CN108277244A - 固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖 - Google Patents

固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖 Download PDF

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose

Abstract

本发明涉及一种固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖，具体公开了固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖的方法，其采用L‑赤藓酮糖和1,3‑二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D‑景天庚酮糖‑7‑磷酸；并进一步生成景天庚酮糖及醛糖。本发明的方法制备效率高，原料便宜，适合大规模工业生产，极大地降低了制备成本。

Description

固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖
技术领域
本发明涉及景天庚酮糖及醛糖的制备方法，特别涉及利用固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖的方法。
背景技术
景天庚酮糖jing-tian geng ketone sugar/醛糖是一种单糖，分子式为C7H14O7,分子量为210。景天庚酮糖由LaForge和Hudson在景天科植物Sedum spectabile中发现是自然界为数不多的七碳糖，它广泛存在于植物体内并在戊糖磷酸循环、植物光合作用、合成其它糖及生物合成莽草酸和芳香氨中是重要的初级和次级代谢产物。虽然大量文献报道了景天庚酮糖/醛糖在生物体内具有的重要生理功能，然而昂贵的价格一直严重的制约着该七碳糖的进一步应用推广研究；因此开发一种合理的大量制备景天庚酮糖/醛糖方法以降低其应用成本就变得非常重要。
景天庚酮糖及醛糖常规制备方法有天然产物分离法、化学合成法以及酶催化制备法；天然产物分离法费时费力，成本高收率低，无法放大生产；景天庚酮糖及醛糖的化学制备法往往利用六碳糖经过繁琐的基团保护缩合最终得到七碳糖的混合物(Ia)，分离麻烦，最终转化率低；酶合成法则是用来制备该七碳酮糖的普遍方法，该类方法通常采用赤藓糖及其磷酸、核糖及其磷酸与3-羟基丙酮酸或1,3-二羟基丙酮在转酮酶(Transketolase)或醛缩酶(Aldolase)催化下制备而来(Ib-IIIb)；常用酶合成方法中IIIb、IVa利用转酮酶将D-核糖-5-磷酸与3-羟基丙酮酸或者磷酸木酮糖缩合成D-景天庚酮糖-7-磷酸，然而在实际放大生产应用中，由于D-核糖-5-磷酸、磷酸木酮糖、3-羟基丙酮酸价格都比较昂贵(TableI)故而无法采用。现有技术中的制备流程如下：
现有技术中采用的方法原料昂贵，反应效率较低，产品纯度不高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明一个目的提供了一种制备D-景天庚酮糖和D-景天庚醛糖中间体D-景天庚酮糖-7-磷酸的制备方法。
本发明另一个目的提供了一种D-景天庚酮糖的制备方法。
本发明再一个目的提供了一种D-景天庚醛糖的制备方法。
具体的，本发明一个方面提供了一种制备D-景天庚酮糖和D-景天庚醛糖中间体D-景天庚酮糖-7-磷酸的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸。
本发明另一个方面提供了D-景天庚酮糖的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸；
4-1)以D-景天庚酮糖-7-磷酸为原料，在固定化磷酸水解酶IPH作用下反应获得D-景天庚酮糖及其醛糖。
本发明另一个方面提供了D-景天庚醛糖的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸；
4-2)以D-景天庚酮糖-7-磷酸为原料，在固定化异构酶SPI、固定化致活酶SPK、固定化磷酸水解酶SPH以及固定化ATP再生酶PPK作用下获得D-景天庚醛糖-7-磷酸；D-景天庚醛糖-7-磷酸在固定化磷酸水解酶IPH作用下反应获得D-景天庚醛糖。
在本发明的制备方法中，其中步骤3)为将L-赤藓酮糖，1,3-二羟基丙酮、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁、氯化钾缓冲溶液中，加入固定化致活酶、固定化异构酶TRI、固定化异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA以及固定化ATP再生酶PPK，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
优选地，固定化醛缩酶FSA以及固定化ATP再生酶PPK的活性分别为1000U和1200U以上。
在本发明的制备方法中，其中步骤3)还包括纯化D-景天庚酮糖-7-磷酸的步骤，纯化D-景天庚酮糖-7-磷酸的方法为以草酸钡沉淀D-景天庚酮糖-7-磷酸及其它含磷酸杂质；析出的固体溶解在缓冲液中，再硫酸钠沉淀不溶性硫酸钡，滤液柱层析进行分离。优选地，以阴离子树酯交换柱分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱。
