CN112210551A - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备方法 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备方法 Download PDF

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路福平
毛淑红
宋展
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Abstract

本发明提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶的制备方法，包括如下步骤：将环氧树脂置于磷酸钾缓冲液中，25℃恒温振荡处理后用超纯水清洗；将D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶加入磷酸钠缓冲液，再加入经步骤1处理后的环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h；反应产物用PBS清洗后得到D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶。本发明通过环氧树脂E103与D‑阿洛酮糖‑3差向异构酶分子结合进行固定化酶制备，不需要使用戊二醛交联，也不使用任何有毒有害的试剂，制备过程及产品安全无毒害。其次，本发明制备的固定化酶稳定性高，可重复多次使用，在55℃条件下连续反应11批次内固定化酶的酶活性没有明显衰减，应用前景广阔。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备方法
技术领域：
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的制备方法。
背景技术：
D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，可用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有较大的潜在应用价值，例如，D-阿洛酮糖可抑制肠道α-葡糖苷酶活性，防止血糖升高，作为Ⅱ型糖尿病的辅助治疗剂；D-阿洛酮糖可减小脂肪合酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积，降低血脂，还可预防肥胖；同时，D-阿洛酮糖还对神经具有保护作用。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质，2019年FDA又宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此不需要在这两项类目中计算其添加量，无疑将帮助其在未来进一步拓展市场。
利用生物合成法生产D-阿洛酮糖，是利用微生物所产的特异性酶，专一性地催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，可以D-果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。随着D-阿洛酮糖市场需求量的日益增加，高效生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。然而，D-阿洛酮糖-3-异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖的反应过程中，由于酶无法重复利用从而使得工艺成本较高，且水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和自动化生产。因此，开发D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化技术，增加酶稳定性的同时使酶可以反复多次使用，在降低成本的基础上可进行D-阿洛酮糖的连续生产，对阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。
发明内容：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的制备方法，所述方法实现了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化，使D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可多次重复利用，降低酶催化反应成本。
为此，本发明技术方案具体如下：
1、将环氧树脂置于磷酸钾缓冲液中，25℃恒温振荡处理后用超纯水清洗；
2、将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶加入磷酸钠缓冲液中，之后再加入适量经步骤1处理后的环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h；
3、反应产物用PBS清洗数次，得到以环氧树脂为载体的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶。
进一步地，步骤2中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是以纯酶液的形式加入到反应体系中，纯酶液中酶的浓度为5～8mg/ml；经步骤1处理后的环氧树脂与酶在反应体系中的加量比例为：每20～35mg酶对应加入1g环氧树脂。
进一步地，步骤1中所述磷酸钾缓冲液由0.1mol/L的K2HPO4和0.1mol/L的KH2PO4按体积比15～16:1混合配制而成；步骤1中的25℃恒温振荡处理是以150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次；步骤2中所述磷酸钠缓冲液的浓度为2mol/L，pH为6.4。
进一步地，步骤2中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶通过如下方法制备获得：构建表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株；将工程菌株于适宜条件下培养至对数期后进行诱导表达；离心收集表达后的菌体，将菌体进行细胞破碎处理，之后通过亲和层析制备得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。
进一步地，表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株通过如下方法获得：以D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的核苷酸序列为模板设计引物并进行PCR扩增反应，之后对获得的目的基因产物进行纯化回收；采用不同的限制性内切酶分别对纯化回收的目的基因产物和质粒载体进行双酶切，之后将目的基因产物和质粒载体进行连接，得到连接产物；将连接产物转化宿主菌，转化后的宿主菌通过抗生素平板进行筛选，对筛选获得的阳性克隆进行测序验证，验证无误的阳性克隆即为表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株。
