CN113702341B - 一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法。细胞外引入外源的过氧化物酶催化化学探针产生活性强、寿命短的自由基对暴露在细胞质膜外侧的蛋白质基团进行选择性共价标记。反应一段时间后，加入封闭缓冲液终止标记反应。接着，利用化学探针上的捕获基团对标记的蛋白质进行蛋白质组学分析。化学探针自由基可以与相邻蛋白质上氨基酸，主要与酪氨酸、色氨酸、组氨酸和半胱氨酸等电子密度较高的氨基酸中的一种或二种以上发生共价连接。此标记策略操作简单，选择性好，反应速率快，不破坏细胞表面蛋白质的糖型，可以应用于细胞表面蛋白质组(或质膜蛋白质组)及其动态变化分析，也可以应用于细胞表面蛋白质‑蛋白质相互作用以及细胞‑细胞间相互作用等的研究。

Description

一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向细胞表面蛋白质或者质膜蛋白质研究领域，具体涉及一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法。
背景技术
近年来，细胞表面蛋白质组的研究为免疫治疗、细胞分选、靶向治疗、疫苗开发以及病理的研究提供了新的方法与手段[Shekari F,Han C L,Lee J,et al.Surfacemarkers of human embryonic stem cells:A meta analysis of membrane proteomicsreports[J].Expert Review of Proteomics,2018,15(11):911-22.]。细胞表面蛋白质组在药物研究中起着非常重要的作用，在已发现的药物靶标中质膜蛋白质占有约70％，单是靶点为1型或2型G蛋白受体的药物就占据所有药物的25％[Yin H,Flynn A D.Druggingmembrane protein interactions[J].Annual Review of Biomedical Engineering,2016,18(1):51-76.]。需要注意的是，细胞表面蛋白质的组成并不是静态的。细胞表面蛋白质就像细胞的“门铃”，为外界微环境改变引起胞内信号转导的起始部位，在细胞识别、信号转导、免疫应答、细胞内外物质交换以及代谢调控等生命活动过程中执行重要功能。细胞不断调整细胞表面蛋白质组的组成信息以适应外界微环境的改变。对于一个多细胞生物来说，感知外界环境信息并完成相应的胞内信号的调控对于生物体的生长发育以及维持机体的稳态等都是非常重要的[Antonescu C N,Mcgraw T E,Klip A.Reciprocal regulationof endocytosis and metabolism[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2014,6(7):a016964]。因此，细胞表面蛋白质组学的研究不仅仅是特定细胞特定状态下的细胞表面蛋白质的种类和数量的深度覆盖分析，还需要完整的描绘出不同应激条件下细胞表面蛋白质组的动态变化过程信息，尤其是感知外界微环境的变化而瞬时变化的这部分细胞表面蛋白质，这对于全面、深入地认识复杂的生命活动，包括病理过程等来说非常重要。
生物膜是高度动态的，这一过程可以发生在毫秒到分钟的时间尺度上，这也是生物膜结构的主要特征[Groves J T,Parthasarathy R,Forstner M B.Fluorescenceimaging of membrane dynamics[J].Annual Review of Biomedical Engineering,2008,10:311-38.]。近年来，单分子成像技术更是直观地监测到特定质膜蛋白质的高度动态变化[Cui Y,Yu M,Yao X,et al.Single-particle tracking for the quantification ofmembrane protein dynamics in living plant cells[J].Molecular Plant,2018,11(11):1315-27.]。但是，目前这一技术分析对象相对简单，且难以实现未知蛋白质的分析。随着细胞表面蛋白质化学富集策略的发展，很多细胞表面蛋白质组研究开始关注不同应激条件下细胞表面蛋白质组的动态变化分析[Yoon C,Song H,Yin T,et al.Fzd4 markslateral plate mesoderm and signals with norrin to increase cardiomyocyteinduction from pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors[J].Stem CellReports,2018,10(1):87-100.Miki Y,Takahashi D,Kawamura Y,et al.Temporalproteomics of arabidopsis plasma membrane during cold-and de-acclimation[J].Journal of Proteomics,2019,197:71-81.Kalxdorf M,Gade S,Eberl H C,etal.Monitoring cell-surface n-glycoproteome dynamics by quantitativeproteomics reveals mechanistic insights into macrophage differentiation[J].Molecular&Cellular Proteomics,2017,16(5):770-85.]。但是，现有的基于化学标记的细胞表面蛋白质富集策略，如氨基靶向的生物素标记法、糖链靶向的细胞表面捕获技术(Cell Surface Capturing,CSC)的标记反应动力学较慢，一般需要一步或者多步长时间(>10分钟)的标记反应来实现细胞表面蛋白质的有效标记。因此，目前基于这些富集策略的研究大多监测的是应激反应后几个小时甚至是几天内的细胞表面蛋白质组的动态变化信息。考虑到细胞表面蛋白质组高度动态变化的特点，感知微环境变化而瞬时变化的这部分蛋白质可能是生物学功能的重要驱动因子，在生物学功能调控方面承担关键角色，但是目前利用组学的手段还不能实现瞬时变化的这部分细胞表面蛋白质的分析。
近年来，研究人员通过将生物酶与目标蛋白进行偶联或者融合共表达的邻近标记策略成功用于亚细胞器蛋白质组、蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸动态相互作用等研究[Kim D I,Roux K J.Filling the void:Proximity-based labeling of proteins inliving cells[J].Trends in Cell Biology,2016,26(11):804-17.]，其中，改造的抗环血酸过氧化物酶催化的标记策略(engineered ascorbate peroxidase，APEX)表现出比较快的反应动力学[Lobingier B T,Huttenhain R,Eichel K,et al.An approach tospatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells[J].Cell,2017,169(2):350-60e12.Kotani N,Gu J,Isaji T,et al.Biochemicalvisualization of cell surface molecular clustering in living cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2008,105(21):7405-9.]，这引起了我们极大的兴趣。文献调研发现，目前还没有外源加入过氧化物酶用于细胞表面蛋白质组或质膜蛋白质组富集分析的相关研究。基于此，我们希望基于过氧化物酶发展一种细胞表面蛋白质快速标记方法用于细胞表面蛋白质组(或质膜蛋白质组)及其动态变化分析，细胞表面蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞-细胞间相互作用等研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法(PECSL)，可以克服现有的化学标记富集策略标记反应速率慢等缺点。
