床)，直至流出液pH为8.5，电导与平衡缓冲液电导相差1mS/cm以内；Buffer A1缓冲液中Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S43、上样：调节阳离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率为3ms/cm(使用BufferA1缓冲液稀释以降低阳离子层析洗脱液电导率)，此样品为Q Sepharose FF层析上样液，随后以150cm/h的流速上样于阴离子层析柱，样品经过离子层析柱后流出液体为流穿液，二步上样载量控制在每mL填料不超过20ml上样液(即阳离子层析洗脱液)；
S44、再平衡：继续采用5倍柱体积Buffer A1缓冲液以150cm/h的流速平衡柱床；
S45、洗杂：采用6倍柱体积Buffer B1缓冲液以150cm/h的流速用Buffer B1缓冲液冲洗柱床；Buffer B1缓冲液中NaCl的浓度为0.05M、Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S436、洗脱：采用5倍柱体积Buffer B2缓冲液以160cm/h的流速洗脱柱床，得到阴离子层析洗脱液；Buffer B2缓冲液中NaCl的浓度为0.3M、Tris-HCl(pH8.5)的浓度为0.02M、甘油的体积浓度为5％、吐温20的体积浓度为0.1％；
S47、CIP：分别依次采用2M NaCl和0.8M NaOH对层析柱进行CIP清洗；
S5、三步疏水层析(即以Phenyl Sepharose 6FF为介质填料进行疏水层析)，具体包括以下步骤：
S51、去热源：采用0.5M NaOH溶液以180cm/h的流速冲洗层析柱，至少进行30min灭菌并去除热原；
S52、平衡：采用5倍柱体积Buffer A2缓冲液以150的流速平衡柱床(柱高10cm，柱体积50mL，Phenyl Sepharose 6FF层析柱床)；Buffer A2缓冲液中Tris-HCl(pH7.5)的浓度为0.02M、(NH4)2SO4的浓度为0.8M；
S53、上样：向阴离子层析洗脱液中加入电解盐(0.8M(NH4)2SO4)使其电导率增加95mS/cm，用0.45μm滤膜进行过滤，此样品为Phenyl Sepharose 6FF层析上样液，以160cm/h的流速进行疏水柱上样，样品经过疏水层析柱后流出液体为流穿液；三步载量控制在每mL填料上样量不超过10mL上样液(即阴离子层析洗脱液)；
S54、再平衡：继续采用3倍柱体积Buffer A2缓冲液以150cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡，收集流穿液及再平衡液得到疏水层析洗脱液；
S55、CIP：依次采用H2O和1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
S6、后处理，同实施例1。
性能测试
分别按照实施例1～2中的方法，测试得到的无机焦磷酸酶酶活，结果如下表1所示。
表1-实施例1～2中得到的无机焦磷酸酶酶活
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具体的，表1中实施例2中随着菌泥量级增加，柱体积随之增加；层析收率是指洗脱样品蛋白量占上样样品蛋白量的百分比。其中，一步层析收率是指阴离子洗脱液中蛋白总量占上样蛋白总量的百分比；二步层析洗脱液是指阳离子洗脱液中蛋白总量占阴离子洗脱液蛋白总量的百分比；三步层析洗脱液是指疏水层析洗脱液中蛋白总量占阳离子洗脱液蛋白总量的百分比。
从表1中可以看出，菌泥量级放大后，各个层析收率稳定，成品比酶活活性高且稳定，均大于500U/mg，证明此工艺工艺兼容性高，易放大，最终成品回收率高，比酶活稳定。
图2为实施例1中10g级菌泥分离纯化过程SDS-PAGE图；
图3为实施例2中100g级菌泥分离纯化过程SDS-PAGE图；
具体的，图2～3中，1表示Marker，2表示破碎上清，3表示破碎沉淀，4表示PEI上清(即步骤S2中上清液)，5表示PEI沉淀，6表示一步层析上样(对应步骤S33上样液)，7表示一步层析流穿(对应步骤S33流穿液)，8表示一步层析再平衡(对应步骤S34)，9表示一步层析洗杂(对应步骤S35)，10表示一步层析洗脱(对应步骤S36)，11表示一步层析采用2M NaCl对层析柱进行CIP清洗(对应步骤S37中采用2M NaCl对层析柱进行CIP清洗)，12表示一步层析采用0.8M NaOH对层析柱进行CIP清洗(对应步骤S37中采用0.8MNaOH对层析柱进行CIP清洗)，13表示二步层析上样(对应步骤S43上样液)，14表示二步层析洗脱(对应步骤S44洗脱液)，15表示二步层析中采用2M NaCl对层析柱进行CIP清洗(对应步骤S45中采用2M NaCl溶液对层析柱进行CIP清洗)，16表示二步层析中采用0.8M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗(对应步骤S45中采用0.8M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗)，17表示三步层析上样(对应步骤S53上样液)，18表示三步层析洗脱(对应步骤S54洗脱液)，19表示三步层析采用H2O对层析柱进行CIP清洗(对应步骤S55中采用H2O对层析柱进行CIP清洗)。
图4为实施例3和实施例1中最终分离纯化得到的PPase成品的SDS-PAGE图。图4中1表示Marker，2表示实施例3中得到的PPase成品，3表示实施例1中得到的PPase成品。
根据SDS-PAGE图(图4)显示实施例3工艺的最终PPase成品纯度为82％，实施例1工艺的PPase成品纯度为＞95％；实施例3工艺的收率为19.06mg/g菌，实施例1工艺的收率为36.98mg/g菌。综合最终成品纯度及蛋白收率选择实施例1的工艺路线。
纯度检测
将10g级菌泥和100g级菌泥分别分离纯化得到的重组PPase成品经SDS-PAGE检测分析，结果如图5所示。采用凝胶成像仪(Gel Doc XR+凝胶成像系统)扫描灰度，采用峰面积归一法，纯度均达到95.0％以上。图5中1为实施例1中采用10g级菌泥分离纯化得到的重组PPase成品，2为实施例2中采用100g级菌泥分离纯化得到的重组PPase成品。
内毒素含量的检测
取实施例1和实施例2中调配前样品(即步骤S64中超滤置换半成品)进行内毒素含量的测定，测定方法按照中国药典2020版四部通则1143细菌内毒素检查法中的凝胶法(鲎试剂)进行测定。测定结果显示，10g级PPase样品内毒素的含量范围0.2-0.3EU/mg，100g级PPase样品内毒素的含量范围为0.2-0.6EU/mg，远低于mRNA疫苗酶原料通用标准10EU/mg的限度。
DNA残留的检测
取实施例1和实施例2中得到的PPase成品进行DNA残留的检测，检测方法为：0.1U本品中残留的核酸经E.coli 16s rDNA特异性的TaqMan qPCR检测，E.coli基因组残留≤1拷贝。测定结果显示，10g级PPase成品的DNA残留含量为0.0103pg/μL，100g级PPase成品的DNA残留含量为0.0048pg/μL，远低于mRNA疫苗酶原料通用标准0.1pg/μL的限度，符合生产工艺的要求。
