JPH05137588A - ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アデノシン−5'−３リン酸からアデノシン−
5'−３リン酸スルフリラーゼ及びアデノシン−5'−ホス
ホ硫酸キナーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応に
より3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホ硫酸を製造する
に際し、触媒として用いる二つの酵素が耐熱性酵素であ
る方法、及びアデノシン−5'−３リン酸からアデノシン
−5'−３リン酸スルフリラーゼ及びアデノシン−5'−ホ
スホ硫酸キナーゼの二種の酵素を触媒に用いて、3'−ホ
スホアデノシン−5'−ホスホ硫酸を製造する際に、アデ
ノシン−5'−２リン酸をアデノシン−5'−３リン酸に変
換する酵素を共存させる方法。 【効果】従来、きわめて困難であった3'−ホスホアデノ
シン−5'−ホスホ硫酸ＰＡＰＳの合成の工業的製造が可
能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素法による3'−ホス
ホアデノシン−5'−ホスホ硫酸（以下、ＰＡＰＳと略称
する。）の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＰＡＰＳは化１に示す構造をしており、
生体内では、芳香族化合物の解毒や神経伝達物質である
モノアミンの代謝、さらにはコレシストキニンやガスト
リンなどのホルモンの活性発現に必要な硫酸基供与体で
あるといわれている。

【０００３】

【化１】

【０００４】したがって、その生体内での役割は非常に
重要であり医薬品などの分野に高い利用価値がある。し
かしその製造方法は工業的に実施できるものがなく実用
化されていない。

【０００５】ＰＡＰＳの化学的な合成法はたとえば１９
６４年にロバートらが報告している〔アール チェルナ
ク（R.Cherniak）他、ジェービーシー（Ｊ．Ｂ．
Ｃ．），ｖｏｌ．２３９、ｐ．２９８６（１９６
４）〕。発酵法としてはたとえばストレプトミセス属の
細菌を用いる方法が報告されている（特公昭４１−１７
６３２号公報参照）。また酵素法としてたとえばパン酵
母〔エス ピー クローイック（S.P.Colowick）、エヌ
オウ カプラン（N.O.Kaplan）、ピー・ダブリュウ・
ロビンズ（P.W.Robbins ）編、メソッズインエンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology ）第５巻、９６４頁、
アカデミックプレスインク（Academic Press Inc.）ニ
ューヨークアンドロンドン（NewYork and London）、１
９６２〕やラット肝臓〔エス エス シンガー、アナリ
チカルバイオケミストイリー（Anal.Biochem.）ｖｏ
ｌ．９６、ｐ．３４（１９７９）〕から抽出したアデノ
シン−5'―３リン酸スルフリラーゼ（以下、ＡＴＰスル
フリラーゼと略称する。）とアデノシン−5'−ホスホ硫
酸キナーゼ（以下、ＡＰＳキナーゼと略称する。）の二
つの酵素を用いた二段階反応により、ＡＴＰから製造す
る方法が知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらこれらの
方法は総て数ミリグラムから数十ミリグラムのＰＡＰＳ
しか製造することができず、工業的には実用性に欠けて
いた。すなわち化学的な方法では取り扱いが難しい試薬
と複雑な反応のためスケールアップできないことが問題
であり、発酵法では蓄積するＰＡＰＳの量が微量であり
これを菌体あるいは培地から単離することはたいへん困
難であることが問題であった。また酵素法によるＰＡＰ
Ｓの合成では、下記（式４）に示すように２分子のアデ
ノシン−5'−３リン酸（以下、ＡＴＰと略称する。）か
ら１分子のＰＡＰＳが生成し、そのときに１分子のアデ
ノシン−5'−２リン酸（以下、ＡＤＰと略称する。）が
副生する。したがって酵素法ではＡＴＰに対するＰＡＰ
Ｓの収率はたかだか５０％にとどまるという欠点を有し
ていた。