一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记新方法，细胞外引入外源的过氧化物酶和相应的化学探针产生活性自由基，与暴露在细胞质膜外侧的蛋白质上的氨基酸，主要与电子密度较高的酪氨酸、色氨酸等中的一种或二种以上发生共价反应，产生的自由基活性强，寿命短，而可以实现细胞表面蛋白质(或质膜蛋白质)的选择性共价标记。
该方法的步骤为：
a.选取化学探针；
b.待标记细胞样品中加入过氧化物酶和化学探针，反应；
c.加入过量封闭缓冲液终止标记反应，去除标记试剂；
d.收集标记的蛋白质样品。
化学探针可以是双功能或者多功能探针；
化学探针必须带有酚羟基或者芳香叠氮基等中的一种或二种以上可被过氧化物酶催化产生活性自由基的反应基团；
必须带有一种或多种捕获基团，如生物素、点击化学反应基团或者荧光基团等中的一种或二种以上；
不带有或带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团、光交联基团等其他反应基团中的一种或二种以上；
优选，化学探针反应基团为酚羟基，捕获基团为生物素的化学探针B××P，其中间带有一个长的极性聚酰胺连接基团，不能穿透细胞膜而进入细胞内；具体结构式为：
Figure GDA0002609517680000031
化学探针的使用浓度可以为1μM-10mM；
优选，化学探针使用浓度为100μM-500μM。
所述待标记细胞样品的质膜结构应完整。
所述待标记细胞样品可以为经过冷热刺激、或加入外源的药物分子、生长因子、代谢物、蛋白质或细胞等方式中一种或多种方式处理后得到的待标记细胞样品，用以分析不同方式处理后的细胞细胞表面蛋白质的组成变化。
所述过氧化物酶可以为辣根过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、或者其他微生物或植物所产生的过氧化物酶中的一种或二种以上；
优选，过氧化物酶为催化活性较高的辣根过氧化物酶。
所述过氧化物酶的使用浓度可以在1U/mL-1000U/mL，其底物消耗能力应适当高于探针的使用浓度；
优选，辣根过氧化物酶的使用浓度为100U/mL-500U/mL。
化学探针反应基团不同，步骤c操作细则会稍有差别；具体步骤为：
若化学探针的反应基团为芳香叠氮基团，分别向待标记细胞样品中加入化学探针和过氧化物酶引发标记反应发生；
或，若化学探针的反应基团为酚羟基，向待标记细胞样品中加入过氧化物酶和化学探针后，需要在加入过氧化氢引发标记反应发生。
所述过氧化氢的使用浓度可以在1μM-1M；
优选，过氧化氢的使用浓度在0.1mM-10mM。
所述标记反应试剂(过氧化物酶，化学探针以及过氧化氢)需要预先溶解在一定的溶液中再加入待标记细胞样品中，溶液的pH值在6-9范围内，溶液中除了标记试剂外应尽量减少外源蛋白质、富电子氨基酸等可以消耗产生的自由基的物质的引入；尽量减少抗坏血酸，奎诺二甲基丙烯酸酯等可以猝灭自由基的物质的引入；尽量减少可抑制过氧化物酶活性或者变性过氧化物酶的物质的引入，如叠氮钠，变性剂、表面活性剂等；尽量避免使用可以破坏细胞质膜结构的缓冲溶液体系，如低渗缓冲液；
优选，溶解标记反应试剂的溶液可以为pH为7-8的PBS缓冲盐溶液，pH为7-8的DPBS缓冲盐溶液，pH为7-8的TBS缓冲盐溶液，0.9％的生理盐水，pH为7-8的不含酚红指示剂的1640培养基中的一种或两种以上。
所述标记反应温度应该以不破坏待标记细胞质膜结构或和过氧化物酶活性为参考，建议4-37℃；标记反应时间可以为5秒-1小时；标记反应时间和温度可适当调整；
优选，标记反应在20℃-37℃缓慢混匀反应10秒-10分钟。
所述封闭缓冲液可以为含有抗坏血酸、奎诺二甲基丙烯酸酯等自由基猝灭剂或者(和)叠氮钠等过氧化物酶的活性抑制剂中的一种或二种以上的缓冲液；
优选，体积预冷的含有10mM叠氮钠、10mM抗坏血酸钠、5mM奎诺二甲基丙烯酸酯的PBS缓冲盐溶液作为封闭缓冲液。
封闭缓冲液的含有自由基猝灭剂和过氧化物酶的活性抑制剂的使用浓度应该相比较探针和过氧化物酶的使用浓度过量，其中自由基猝灭剂(每毫升)：标记探针(每毫升)＝2-1000倍；过氧化物酶的活性抑制剂(每毫升):过氧化物酶的酶活力单位(每毫升)＝2-1000倍；
优选，自由基猝灭剂(每毫升)：标记探针(每毫升)＝10-100倍；过氧化物酶的活性抑制剂(每毫升):过氧化物酶的酶活力单位(每毫升)＝10-100倍；
所述收集标记的蛋白质样品后进行蛋白质组学分析，蛋白质组学分析的手段可以包括点杂交，免疫印迹、流式细胞荧光分选，免疫荧光和液质联用检测等中的一种或二种以上，但不局限于这几种分析手段。
本发明具有如下优点：
1、标记反应动力学快，标记选择性好。过氧化物酶催化产生的活性自由基活性高，寿命短，迅速与暴露在细胞质膜表面的蛋白质发生共价反应而不进入细胞膜内，使得该方法具有比较好的选择性。比如已有文献报道苯氧自由基寿命在1毫秒以内，理论上只能标记空间范围在20纳米以内的蛋白质(Rhee,H.-W.,et al.(2013)."Proteomic Mapping ofMitochondria in Living Cells via Spatially Restricted Enzymatic Tagging."Science 339(6125):1328-1331)；活性很高，反应速度极快，标记反应只需要1分钟；同时，苯氧自由基不能透膜。
2、化学探针反应基团(自由基)化学性质稳定，可以与相邻蛋白质上电子密度较高的氨基酸如酪氨酸、色氨酸、组氨酸和半胱氨酸中的一种或二种以上相连，其中，主要靶向酪氨酸。目前，现有的化学标记细胞表面蛋白质富集策略主要靶向赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸、侧链糖基以及蛋白质N-端。这样，新建立的过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质富集策略与这些方法具有一定的互补性，有助于提高细胞表面蛋白质鉴定结果的覆盖度。
3、对于糖基化蛋白和非糖基化蛋白无偏向性，不破坏完整糖型结构。本方法共价结合电子密度较高的氨基酸如酪氨酸、色氨酸、组氨酸和半胱氨酸中的一种或二种以上，对于糖基化蛋白质和非糖基化蛋白质无偏好性，且不会破坏细胞表面蛋白质的糖型，可以用于细胞表面蛋白质完整糖型结构的分析。
4、此标记策略操作简单，可以应用于细胞表面蛋白质组(或质膜蛋白质组)及其动态变化分析，也可以应用于细胞表面蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞-细胞间相互作用等的研究。
附图说明
图1为所述将辣根过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记策略(PECSL)结合液质联用技术用于细胞表面蛋白质组学分析的基本流程图。其中使用的化学探针为B××P，具体结构式为
Figure GDA0002609517680000051
(中肽生化合成)。应当理解，此处所描述的流程图仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图2：免疫印迹分析结果说明PECSL标记策略可以实现HeLa细胞的有效标记。
图3：免疫荧光分析结果表明PECSL标记策略可以实现HeLa细胞细胞表面蛋白质的选择性标记。
图4液质联用分析结果表明PECSL技术可以实现细胞表面蛋白质组学的选择性富集分析。(a)比较PECSL技术和全蛋白质组分析策略的HeLa细胞蛋白质鉴定结果。(b)GO富集分析PECSL技术鉴定到的HeLa细胞表面蛋白质组以及PECSL技术和全蛋白质组分析策略单独鉴定到的蛋白质。(c)PECSL技术单独鉴定到的蛋白质的GO富集分析结果图。(d)全蛋白质分析策略单独鉴定到的蛋白质的GO富集分析结果图。
图5免疫印迹分析和液质联用分析结果说明相比较传统的氨基靶向的生物素标记法，PECSL技术具有较快的反应速率，可以10秒标记反应时间实现细胞表面的有效标记。
图6说明PECSL技术结合无标记定量分析方法可以实现胰岛素作用后(10秒-24小时)时间分辨的HepG2细胞细胞表面蛋白质组动态变化分析。