在本发明的制备方法中，其中步骤4-1)为D-景天庚酮糖-7-磷酸钠钠溶解在缓冲溶液中加入氯化镁和固定化磷酸水解酶IPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
在本发明的制备方法中，其中步骤4-1)还包括纯化D-景天庚酮糖步骤，是以阴离子树酯交换柱进行层析分离纯化。
在本发明的制备方法中，其中步骤4-2)是D-景天庚酮糖-7-磷酸钠溶解在缓冲溶液中加入三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁、氯化钾；然后加入固定化异构酶SPI和固定化致活酶SPK，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全；过滤固定化酶，然后以固定化磷酸水解酶SPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全，得到D-景天庚醛糖-1-磷酸钠；任选地，进行D-景天庚醛糖-1-磷酸钠纯化；D-景天庚醛糖-1-磷酸钠溶解在缓冲溶液中加入氯化镁和固定化磷酸水解酶IPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
D-景天庚醛糖-1-磷酸钠纯化步骤为以草酸钡沉淀D-景天庚醛糖-1-磷酸及其它含磷酸杂质；析出的固体溶解在缓冲液中，再硫酸钠沉淀不溶性硫酸钡，滤液柱层析进行分离。优选地，以阴离子树酯交换柱分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱。
在本发明的技术方案中，所述的致活酶EK的EC号为EC 2.7.1.209、其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
EK正向引物:5’-GAAGGACGGACATATGACGTACCTCCTGAAC-3’SEQ ID No.1
EK反向引物:5’-GTCGGTCGGGCCTCGAGCCGGGTGAGGTGC-3’SEQ ID No.2
扩增致活酶EK基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，异构酶TRI的EC号为EC 5.1.3.39、其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
TRI正向引物:5’-CATCTGCGCGTACGCATATGCCTGACGCTCG-3’SEQ ID No.3
TRI反向引物:5’-CACCTACCGGCCGAAGCTTCACTCACCGGTG-3’SEQ ID No.4
扩增致活酶TRI基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，赤藓酮糖磷酸异构酶RPI的EC号为EC 5.3.1.34、其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
RPI正向引物:5’-GGAGAAGGAGAGCCATATGGCGTTGAAGATCG-3’SEQ ID No.5
RPI反向引物:5’-GGTGCCGATCCAAAGCTTTGCGGCGCCGAGC-3’SEQ ID No.6
扩增致活酶RPI基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，醛缩酶FSA的EC号为FSA,EC4.1.2.-、其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
FSA正向引物:5’-CATTTTGAGGATGCATATGGAAGGAACTGTATC-3’SEQ ID No.7
FSA反向引物:5’-CGTCATCAGCAATT CTCGAGGATGCAGAACG-3’SEQ ID No.8
扩增致活酶FSA基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，景天庚酮糖-7-磷酸异构酶(SPI)的EC号为EC
5.3.1.28，其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
SPI正向引物：5’-GGATATCCATATGTACCAGG-3’SEQ ID No.9
SPI反向引物：5’-CAAATGCCGGATCCGGCGTAAAC-3’SEQ ID No.10
扩增致活酶SPI基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，景天庚醛糖-7-磷酸致活酶(SPK)的EC号为EC2.7.1.167；其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
SPK正向引物:5’-GGAAGAACTCATATGAATCTTTACCCG-3’SEQ ID No.11
SPK反向引物:5’-CGGTCACCAGGATCCTGTTGATTCTCC-3’SEQ ID No.12
扩增致活酶SPK基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶(SPH)的EC号为EC3.1.3.82；其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
SPH正向引物:5’-GAGCTATAACATATGGCGAAGAG-3’SEQ ID No.13
SPH反向引物:5’-GAGTCGGATCCGGAAGACAAG-3’SEQ ID No.14