【０００７】

【０００８】以上のようにＰＡＰＳの製造の実用化はき
わめて困難であった。本発明は、ＡＴＰからＡＴＰスル
フリラーゼ及びＡＰＳキナーゼの二種の酵素を触媒とす
る二段階反応によりＰＡＰＳを製造する方法において、
ＰＡＰＳを多量に製造でき、しかも容易に単離すること
ができる方法を提供することを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな課題達成の為鋭意研究の結果、本物質を酵素法で合
成する際に、触媒として用いるＡＴＰスルフリラーゼ及
びＡＰＳキナーゼの二種の酵素として耐熱性の酵素を用
いると驚くべきことに飛躍的にＰＡＰＳの生成量が増加
し、単離精製も簡単にできること、さらに高濃度の基質
ＡＴＰを用いることが可能になり工業的生産に有利であ
ることを見出し本発明の第一発明を完成し、又、本物質
を酵素法で合成する際に、ＡＴＰスルフリラーゼ及びＡ
ＰＳキナーゼの二種の酵素と伴に、ＡＤＰをＡＴＰに変
換する酵素を共存させることによりＡＴＰに対するＰＡ
ＰＳの収率が飛躍的に増大することを見いだし、本発明
の第二発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち本第一発明は、ＡＴＰからＡＴＰ
スルフリラーゼ及びＡＰＳキナーゼを触媒とする二段階
反応によりＰＡＰＳを製造するに際し、触媒として用い
る二つの酵素が耐熱性酵素であることを特徴とするＰＡ
ＰＳの製造方法を要旨とするものであり、本第二発明
は、ＡＴＰからＡＴＰスルフリラーゼ及びＡＰＳキナー
ゼを触媒とする二段階反応によりＰＡＰＳを製造するに
際し、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素を共存させること
を特徴とするＰＡＰＳ製造方法を要旨とするものであ
る。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本第一及
び第二発明のＰＡＰＳの製造方法に関与する酵素反応
は、上記したように、ＡＴＰと硫酸塩からＡＴＰスルフ
リラーゼの触媒作用によりＡＴＰの5'−リン酸を硫酸化
し（式１）、生じるアデノシン−5'−ホスホ硫酸（以
下、ＡＰＳと略称する。）の3'−水酸基を、ＡＴＰをリ
ン酸基供与体としてＡＰＳキナーゼの触媒作用によりリ
ン酸化する（式２）際に、式２で生じたＡＤＰを、アセ
チルリン酸（以下、ＡｃＯＰと略称する。）をリン酸供
与体として、ＡＴＰに変換する酵素を共存させるという
方法である。

【００１２】また通常、（式３）に示すように、反応の
平衡をいっそうＰＡＰＳ生成の方向に傾けるためにピロ
リン酸をリン酸に加水分解する酵素、すなわちピロフォ
スファターゼ（以下、ＰＰａｓｅと略称する。）を共存
させることが好ましい。

【００１３】本第一発明においては、ＡＴＰスルフリラ
ーゼとＡＰＳキナーゼは、耐熱性を有している必要があ
る。そのような酵素の由来等は特に限定されるものでは
ないが、そのようなものとしては、好熱性の細菌から得
られるものが挙げられ、特に４０℃以上に酵素活性の至
適温度を示す酵素であることが好ましい。

【００１４】このような好熱性細菌としてはバチルス・
ステアロサーモフイルス、バチルス・プレビス、バチル
ス・コアギユランス、バチルス・サーモプロテオリテイ
クス、バチルス・アシドカルダリウスなどのバチルス
属、クロストリジウム属、サーモアクチノマイセス属、
アクロモバクター属、ストレプトマイセス属、ミクロポ
リスポラ属、サーマス・アクアテイクス、サーマス・サ
ーモフイルス、サーマス・フラプスなどのサーマス属、
サーモミクロビウム属、カルデリア属好熱性細菌などが
あげられる。具体的な菌株名としては、例えばバチルス
・ステアロサーモフイルス（ＮＣＡ１５０３株）やバチ
ルス・コアギュランス（ＡＴＣＣ７０５０株）などが挙
げられる。また、これら微生物の遺伝子を導入した常温
生育細菌も含まれる。

【００１５】本第二発明において用いられるＡＴＰスル
フリラーゼとＡＰＳキナーゼは、これらを組み合わせて
ＰＡＰＳを合成する能力を有するものであればいかなる
ものでもよい。例えば、エシエリキア・コリ由来の酵
素、酵母由来の酵素、バチルス属やサーマス属などの好
熱性細菌由来の酵素などを具体例としてあげることがで
き、特に好熱性細菌由来の耐熱性酵素が好ましく、この
ような好熱性細菌としては前記したようなものが挙げら
れる。