图7说明PECSL技术结合无标记定量结果可以有效的识别出来EGF在细胞表面的受体蛋白EGFR，可以用于特异性的识别某些配体在细胞表面的受体蛋白质。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1表示为所述将辣根过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记策略(PECSL)结合液质联用技术用于细胞表面蛋白组学分析的基本流程图。其中化学探针为B××P。具体流程如下：
首先，向待标记细胞样品外源加入含有适当浓度的过氧化物酶和化学探针B××P的反应溶液1；接着，立即向待标记细胞样品中加入含有适当浓度过氧化氢和化学探针B××P的反应溶液2引发标记反应；标记反应一段时间后，加入过量体积的含有自由基终止剂和过氧化物酶活性抑制剂的封闭缓冲液迅速终止反应；接下来将标记的细胞进行细胞裂解，并将提取的细胞蛋白质进行亲和富集、on-bead酶解以及液质联用分析检测标记的细胞表面蛋白质。
本发明实施例提供的过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法进行细胞表面蛋白质组学分析，具体实施例如下，其中以下所有具体实施的标记探针B××P，具体结构式为
Figure GDA0002609517680000061
(中肽生化合成)：
实施例1
HeLa细胞培养至覆盖10厘米培养皿(购自Corning)表面面积的80％，去除培养基后，PBS磷酸盐缓冲液(内含0.01M磷酸盐、0.15M氯化钠，pH7.4，余量为水，预先平衡至室温)洗涤两次，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P(中肽生化合成)的PBS标记溶液(预先平衡至室温)置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保标记反应溶液覆盖到所有细胞。向实验组中立即加入2毫升有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)于反应体系中引发标记反应。同时，向对照组细胞中加入2毫升含有200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)。分别在脱色摇床上缓慢振荡晃动室温下反应1分钟后，立即加入10毫升4℃预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠、5mM水溶性维生素E)。4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，4℃预冷的终止标记反应溶液洗涤两次。
弃去培养皿(购自Corning)中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升4℃预冷的含有2％蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptin hemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)、10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠及5mM水溶性维生素E的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH 8.0)，培养皿置于冰上将细胞轻轻刮下来、并与裂解液一同转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上的容器内。超声破碎细胞：超声30s，间隔30s；5-10个循环，得蛋白质提取液。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过PierceTM660nm蛋白质浓度测定试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific，货号22660)测定蛋白质浓度。分别取20μg实验组和对照组的细胞裂解液和还原性十二烷基磺酸钠上样缓冲液(Thermo Fisher Scientific，货号：39000)混合，95℃变性处理5-10分钟。分离胶浓度为10％，浓缩胶为4％，厚度为1.0mm的聚丙烯酰胺凝胶(10％和4％是指丙烯酰胺在十二烷基磺酸钠-PAGE凝胶中的百分比)分离：60V，150分钟。转膜(0.45μM聚偏二氟乙烯膜，PVDF，购自MERK)：恒流250mA，90分钟。置于10毫升封闭缓冲液中(每100毫升TBST中含有5克脱脂奶粉，其中TBST为内含20mM三羟甲基氨基甲烷,150mM氯化钠，0.1％吐温-20，余量为水，pH为7.4的溶液体系)，其中封闭液为室温封闭2小时后，与抗体辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自cell-signaling technology，货号3999，取2毫升稀释于8毫升上述封闭液中使用)脱色摇床上4℃过夜(12-16小时)孵育。第二天，TBST洗涤三次，每次10分钟。加入约1毫升化学发光过氧化物酶底物试剂(购自Thermo Fisher Scientific)，于Fusion FX5化学发光成像系统对目标蛋白水平进行检测。
图2免疫印迹分析结果说明PECSL标记策略可以实现HeLa细胞的有效标记。免疫印迹分析结果表明实验组的细胞样品中检测到很多探针标记的蛋白质条带，而对照组的细胞样品中几乎没有检测到内源生物素化蛋白质条带，说明HeLa细胞成功被探针标记，且PECSL标记策略是过氧化氢依赖的。
实施例2
操作过程同实施例1，与实施例1不同之处在于细胞表面标记反应完成后检测标记效果的技术不同。
HeLa细胞培养至覆盖10cm培养皿(购自Corning)表面面积的80％，去除培养基后，PBS磷酸盐缓冲液(内含0.01M phosphate、0.15M sodiumchloride，pH 7.4，余量为水，预先平衡至室温)洗涤两次，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P(中肽生化合成)的PBS标记溶液(预先平衡至室温)置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保标记反应溶液覆盖到所有细胞。向实验组中立即加入2毫升有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)于反应体系中引发标记反应。同时，向对照组细胞中加入2毫升含有200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)。分别在脱色摇床上缓慢振荡晃动室温下反应1分钟后，加入10毫升4℃预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠、5mM水溶性维生素E)。4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，4℃预冷的终止标记反应溶液洗涤两次。去除培养皿(购自Corning)中的标记反应封闭缓冲溶液后，向HeLa细胞中加入含有4％(w/v)多聚甲醛的PBS缓冲盐溶液，室温条件下固定处理15分钟；PBS缓冲盐溶液洗涤三次后，加入含有0.2％(v/v)Triton X-100的PBS缓冲盐溶液，室温条件下通透处理5分钟；PBS缓冲盐溶液洗涤三次后，加入含有10％(v/v)山羊血清(碧云天，货号C0265)的PBS缓冲盐溶液，室温条件下反应2小时以封闭培养皿(购自Corning)中的空白位点；去除封闭缓冲液后，加入含有0.2微克/毫升Alexa FluorTM568标记的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific，货号：S11226)和1％(v/v)山羊血清的PBS缓冲盐溶液，4℃条件下避光孵育过夜(12-16h)。接下来的操作均需要于避光条件下进行。第二天，PBST(内含0.05％吐温-20，PBS)洗涤液洗涤四次，加入含有1微克/毫升细胞核荧光染料DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)和1％(v/v)山羊血清的PBS缓冲盐溶液，室温条件下孵育1小时。PBS缓冲盐溶液洗涤三次后，进行ANDORTM活细胞共聚焦显微镜(Revolution WD)成像分析。
