CN110452942A - 固定化酶催化法制备d-核酮糖 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了固定化酶催化法制备D‑核酮糖，该方法先扩增、发酵生产D‑核酮糖代谢途径中所需的系列酶，接着对酶做纯化和固定，再加入起始原料，合成D‑核酮糖。本发明方法采用系列酶连续地将D‑葡萄糖酸转化成2‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸‑6‑磷酸以及D‑核酮糖‑5‑磷酸，比较完全地将D‑葡萄糖酸一步转化成最终产物。并通过在反应体系引入乳酸脱氢酶与丙酮酸，ATP再生酶与多聚磷酸，则能循环再生辅酶，从而有效降低这些昂贵的辅酶的用量。

Description

固定化酶催化法制备D-核酮糖
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及固定化酶催化法制备D-核酮糖，利用多个固定化酶连续转化D-葡萄糖酸得到D-核酮糖。
背景技术
核酮糖(Ribulose)是一种五碳酮糖，其对应的醛糖是核糖(Ribose)，该酮糖含有D,L两种构型，分子式为C5H10O5，分子量150。
D-核酮糖是生物体内普遍存在的戊糖代谢通路(Pentose Phosphate Pathway)里重要的中间体，是很多活性物质生物合成的起始原料。核酮糖的衍生物核酮糖-5-磷酸以及核酮糖-1,5-二磷酸在植物光合作用的暗反应中非常重要；此外，在人体的粪便中就检测D/L-核酮糖的存在，证明人体微生物能产生该类物质。
然而昂贵的价格一直严重地制约核酮糖理论及应用研究(D-核酮糖：￥9000元/克)，因而开发一种简易的、能批量生产核酮糖的方法以降低其成本变得很重要。
目前核酮糖常用的制备方法有分离法、化学合成法及酶催化法。虽然自然界中核糖非常丰富，但其酮糖含量很低，再加上其它大量类似糖类分子的存在，天然产物分离制备该水溶性小分子单糖非常繁琐，并且无法放大。
糖的化学合成工艺研究历史悠久，但是由于糖的多个手性中心及该类化合物的特殊物理性质导致该领域研究进展缓慢，无论是从其醇糖(阿糖醇)氧化或是从核糖异构化，多步的羟基选择性保护/脱保护导致核酮糖制备成本居高不下；因此生物转化成为核酮糖制备的必然选择。
虽然不少文献公开报道了利用异构酶或者是氧化酶制备核酮糖的可能性，但由于未综合考虑原料成本、纯化工艺以及实际放大生产的可行性，因而无法实现廉价生产。
发明内容
为了克服现有技术无法低成本地、便捷地制备高纯度D-核酮糖的缺陷，本发明的目的在于提供固定化酶催化法制备D-核酮糖。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种制备D-核酮糖的方法，本发明方法所涉及的代谢途径如下所示：
具体包括以下步骤：
(1)PCR扩增D-葡萄糖酸脱氢酶(GDH)、酮酸异构酶(GIS)、酮酸激酶(GK)、酮酸脱羧酶(GDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP再生酶(PPK)和磷酸水解酶(AP)的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；
所述的PCR扩增，是以大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株gDNA、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter K84,ATCC BAA868)染色体为模板；
所述的质粒优选pET28a；
所述的细胞优选E.coli BL21(DE3)菌株；
步骤(1)中，所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基；做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素；
所述的扩大培养，培养基中含有0.5mM IPTG，37℃诱导表达6小时；
(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到GDH、GIS、GK、GDC、LDH、PPK、AP液体酶；
所述的离心，是10000-16000rpm离心12-45min；
所述的纯化，是将蛋白溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的液体酶；
(3)将GDH、GIS、GK、GDC的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌2-6小时，酶固定在环氧树脂上，过滤出环氧树脂，用清水和缓冲液洗涤，固定化混合酶活力是原液的10-40％；LDH、PPK、AP的纯化酶依同样的步骤单独固定，得到的活力维持在30-60％；
在该工艺中，LDH、PPK是两个辅酶，一个用来再生NAD+，一个用来再生ATP。本发明的大量前期实验数据证明这两个酶稳定性非常好，而固定化的GDH等酶稳定性相对差。为了减少LDH、PPK的整体用量，故采用单独固定，一起添加。
所述的混合酶中，按活性单位计，GDH、GIS、GK、GDC的比值为(2.0-4.0):(0.5-1.5):(3.0-8.0):(0.5-2.0)；要实现酶的多步有效转化，调节反应体系内的酶的用量比较关键。这与酶的活力、稳定性以及每步反应的难度、平衡度有关。该连续反应中，GDH反应是平衡反应，难度较大，而后是GK的激酶反应难度次之，GIS反应酶稳定性高，反应容易进行；GDC是脱羧基释放CO2的反应，也比较容易进行，酶稳定性也不错。在大量制备反应中，通过事前考虑这些因素而调节酶量可以很好地实现整个反应过程中地有效转化。
所述的缓冲液优选25-50mM pH值8.0的磷酸钾溶液；
(4)在缓冲液中加入D-葡萄糖酸钠、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐(NAD+)、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5-9.0，固定化混合酶(GDH、GIS、GK、GDC)、固定化LDH、固定化PPK一次性加入反应体系中，25-40℃反应直至反应完全(D-葡萄糖酸钠基本耗尽)，过滤回收固定化酶(回收活性在50-75％)，所得D-核酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