进一步地，上述方法中，所述双酶切选择的限制性内切酶为Nde I和Hind III，所述质粒载体优选pET28a载体；用于转化的所述宿主菌优选大肠杆菌，所述抗生素平板为卡那霉素LB固体培养基。
进一步地，用于诱导表达的工程菌株的适宜培养条件为：在LB培养基中，于37℃、220rpm振荡下发酵培养；对所述工程菌株进行诱导表达的处理方式为：向培养基中加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于16℃、120rpm振荡下诱导16～18h。
进一步地，诱导表达后的菌体的细胞破碎处理方式为：用裂解缓冲液(LysisBuffer)悬浮菌细胞，之后向菌细胞悬液中加入200～400μL溶菌酶、0.2～0.4μL0.1％的TritonX-100以及120～240μL PMSF，混匀后冰浴20min，冰浴后的菌细胞悬液进行超声破碎处理：超声2.5s，间隔3.0s，整个破碎时间20min；所述亲和层析制备纯酶液的方法为：将超声破碎后的菌细胞悬液于4℃、12000r/min离心30min，将离心后的上清液加载到平衡后的镍树脂亲和层析柱上，样品结合完毕后用裂解缓冲液过柱洗去杂质，之后用洗脱缓冲液(Elution Buffer)溶出目的蛋白，再将目的蛋白置换到PBS中即得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。
进一步地，所述裂解缓冲液的pH为7.4，其组分含量为：20mM Tirs-HCl、20mM咪唑以及500mM氯化钠；所述洗脱缓冲液的pH为7.4，其组分含量为：20mM Tirs-HCl、500mM咪唑以及500mM氯化钠。用于固定化酶产物清洗及纯酶液蛋白置换的所述PBS的pH为7.4，制备方法为：将8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.2g KCl、0.24g KH2PO4加入800mL ddH2O中，待溶质充分溶解后调pH值至7.4，然后将溶液定容至1L，通过抽滤使溶液过0.22μm水系过滤膜。
本发明在上述技术方案的基础上提供一种利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备D-阿洛酮糖的方法：
1)以果糖为底物，配制浓度为500g/L的果糖溶液；
2)向果糖溶液中加入D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶，之后于50～60℃下反应1.5～2.5h；所述固定化酶的投加量为：每50mL果糖溶液中加入1g固定化酶；
3)每次催化反应完成后用PBS洗涤固定化酶，之后于PBS中4℃保存备用。
本发明有益效果：
本发明通过环氧树脂E103与D-阿洛酮糖-3差向异构酶分子结合进行固定化酶的制备，不需要使用戊二醛交联，也不使用任何有毒有害的试剂，制备过程及产品安全无毒害。其次，本发明制备的固定化酶稳定性高，可重复多次使用，在55℃条件下连续反应11批次内固定化酶的酶活性没有明显衰减，应用前景广阔。
附图说明：
图1经亲和层析纯化获得的D-阿洛酮糖-3差向异构酶的SDS-PAGE鉴定图，图中泳道1的蛋白条带为D-阿洛酮糖-3差向异构酶。
图2D-阿洛酮糖和D-果糖的HPLC鉴定图。
图3D-阿洛酮糖-3差向异构酶固定化酶随反应批次的转化率变化趋势图。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的制备：
1、将环氧树脂E103(购自天津南开和成科技有限公司)置于磷酸钾缓冲液中，于25℃、150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次，之后用超纯水清洗树脂1～2次。所述磷酸钾缓冲液由0.1mol/L的K2HPO4和0.1mol/L的KH2PO4按体积比15～16:1混合配制而成。
2、将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液逐滴加入2mol/L，pH6.4的磷酸钠缓冲液中，滴加过程中可对反应容器辅以振荡，之后再加入适量经步骤1处理后的环氧树脂，于25℃、150rpm振荡反应12h；本步骤中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液的浓度为5～8mg/ml，经步骤1处理后的环氧树脂与纯酶液的加量比例按质量比为：每20～35mg酶对应加入1g环氧树脂。
所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液通过如下方法获得：
1)构建表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株，具体操作如下：
a.以已报道的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO:1所示)为模板设计引物并进行PCR扩增反应，两个引物：AgDAE-NdeI上游和AgDAE-HindIII下游的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。PCR反应体系为50μL体系，组分如表1所示。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002725934110000061
PCR反应条件及过程具体如下：
Figure BDA0002725934110000062
PCR反应结束后，取2μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，观察结果并纯化回收约870bp处的PCR产物(即目的基因产物)。DNA的纯化回收采用OMEGA公司的小量DNA纯化回收试剂盒(货号：D2000-02)，按照试剂盒操作说明进行纯化回收。
b.采用Nde I和Hind III两种限制性内切酶分别对纯化回收的目的基因产物和pET28a载体进行双酶切，将酶切后的目的基因产物和载体进行连接。
其中，双酶切的反应体系具体如下：
目的基因产物的酶切反应体系(50μL)，在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：
Figure BDA0002725934110000071
载体的酶切反应体系(50μL)，在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：
Figure BDA0002725934110000072
37℃反应2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。酶切产物的纯化回收采用OMEGA公司的胶回收纯化试剂盒(货号：D2500-02)，参照试剂盒说明书进行酶切产物的纯化回收。
连接前通过琼脂糖电泳确定酶切后的目的基因产物与载体的相对浓度，调整两者的倍数使载体与目的基因产物在连接反应体系中的摩尔比为1:1～3:1。
采用DNA连接试剂盒进行目的基因产物和载体的连接，连接反应体系如下：
目的基因 3μL
载体 1μL
