CN116790466B - 一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法。本发明以枯草芽孢杆菌为底盘，首先在枯草芽孢杆菌基因组上共表达酿酒酵母的胆碱激酶基因CKI和磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT，向发酵培养基中添加前体物氯化胆碱和5'‑胞苷单磷酸，然后整合表达内源的甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱转运蛋白基因opuD，最后缺陷5′‑核苷酸酶YfkN，以期减少CMP到胞苷的合成。结果表明：经本发明工程改造之后获得的枯草芽孢杆菌能够发酵合成胞磷胆碱，具有精确修饰目标基因、次级突变概率低、遗传育种周期短的优势，本发明的方法为将来工业上通过合成生物学手段，构建高效合成胞磷胆碱的枯细胞工厂提供了基础研究和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法。
背景技术
胞磷胆碱（Citicoline），又称胞嘧啶核苷-5′-二磷酸胆碱（CDPC）、胞二磷胆碱、胞胆碱。胞磷胆碱是细胞膜结构性磷脂生物合成过程中的一种关键物质，还是乙酰胆碱生物合成途径中胆碱的来源。胞磷胆碱作为哺乳动物的一种内源性化合物，用于改善动物和人类的大脑代谢，具有保护神经的特性，临床上主要用于脑手术和颅脑外伤所引起的意识障碍以及其它中枢神经系统急性损伤引起的功能和意识障碍、震颤麻痹、耳鸣和神经性耳聋及安眠药中毒等。
目前，胞磷胆碱的生产方法包括化学合成法、酶催化法和微生物转化法。化学合成法存在步骤复杂、转化率低、副产物多、污染环境等问题，不适合大规模生产，采用合成生物学手段开发高效合成胞磷胆碱的微生物细胞工厂，可有效解决化学合成法存在的问题，具有生产工艺简单、生产成本低、环境污染小等优势。
现阶段，胞磷胆碱的合成途径已被证明存在于众多的微生物中，如：在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内，存在完整的胞磷胆碱合成途径，邱蔚然等人以S. cerevisiaeCGMCC2842为出发菌株，利用化学诱变方法筛选出氯化钾敏感株，测得该菌株的CMP激酶和CKI活性增强，首先在5 L自动发酵罐中培养该菌株20 h，收集细胞沉淀破壁后作为粗酶液，以磷酸胆碱和CMP为底物进行反应，胞磷胆碱的转化率为85%（CN103436455A）；邓童心等人将S. cerevisiae来源的cct基因克隆到载体pYES2.0-Kanmx上，转化S. cerevisiaeHG，构建基因工程菌S.c HG/pYES2.0-Kanmx-cct，以磷酸胆碱和CMP为原料，反应7 h，胞磷胆碱的摩尔转化率为73%（CN107488603A）；蔡孟浩等人在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中表达S. cerevisiae来源的CCT、CKI和HNM1，将该重组菌培养至对数期后，接种至含有氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP的YPD培养基中发酵96 h，胞磷胆碱产量约为0.45 g/L（CN108424859A）；然而上述的方案中采用酵母发酵，发酵密度低，生产效率较低。
另外，大肠杆菌（Escherichia coli）内不存在完整的胞磷胆碱合成途径，有研究将S. cerevisiae的CCT引入E. coli中进行表达，用来催化胞磷胆碱的合成。如：李晓丹等人在E. coli中表达S. cerevisiae的、密码子优化后的cct，构建后的重组菌经诱导表达后的培养物作为酶源，以磷酸胆碱和CTP为底物进行反应，检测到胞磷胆碱的合成（CN105039366A）；罗勇等人在E. coli内表达内源的乳清苷酸焦磷酸化酶(PyrE)、乳清苷酸脱羧酶(PyrF)、尿甘酸激酶(PyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)、CTP连接酶(PyrG)和S. cerevisiae的CCT，以该重组菌为酶源，利用磷酸胆碱和乳清酸、氯化铵为底物反应24 h，胞磷胆碱的产量为6.9 g/L（CN105463042A）；李国庆等人以氯化胆碱和胞苷为底物，ATP和六偏磷酸钠为磷源供体，在UCK、PPK、CMK、NDK、CCT和CKI多酶体系的催化下合成胞磷胆碱钠，胞苷转化率>99%（CN114262726A）。