扩增致活酶SPH基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，无机磷酸水解酶IPH的EC号为EC 3.6.1.1；其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以采用下述引物
IPH正向引物:5’-AAGGAAACACATATGAGCTTACTCAACGTC-3’SEQ ID No.15
IPH反向引物:5’-CGTTCAGGGTTATTACTCGAGAAGAACTTAT-3’SEQ ID No.16
扩增致活酶IPH基因片段，并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，ATP再生酶PPK的EC号为EC 2.7.4.1、其可以通过市售或者发酵方法获得；具体发酵方法可以将ATP再生酶PPK与环形杆菌(Bacillus circulans)几丁质结合域CBD(Chitin-Binding Domain)融合基因(CBD-PPK)并通过质粒转染至微生物中进行发酵培养获得。
在本发明的技术方案中，固定化酶的方法为将一种酶单独进行固定化，或者将几种酶混合后进行固定化。
在本发明的技术方案中，固定化酶以环氧树脂或几丁质珠树酯作为载体。
表1化合物价格表
化合物名 公司 价格(人民币元)
1,3-二羟基丙酮 Carbosynth 715/公斤
3-羟基丙酮酸 Alfa-aesar 2226000/公斤
D-赤藓糖 Carbosynth 250000/公斤
L-赤藓酮糖 Carbosynth 1200/公斤
D-核糖 Carbosynth 800/公斤
D-核糖-5-磷酸 Carbosynth 1630000/公斤
D-木酮糖 Carbosynth 10.9/毫克
D-木酮糖-5-磷酸 Carbosynth 550/毫克
D-景天庚酮糖-7-磷酸 Carbosynth 130/毫克
本发明的发明人发现，部分羟基丙酮致活酶(EK,EC 2.7.1.209)能将L-赤藓酮糖磷酸化成L-赤藓酮糖-1-磷酸，而异构酶TRI(EC 5.1.3.39)、RPI(EC 5.3.1.34)能将L-赤藓酮糖-1-磷酸连续异构化成D-赤藓糖-4-磷酸，随后与1,3-二羟基丙酮在醛缩酶(FSA,EC4.1.2.-)催化条件下选择性生成D-景天庚酮糖-7-磷酸。D-景天庚酮糖-7-磷酸在对应异构酶(SPI,EC 5.3.1.28)以及致活酶(SPK,EC 2.7.1.167)存在下转化成景天庚醛糖-7-磷酸及景天庚醛糖-1,7-二磷酸,最后通过磷酸水解酶(SPH,EC 3.1.3.82；IPH,EC 3.6.1.1)就可以将景天庚酮糖-7-磷酸、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解成对应的景天庚酮糖与醛糖。在整个反应路径中，不可逆反应穿插在可逆反应(异构化)后以实现完全转化；与此同时，通过在反应体系中加入了固定化ATP再生酶(PPK,EC 2.7.4.1)循环再生ATP，一方面可以大大减少价格昂贵的ATP的用量(减少99％用量)，而另一方面可以降低反应体系二磷酸腺苷ADP的浓度而避免其副作用(如抑制酶活等)。
有益效果
本发明利用多种廉价的固定化酶同一体系连续反应将廉价的L-赤藓酮糖与1,3-二羟基丙酮转化成高附加值景天庚酮糖/醛糖，操作简单、收率高，固定化酶催化剂极其适用于规模工业化生产，生产成本低、环境污染少、生产绿色指数高。
附图说明
图1为以本发明的方法制备D-景天庚酮糖和D-景天庚醛糖的制备流程图。
图2为D-景天庚酮糖氢谱1H-NMR,核磁谱图(20mM D2O溶液Varian Inova 600MHzNMR)。
图3为D-景天庚酮糖碳谱13C-NMR核磁谱图(20mM D2O溶液Varian Inova 600MHzNMR)。
图4为D-景天庚醛糖氢谱1H-NMR,核磁谱图(20mM D2O溶液Varian Inova 600MHzNMR)。
图5为D-景天庚醛糖碳谱13C-NMR核磁谱图(20mM D2O溶液Varian Inova 600MHzNMR)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1发酵生产酶
发酵生产赤藓酮糖致活酶(EK)、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶(FSA)、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶(SPI)、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶(SPK)、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶(SPH)、无机磷酸水解酶(IPH)以及ATP再生酶(PPK)。
以提取的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株(购于通用生物)DNA、ATCC购买的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与支气管败血性杆菌(Bordetellabronchiseptica)染色体为模板，通过PCR扩增出EK、TRI、RPI、FSA、SPI、SPK、SPH以及IPH基因片段，其中使用的扩增引物如下所示:
基因的序列扩增引物:
EK正向引物:5’-GAAGGACGGACATATGACGTACCTCCTGAAC-3’SEQ ID No.1