Solution I 4μL
16℃反应6h或过夜，得到连接产物。
c.将连接产物转化大肠杆菌BL21，转化后的宿主菌通过抗生素平板进行筛选，对筛选获得的阳性克隆进行测序验证，验证无误的阳性克隆即为表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株。具体操作如下：
将连接产物加入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，混匀后冰浴30min，42℃热击90s，立即冰浴5min，再加入LB复苏液，于37℃、220r/min振荡复苏培养40～60min，之后4000r/min离心5min；离心得到的菌体用LB培养基悬浮，混合涂布于含有卡那霉素的LB平板上，待菌液充分吸收后，37℃倒置培养12～16h，直至出现单菌落；挑取单菌落进行测序验证，验证无误的阳性转化子即为表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株。
2)将工程菌株于适宜条件下培养至对数期后进行诱导表达，具体操作如下：
按1％的接种量将工程菌株接种于LB培养基中，于37℃、220rpm振荡发酵培养2.5～3h，当OD值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃、120rpm诱导表达16～18h。
3)离心收集表达后的菌体，将菌体进行细胞破碎处理，之后通过亲和层析制备得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。具体操作如下：
a.于4℃，8000rpm离心收集表达后的菌体，用Lysis Buffer(20mM Tirs-HCl、20mM咪唑、500mM NaCl，pH7.4)悬浮菌体细胞，混匀后加入200μL溶菌酶、0.3μL 0.1％的TritonX-100以及240μL苯甲基磺酰氟(PMSF)，混匀后倒入烧杯中冰浴20min。
b.冰浴后的细胞悬液用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，处理时间为20min(超声2.5s，间隔3.0s)。
c.将细胞破碎液于4℃、12000r/min离心30min，将上清液加载到经Lysis Buffer平衡后的镍树脂亲和层析柱(Ni-NTA superflow)结合1h，使混合的样品流经纯化柱，用Wash Buffer(20mM Tirs-HCl、20mM咪唑、500mM NaCl，pH7.4)洗去杂质蛋白,再用ElutionBuffer(20mM Tirs-HCl、500mM咪唑、500mM NaCl，pH7.4)溶出目的蛋白，然后用pH7.4的PBS将Elution Buffer透析去除，得到置换后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。
纯酶液的酶浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒测定(北京索莱宝，货号：PC0020)。
3、反应产物用pH7.4的PBS清洗3次，洗去没有固定到环氧树脂上的游离的酶，得到以环氧树脂为载体的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶。
实施例2
利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备D-阿洛酮糖：
1)以果糖为底物，配制浓度为500g/L的果糖溶液。
2)以D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶为催化剂，按每50mL果糖溶液中加入1g催化剂的比例向果糖溶液中添加固定化酶，之后于50～60℃下反应1.5～2.5h。
3)催化反应完成后用pH为7.4的PBS洗涤固定化酶，之后于pH为7.4的PBS中4℃保存，以备下一批次的反应使用。
后续批次的反应均可通过重复上述步骤完成。本实施例总共进行了15个批次的催化反应。结果如图3所示，前11个批次的转化率始终保持在20％以上，酶活性稳定，无明显衰减。
实施例1和实施例2中所用到的PBS的配制方法：将8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.2gKCl、0.24g KH2PO4加入800mL ddH2O中，待溶质充分溶解后调pH值至7.4，然后将溶液定容至1L，通过抽滤使溶液过0.22μm水系过滤膜，滤液即为pH7.4的PBS。
实施例3
D-阿洛酮糖产物的HPLC鉴定：将实施例2催化反应完成后的反应液稀释至合适浓度后加入到液相小瓶中进行定量分析，测定条件如下：
色谱仪：Agilent1260；
检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)
进样：Agilent自动进样器；进样量20μL；
色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,AgelaTechnologies,China)；柱温40℃；
流动相：75％乙腈；流速1mL/min。
结果如图2所示，底物D-果糖和产物D-阿洛酮糖在柱子中得到很好的保留和分离。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备方法
<130> 0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> 球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)
<400> 1
atgaaaattg gttgccatgg cctggtttgg accggccact tcgacgctga aggcattcgc 60
tactccgtcc agaaaaccag ggaagccggt ttcgacctcg ttgagttccc gctcatggat 120
ccgttctcct tcgatgtgca gacggccaag tccgcactgg ccgaacatgg gctggcggcc 180
tcggcatctc tgggactctc ggacgccact gacgtaagca gcgaagatcc cgccgtcgtg 240
aaggcagggg aggagctgct caaccgcgcc gtggatgttc tggccgaact gggtgcgacg 300
gatttctgcg gcgtgattta tagcgccatg aagaagtaca tggagccggc aactgctgcc 360
gggctggcca acagcaaggc agccgtcggg cgggtcgcgg accgggcatc ggatctgggg 420
atcaatgttt cgctagaggt cgtcaacagg tacgaaacca acgtactgaa caccggacgt 480
caggcccttg cctacttgga ggagctcaac cggccgaacc tgggcatcca cctggacact 540