但是E. coli分泌内毒素，以其为宿主生产的胞磷胆碱不能应用于医药行业。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是重要的工业菌株，具有良好的表达和分泌系统、良好的环境相容性和基因工程适应性，可通过简单廉价的培养方法进行大规模发酵，广泛应用于医药、食品、农业及工业领域。然而与E. coli一样，B. subtilis内也不存在完整的胞磷胆碱合成途径，但到目前为止，还未见工程改造B. subtilis发酵生产胞磷胆碱的相关报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法。
本发明所提供的工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，包括以下的步骤：
（1）CCT-CKI共表达菌株的制备：以枯草芽孢杆菌为底盘，在其基因组的yrpC位点上共表达酿酒酵母的磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，获得CCT-CKI共表达菌株；
（2）整合表达opuD：在枯草芽孢杆菌基因组上的ytsJ位点过表达内源的甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱转运蛋白基因opuD基因；
（3）敲除5′-核苷酸酶基因yfkN，获得yfkN敲除枯草芽孢杆菌菌株；
（4）采用（3）中获得的菌株进行发酵培养，生产胞磷胆碱，发酵的操作如下：
从平板上挑取新活化的（3）中制备的yfkN敲除单菌落菌株接入装有LB液体培养基的试管中，振荡培养，按1%的接种量转接至装有发酵培养基的锥形瓶中，振荡培养36~50 h，在发酵6 h时，添加氯化胆碱和5'-胞苷单磷酸，发酵结束后，离心，收集细胞沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤一次，然后加入5 mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，超声破碎后离心取上清，过滤即得。
上述的方法所涉及的各步骤中，（1）中以BS168NCm的基因组为模板，分别用引物yrpC-U1/yrpC-U2q、yrpC-D1q/yrpC-G2扩增片段U（如SEQ ID No.29所示，1062 bp）、DCRG（如SEQ ID No.30所示，3978 bp）；以质粒pUC57-Simple-vgb为模板，用引物TP2-1/TP2-2q扩增含有组成型强启动子TP2的片段P（如SEQ ID No.31所示，183 bp）；以酿酒酵母的基因组为模板，分别用引物CCT-1/CCT-2、CKI-1q/CKI-2扩增含有CCT基因序列的片段C1（如SEQID No.32所示，1276 bp）、含有CKI基因序列的片段C2（如SEQ ID No.33所示，1870 bp）；然后通过重叠PCR的方法，利用引物yrpC-U1/CCT-2，将片段U、P和C1拼接成片段UPC1（2521bp）；再利用引物yrpC-U1/yrpC-G2将片段UPC1、C2和DCRG拼接成片段UPC1C2DCRG（如SEQIDNo.34所示，8369 bp），最后将片段UPC1C2DCRG转化受体菌BS168N的感受态细胞，经筛选，获得CCT-CKI共表达菌株。
上述的步骤（2）中，以BS168NJm的基因组为模板，分别用引物ytsJ-U1/ytsJ-U2q、opuD-1q/opuD-2、ytsJ-D1q/ytsJ-G2扩增片段U（如SEQ ID No.35所示，1636 bp）、含有opuD基因序列的片段O（如SEQ ID No.36所示，1745bp）、DCRG（如SEQ ID No.37所示，4035 bp）；以质粒pMA5为模板，用引物PHpaII-1/PHpaII-2扩增含有组成型强启动子P HpaII 的片段P（如SEQID No.38所示，274 bp）；然后通过重叠PCR方法，利用引物ytsJ-U1/PHpaII-2，将片段U和P拼接成片段UP（1934 bp），再利用引物ytsJ-U1/ytsJ-G2，将片段UP、O和DCRG拼接成片段UPODCRG（如SEQ ID No.39所示，7690 bp），将片段UPODCRG转化受体菌BSC1-2的感受态细胞，经筛选，获得P HpaII -opuD在ytsJ位点整合表达的重组菌株BSC2。提取基因组，并利用引物PHpaII-1/opuD-2进行扩增，利用引物PHpaII-1/CX-opuD2/opuD-2进行测序，结果表明无额外点突变。