图3免疫荧光分析结果表明PECSL标记策略可以实现HeLa细胞细胞表面蛋白质的选择性标记。实验组的细胞表面和胞外区域被均匀标记，细胞表面蛋白质被探针选择性标记。而对照组中仅在胞质内检测到少量的探针标记的蛋白质，可能是内源生物素化蛋白质。
实施例3
操作过程同实施例1，与实施例1不同之处在于细胞表面标记反应完成后检测标记效果技术不同。
HeLa细胞培养至覆盖10cm培养皿(购自Corning)表面面积的80％，去除培养基后，PBS磷酸盐缓冲液(内含0.01M磷酸盐、0.15M氯化钠，pH 7.4，余量为水，预先平衡至室温)洗涤两次，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P(中肽生化合成)的PBS标记溶液(预先平衡至室温)置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保标记反应溶液覆盖到所有细胞。向实验组中立即加入2毫升有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)于反应体系中引发标记反应。同时，向对照组细胞中加入2毫升含有200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)。分别在脱色摇床上缓慢振荡晃动室温下反应1分钟后，加入10毫升4℃预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠、5mM水溶性维生素E)。4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，4℃预冷的终止标记反应溶液洗涤两次。
弃去培养皿(购自Corning)中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升4℃预冷的含有2％蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptin hemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)、10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠及5mM水溶性维生素E的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH 8.0)，培养皿置于冰上将细胞轻轻刮下来、并与裂解液一同转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上的容器内。超声破碎细胞：超声30s，间隔30s；5-10个循环，得蛋白质提取液。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过PierceTM660nm蛋白质浓度测定试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific，货号22660)测定蛋白质浓度。
取1毫升PBS于1.5毫升离心管中，加入中性亲和素琼脂糖材料(Thermo FisherScientific，货号：29200)，上下轻轻颠倒几次，500g离心1分钟，胰岛素注射器(BD碧迪一次性使用无菌胰岛素注射器u-40)小心移去上清；加入1毫升PBS清洗，重复两次，弃去上清。加入标记后的蛋白质提取液，室温条件下翻转孵育1-3小时。500g离心1分钟并用1毫升胰岛素注射器小心去除上清后，加入1毫升PBS缓冲盐溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复6次。洗涤后的富集材料小心转移至2毫升离心管中，离心并小心弃去上清，向富集材料中加入500μL含6M尿素(Sigma-Aldrich)和10mM二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液，65℃条件下反应15分钟。加入1M碘乙酰胺(IAA)(溶于含6M尿素的PBS缓冲液中，Sigma-Aldrich)至终浓度20mM，室温条件下避光反应40分钟。离心并弃去上清，加入500微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复两次。将固载有标记蛋白质的亲和素材料(Thermo Fisher Scientific，货号：29200)重悬于100微升20mM碳酸氢铵溶液，按照酶与蛋白比例约1:25(w/w)的比例加入牛胰蛋白酶(TPCK-trypsin，购自Sigma-Aldric，货号：9002-07-7)并37℃条件下800r/分钟过夜(12-16小时)反应。第二天，将酶解液转移入600μL离心管中，并加入100微升3％(v/v)甲酸(Thermo FisherScientific)/水洗涤一次，洗涤液与酶解液合并冻干后0.1％(v/v)甲酸/水复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate 3000RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
细胞全蛋白质样品准备步骤如下：取100μg HeLa细胞蛋白提取液37℃超滤辅助酶解(FASP)过夜(12-24小时，胰蛋白酶，1:25(w/w))，14000g离心30分钟收集流穿液，酸化至3％(v/v)甲酸/水，冻干后0.1％(v/v)甲酸/水复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate 3000 RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
图4液质联用分析结果表明PECSL技术可以实现细胞表面蛋白质组学的选择性富集分析。PECSL技术从约4×106个HeLa细胞中共鉴定到2773个蛋白质，其中，有1303个蛋白质GO-标注的细胞表面蛋白质(GO中标注有“plasma membrane”、“cell surface”和extracellular(包括“extracel lular matrix”、“extracellular region”、“extracellular space”、“extracellular vesicle”及“extracellular exosome”)的蛋白质定义为细胞表面蛋白质)，669个跨膜蛋白质(TMHMM和Phobius软件预测)以及73类CD分子。(a)我们将PECSL技术鉴定到的HeLa细胞细胞表面蛋白质组数据与HeLa细胞全蛋白质组鉴定结果进行比较分析。(b)我们首先对PECSL技术鉴定到的HeLa细胞表面蛋白质组数据进行GO富集分析(http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis)，其中，HeLa细胞全蛋白质组数据作为参考列表。膜蛋白质、质膜蛋白质、胞外基质蛋白质、细胞表面蛋白以及受体复合体蛋白等GO条目在HeLa细胞细胞表面蛋白质组数据中被显著性富集。接着，(c-d)我们对PECSL技术和全蛋白质组分析策略单独鉴定到的蛋白质分别进行GO富集分析，其中，将DAVID软件中人源蛋白质组作为参考列表。细胞表面相关的GO条目，如“basementmembrane”，“receptor complex”，“cell surface”以及“plasma membrane”在PECSL技术单独鉴定到的786个蛋白质中被显著性富集，而细胞核相关蛋白以及胞内蛋白在全蛋白质组分析策略单独鉴定到的896个蛋白质中被显著性富集。
实施例4