按活性单位比，所述固定化混合酶(GDH、GIS、GK、GDC)、固定化LDH、固定化PPK三者的比值为(3.0-5.0):(0.8-2.0):(2.0-3.0)；该反应中，主反应酶(即固定化混合酶)稳定性差，故酶用量较多；LDH稳定性很好，所以用量少；PPK稳定性较好。
所述的D-核酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：
往过滤液中加入1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分(D/L-核酮糖-5-磷酸、AMP、ADP、ATP)，离心收集白色沉淀并将之溶解在酸性溶液中(pH值0.5-2.0)，随后加入1.2当量无水硫酸钠除去Ba2+离子，过滤、离心除去硫酸钡沉淀，调节溶液pH值至7.0后用D201阴离子交换树酯除去混合物中的含磷酸杂质(AMP、ADP、ATP)，采用碳酸氢氨水溶液梯度洗脱(0-1N)，分离得到D-核酮糖-5-磷酸钠纯品；最后G25尺寸排阻柱脱盐、冻干得到D-核酮糖-5-磷酸钠；
(5)将D-核酮糖-5-磷酸钠和六水氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，25-40℃反应1.5-3.0个小时，然后过滤回收固定化AP(具有92％初始活性)，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-核酮糖纯品；
步骤(4)和(5)所述的缓冲液优选三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液，特别优选100mM pH值7.5-8.0的Tris.HCl溶液；
所述的纯化是G25尺寸排阻柱脱盐。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明方法以少量的糖酸氧化酶(GDH,EC 1.2.1.-)、异构酶(GIS,EC5.3.1.-)、激酶(GK,EC 2.7.1.-)、脱羧酶(GDC,EC 4.1.2.-)，连续地将D-葡萄糖酸转化成2-氧-D-葡萄糖酸、3-氧-D-葡萄糖酸、3-氧-D-葡萄糖酸-6-磷酸以及D-核酮糖-5-磷酸，以上酶同时使用能比较完全地将D-葡萄糖酸一步转化成最终产物。
2、由于上述氧化酶、激酶都需要使用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、三磷酸腺苷(ATP)等价格比较昂贵的辅酶，通过在反应体系引入乳酸脱氢酶(LDH,EC 1.1.1.28)与丙酮酸，ATP再生酶(PPK,EC 2.7.4.1)与多聚磷酸，则能循环再生辅酶，从而有效降低其用量。上述制备的磷酸核酮糖通过磷酸水解酶(AP,EC 3.1.3.1)就能方便的制备核酮糖，本发明还将以上各种酶进行固定化，可以进一步提高其规模化生产的可行性。
3、本专利充分利用酶催化的优势(多步联合催化实现完全转化、酶固定化重复利用等)，将廉价的L-阿拉伯糖(￥2/克,Aladdin试剂)及D-葡萄糖酸(￥200/公斤,Aladdin试剂)转化成核酮糖。该方法副产物少、产率高、分离纯化方便,其规模化生产将大大降低核酮糖生产成本。
附图说明
图1是纯化酶的SDS-PAGE凝胶图；其中最左边泳道是三色预染蛋白质标准。
图2是纯化后D-核酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的1H-NMR谱图。
图3是是纯化后D-核酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的13C-NMR谱图。
图4是是纯化后D-核酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的质谱。
图5是纯化后D-核酮糖在600M Varian D2O溶液中的1H-NMR谱图。
图6是纯化后D-核酮糖在600M Varian D2O溶液中的13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
固定化酶催化法制备D-核酮糖，包括以下步骤：
(1)以提取的大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株(购于通用生物)gDNA、ATCC购买的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter K84,ATCC BAA868)染色体为模板，PCR分别扩增GDH、GIS、GK、GDC、LDH、PPK以及AP基因片段，然后分别通过相应酶切、酶连接到pET28a质粒上(购于生物风)。
PCR扩增所用的引物如下：
GDH正向引物:5’-gggagggcagctcatatgaccggtcggaag-3’(SEQ.ID.NO.1)
GDH反向引物:5’-cagacgacgtttggatccgctgttgtcgctc-3’(SEQ.ID.NO.2)
GIS正向引物:5’-cggagacaatccatatgcccgtctttgcgg-3’(SEQ.ID.NO.3)
GIS反向引物:5’-gtcggcaatcgcctcgagcaagagtgtcatc-3’(SEQ.ID.NO.4)
GK正向引物:5’-caaaaggataaa catatgacactcttgctc-3’(SEQ.ID.NO.5)
GK反向引物:5’-ggtgtccctacctcgagtgcctaatgcatc-3’(SEQ.ID.NO.6)
GDC正向引物:5’-cgaggtagggaccatatgaccgaagaagcg-3’(SEQ.ID.NO.7)
GDC反向引物:5’-ggttctttgttctcgaggggctgaaatcag-3’(SEQ.ID.NO.8)
LDH正向引物:5’-catcactggagaaagtcatatgaaactcg-3’(SEQ.ID.NO.9)
LDH反向引物:5’-gaatgcaggggagcctcgagattaaaccag-3’(SEQ.ID.NO.10)
PPK正向引物:5’-gagcgggaggaagcatatggcactcgacg-3’(SEQ.ID.NO.11)