上述的步骤（3）中，以BS168NCm的基因组为模板，分别用引物yfkN-U1/yfkN-U2、yfkN-D1q/yfkN-D2、yfkN-CR1q/yfkN-CR2、yfkN-G1q/yfkN-G2扩增片段U（如SEQ ID No.40所示，1164 bp）、D（如SEQ ID No.41所示，1138 bp）、CR（如SEQID No.42所示，2069 bp）、G（如SEQ ID No.43所示，931 bp）；然后通过重叠PCR方法，利用引物yfkN-U1/yfkN-D2，将片段U和D拼接成片段UD，再利用引物yfkN-U1/yfkN-G2将片段UD、CR和G拼接成片段UDCRG（如SEQ ID No.44所示，5302bp），最后将片段UDCRG转化受体菌BSC2的感受态细胞，经筛选，获得yfkN敲除菌株BSC3。
优选的，（4）中所述的发酵培养基，包括：葡萄糖20～80 g/L、胰蛋白胨5～15 g/L、酵母提取物1～9 g/L、NaCl 5～15 g/L、MgSO4•7H2O 0.4～2 g/L、氯化胆碱0.1～6 g/L、5'-胞苷单磷酸0.01～2 g/L。
优选的，发酵的条件为：pH为6.0～8.0，发酵温度35～45℃，转速100～250 r/min。
此外，采用本发明的工程改造获得的枯草芽孢杆菌在发酵生产胞磷胆碱中的应用也是本发明所要重点保护的技术范围。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，经改造后的枯草芽孢杆菌能够合成胞磷胆碱，具有精确修饰目标基因、次级突变概率低、遗传育种周期短的优势。
（2）本发明首次以通常被认为是安全的枯草芽孢杆菌为出发菌，通过整合共表达酿酒酵母的CCT和CKI基因，打通了胆碱到胞磷胆碱的合成通路，同时表明CKI中216位的谷氨酸突变为甘氨酸有利于胞磷胆碱的合成；表达内源的OpuD，胞磷胆碱合成增加，说明该酶不仅具有转运甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱的功能，还具有转运氯化胆碱的功能；缺陷YfkN，阻断CMP到胞苷的合成，进一步促进了胞磷胆碱的合成，为工业上通过合成生物学手段构建高效合成胞磷胆碱的枯草芽孢杆菌细胞工厂提供基础研究和理论依据。
附图说明
图1为本发明的B. subtilis内CDPC的生物合成途径及工程改造策略示意图；
其中，ATP：5'-腺苷三磷酸；ADP：5'-腺苷二磷酸；CMP：5'-胞苷单磷酸；CDP：5'-胞苷二磷酸；CTP：5'-胞苷三磷酸；PPi：焦磷酸；CDPC：胞磷胆碱；OpuD：甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱转运蛋白；CKI：胆碱激酶；CCT：磷酸胆碱胞苷酰转移酶；Cmk：胞苷酸激酶；Ndk：核苷二磷酸激酶；YfkN：2'，3'-环核苷酸磷酸二酯酶、2'（或3'）-核苷酸酶、5'-核苷酸酶；
图2为胞磷胆碱的HPLC色谱图；
其中，A为胞磷胆碱标准品的HPLC色谱图；B为菌株BSC3发酵48 h后的细胞沉淀经处理后的上清的HPLC色谱图。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好地理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
一、菌株、质粒和培养基的准备及来源。
本发明涉及的所有菌株和质粒信息详见表1，引物由GenScript公司合成。
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，用于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的一般培养，固体培养基添加15 g/L琼脂粉，需要时加入新霉素16 μg/mL，或氯霉素8 μg/mL。
发酵培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，葡萄糖40 g/L、MgSO4•7H2O 1.0 g/L、氯化胆碱0.5 g/L、CMP 0.05 g/L。
表1 实验中涉及的菌株和质粒