RNase的检测
对实施例1和实施例2的PPase成品进行RNase的检测，检测方法为：0.1U的PPase成品和1.6μg MS2 RNA在37℃下反应4小时，RNA的电泳谱带是否发生变化。检测结果如图6所示，实施例1和2得到的重组PPase产品中均无RNase污染，采购市场RNase free的PPase I产品进行RNase检测，RNase污染比竞品轻。其中，1、2代表实施例1的PPase成品，3、4代表实施例2的PPase成品，5代表市场采集的RNase free的PPase I产品。
无机焦磷酸酶活性测定
对实施例1和实施例2的PPase成品进行活性检测，测定在37℃条件下孵育不同天数(0，1，3，7d)PPase的活性。反应总体积为3mL，含0.75mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，0.06mol/L MgCl2，600mg/L Na4P2O7，10μL 2mg/mL的PPase蛋白，25℃反应10min；再加入26g/L钼酸铵溶液，20g/L抗坏血酸溶液，反应10min，测量710mm波长的吸光值。采购市场三种PPase I(分别为翌圣10658ES10、近岸M036-01A、NEB M0296S)进行稳定性检测结果如表2，图7所示，在25℃进行酶活检测，实施例1和实施例2的PPase成品在第7天的酶活残留依旧在60％以上，而竞品的酶活残留在第7天已经低于60％。因此，本发明的分离纯化方法制备的PPase产品相对市场同类型样品具有明显优势。
表2-不同的无机焦磷酸酶稳定性检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
取PPase粗酶液；
向所述PPase粗酶液中加入阳离子聚合物，过滤，得到上清液；
将所述上清液进行阴离子交换层析，得到阴离子层析洗脱液；
将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，得到阳离子层析洗脱液；
将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，得到疏水层析洗脱液；
对所述疏水层析洗脱液进行超滤置换，得到PPase成品。
2.如权利要求1所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，所述阳离子聚合物包括聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚氨基酯、壳聚糖、聚丙烯胺、二乙氨乙基葡聚糖、聚氨树枝状聚合物中的至少一种。
3.如权利要求1所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，将所述上清液进行阴离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Q强阴离子交换剂和/或DEAE弱阴离子交换剂；
所述Q强阴离子交换剂包括Q Sepharose BB、Q Sepharose FF、Q Sepharose HP、QSepharose XL中的至少一种；
所述DEAE弱阴离子交换剂包括DEAE Sepharose FF、DEAE Sephacel、Capto DEAE中的至少一种；
和/或，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括SP强阳离子交换剂和/或CM弱阳离子交换剂；
所述SP强阳离子交换剂包括SP Sepharose BB、SP Sepharose FF、SP Sepharose HP中的至少一种；
所述CM弱阳离子交换剂包括CM Sepharose BB、CM Sepharose FF、CM Sepharose HP中的至少一种；
和/或，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析的步骤中，层析柱内所用的介质填料包括Phenyl强疏水交换剂和/或Butyl弱疏水交换剂；
所述Phenyl强疏水交换剂包括Phenyl Sepharose 6FF、Phenyl Sepharose HP中的至少一种；
所述Butyl弱疏水交换剂包括Butyl Sepharose 4FF、Butyl Sepharose 6FF、ButylSepharoseHP、Octyl Sepharose 4FF中的至少一种。
4.如权利要求1所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，将所述上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
洗杂：采用Buffer B1缓冲液冲洗柱床；
洗脱：采用Buffer B2缓冲液洗脱柱床；
CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
其中，所述Buffer A1缓冲液包括Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
所述Buffer B1缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物；
所述Buffer B2缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物。
5.如权利要求1所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A1缓冲液平衡柱床；
上样：调节所述阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后进行离子柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用NaCl溶液和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
其中，所述Buffer A1缓冲液包括Tris-HCl、甘油和吐温20的混合物。
6.如权利要求1～5任一所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
再生：采用NaOH溶液冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用Buffer A2缓冲液平衡柱床；
上样：向所述阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，随后进行疏水柱上样；
再平衡：继续采用Buffer A2缓冲液对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用H2O和NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