EK反向引物:5’-GTCGGTCGGGCCTCGAGCCGGGTGAGGTGC-3’SEQ ID No.2
TRI正向引物:5’-CATCTGCGCGTACGCAT ATGCCTGACGCTCG-3’SEQ ID No.3
TRI反向引物:5’-CACCTACCGGCCGAAGCTTCACTCACCGGTG-3’SEQ ID No.4
RPI正向引物:5’-GGAGAAGGAGAGCCATATGGCGTTGAAGATCG-3’SEQ ID No.5
RPI反向引物:5’-GGTGCCGATCCAAAGCTTTGCGGCGCCGAGC-3’SEQ ID No.6
FSA正向引物:5’-CATTTTGAGGATGCATATGGAAGGAACTGTATC-3’SEQ ID No.7
FSA反向引物:5’-CGTCATCAGCAATT CTCGAGGATGCAGAACG-3’SEQ ID No.8
SPI正向引物：5’-GGATATCCATATGTACCAGG-3’SEQ ID No.9
SPI反向引物：5’-CAAATGCCGGATCCGGCGTAAAC-3’SEQ ID No.10
SPK正向引物:5’-GGAAGAACTCATATGAATCTTTACCCG-3’SEQ ID No.11
SPK反向引物:5’-CGGTCACCAGGATCCTGTTGATTCTCC-3’SEQ ID No.12
SPH正向引物:5’-GAGCTATAACATATGGCGAAGAG-3’SEQ ID No.13
SPH反向引物:5’-GAGTCGGATCCGGAAGACAAG-3’SEQ ID No.14
IPH正向引物:5’-AAGGAAACACATATGAGCTTACTCAACGTC-3’SEQ ID No.15
IPH反向引物:5’-CGTTCAGGGTTATTACTCGAGAAGAACTTAT-3’SEQ ID No.16
然后通过相应酶切连接到pET28a质粒上(购于生物风)，其中ATP再生酶PPK与环形杆菌(Bacillus circulans)几丁质结合域CBD(Chitin-Binding Domain)融合基因(CBD-PPK)直接从通用生物公司购买并亚克隆在pET28a质粒上。所有基因序列进而转入E.coliBL21(DE3)菌株(通用生物)，确认正确的菌落培养到含50uM卡拉霉素的LB培养液中；当细胞增长至对数期后加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达4小时，然后收集、破碎细胞，高速离心清液在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达。确认蛋白表达的种子培养基也可以接入到10L培养发酵罐里生长至对数期后用0.5mM IPTG诱导表达6小时，收集湿细胞200g。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl、1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
实施例2将酶固定化至载体上
异构酶(TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI,SPI)、致活酶(EK,SPK)、磷酸水解酶(SPH,IPH)以及醛缩酶(FSA)细胞破碎清液先逐步加入65％饱和的硫酸铵沉淀析出，然后将固体缓慢溶解到25mM pH 8.0的Tris缓冲液中，经G25尺寸排阻柱脱盐(购于Sigma)后再利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化EK、TRI、RPI、FSA、SPI、SPK、SPH、IPH酶，所有酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照以下方法进行单独或者混合固定化：1000U纯化酶溶解在1L 100mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入60mM苯氧乙酸以及200克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌24小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及100mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤两次后低温干燥待用。固定化异构酶(TRI、RPI、SPI)、致活酶(EK,SPK)、醛缩酶(FSA)、磷酸水解酶(SPH、IPH)具有液体酶15-70％的活性。而对于ATP再生酶，1L融合酶CBD-PPK细胞破碎清液直接上样几丁质珠树酯纯化固定，该固定化CBD-PPK酶具有液体酶90％的活性。
实施例3以固定化酶制备D-景天庚酮糖-7-磷酸
利用固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化致活酶(EK)、固定化转酮酶(FSA)、固定化ATP再生酶(PPK)以及起始原料L-赤藓酮糖、1,3-二羟基丙酮一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化D-景天庚酮糖-7-磷酸；