二、试剂及仪器。
2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)、2×Taq Master Mix (Dye Plus)均购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技股份有限公司；酵母基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；标准品胞磷胆碱钠购自Sigma-Aldrich（USA）；其余生化试剂为国产分析纯试剂。
所用仪器：PCR仪（LifeECO）、酶标仪（Thermo）、超声笔细胞破碎仪（宁波新芝）、高效液相色谱仪（Agilent）。
三、引物与片段。
用于PCR的28种引物见表2。
表2 28种PCR引物序列
本发明的一种工程改造枯草芽孢杆菌生产胞磷胆碱的方法如下：
DNA操作：所有的DNA片段都来自PCR扩增，用于转化的DNA片段均采用重叠PCR方法拼接而成。
B. subtilis感受态细胞的制备及转化采用Spizizen方法。
本实验采用的无标记基因修饰原理详见专利CN108715825A。
实施例1
（1）CCT-CKI共表达菌株的制备：在B. subtilis基因组上的yrpC位点共表达酿酒酵母（S. cerevisiae）的CCT和CKI基因。
首先，以BS168NCm的基因组为模板，分别用引物yrpC-U1/yrpC-U2q、yrpC-D1q/yrpC-G2扩增片段U（如SEQ ID No.29所示，1062 bp）、DCRG（如SEQID No.30所示，3978 bp）；以质粒pUC57-Simple-vgb为模板，用引物TP2-1/TP2-2q扩增含有组成型强启动子TP2的片段P（如SEQ ID No.31所示，183 bp）；以S. cerevisiae的基因组为模板，分别用引物CCT-1/CCT-2、CKI-1q/CKI-2扩增含有CCT基因序列的片段C1（如SEQ ID No.32所示，1276 bp）、含有CKI基因序列的片段C2（如SEQ ID No.33所示，1870 bp）。
其次，通过重叠PCR方法，利用引物yrpC-U1/CCT-2，将片段U、P和C1拼接成片段UPC1（2521 bp）；再利用引物yrpC-U1/yrpC-G2将片段UPC1、C2和DCRG拼接成片段UPC1C2DCRG（如SEQ ID No.34所示，8369 bp）。
最后，将片段UPC1C2DCRG转化受体菌BS168N的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得五株CCT-CKI共表达菌株，分别提取基因组，并利用引物TP2-1/CKI-2进行扩增，然后利用引物TP2-1/CCT-2/CX-CC3/CKI-2进行测序，结果得到1株无额外点突变的重组菌和3株带有不同额外点突变的重组菌，菌株命名如表3所示。
表3 测序结果及菌株命名
| 序号 | 碱基突变 | 对应氨基酸突变 | 菌株命名 |
| 1 | CKI：t119c、a711g | CKI：L40P、Q237Q | BSC1-1 |
| 2 | CKI：a647g、t1744c | CKI：E216G、L582L | BSC1-2 |
| 3 | CCT：c1268t | CCT：A423V | BSC1-3 |
| 4 | —— | —— | BSC1-4 |
（2）整合表达opuD：在B. subtilis基因组上的ytsJ位点过表达内源的opuD基因。
首先，以BS168NJm的基因组为模板，分别用引物ytsJ-U1/ytsJ-U2q、opuD-1q/opuD-2、ytsJ-D1q/ytsJ-G2扩增片段U（如SEQ ID No.35所示，1636 bp）、含有opuD基因序列的片段O（如SEQ ID No.36所示，1745 bp）、DCRG（如SEQ ID No.37所示，4035 bp）；以质粒pMA5为模板，用引物PHpaII-1/PHpaII-2扩增含有组成型强启动子P HpaII 的片段P（如SEQ IDNo.38所示，274 bp）。
其次，通过重叠PCR方法，利用引物ytsJ-U1/PHpaII-2，将片段U和P拼接成片段UP（1934 bp），再利用引物ytsJ-U1/ytsJ-G2，将片段UP、O和DCRG拼接成片段UPODCRG（如SEQID No.39所示，7690 bp），将片段UPODCRG转化受体菌BSC1-2的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得一株P HpaII -opuD在ytsJ位点整合表达的重组菌株BSC2。