【００１６】また本第二発明に用いられるＡＤＰをＡＴ
Ｐに変換する酵素としては、酢酸キナーゼ、カルバミン
酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、３―ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナー
ゼなど多くのものが使用できるが、酵素の入手の容易さ
などを勘案すると、酢酸キナーゼを使用するのが最も有
利である。またＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素の由来と
しては、エシエリキア・コリ由来の酵素、酵母由来の酵
素、バチルス属やサーマス属などの好熱性細菌由来の酵
素などを具体例としてあげることができ、特に好熱性細
菌由来の耐熱性酵素が好ましく、このような好熱性細菌
としては前記したようなものが挙げられる。

【００１７】エシエリキア・コリ、酵母、バチルス属や
サーマス属等の好熱性細菌等の培養は周知の方法で行う
ことができる。本発明における細菌を培養するに際して
用いられる栄養培地において、炭素源として、例えば、
グルコース、シュークロース、フルクトース、殿粉加水
分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸等
の有機酸類、さらには使用する細菌が資化しうるアルコ
ール類、油脂、脂肪酸およびグリセリン等が使用でき、
窒素源として、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物
が使用できる。さらに無機塩類として、例えば、カリウ
ム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マ
ンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーンスティープリカー、ビタミン
類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄養培地が
使用できる。これらの培地を用いて、細菌を２０〜８０
℃、好ましくは４０〜７０℃、最適には６０℃で、２〜
６時間、好気的に培養すればよい。

【００１８】これらの菌体から上記の三種の酵素を得る
ためには、例えば、先ず培養物から菌体を集菌したの
ち、ホモジナイザー、ブレンダー、マントンゴーリン、
ダイノミル、フレンチプレス、超音波処理、凍結融解、
リゾチーム処理等により細胞を破砕して得ることが出来
る。次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチオン系高
分子凝集剤を添加して、細胞破砕片及び核酸を沈澱させ
る。本発明に用いられるカチオン系高分子凝集剤として
は、例えば、ポリアミノアルキルメタアクリレート類、
ポリアミノアルキルメタアクリレートとアクリルアミド
の共重合物類、ポリアクリルアミドのマンニツヒ変性物
類、ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類、ポリビニ
ルイミダゾリン類、ポリアクリルアミド類、アミン系重
縮合物類などがあげられる。その際の高分子凝集剤の添
加量としては、凝集剤の種類によって異なるが、破砕し
た微生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜４０重量部
が好ましい。このカチオン系高分子凝集剤を予め水に溶
解した後、細胞破砕液に添加して１０分から２４時間撹
拌する。また、ｐＨの調整が必要な場合には、適宜１０
〜２００ｍＭになるように緩衝液を加えることもできる
し、蛋白質の安定化のために、グルコースを細胞破砕液
１００重量部に対し、１〜５０重量部添加してもよい。
次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分離する。その
ためには、例えば、静置するか、遠心分離するか、ある
いは濾過するかして行えばよい。これらの操作により、
粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に精製され
た酵素標品を得るには、ゲル濾過クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィ等の各種クロマ
トグラフィーを用いることができる。

【００１９】本第一発明のＰＡＰＳの製造方法は、たと
えば同一の反応器の中に緩衝液、ＡＴＰ、硫酸イオン
（ＳＯ₄ ^2- ）、マグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）、耐熱性
ＡＴＰスルフリラーゼ及び耐熱性ＡＰＳキナーゼを共存
させて反応させればよく、必要に応じてＰＰａｓｅを共
存させることができる。さらに、本第一発明のＰＡＰＳ
の製造方法において、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素及
びリン酸供与体を共存させて反応させることがより好ま
しい。

【００２０】本第二発明のＰＡＰＳの製造方法は、たと
えば同一の反応器の中に緩衝液、ＡＴＰ、硫酸イオン
（ＳＯ₄ ^2- ）、マグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）、ＡＴＰ
スルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼ、ＡＤＰをＡＴＰに変
換する酵素及びリン酸供与体を共存させて反応させれば
よく、必要に応じてＰＰａｓｅを共存させることができ
る。

【００２１】このときに用いられる反応器としては、反
応をスムーズに進行させ得るものであればいかなるもの
でもよく、各々の酵素量、基質液の濃度、ｐＨ及び供給
速度、反応温度などによって反応器の大きさ及び形状を
選定すればよい。その反応器の形状としては、例えば、
膜型の反応器、カラム型反応器を使用することができ
る。この中でも膜型反応器は、反応生成物が低分子であ
るので、特に有効に使用できる。この際、酵素は高分子
物質であるので、各酵素はそのまま反応器の中にとどま
った状態で使用することができる。