在1L 25mM pH 7.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入9.0克L-赤藓酮糖(75mM)，7.2克1,3-二羟基丙酮(80mM)、551毫克三磷酸腺苷二钠盐ATP(1mM)、7.6克多聚磷酸(Sigma,25聚，74mM磷酸)、2.8克氯化镁(30mM)、1.5克氯化钾(20mM)；待pH值调节到7.0后，500U固定化致活酶(EK)、800U固定化异构酶(TRI、RPI)、1200U固定化醛缩酶(FSA)以及1500U固定化ATP循环再生酶(CBD-PPK)相继加入反应体系开始反应，反应30℃搅拌5小时后取溶液用L-赤藓酮糖致活酶的方法定量检测残余L-赤藓酮糖，结果表明反应完全。(活性单位U代表30℃每分钟转化1μM底物所需要的酶量)
过滤反应液回收利用固定化酶，在滤液中加入19.1克草酸钡(75mmol)沉淀D-景天庚酮糖-7-磷酸及其它含磷酸杂质。随后将析出固体溶解在pH 1.0的Tris缓冲溶液中，加入10.6克无水硫酸钠(75mmol)析出不溶性硫酸钡；过滤除去固体，将过滤液pH调到7.0后上样D201阴离子树酯交换柱(晶祥化工)分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱得纯D-景天庚酮糖-7-磷酸。最后G25尺寸排阻柱脱盐得到17.5克D-景天庚酮糖-7-磷酸钠白色粉末，收率达75％。固定化酶回收15次后保留70％原始活性。
实施例4以固定化酶制备D-景天庚酮糖
产物D-景天庚酮糖-7-磷酸钠钠溶解在500mL 25mM pH 7.0Tris缓冲液，随后加入800毫克氯化镁、1000U固定化磷酸水解酶(IPH)室温混合搅拌三小时，过滤回收固定化酶，滤液上样D201阴离子树酯交换柱，产物D-景天庚酮糖直接流出。产品浓缩除盐后得到90％收率。固定化磷酸水解酶(IPH)回收利用10次保留90％活性。核磁结果参见附图2-3。
实施例5以固定化酶制备D-景天庚醛糖
以D-景天庚酮糖-7-磷酸为原料，固定化异构酶(SPI)、固定化致活酶(SPK)、固定化磷酸水解酶(SPH,IPH)以及固定化ATP再生酶(PPK)为催化剂生产D-景天庚酮糖及其醛糖。
将10克D-景天庚酮糖-7-磷酸钠(64mM)溶解在500mL 25mM pH 7.0的Tris.HCl溶液中先后加入275毫克三磷酸腺苷二钠盐ATP(1mM)、3.3克多聚磷酸(Sigma,25聚，64mM磷酸)、1.4克氯化镁(30mM)、745毫克氯化钾(20mM)；待pH值调节到7.0后，300U固定化异构酶(SPI)、500U固定化致活酶(SPK)分别加入溶液开始反应；30℃缓慢搅拌4小时后直接过滤固定化酶终止反应，随后在过滤液中直接加入1000U固定化磷酸水解酶(SPH)室温搅拌反应2小时，最终反应液依据上述D-景天庚酮糖-7-磷酸产物纯化步骤分离得8.5克D-景天庚醛糖-1-磷酸钠，收率85％。
产物D-景天庚醛糖-1-磷酸钠溶解在500mL 25mM pH 7.0Tris缓冲液，随后加入800毫克氯化镁、1000U固定化磷酸水解酶(IPH)室温混合搅拌三小时，过滤回收固定化酶，滤液上样D201阴离子树酯交换柱，产物D-景天庚醛糖直接流出。产品浓缩除盐后得到87％收率。固定化磷酸水解酶(IPH)回收利用10次保留90％活性。核磁结果参见附图4-5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司
<120> 固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖
<130> CP11701243C
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaggacgga catatgacgt acctcctgaa c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcggtcggg cctcgagccg ggtgaggtgc 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catctgcgcg tacgcatatg cctgacgctc g 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacctaccgg ccgaagcttc actcaccggt g 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggagaaggag agccatatgg cgttgaagat cg 32
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtgccgatc caaagctttg cggcgccgag c 31
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cattttgagg atgcatatgg aaggaactgt atc 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgtcatcagc aattctcgag gatgcagaac g 31
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggatatccat atgtaccagg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caaatgccgg atccggcgta aac 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaagaactc atatgaatct ttacccg 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cggtcaccag gatcctgttg attctcc 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gagctataac atatggcgaa gag 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagtcggatc cggaagacaa g 21