最后，提取基因组，并利用引物PHpaII-1/opuD-2进行扩增，利用引物PHpaII-1/CX-opuD2/opuD-2进行测序，结果表明无额外点突变。
（3）敲除5′-核苷酸酶yfkN，获得yfkN敲除枯草芽孢杆菌菌株：
首先，以BS168NCm的基因组为模板，分别用引物yfkN-U1/yfkN-U2、yfkN-D1q/yfkN-D2、yfkN-CR1q/yfkN-CR2、yfkN-G1q/yfkN-G2扩增片段U（如SEQ ID No.40所示，1164bp）、D（如SEQ ID No.41所示，1138 bp）、CR（如SEQ ID No.42所示，2069bp）、G（如SEQID No.43所示，931 bp）。
其次，通过重叠PCR方法，利用引物yfkN-U1/yfkN-D2，将片段U和D拼接成片段UD（2302 bp）；再利用引物yfkN-U1/yfkN-G2将片段UD、CR和G拼接成片段UDCRG（如SEQ IDNo.44所示，5302 bp）。
最后，将片段UDCRG转化受体菌BSC2的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得yfkN敲除菌株BSC3。
（4）摇瓶发酵培养：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5 mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养12 h，按1%接种量转接至装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃、220 r/min振荡培养48 h，在发酵6 h时，添加氯化胆碱和CMP，发酵培养基为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，葡萄糖40 g/L、MgSO4•7H2O 1.0 g/L、氯化胆碱0.5 g/L、CMP 0.05 g/L。
生物量的测定：分别于发酵6 h、12 h、24 h、36 h、48 h取1 mL发酵液离心去上清，用去离子水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD600值。
实施例2 胞磷胆碱的提取及检测
取实施例1中48 h的发酵液25 mL，8000 rpm、4℃离心10 min，舍去上清，用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀一次，然后加入5 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，8000 rpm、4℃离心10 min，取上清1.5 mL，过滤后进行HPLC检测。
色谱条件：色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温，30℃；流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为纯甲醇，A:B以98:2的比例进行等度洗脱；流速，0.6 mL/min；检测器，紫外检测器；检测波长，270 nm；进样量，5 μL。定量方法：使用相同的色谱条件测定标准品胞磷胆碱的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对胞磷胆碱定量。
实施例3 引入异源CCT和CKI对菌株生长和胞磷胆碱合成的影响
为便于使用无标记方法对基因组进行修饰，本实施例以天津大学宋浩课题组提供的BS168N为出发菌，该菌是将P ara 启动子控制的新霉素抗性基因neo整合到野生型B. subtilis168基因组的xylR位点所得。在B. subtilis内，缺少从磷酸乙醇胺到胞磷胆碱的合成途径；而S. cerevisiae内存在完整的胞磷胆碱合成途径。
本实施例将S. cerevisiae的胆碱激酶基因CKI和磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT插入到BS168N基因组上的yrpC位点，得到四株重组菌BSC1-1、1-2、1-3、1-4。经测序表明，BSC1-1中CKI的40位亮氨酸突变成脯氨酸；BSC1-2中CKI的216位谷氨酸突变成甘氨酸；BSC1-3中CCT的423位丙氨酸突变成缬氨酸；BSC1-4中CCT和CKI均无额外点突变。