taccacatga acattgagga atcggacatg ttctccccga tcctggacac cgcggaggcc 600
ctgcggtacg tccatatcgg cgaaagccac cgcggctacc tcggcacggg aagcgttgac 660
ttcgacactt tcttcaaggc cctcggccgc atcggctatg acggacccgt tgtcttcgaa 720
tcgttctcct cctccgtcgt ggcaccggat ctgagccgga tgctcggcat ctggcgcaac 780
ctgtgggccg acaacgagga actgggtgcg cacgcgaatg ccttcatccg cgacaagctc 840
accgcgatca agaccatcga actgcactaa 870
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattccat atgaaaattg gttgccatg 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaagcttg tgcagttcga tggtcttg 28

Claims (10)

1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将环氧树脂置于磷酸钾缓冲液中，25℃恒温振荡处理后用超纯水清洗；
2)将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶加入磷酸钠缓冲液中，之后再加入适量经步骤1处理后的环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h；
3)反应产物用PBS清洗数次，得到以环氧树脂为载体的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶。
2.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是以纯酶液的形式加入到反应体系中，纯酶液中酶的浓度为5～8mg/ml；经步骤1处理后的环氧树脂与酶在反应体系中的加量比例为：每20～35mg酶对应加入1g环氧树脂。
3.根据权利要求1或2所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤1中所述磷酸钾缓冲液由0.1mol/L的K2HPO4和0.1mol/L的KH2PO4按体积比15～16:1混合配制而成；步骤1中的25℃恒温振荡处理是以150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次；步骤2中所述磷酸钠缓冲液的浓度为2mol/L，pH为6.4。
4.根据权利要求3所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶通过如下方法制备获得：构建表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株；将工程菌株于适宜条件下培养至对数期后进行诱导表达；离心收集表达后的菌体，将菌体进行细胞破碎处理，之后通过亲和层析制备得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。
5.根据权利要求4所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株通过如下方法获得：以D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的核苷酸序列为模板设计引物并进行PCR扩增反应，之后对获得的目的基因产物进行纯化回收；采用不同的限制性内切酶分别对纯化回收的目的基因产物和质粒载体进行双酶切，之后将目的基因产物和质粒载体进行连接，得到连接产物；将连接产物转化宿主菌，转化后的宿主菌通过抗生素平板进行筛选，对筛选获得的阳性克隆进行测序验证，验证无误的阳性克隆即为表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌株。
6.根据权利要求5所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：所述双酶切选择的限制性内切酶为Nde I和Hind III，所述质粒载体优选pET28a载体；用于转化的所述宿主菌优选大肠杆菌；所述抗生素平板为卡那霉素LB固体培养基。
7.根据权利要求6所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：用于诱导表达的工程菌株的适宜培养条件为：在LB培养基中，于37℃、220rpm振荡下发酵培养；对所述工程菌株进行诱导表达的处理方式为：向培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16℃、120rpm振荡下诱导16～18h。
8.根据权利要求4～7中任意一项所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：诱导表达后的菌体的细胞破碎处理方式为：用裂解缓冲液悬浮菌细胞，之后向菌细胞悬液中加入200～400μL溶菌酶、0.2～0.4μL 0.1％的TritonX-100以及120～240μL PMSF，混匀后冰浴20min，冰浴后的菌细胞悬液进行超声破碎处理：超声2.5s，间隔3.0s，整个破碎时间20min；所述亲和层析制备纯酶液的方法为：将超声破碎后的菌细胞悬液于4℃、12000r/min离心30min，将离心后的上清液加载到平衡后的镍树脂亲和层析柱上，样品结合完毕后用裂解缓冲液过柱洗去杂质，之后用洗脱缓冲液溶出目的蛋白，再将目的蛋白置换到PBS中即得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的纯酶液。
9.根据权利要求8所述的固定化酶的制备方法，其特征在于：
所述裂解缓冲液的pH为7.4，其组分含量为：20mM Tirs-HCl、20mM咪唑以及500mM氯化钠；
所述洗脱缓冲液的pH为7.4，其组分含量为：20mM Tirs-HCl、500mM咪唑以及500mM氯化钠；
所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.2g KCl、0.24g KH2PO4加入800mLddH2O中，待溶质充分溶解后调pH值至7.4，然后将溶液定容至1L，通过抽滤使溶液过0.22μm水系过滤膜。
10.一种利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)配制浓度为500g/L的果糖溶液；
2)向果糖溶液中加入D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶，之后于50～60℃下反应1.5～2.5h；所述固定化酶的投加量为：每50mL果糖溶液中加入1g固定化酶；
3)每次催化反应完成后用PBS洗涤固定化酶，之后于PBS中4℃保存备用。
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