所述Buffer A2缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4或NaCl或KCl中的任一种的混合物。
7.如权利要求6所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，将所述上清液进行阴离子交换层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110～220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
上样：调节上清液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后以110-220cm/h的流速进行离子柱上样；其中，采用Tris或盐酸调节上清液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对上清液进行稀释以调节上清液电导率；
再平衡：继续采用5～10倍柱体积Buffer A1缓冲液对上样后的层析柱以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
洗杂：采用5～10倍柱体积Buffer B1缓冲液以110-220cm/h的流速冲洗柱床；
洗脱：采用5～10倍柱体积Buffer B2缓冲液以110-220cm/h的流速洗脱柱床；
CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，将所述阴离子层析洗脱液进行阳离子交换层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以240-450cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用10～20倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速平衡柱床；
上样：调节所述阴离子层析洗脱液pH至7.0～8.5、电导率低于5ms/cm，随后以240-450cm/h的流速进行离子柱上样；其中，采用Tris或盐酸调节阴离子层析洗脱液pH，通过使用Buffer A1缓冲液对阴离子层析洗脱液进行稀释以调节阴离子层析洗脱液电导率；
再平衡：继续采用3～5倍柱体积Buffer A1缓冲液以240-450cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用1～3M NaCl溶液和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，将所述阳离子层析洗脱液进行疏水层析，具体包括：
再生：采用0.5～1M NaOH溶液以110-220cm/h的流速冲洗层析柱，并灭菌；
平衡：采用3～5倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速平衡柱床；
上样：向所述阳离子层析洗脱液中加入电解盐使其电导率增加60～130mS/cm，随后以110-220cm/h的流速进行疏水柱上样；所述电解盐包括(NH4)2SO4、NaCl、KCl中的任一种；
再平衡：继续采用2～3倍柱体积Buffer A2缓冲液以110-220cm/h的流速对上样后的层析柱进行再平衡；
CIP：依次采用H2O和0.5～1M NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗；
和/或，所述Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer A1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5；
和/或，所述Buffer B1缓冲液中NaCl的浓度为0.05～0.15M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer B1缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0；
和/或，所述Buffer B2缓冲液中NaCl的浓度为0.2～0.4M、Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、甘油的体积浓度为0～10％、吐温20的体积浓度为0～0.2％，所述Buffer B2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.0；
和/或，所述Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.02-0.05M、(NH4)2SO4的浓度为0.5～1M、NaCl或KCl的浓度均为1～1.5M，所述Buffer A2缓冲液中Tris-HCl的pH为7.0～8.5。
8.如权利要求1～5任一所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，对所述疏水层析洗脱液进行超滤置换得到PPase成品，具体包括：
将所述疏水层析洗脱液使用截留分子量不大于10KD超滤膜包进行超滤浓缩、置换，得到超滤置换半成品；
向所述超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA，过滤，得到PPase成品；
其中，所述置换所用置换缓冲液包括Tris-HCl和NaCl的混合物，所述置换缓冲液中Tris-HCl浓度为0.02～0.06M、pH为7.3～7.9，NaCl浓度为0.1～0.3M。
9.如权利要求8所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，向所述超滤置换半成品中加入甘油、DTT、EDTA的步骤中，所述甘油与超滤置换半成品的体积比为(1～3):(1～3)；加入DTT后DTT的浓度为0.1～1mM；加入EDTA后EDTA的浓度为0.1～1mM。
10.如权利要求1～5任一所述的无机焦磷酸酶分离纯化方法，其特征在于，所述PPase粗酶液的配制方法包括：
取表达重组PPase基因的细胞发酵液或细胞裂解液进行离心获得上清液，即为PPase粗酶液；
向所述PPase粗酶液中加入阳离子聚合物的步骤中，所述阳离子聚合物的质量为所述PPase粗酶液质量的0.05～3％。
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|---|---|---|---|---|
| CN117866038A (zh) * | 2024-03-11 | 2024-04-12 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
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| CN117866038B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
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