PECSL标记策略：HeLa细胞培养至覆盖10cm培养皿(购自Corning)表面积的80％，去除培养基后，PBS磷酸盐缓冲液(内含0.01M phosphate、0.15M sodium chloride，余量为水，pH 7.4)洗涤两次，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P的PBS标记溶液置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保标记反应溶液覆盖到所有细胞。向实验组中立即加入2毫升有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)于反应体系中引发标记反应。在脱色摇床上缓慢振荡晃动反应，分别反应10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟及10分钟后立即加入10毫升4℃预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠、5mM水溶性维生素E)。4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，4℃预冷的终止标记反应溶液洗涤两次。若标记反应在室温条件下进行，则标记过程中使用的所有溶液(标记溶液，PBS缓冲盐溶液)预先平衡至室温。相应的，若标记反应在37℃条件下进行，则标记过程中使用的所用溶液(标记溶液，PBS缓冲盐溶液)预先平衡至37℃。弃去培养皿中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升4℃预冷的含有2％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptin hemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)、10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠及5mM水溶性维生素E的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH 8.0)，培养皿(购自Corning)置于冰上将细胞轻轻刮下来、并与裂解液一同转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上的容器内。超声破碎细胞：超声30s，间隔30s；5-10个循环，得蛋白质提取液。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过PierceTM660nm蛋白质浓度测定试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific，货号22660)测定蛋白质浓度。分别取20μg实验组和对照组的细胞裂解液和还原性十二烷基磺酸钠上样缓冲液(Thermo FisherScientific，货号：39000)混合，95℃变性处理5-10分钟。分离胶浓度为10％，浓缩胶为4％，厚度为1.0mm的聚丙烯酰胺凝胶(10％和4％是指丙烯酰胺在十二烷基磺酸钠-PAGE凝胶中的百分比)分离：60V，150分钟。转膜(0.45μM聚偏二氟乙烯膜，PVDF)：恒流250mA，90分钟。置于10毫升封闭液(每100毫升TBST中含有5克脱脂奶粉，其中TBST为内含20mM三羟甲基氨基甲烷,150mM氯化钠，0.1％吐温-20，余量为水，pH为7.4的溶液体系)室温封闭2小时后，与抗体辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自cell-signaling technology，货号3999，取2微升加入8毫升上述封闭液中使用)脱色摇床上4℃过夜(12-16小时)孵育。第二天，TBST洗涤三次，每次10分钟。加入约1毫升化学发光过氧化物酶底物试剂(购自Thermo FisherScientific，)，于FusionFX5化学发光成像系统对目标蛋白水平进行检测。测定标记的细胞样品蛋白质浓度后，取1毫升PBS于1.5毫升离心管中，加入中性亲和素琼脂糖材料(ThermoFisher Scientific，货号：29200)，上下轻轻颠倒几次，500g离心1分钟，胰岛素注射器(BD碧迪一次性使用无菌胰岛素注射器u-40)小心移去上清；加入1毫升PBS清洗，重复两次，弃去上清。加入标记后的蛋白质提取液，室温条件下翻转孵育1-3小时。500g离心1分钟并用1毫升胰岛素注射器小心去除上清后，加入1毫升PBS缓冲盐溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复6次。洗涤后的富集材料小心转移至2毫升离心管中，离心并小心弃去上清，向富集材料中加入500微升含6M尿素(Sigma-Aldrich)和10mM二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液，65℃条件下反应15分钟。加入1M碘乙酰胺(IAA，Sigma-Aldrich)(溶于含6M尿素的PBS缓冲液中)至终浓度20mM，室温条件下避光反应40分钟。离心并弃去上清，加入500微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复两次。将固载有标记蛋白质的亲和素材料(Thermo Fisher Scientific，货号：29200)重悬于100微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，按照酶与蛋白比例约1:25(w/w)的比例加入牛胰蛋白酶(TPCK-trypsin，购自Sigma-Aldric，货号：9002-07-7)并37℃条件下800r/分钟过夜(12-24小时)反应。第二天，将酶解液转移入600微升离心管中，并加入100微升3％(v/v)甲酸/水洗涤一次，洗涤液与酶解液合并冻干后0.1％(v/v)甲酸复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate 3000 RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
传统的氨基靶向的生物素标记法对HeLa细胞细胞表面蛋白质组分析，实验流程参考：Li,Y.N.,et al.(2019)."Sensitive profiling of cell surface proteome byusing an optimized biotinylation method."Journal of Proteomics196:33-41。具体如下：HeLa细胞培养至覆盖10cm培养皿(购自Corning)表面积的80％，去除培养基后，使用PBS洗涤两次，每次洗涤后使用移液枪去除残余洗涤液。培养皿中加入3毫升含有0.25毫克/毫升标记探针(EZ-Link Sulfo-NHS-SS-biotin，购自Thermo Fisher Scientific，货号：21331)的PBS标记反应液，确保标记反应液能覆盖到所有细胞后置于脱色摇床上轻轻摇动孵育分别反应10秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟及30分钟。去除标记反应液后，向培养皿中加入10毫升预冷的含有100mM甘氨酸的PBS封闭缓冲液以终止标记反应，4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟。去除封闭缓冲液后，加入10毫升预冷的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液(TBS，内含20mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，余量为水，pH 7.4)洗涤两次，每次洗涤后使用移液枪去除残余洗涤液。若标记反应在室温条件下进行，则标记过程中使用的所有溶液(标记溶液，PBS缓冲盐溶液)预先平衡至室温。相应的，若标记反应在37℃条件下进行，则标记过程中使用的所用溶液(标记溶液，PBS缓冲盐溶液)预先平衡至37℃。弃去培养皿(购自Corning)中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升预冷的含有2％蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptinhemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH 8.0)，冰上将细胞轻轻刮下来并转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上。