PPK反向引物:5’-ctgatcgtcagctcgagggaatcacctgag-3’(SEQ.ID.NO.12)
AP正向引物:5’-catggagaaaatcatatgaaacaaagcac-3’(SEQ.ID.NO.13)
AP反向引物:5’-aattcactgccgggctcgagtttatttcagc-3’(SEQ.ID.NO.14)
通过基因测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株，在37℃、5ml含50uM卡那霉素(Kanamycin)的LB培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后(OD 0.5-0.6)，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达4小时，最后收集细胞、破碎、离心，上清液利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达(见图1)。
蛋白表达正确的菌种然后逐级接入到5升培养发酵罐里培养，在0.5mM IPTG条件下37℃诱导表达6小时，收集湿细胞近40克。
LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾，1％磷酸氢二钾以及5％的甘油，其余为水。
(2)收集的湿细胞通过高压破碎、高速离心(16000rpm,45min)，上清液逐量加入硫酸铵固体直至酶固体析出(25％-60％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体随后通过离心收集(10000rpm,12min)，并缓慢溶入25mM pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化GDH、GIS、GK、GDH、LDH、PPK、AP液体酶。
GDH、GIS、GK、GDC按活性单位比(2-4):(0.5-1.5):(3-8):(0.5-2)混合，500-1000U混合酶溶解在1L 50mM pH值8.0的磷酸钾溶液中，随后加入100-300克LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)至缓冲液，室温搅拌2-6小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH值8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用。固定化混合酶活力是原液的10-40％。
ATP再生酶(PPK),乳酸脱氢酶(LDH),磷酸水解酶(AP)则利用上述同样的方法分别进行单独固定化，得到的活力维持在30-60％。
(3)在1L 100mM pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入16.4克D-葡萄糖酸钠(75mM)，8.8克丙酮酸钠(80mM)，2.8克三磷酸腺苷二钠盐ATP(5mM)，1.4克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐NAD+(2mM)，10.3克多聚磷酸(Sigma,25聚,100mM单磷酸)，1.9克氯化镁(20mM)和0.7克氯化钾(10mM)；待pH值调节到8.0后，加入2000-5000U固定化混合酶(GDH、GIS、GK、GDC)，800-2000U乳酸脱氢酶(LDH)以及2000-3000U固定化ATP再生酶(PPK)，反应在30℃轻微搅拌5小时后检测反应完全(通过检测残余D-葡萄糖酸钠在氧化酶及NAD+下340nm吸收值变化)，过滤回收固定化酶(回收活性在50-75％)，D-核酮糖-5-磷酸粗液进行下一步纯化。
往上述反应过滤液中加入1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍体积的乙醇溶液，沉淀所有含磷酸成分(D/L-核酮糖-5-磷酸、AMP、ADP、ATP)，离心收集白色沉淀并将之溶解在酸性溶液中(pH值0.5-2.0)，随后加入1.2当量无水硫酸钠除去Ba2+离子，过滤/离心除去硫酸钡沉淀，调节溶液pH值至7.0后用D201阴离子交换树酯(晶祥化工)除去混合物中的含磷酸杂质(AMP、ADP、ATP)，通过采用碳酸氢氨(NH4HCO3)水溶液梯度洗脱(0-1N)分离得到D-核酮糖-5-磷酸钠纯品。最后G25尺寸排阻柱脱盐、冻干得到13.4克D-核酮糖-5-磷酸钠(收率71％)(见图2-图4)。
(4)将12.5克上述制备的D-核酮糖-5-磷酸钠(50mmol)、406mg六水氯化镁(2mM)溶解在500毫升100mM pH值7.5的Tris.HCl溶液中，然后加入1000U固定化磷酸水解酶AP进入进行反应，该混合溶液在30℃缓慢搅拌2个小时后，直接过滤分离回收固定化磷酸水解酶AP(回收酶具有92％初始活性)。反应液过D201阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出(见图5-图6)，最后经G25尺寸排阻柱脱盐得到9.8克的D-核酮糖(85％收率)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 固定化酶催化法制备D-核酮糖
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GDH 正向引物
<400> 1
gggagggcag ctcatatgac cggtcggaag 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GDH 反向引物
<400> 2
cagacgacgt ttggatccgc tgttgtcgct c 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GIS 正向引物
<400> 3
cggagacaat ccatatgccc gtctttgcgg 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GIS 反向引物
<400> 4
gtcggcaatc gcctcgagca agagtgtcat c 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GK 正向引物