【００２２】また、カラム型反応器の場合には、使用す
る酵素を適当な担体、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロースなどのような多糖類の誘導体、ポリスチ
レン、エチレン―マレイン酸共重合体、架橋ポリアクリ
ルアミドなどのようなビニルポリマーの誘導体、Ｌ―ア
ラニン、Ｌ―グルタミン酸共重合体、ポリアスパラギン
酸などのようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体、ガラ
ス、アルミナ、ヒドロキシアパタイトなどのような無機
物の誘導体などに結合、包括あるいは吸着させて、いわ
ゆる固定化酵素としてカラムに充填して使用すればよ
い。

【００２３】上述の反応器は、連続的に操作することを
前提として説明したものであるが、このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし、場合によっ
ては、バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。

【００２４】次にバッチ式の反応器でＰＡＰＳを製造す
る場合を例にとり、反応条件について説明する。反応の
ｐＨとしては、酵素によって異なるが、おおむね中性付
近、すなわち、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜９の
範囲が使用され、緩衝液で調整することができる。この
緩衝液としては、これらのｐＨに適した通常のものを使
用することができる。また、反応の温度としては、酵素
の失活が起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であ
れば特に限定されるものではないが、２０℃から７０
℃、特に２５℃から４５℃の範囲が好ましい。ＡＴＰの
濃度は特に限定されるものではないが２００ｍＭ以下、
特に１００ｍＭ以下が適当である。加える硫酸イオンと
マグネシウムイオンはどのような形のものでもよいが、
その濃度は硫酸イオンはＡＴＰ濃度の２倍程度が、マグ
ネシウムイオンは１ｍＭ（当量）から１００ｍＭ（当
量）が、好ましい。ＡＴＰスルフリラーゼは５ｍｕ／ｍ
ｌから２００ｍｕ／ｍｌが適当である。ＡＰＳキナーゼ
はユニット数にしてＡＴＰスルフリラーゼの２倍量が好
ましい。ＰＰａｓｅは５ｕ／ｍｌから１００ｕ／ｍｌが
適当である。ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素は１ｕ／ｍ
ｌから１００ｕ／ｍｌが好ましい。

【００２５】リン酸供与体としてはＡｃＯＰが使用され
る。ＡｃＯＰは、アンモニウム塩、カリウム・リチウム
塩、ナトリウム塩などの塩として使用することができる
が、入手のしやすさから二ナトリウム塩を用いることが
好ましい。アセチルリン酸はＡＴＰの濃度に対して１／
１０ないし１００倍当量、特に１ないし５０倍当量の濃
度で用いるのが好ましい。その添加方法は特に限定され
るものではなく、反応スタート時に一括して添加しても
よいし、分割して添加してもよい。

【００２６】以下に、本発明において用いられる測定法
及び使用酵素の活性測定法を解説する。 （１）ＡＴＰスルフリラーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち適量の酵素試料
液を加えて反応を開始する。１０分後に３Ｎの硫酸を
０．０５ｍｌ加え反応を停止する。反応終了後のリン酸
濃度を、和光純薬工業株式会社製無機リン酸測定試薬ホ
スファＣ―テストワコーにより定量する。１分間に２μ
ｍｏｌのリン酸、すなわち１μｍｏｌのピロリン酸が生
成するＡＴＰスルフリラーゼの量を１ｕ（ユニット）と
する。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム １０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ピロフォスファターゼ ０．４ｕ／ｍｌ 試料（ＡＴＰスルフリラーゼ溶液） 適量

【００２７】

【００２８】（２）ＡＰＳキナーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち適量の酵素試料
液を加えて反応を開始する。１０分後に沸騰水浴中で１
分間加熱し反応を停止する。反応終了後、生成したＰＡ
ＰＳの量をＨＰＬＣで定量する。１分間に１μｍｏｌの
ＰＡＰＳが生成するＡＰＳキナーゼの量を１ｕ（ユニッ
ト）とする。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 硫酸マグネシウム １０ｍＭ ＡＴＰ １ｍＭ ＡＴＰスルフリラーゼ ０．５ｕ／ｍｌ 試料（ＡＰＳキナーゼ溶液） 適量