超声破碎细胞：超声30秒，间隔30秒；5-10个循环。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。分别取20μg各细胞裂解液和非还原性十二烷基磺酸钠上样缓冲液(ThermoFisher Scientific，货号：39001)混合，95℃变性处理5-10分钟。分离胶浓度为10％，浓缩胶为4％，厚度为1.0mm的聚丙烯酰胺凝胶(10％和4％是指丙烯酰胺在十二烷基磺酸钠-PAGE凝胶中的百分比)分离：60V，150分钟。转膜(0.45μM聚偏二氟乙烯膜)：恒流250mA，90分钟。置于封闭缓冲液(每100毫升TBST中含有5克脱脂奶粉，其中TBST为内含20mM三羟甲基氨基甲烷,150mM氯化钠，0.1％吐温-20，余量为水，pH为7.4的溶液体系)室温封闭2h后，与抗体辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自cell-signaling technology，货号3999，取2微升加入8毫升上述封闭液中使用)脱色摇床上4℃过夜孵育。第二天，TBST洗涤三次，每次10分钟。加入约1毫升化学发光过氧化物酶底物试剂(购自Thermo Fisher Scientific，)，于Fusion FX5化学发光成像系统对目标蛋白水平进行检测。此外，测定蛋白质浓度后，取PBS缓冲盐溶液于1.5毫升离心管中，加入中性亲和素琼脂糖富集材料(Thermo FisherScientific，货号：29200)，上下轻轻颠倒几次，室温条件下500g离心1分钟，胰岛素注射器(BD碧迪一次性使用无菌胰岛素注射器u-40)小心移去上清；加入PBS缓冲盐1毫升，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，500g离心1分钟，利用胰岛素注射器小心移去上清，重复两次。加入上述标记后的蛋白质提取液，室温条件下翻转孵育1-3小时。500g离心1分钟，用1毫升胰岛素注射器小心去除上清；加入1毫升PBS缓冲盐溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，500g离心1分钟，用1毫升胰岛素注射器小心去除上清，重复6次。洗涤后的富集材料小心转移至2毫升离心管中，500g离心1分钟，用1毫升胰岛素注射器尽量去除富集材料中的残余液体；向富集材料中加入100微升洗脱液(PBS，内含6M尿素，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，50-100mM二硫苏糖醇)，65℃条件下孵育30分钟，500g离心1分钟，细胞表面蛋白质组分洗脱液转移入600微升离心管中；加入100微升新鲜的洗脱液重复操作一次，合并两次细胞表面蛋白质组分洗脱液。FASP酶解细胞表面蛋白质组分，酶解液冻干后0.1％(v/v)甲酸/水复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate 3000 RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
图5免疫印迹分析和液质联用分析结果说明相比较传统的氨基靶向的生物素标记法，PECSL技术具有较快的反应速率，可以10秒标记反应时间实现细胞表面的有效标记，有望实现瞬时变化的细胞表面蛋白质组的分析。对于PECSL技术，除了室温条件下标记反应时间为10秒的细胞样品中标记的蛋白质条带略少外，在室温和37℃条件下的其他各反应时间点的细胞样品均表现出比较好的标记效果。PECSL标记策略在室温和37℃条件下反应不同时间得到的细胞样品的细胞表面蛋白质鉴定结果相近，温度和标记反应时间对PECSL技术的细胞表面蛋白质鉴定结果影响不大。室温条件下进行10s的PECSL标记反应的细胞样品鉴定到1020个GO-标注的细胞表面蛋白质(GO中标注有“plasma membrane”、“cell surface”和extracellular(包括“extracellular matrix”、“extracellular region”、“extracellular space”、“extracellular vesicle”及“extracellular exosome”)的蛋白质定义为细胞表面蛋白质)。但是，对于传统的氨基靶向的生物素标记法，在室温和37℃条件下，不同反应时间点的细胞样品中探针标记的蛋白质条带和细胞表面蛋白质鉴定数量差异较大，其中37℃条件下反应得到的细胞样品的蛋白质标记情况好于室温条件下反应得到的结果。室温条件下氨基靶向的细胞表面蛋白质标记策略反应1分钟得到HeLa细胞样品中仅鉴定到454个GO-标注的细胞表面蛋白质。室温条件下，从氨基靶向的标记策略反应5分钟的细胞样品的细胞表面蛋白质鉴定结果为标记反应30分钟的细胞样品的85％。说明了氨基靶向的生物素标记法具有比较慢的反应速率，这也可能是文献中氨基靶向的生物素标记法的标记反应时间通常为15分钟-1h的原因。
实施例5
操作过程同实施例1，与实施例1不同之处所用细胞为HepG2细胞，且细胞经过了胰岛素不同时间的预处理。
HepG2细胞培养至覆盖10cm培养皿(购自Corning)表面积的70％，去除培养皿中的培养基，加入37℃预热的10毫升PBS缓冲盐溶液(内含0.01M磷酸盐、0.15M氯化钠，pH 7.4，余量为水)洗涤去除培养基，重复一次。接着，向培养皿中加入10毫升不含血清的RPMI 1640培养基(不含酚红，购自Thermo Fisher Scientific)后置于37℃恒温培养箱中继续培养16-24小时。将培养皿(购自Corning)中的RPMI 1640培养基(不含酚红)去除后，加入10毫升37℃预热的含有200nM胰岛素(Sigma-Aldrich，货号：I9278)的RPMI1640培养基(不含酚红)于37℃条件下反应至预先设定的时间(10秒、30秒、2分钟、5分钟、30分钟、2小时、12小时、24小时)。同时，作为对照组，另取培养皿分别10毫升加入不含胰岛素的37℃预热的RPMI 1640培养基于37℃条件下反应一段时间。接着，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P(中肽生化合成)的PBS标记溶液置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保溶液覆盖到所有细胞。立即加入2毫升含有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液于反应体系中引发标记反应。脱色摇床上缓慢振荡晃动反应10秒后，立即加入10毫升预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠，10mM脱氧胆酸钠，5mM水溶性维生素E)。于4℃条件下脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，预冷的终止溶液洗涤两次并去除残留的标记试剂。标记反应在37℃进行，且标记过程中的使用的溶液(RPMI1640培养基，标记溶液)预先平衡到37℃。弃去培养皿中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升预冷的含有2％蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptin hemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)、10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠及5mM水溶性维生素E的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH 8.0)，冰上将细胞轻轻刮下来并转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上。超声破碎细胞：超声30秒，间隔30秒；5-10个循环。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过PierceTM660nm蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。