对出发菌BS168N和四株重组菌进行发酵，结果如表4所示。结果显示：菌株生长下降，可能是由于异源基因的引入，也可能是氯化胆碱和CMP的加入，对细胞生长有一定的毒性。发酵48 h后，在出发菌的上清中和细胞沉淀中均未检测到胞磷胆碱的存在，这是因为B. subtilis内不存在完整的胞磷胆碱合成途径；在重组菌的上清中也未检测到胞磷胆碱的存在，而在细胞沉淀中均检测到胞磷胆碱的存在，说明胞磷胆碱主要积累在胞内。
另外，发酵48 h后，四株重组菌胞内的胞磷胆碱含量如表5所示，分别为90.1 ±0.2 mg/L、94.1 ± 0.2 mg/L、88.2 ± 0.3 mg/L、85.9 ± 0.1 mg/L，胞磷胆碱的转化率分别为18.02%、18.82%、17.64%、17.18%，说明CKI中216位的谷氨酸突变为甘氨酸有利于胞磷胆碱的合成。
表4 菌株生长情况
| 发酵时间（h） | OD600（BS168N） | OD600（BSC1-1） | OD600（BSC1-2） | OD600（BSC1-3） | OD600（BSC1-4） |
| 6 | 3.60 ± 0.11 | 3.18 ± 0.24 | 3.27 ± 0.08 | 3.09* ± 0.11 | 3.15 ± 0.17 |
| 12 | 7.21 ± 0.13 | 7.01 ± 0.33 | 7.18 ± 0.13 | 6.89* ± 0.01 | 6.95 ± 0.10 |
| 24 | 10.05 ± 0.35 | 9.12* ± 0.16 | 9.02* ± 0.25 | 8.97* ± 0.30 | 8.85* ± 0.13 |
| 36 | 9.10 ± 0.85 | 8.06* ± 0.06 | 8.16* ± 0.07 | 7.96* ± 0.04 | 7.99* ± 0.12 |
| 48 | 7.38 ± 0.79 | 6.31* ± 0.24 | 6.30* ± 0.25 | 6.10* ± 0.10 | 6.17* ± 0.29 |
注：*示与BS168N相比具有显著差异（P＜0.05）。
表5 发酵48 h后不同菌株的胞磷胆碱产量
| 菌株 | 胞磷胆碱产量（mg/L） |
| BS168N | —— |
| BSC1-1 | 90.1#± 0.2 |
| BSC1-2 | 94.1#± 0.2 |
| BSC1-3 | 88.2#± 0.3 |
| BSC1-4 | 85.9#± 0.1 |
注：#示与BS168N相比具有极显著差异（P＜0.01）。
实施例4 表达OpuD对菌株生长和胞磷胆碱合成的影响
在B. subtilis内，opuD编码甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱转运蛋白，由于胆碱的化学结构与甜菜碱类似，推测OpuD可能也具有运输氯化胆碱的功能。因此，本实施例在BSC1-2基因组上的ytsJ位点表达opuD，得到重组菌BSC2，菌株的生长情况见表6，发酵48 h后胞磷胆碱的合成量如表7所示。
发酵结果表明：菌株生长略有下降，可能是由于膜蛋白OpuD的过量表达，对细胞生长不利，也可能是由于氯化胆碱的过量吸收影响细胞代谢平衡，从而影响细胞生长。发酵48h，BSC2细胞内的胞磷胆碱含量为114.3 ± 0.5 mg/L，较对照菌BSC1-2增加17.7%，表明OpuD的确具有吸收氯化胆碱的功能，使得氯化胆碱到胞磷胆碱的转化率提高到22.86%。
表6 菌株生长情况
| 发酵时间（h） | OD600（BSC1-2） | OD600（BSC2） |
| 6 | 3.27 ± 0.08 | 3.17 ± 0.10 |
| 12 | 7.18 ± 0.13 | 6.98 ± 0.01 |
| 24 | 9.02 ± 0.25 | 7.72* ± 0.14 |
| 36 | 8.16 ± 0.07 | 7.16* ± 0.16 |
| 48 | 6.30 ± 0.25 | 5.50* ± 0.14 |
注：*示与BSC1-2相比具有显著差异（P＜0.05）。
表7 发酵48 h后的胞磷胆碱合成量
| 菌株 | 胞磷胆碱产量（mg/L） |
| BSC1-2 | 94.1 ± 0.2 |