<400> 5
caaaaggata aacatatgac actcttgctc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GK 反向引物
<400> 6
ggtgtcccta cctcgagtgc ctaatgcatc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GDC 正向引物
<400> 7
cgaggtaggg accatatgac cgaagaagcg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GDC 反向引物
<400> 8
ggttctttgt tctcgagggg ctgaaatcag 30
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDH正向引物
<400> 9
catcactgga gaaagtcata tgaaactcg 29
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDH反向引物
<400> 10
gaatgcaggg gagcctcgag attaaaccag 30
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PPK正向引物
<400> 11
gagcgggagg aagcatatgg cactcgacg 29
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PPK反向引物
<400> 12
ctgatcgtca gctcgaggga atcacctgag 30
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP正向引物
<400> 13
catggagaaa atcatatgaa acaaagcac 29
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP反向引物
<400> 14
aattcactgc cgggctcgag tttatttcag c 31

Claims (10)

1.一种制备D-核酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PCR扩增D-葡萄糖酸脱氢酶(GDH)、酮酸异构酶(GIS)、酮酸激酶(GK)、酮酸脱羧酶(GDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP再生酶(PPK)和磷酸水解酶(AP)的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；
(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到GDH、GIS、GK、GDC、LDH、PPK、AP液体酶；
(3)将GDH、GIS、GK、GDC的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌2-6小时，将酶固定在环氧树脂上；LDH、PPK、AP的纯化酶依同样的步骤单独固定；
(4)在缓冲液中加入D-葡萄糖酸钠、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节体系pH值到6.5-9.0，固定化混合酶、固定化LDH、固定化PPK一次性加入反应体系中，25-40℃反应直至反应完全，过滤回收固定化酶，所得D-核酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
(5)将D-核酮糖-5-磷酸钠和六水氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，25-40℃反应1.5-3.0个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-核酮糖纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的混合酶中，按活性单位计，GDH、GIS、GK、GDC的比值为(2.0-4.0):(0.5-1.5):(3.0-8.0):(0.5-2.0)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的缓冲液是pH值8.0的磷酸钾溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，按活性单位比，所述固定化混合酶、固定化LDH、固定化PPK三者的比值为(3.0-5.0):(0.8-2.0):(2.0-3.0)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)和(5)所述的缓冲液是pH值7.5-8.0的Tris.HCl溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的D-核酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：
往过滤液中加入1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分，离心收集白色沉淀并将之溶解在酸性溶液中，随后加入1.2当量无水硫酸钠除去Ba2+离子，过滤、离心除去硫酸钡沉淀，调节溶液pH值至7.0后用D201阴离子交换树酯除去混合物中的含磷酸杂质，采用碳酸氢氨水溶液梯度洗脱，分离得到D-核酮糖-5-磷酸钠纯品；最后G25尺寸排阻柱脱盐、冻干得到D-核酮糖-5-磷酸钠。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的PCR扩增，是以大肠杆菌菌株gDNA、放射形土壤杆菌染色体为模板。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的扩大培养，培养基中含有0.5mMIPTG，37℃诱导表达6小时。
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