【００２９】

【００３０】（３）ピロホスファターゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち適量の酵素試料
液を加えて反応を開始する。１０分後、３Ｎの硫酸を
０．０５ｍｌ加えて反応を停止する。反応終了後のリン
酸濃度を、和光純薬工業株式会社製無機リン酸測定用ホ
スファＣ−テストワコーにより定量する。１分間に２μ
ｍｏｌのリン酸、すなわち１μｍｏｌのピロリン酸が生
成するピロホスファターゼの量を１ｕ（ユニット）とす
る。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ５ｍＭ 試料（ピロフォスファターゼ） 適量

【００３１】

【００３２】（４）酢酸キナーゼ（ＡＫ）の活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち３分間予備加温
する。 反応溶液組成（総量２．４ｍｌとする） イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） ７０ｍＭ 塩化マグネシウム ２５０ｍＭ 塩化カリウム ９４ｍＭ ＡＴＰ １２．５ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ） ４．２ｍＭ ＮＡＤＨ ３．３ｍＭ ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ） ２４０ｕ 乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ） ３３０ｕ この反応溶液に２Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．６ｍｌを加
える。試料（酢酸キナーゼ）を５０ｍＭのリン酸バッフ
ァーに５〜１０ｕ／ｍｌとなるように溶解し、その試料
溶液を反応溶液に０．０１ｍｌ加える。ＵＶの３４０ｎ
ｍにおける吸光度を１分おきに測定し、直線部分の傾き
を求める。

【００３３】 ｄ．ｆ．：希釈係数 ６．２２：ＮＡＤＨの分子吸光係数（ｃｍ² ／μｍｏ
ｌ） 酵素濃度：ブラッドフォード法により決定 １分間に１μｍｏｌのＡＤＰが生成する酢酸キナーゼの
量を１ユニットとする。

【００３４】

【００３５】（５）ＨＰＬＣによるＰＡＰＳの定量法 ウォ―タ―ズ社製マイクロボンダパックＣ１８カラムを
用いてＰＡＰＳの定量を行った。移動相は 過塩素酸テトラブチルアンモニウム ３ｍＭ リン酸１カリウム ３０ｍＭ メタノール ２５ｖｏｌ％ 水 ７５ｖｏｌ％ である。流速は０．６ｍｌ／分、検出はＵＶの吸収（λ
＝２５４ｎｍ）を測定することにより行った。

【００３６】

【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 参考例１ グルコース濃度１％、酵母エキス濃度１％、リン酸濃度
０．１％及び若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌した
後、ｐＨを６．５に調整し、バチルス・ステアロサーモ
フイルス（ＮＣＡ１５０３株）を接種し、培養を行っ
た。６０℃で３時間培養後、培地中のグルコースが消費
されたことを確認し、遠心分離にて菌体を得た。

【００３７】参考例２ 参考例１のようにして得られた湿菌体を凍結融解法で破
砕したのち、ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除
核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離により除去して、
粗酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライしたところ、ＡＴＰスルフリ
ラーゼが吸着されたので、同緩衝液で十分洗浄したの
ち、同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し、１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセフ
ァロースカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄し
た後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出
した。得られた活性画分を回収し、濃縮・透析後、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したマト
レックスゲルブルーＡカラムにアプライした。同緩衝液
で十分洗浄した後、１Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液で
溶出した。活性画分を回収し、濃縮後ポリアクリルアミ
ド電気泳動を行ったところ、単一なバンドが得られた。
酵素標品の比活性は１１．１Ｕ／ｍｇであった。

【００３８】参考例３ 参考例１のようにして得られた湿菌体を凍結融解法で破
砕したのち、ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除
核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去して、粗酵
素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム
に粗酵素液をアプライしたところ、ＡＰＳキナーゼが吸
着されたので、同緩衝液で十分洗浄したのち、同緩衝液
を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線濃度
勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し、７０％
飽和となるよう、硫酸アンモニウムを加えた。遠心分離
後、沈澱を同緩衝液に溶かし、透析した。これを同緩衝
液で平衡化したマトリックスブルーＡカラムにアプライ
した後、同緩衝液で十分洗浄し、１．５Ｍ塩化カリウム
を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２を送液した。得られた活
性画分に８００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加
え、８００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したフェニルセルロファ
インカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄した
後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を送液した。
活性画分を回収し、濃縮後、ポリアクリルアミド電気泳
動を行ったところ、単一なバンドが得られた。酵素標品
の比活性は１．１Ｕ／ｍｇであった。