| BSC2 | 114.3#± 0.5 |
注：#示与BSC1-2相比具有极显著差异（P＜0.01）。
实施例5 敲除yfkN对菌株生长和胞磷胆碱合成的影响
在B. subtilis内，YfkN是一个三功能酶，具有2′，3′-环核苷酸磷酸二酯酶、2′（或3′）-核苷酸酶、5′-核苷酸酶活性，可催化5′-尿苷单磷酸（UMP）及CMP脱去磷酸产生相应的尿苷及胞苷。YfkN是一个分泌蛋白，属于胞外5′-核苷酸酶，由于发酵时向培养基中加入CMP，本发明选择敲除yfkN基因，得到基因敲除菌株BSC3，对所获得的菌株BSC3以及对照菌株BSC2的生长情况进行统计见表8，菌株发酵48 h后的胞磷胆碱合成量见表9。
发酵结果表明：菌株生长略有变化不大；发酵48 h，BSC3胞内的胞磷胆碱含量为123.8 ± 0.2 mg/L，较对照菌BSC2提高8.3%，说明敲除yfkN，破坏其5′-核苷酸酶活性，可以减少CMP的消耗，从而促进胞磷胆碱的合成，此时氯化胆碱到胞磷胆碱的转化率为24.76%。BSC3细胞沉淀破碎后的上清进行HPLC检测，色谱图见图2，其中，A为胞磷胆碱标准品的HPLC色谱图；B为菌株BSC3发酵48 h后的细胞沉淀经处理后的上清的HPLC色谱图。
表8 菌株生长情况
| 发酵时间（h） | OD600（BSC2） | OD600（BSC3） |
| 6 | 3.17 ± 0.10 | 3.48 ± 0.28 |
| 12 | 6.98 ± 0.01 | 6.52 ± 0.03 |
| 24 | 7.72 ± 0.14 | 6.83* ± 0.07 |
| 36 | 7.16 ± 0.16 | 6.36*± 0.19 |
| 48 | 5.50 ± 0.14 | 6.79 ± 0.14 |
注：*示与BSC2相比具有显著差异（P＜0.05）。
表9 发酵48 h后的胞磷胆碱合成量
| 菌株 | 胞磷胆碱产量（mg/L） |
| BSC2 | 114.3 ± 0.5 |
| BSC3 | 123.8* ± 0.2 |
注：*示与BSC2相比具有显著差异（P＜0.05）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
且上述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，其特征在于，包括以下的步骤：
（1）CCT-CKI共表达菌株的制备：以枯草芽孢杆菌为底盘，在其基因组的yrpC位点上共表达酿酒酵母的磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，获得CCT-CKI共表达菌株；
（2）整合表达opuD：在枯草芽孢杆菌基因组上的ytsJ位点过表达内源的甘氨酸甜菜碱和砷酸甜菜碱转运蛋白基因opuD基因；
（3）敲除5′-核苷酸酶基因yfkN，获得yfkN敲除枯草芽孢杆菌菌株；
（4）采用（3）中获得的菌株进行发酵培养，生产胞磷胆碱，发酵的操作如下：
从平板上挑取新活化的（3）中制备的yfkN敲除单菌落菌株接入装有LB液体培养基的试管中，振荡培养，按1%的接种量转接至装有发酵培养基的锥形瓶中，振荡培养36~50 h，在发酵6 h时，添加氯化胆碱和5'-胞苷单磷酸，发酵结束后，离心，收集细胞沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤一次，然后加入5 mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，超声破碎后离心取上清，过滤即得。
2.如权利要求1所述的一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，其特征在于，（4）中所述的发酵培养基，包括：葡萄糖20～80 g/L、胰蛋白胨5～15 g/L、酵母提取物1～9 g/L、NaCl 5～15 g/L、MgSO4•7H2O 0.4～2 g/L、氯化胆碱0.1～6 g/L、5'-胞苷单磷酸0.01～2 g/L；发酵的条件为：pH为6.0～8.0，发酵温度35～45℃，转速100～250 r/min。
3.如权利要求1所述的一种工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法在生产胞磷胆碱中的应用。
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