取1毫升PBS于1.5毫升离心管中，加入中性亲和素琼脂糖材料(Thermo Fisher Scientific，货号：29200)，上下轻轻颠倒几次，500g离心1分钟，胰岛素注射器(BD碧迪一次性使用无菌胰岛素注射器u-40)小心移去上清；加入1毫升PBS清洗，重复两次，弃去上清。加入标记后的蛋白质提取液，室温条件下翻转孵育1-3小时。500g离心1分钟并用1毫升胰岛素注射器小心去除上清后，加入1毫升PBS缓冲盐溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复6次。洗涤后的富集材料小心转移至2毫升离心管中，离心并小心弃去上清，向富集材料中加入500μL含6M尿素(Sigma-Aldrich)和10mM二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液，65℃条件下反应15分钟。加入1M碘乙酰胺(IAA，Sigma-Aldrich)(溶于含6M尿素的PBS缓冲液中)至终浓度20mM，室温条件下避光反应40分钟。离心并弃去上清，加入500微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复两次。将固载有标记蛋白质的亲和素材料(Thermo FisherScientific，货号：29200)重悬于100微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，按照牛胰蛋白酶(TPCK-trypsin，购自Sigma-Aldric，货号：9002-07-7)与蛋白比例约1:25(w/w)的比例加入胰蛋白酶并37℃条件下800r/分钟过夜反应。第二天，将酶解液转移入600微升离心管中，并加入100微升3％(v/v)甲酸洗涤一次，洗涤液与酶解液合并冻干后0.1％(v/v)甲酸复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate3000 RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
图6说明PECSL技术结合无标记定量分析方法可以实现胰岛素作用后(10秒-24小时)时间分辨的HepG2细胞细胞表面蛋白质组动态变化分析。此实验中选取八个胰岛素作用时间点，即10秒、30秒、2分钟、5分钟、30分钟、2小时、12小时以及24小时，每个胰岛素作用时间点准备了五次生物学重复的样品，每个样品进行了一次质谱分析。我们利用Perseus软件对胰岛素处理和未处理的HepG2细胞样品的细胞表面蛋白质组的定量结果进行比较分析。各细胞样品的细胞表面蛋白质组的定量结果的平均皮尔森相关性系数为0.9724，相关性较好，说明胰岛素刺激后，仅有少量蛋白质在HepG2细胞表面的丰度发生了显著性变化。另一方面，此结果也进一步确认了标记反应时间为10秒时PECSL技术具有很好的重现性。为了深入理解胰岛素动态调控下细胞表面蛋白质组的动态变化过程，尤其是感知胰岛素刺激后瞬时变化的细胞表面蛋白质组信息，我们将时间分辨的细胞表面蛋白质组数据分为短时间胰岛素刺激事件(10秒、30秒、2分钟、5分钟、30分钟)和长时间胰岛素刺激事件(30分钟、2小时、12小时、24小时)后进行下一步的数据分析。结果如图5.6所示，两组实验中分别定量到3061和3107个蛋白质，其中包含1363个GO-标注的细胞表面蛋白质(GO中标注有“plasmamembrane”、“cell surface”和extracellular(包括“extracellular matrix”、“extracellular region”、“extracellular space”、“extracellular vesicle”及“extracellular exosome”)的蛋白质定义为细胞表面蛋白质)。超过90％的蛋白质被两个事件共同定量到，说明短时间和长时间胰岛素作用事件过程中细胞表面蛋白质组的组成差异不大。经过严格的筛选后，此法共定量到296(～12％)个蛋白质在胰岛素作用过程中(10秒-24小时)在HepG2细胞质膜上的丰度发生了显著性变化(p-value<0.05，图5.6)，其中，这些蛋白质中包含许多已知的与胰岛素相关的蛋白质，如INSR(insulin receptor)、IGF1R(Insulin-like growth factor 1receptor)、CAV1(caveolin-1)、CAV2(caveolin-2)、CTNNB1(Catenin beta-1)、CAP1(Adenylyl cyclase-associated protein 1)，也包含更多可能的新的与胰岛素相关的蛋白质，如FLNA(Filamin-A)、FLNB(Filamin-B)、EWSR1(RNA-binding protein EWS)、CNNM3(Metal transporter CNNM3)、PODXL2(Podocalyxin-likeprotein 2)、ADCY9(Adenylatecyclase type 9)、TNFRSF10B(Tumor necrosis factorreceptor superfamily member 10B)以及TNFRSF10D(Tumor necrosis factor receptorsuperfamily member 10D)。
实施例6
操作过程同实施例5，与实施例5不同之处所用细胞为表皮生长因子刺激后的HeLa细胞。
HeLa细胞在10cm培养皿(购自Corning)中培养至其的表面积70％，PBS缓冲液(内含0.01M磷酸盐、0.15M氯化钠，pH 7.4，余量为水)洗涤三次，加入不含酚红的无血清1640培养基(购自Thermo Fisher Scientific)过夜(12-16小时)饥饿处理，向实验组加入100nM表皮生长因子(EGF，购自Sigma-Aldrich，货号：E9644；溶于不含酚红的无血清1640培养基中)37℃孵育5分钟，向对照组加入不含表皮生长因子的不含酚红的无血清1640培养基37℃孵育5分钟，实验组和对照组均用PBS缓冲液(预先平衡至室温)洗涤三次，去除洗涤液，放于脱色摇床缓慢晃动，加入2毫升含有0.5毫克/毫升辣根过氧化物酶(150-250U/mg，Sigma-Aldrich，货号：P8250)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)置于缓慢振荡晃动的脱色摇床上，确保标记反应溶液覆盖到所有细胞。立即加入2毫升有2mM过氧化氢(Sigma-Aldrich，货号：88597)和200μM B××P的PBS标记溶液(预先平衡至室温)于反应体系中引发标记反应。在脱色摇床上缓慢振荡晃动室温下反应1分钟后，加入10毫升4℃预冷的标记反应终止溶液(PBS，内含10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠、5mM水溶性维生素E)。4℃条件下于脱色摇床上轻轻摇动反应10分钟，接着，4℃预冷的终止标记反应溶液洗涤两次。
弃去培养皿中的标记反应终止溶液，加入0.5毫升4℃预冷的含有2％蛋白酶抑制剂混合物(内含AEBSF、Aprotinin、Bestatin hydrochloride、E-64、Leupeptinhemisulfate salt、Pepstatin A等，可抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性蛋白酶和氨基肽酶,Sigma-Aldrich，P8340，每100毫升裂解液中加入2毫升蛋白酶抑制剂混合物)、10mM叠氮钠、10mM脱氧胆酸钠及5mM水溶性维生素E的强RIPA裂解液(内含50mM三羟甲基氨基甲烷，150mM氯化钠，0.2％十二烷基磺酸钠(每100毫升溶液中加入0.2克十二烷基磺酸钠)，0.5％脱氧胆酸钠(每100毫升溶液中加入0.5克脱氧胆酸钠)，1％(v/v)Triton X-100，余量为水，pH8.0)，培养皿(购自Corning)置于冰上将细胞轻轻刮下来、并与裂解液一同转移至15毫升离心管中。再向培养皿中加入0.5毫升上述预冷的裂解液，重复一次。将两次收集的裂解液合并置于冰上的容器内。超声破碎细胞：超声30秒，间隔30秒；5-10个循环，得蛋白质提取液。蛋白质提取液转移至2毫升离心管中并于4℃条件下16 000g离心15分钟。