【００３９】先ず、本第一発明について実施例を説明す
る。 実施例１ 容量１５０Ｌの反応恒温槽に、５ｍＭのトリス塩酸緩衝
液、１００ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭの硫酸マグネシウ
ム、１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含む１００Ｌの水溶
液を調製し、水酸化ナトリウムにてｐＨを８に調整後、
３０℃に保温した。これにバチルスステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus,NCA-1503）由来
の耐熱性のＡＴＰスルフリラーゼを２５０００ユニッ
ト、同じ由来の耐熱性のＡＰＳキナーゼを５００００ユ
ニット、酵母由来のピロホスファターゼ５００００ユニ
ットを加え反応を開始した。２４時間反応後、限外ろ過
膜により酵素とその他を分離し、酵素液は次の使用のた
めに４℃にて保存した。反応液をＨＰＬＣにより分析し
たところ、４．４６モルのＰＡＰＳが生成し１／２ＡＴ
Ｐに対する転化率は８９．２％であった。

【００４０】酵素液を除いた反応液を５００ＬのＤＥＡ
Ｅセファロースカラムに供与した。０ｍＭから４００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム勾配溶液で展開し反応液からＰＡＰ
Ｓを分離した。ＰＡＰＳ水溶液はさらに逆浸透膜ＮＴＲ
−７２５０（ユニチカ社製）にて濃縮脱塩しこれを凍結
乾燥した。２５２２ｇの白色粉末が得られ単離収率は９
５％であった。ＮＭＲおよびＥＳＣＡにより分析したと
ころ９９％の純度のＰＡＰＳ・４Ｎａであった。

【００４１】実施例２ ３つ首のガラス製酵素反応器（容量１５０ｍｌ）の２つ
の首に管をつけ平膜限外ろ過膜器（ミリポア社製）につ
ないだ。これに５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）を２５０ｍｌ加え、１Ｌ／ｈｒの流速で循環させ
た。反応器全体を４０℃に保った。この反応器の別の入
口から、サーマスフラバス（ATCC 33923）由来のＡＴＰ
スルフリラーゼ２５０ｕおよびＡＰＳキナーゼ５００ｕ
とバチルスステアロサーモフィラス由来のピロホスファ
ターゼ５００ｕを加え、そこへさらに管をつけ、循環液
と同じ緩衝液に溶かした５０ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの
硫酸マグネシウム、５０ｍＭの硫酸ナトリウム混合液を
５０ｍｌ／ｈｒの割合で加えた。上記の限外ろ過器膜を
通った溶液の一部を５０ｍｌ／ｈｒの割合で連続的に回
収し、２℃に保存した。この反応を６２時間おこない、
３．１ＬのＰＡＰＳ水溶液を得た。

【００４２】このときのＰＡＰＳの転化率は１／２ＡＴ
Ｐに対して７８％であった。実施例１と同様にＰＡＰＳ
を単離精製したところ、単離収率９７％となり、純度９
９％のＰＡＰＳ・４Ｎａが３４．９ｇ得られた。

【００４３】実施例３ 実施例２と同じ反応器により実施例２と同様に、しかし
バチルスステアロサーモフィラス（NCA-1503）由来のＡ
ＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼを用いて反応を行
った。但し反応温度は３０℃に保った。１０８時間の反
応により５．４ＬのＰＡＰＳ水溶液が得られた。このと
きのＰＡＰＳの転化率は１／２ＡＴＰに対して８４％で
あった。実施例１と同様にＰＡＰＳを単離精製したとこ
ろ単離収率９５％となり、純度９９％のＰＡＰＳ・４Ｎ
ａが６４．１ｇ得られた。

【００４４】実施例４ サーマスフラバス（ATCC 33923）由来のＡＴＰスルフリ
ラーゼ１００ｕを、１０％のゼラチン１０ｍｌに練りこ
んだのち細目の金網で裏ごしした。得られた粒子を５％
のグルタルアルデヒドに４℃にて１時間浸したのちよく
水洗し固定化酵素を調製した。同じ由来のＡＰＳキナー
ゼ２００ｕおよび同じ由来のピロホスファターゼ２００
ｕも同様に固定化酵素に調製した。それぞれの固定化酵
素酵素を、直径３ｃｍ、長さ６ｃｍのカラムに充填し
た。次に１００ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭの硫酸マグネ
シウム、１００ｍＭの硫酸ナトリウムをふくむ５０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００ｍｌを流速
０．５ｍｌ／分でカラムに通液した。カラムのジャケッ
トに４０℃の温水を流し保温した。カラム通過液を調べ
たところＰＡＰＳの反応率は１／２ＡＴＰに対して９２
％であった。７時間通液後に反応液から、実施例１と同
様にしてＰＡＰＳを単離精製したところ単離収率９７％
で純度９９％の５．３１ｇのＰＡＰＳ・４Ｎａが得られ
た。