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaggaaacac atatgagctt actcaacgtc 30
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgttcagggt tattactcga gaagaactta t 31

Claims (10)

1.一种制备D-景天庚酮糖和D-景天庚醛糖中间体D-景天庚酮糖-7-磷酸的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸。
2.一种D-景天庚酮糖的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸；
4-1)以D-景天庚酮糖-7-磷酸为原料，在固定化磷酸水解酶IPH作用下反应获得D-景天庚酮糖及其醛糖。
3.一种D-景天庚醛糖的制备方法，其包括如下步骤：
1)发酵生产赤藓酮糖致活酶EK、赤藓酮糖磷酸异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、醛缩酶FSA、景天庚酮糖-7-磷酸异构酶SPI、景天庚醛糖-7-磷酸致活酶SPK、景天庚醛糖-1,7-二磷酸水解酶SPH、无机磷酸水解酶IPH以及ATP再生酶PPK；
2)将步骤1)所得的酶固定化在载体上；
3)以L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮为起始原料，在固定化致活酶EK、固定化异构酶TRI、赤藓酮糖磷酸异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA、固定化ATP再生酶PPK一锅法制备D-景天庚酮糖-7-磷酸；分离纯化获得D-景天庚酮糖-7-磷酸；
4-2)以D-景天庚酮糖-7-磷酸为原料，在固定化异构酶SPI、固定化致活酶SPK、固定化磷酸水解酶SPH以及固定化ATP再生酶PPK作用下获得D-景天庚醛糖-7-磷酸；D-景天庚醛糖-7-磷酸在固定化磷酸水解酶IPH作用下反应获得D-景天庚醛糖。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，步骤3)为将L-赤藓酮糖，1,3-二羟基丙酮、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁、氯化钾缓冲溶液中，加入固定化致活酶、固定化异构酶TRI、固定化异构酶RPI、固定化醛缩酶FSA以及固定化ATP再生酶PPK，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，步骤3)还包括纯化D-景天庚酮糖-7-磷酸的步骤，纯化D-景天庚酮糖-7-磷酸的方法为以草酸钡沉淀D-景天庚酮糖-7-磷酸及其它含磷酸杂质；析出的固体溶解在缓冲液中，再硫酸钠沉淀不溶性硫酸钡，滤液柱层析进行分离；优选地，以阴离子树酯交换柱分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱。
6.根据权利要求2，4-5任一项所述的方法，其中，步骤4-1)为D-景天庚酮糖-7-磷酸钠钠溶解在缓冲溶液中加入氯化镁和固定化磷酸水解酶IPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
7.根据权利要求2,4-6任一项所述的方法，其中，步骤4-1)还包括纯化D-景天庚酮糖步骤，是以阴离子树酯交换柱进行层析分离纯化。
8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其中，步骤4-2)是D-景天庚酮糖-7-磷酸钠溶解在缓冲溶液中加入三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁、氯化钾；然后加入固定化异构酶SPI和固定化致活酶SPK，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全；过滤固定化酶，然后以固定化磷酸水解酶SPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全，得到D-景天庚醛糖-1-磷酸钠；任选地，进行D-景天庚醛糖-1-磷酸钠纯化；D-景天庚醛糖-1-磷酸钠溶解在缓冲溶液中加入氯化镁和固定化磷酸水解酶IPH，在25-37℃，pH6.0-8.5条件下反应至完全。
9.根据权利要求8所述的制备方法，D-景天庚醛糖-1-磷酸钠纯化步骤为以草酸钡沉淀D-景天庚醛糖-1-磷酸及其它含磷酸杂质；析出的固体溶解在缓冲液中，再硫酸钠沉淀不溶性硫酸钡，滤液柱层析进行分离。优选地，以阴离子树酯交换柱分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，固定化酶的方法为将一种酶单独进行固定化，或者将几种酶混合后进行固定化。
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