取上清，通过PierceTM660nm蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。取1毫升PBS于1.5毫升离心管中，加入中性亲和素琼脂糖材料(Thermo Fisher Scientific，货号：29200)，上下轻轻颠倒几次，500g离心1分钟，胰岛素注射器(BD碧迪一次性使用无菌胰岛素注射器u-40)小心移去上清；加入1毫升PBS清洗，重复两次，弃去上清。加入标记后的蛋白质提取液，室温条件下翻转孵育1-3小时。500g离心1分钟并用1毫升胰岛素注射器小心去除上清后，加入1毫升PBS缓冲盐溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复6次。洗涤后的富集材料小心转移至2毫升离心管中，离心并小心弃去上清，向富集材料中加入500微升含6M尿素和10mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS缓冲液，65℃条件下反应15分钟。加入1M碘乙酰胺(溶于含6M尿素的PBS缓冲液中)至终浓度20mM，室温条件下避光反应40分钟。离心并弃去上清，加入500微升20mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)溶液，上下轻轻颠倒几次以重悬富集材料，重复两次。将固载有标记蛋白质的亲和素材料(ThermoFisher Scientific，货号：29200)重悬于100微升20mM碳酸氢铵溶液，按照酶与蛋白比例约1:25(w/w)的比例加入牛胰蛋白酶(TPCK-trypsin，购自Sigma-Aldric，货号：9002-07-7)并37℃条件下800r/分钟过夜反应。第二天，将酶解液转移入600微升离心管中，并加入100微升3％(v/v)甲酸/水洗涤一次，洗涤液与酶解液合并冻干后0.1％(v/v)甲酸复溶液质联用分析(质谱：Orbitrap Q-Exactive，高效液相色谱分离仪：Dionex UltiMate 3000 RSLCnano，Thermo Scientific，USA)。
图7说明PECSL技术结合无标记定量结果可以有效的识别出来表皮生长因子(EGF)在细胞表面的受体蛋白表皮生长因子受体(EGFR)，可以用于特异性的识别某些配体在细胞表面的受体蛋白质。表皮生长因子与其受体蛋白EGFR结合后，EGFR的构象发生了改变，导致蛋白在胞外暴露出来的溶液可接触的富电子氨基酸发生变化，最终反应到富集到的受体蛋白的量上的差异。如图7所示，PECSL技术结合无标记定量结果可以有效的识别出来EGF在细胞表面的受体蛋白EGFR，可以用于特异性的识别某些配体在细胞表面的受体蛋白质。

Claims (19)

1.一种过氧化物酶催化的细胞表面蛋白质标记方法，其特征在于，细胞外引入外源的过氧化物酶和相应的化学探针产生活性自由基，与暴露在细胞质膜外侧的蛋白质上的氨基酸发生共价反应而实现细胞表面蛋白质或质膜蛋白质的选择性标记；
所述化学探针结构式为：
Figure 766685DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
a.选取化学探针；
b.待标记细胞样品中加入过氧化物酶和化学探针，反应；
c.加入过量封闭缓冲液终止标记反应，去除标记试剂；
d.收集标记的蛋白质样品。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，化学探针的使用浓度根据标记的细胞样品的量调整，为1μM-10 mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，待标记细胞样品的细胞质膜结构应完整。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b中的待标记细胞样品为经过冷热刺激、或加入外源的药物分子、生长因子、代谢物、蛋白质或细胞的方式中一种或多种方式处理后得到的待标记细胞样品，用以分析不同方式处理后的细胞表面蛋白质的组成变化。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b中过氧化物酶为辣根过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶中的一种或二种以上。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤b中使用的过氧化物酶的使用浓度为1U/mL-1000 U/mL，所述的过氧化物酶的底物消耗能力高于探针的使用浓度。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，若化学探针的反应基团为酚羟基，向待标记细胞样品中加入过氧化物酶和化学探针后，需要在加入过氧化氢引发标记反应发生。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，过氧化氢的使用浓度为1μM -1M。
10.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，标记反应试剂过氧化物酶、化学探针以及过氧化氢需要预先溶解在一定的溶液中再加入待标记细胞样品中，溶液的pH值在6-9范围内，溶液中除了标记试剂外应尽量减少外源蛋白质、富电子氨基酸消耗产生的自由基的物质的引入；尽量减少抗坏血酸，奎诺二甲基丙烯酸酯猝灭自由基的物质的引入；尽量减少可抑制过氧化物酶活性或者变性过氧化物酶的物质的引入；尽量避免使用破坏细胞质膜结构的缓冲溶液体系；
溶解标记反应试剂的溶液为pH为7-8的PBS缓冲盐溶液、pH为7-8的DPBS缓冲盐溶液、pH为7-8的TBS缓冲盐溶液、0.9%的生理盐水、pH为7-8的不含酚红指示剂的1640培养基中的一种或两种以上。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b标记反应温度以不破坏待标记细胞质膜结构和过氧化物酶活性为参考，反应温度为4-37℃；标记反应时间为5秒-1小时。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中的封闭缓冲液为含有抗坏血酸、奎诺二甲基丙烯酸酯的自由基猝灭剂和/或叠氮钠的过氧化物酶的活性抑制剂中的一种或二种以上的缓冲液。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c中的封闭缓冲液中自由基猝灭剂和过氧化物酶的活性抑制剂的使用浓度相比较探针和过氧化物酶的使用浓度过量，其中以每毫升计，自由基猝灭剂：标记探针=2-1000倍；以每毫升计，过氧化物酶的活性抑制剂:过氧化物酶的酶活力单位=2-1000倍。
14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤d中收集标记的蛋白质样品后并进行蛋白质组学分析，蛋白质组学分析的手段包括点杂交，免疫印迹、流式细胞荧光分选，免疫荧光和液质联用检测中的一种或二种以上。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，暴露在细胞质膜外侧的蛋白质上的氨基酸主要为酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸中的一种或两种以上。
16.如权利要求3所述的方法，其特征在于，化学探针使用浓度为100μM -500μM。
17.如权利要求7所述的方法，其特征在于，过氧化物酶的使用浓度为100 U/mL-500 U/mL。
18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，过氧化氢的使用浓度在0.1 mM-10 mM。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤c中的封闭缓冲液中自由基猝灭剂和过氧化物酶的活性抑制剂的使用浓度相比较探针和过氧化物酶的使用浓度过量，以每毫升计，自由基猝灭剂：标记探针=10-100倍；以每毫升计，过氧化物酶的活性抑制剂:过氧化物酶的酶活力单位=10-100倍。
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