【００４５】比較例１ 実施例２と同じ反応器により実施例３と同様に、しかし
酵母(Saccharomyces cerevisiae, ATCC 7752）由来のＡ
ＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼを用いて反応を行
った。６０時間の反応により３．０ＬのＰＡＰＳ水溶液
が得られた。このときのＰＡＰＳの反応率１／２ＡＴＰ
に対して４．４％であった。実施例１と同様にＰＡＰＳ
を単離精製したところ単離収率９７％で純度９９％の
１．９１ｇのＰＡＰＳ・４Ｎａが得られた。

【００４６】次に本第二発明について実施例を説明す
る。 実施例５ ２００ｍｌのフラスコに下記のような組成の反応溶液を
準備し、３０℃に保温した。反応溶液の総量は１００ｍ
ｌである。 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ２５ｍＭ 硫酸マグネシウム ４０ｍＭ ＡＴＰ ２０ｍＭ アセチルリン酸（ＡｃＯＰ） ２０ｍＭ 酢酸キナーゼ（ＡＫ） ５００ｕ ＰＰａｓｅ ２００ｕ ＡＴＰスルフリラーゼ １０ｕ ＡＰＳキナーゼ ２０ｕ

【００４７】ＡＫはユニチカ社製、ＰＰａｓｅはベーリ
ンガー・マンハイム・山之内社製のものを用いた。ＡＴ
Ｐスルフリラーゼは参考例１に示す方法で培養したバチ
ルス・ステアロサーモフイルス菌由来の酵素を参考例２
に示す方法で精製したものを用いた。ＡＰＳキナーゼは
参考例１に示す方法で培養したバチルス・ステアロサー
モフイルス菌由来の酵素を参考例３に示す方法で精製し
たものを用いた。

【００４８】反応開始後、４時間おきに１０ｍＭ相当分
のアセチルリン酸水溶液を加えた。反応を２４時間行っ
たのち、反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、１．
３４ｍｍｏｌのＰＡＰＳが生成し、ＡＴＰに対する転化
率は６８％であった。酵素を除いた反応液を１ｌのＤＥ
ＡＥセファロースカラムに供与し、０ｍＭから４００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム勾配溶液で展開し、反応液からＰＡ
ＰＳを分離した。

【００４９】ＰＡＰＳ水溶液はさらに逆浸透膜ＮＴＲ−
７２５０（ユニチカ社製）にて濃縮脱塩し、これを凍結
乾燥した。０．７６ｇの白色粉末が得られ、精製収率は
９５％であった。ＮＭＲおよびＥＳＣＡにより分析した
ところ９９％の純度のＰＡＰＳ・４Ｎａであった。

【００５０】実施例６ ３つ首のガラス製酵素反応器（容量１５０ｍｌ）の２つ
の首に管をつけ平膜限外ろ過器膜（ミリポア社製）につ
ないだ。これに５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を２５０ｍｌ加え、１Ｌ／ｈｒの流速で循環させた。反
応器全体を４０℃に保った。この反応器の別の入口か
ら、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＡＴＰス
ルフリラーゼ２０ｕ、ＡＰＳキナーゼ４０ｕ、酢酸キナ
ーゼ５００ｕ、ＰＰａｓｅ１００ｕを加えた。ＡＫはユ
ニチカ社製、ＰＰａｓｅはベーリンガー・マンハイム・
山之内社製のものを用いた。ＡＴＰスルフリラーゼは参
考例１に示す方法で培養したバチルス・ステアロサーモ
フイルス菌由来の酵素を参考例２に示す方法で精製した
ものを用いた。ＡＰＳキナーゼは参考例１に示す方法で
培養したバチルス・ステアロサーモフイルス菌由来の酵
素を参考例３に示す方法で精製したものを用いた。そこ
へさらに管をつけ、循環液と同じ緩衝液に溶かした５０
ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸マグネシウム、３０ｍＭ
のＡｃＯＰ混合液を５０ｍｌ／ｈｒの割合で加えた。上
記の限外ろ過器膜を通った溶液の一部を５０ｍｌ／ｈｒ
の割合で連続的に回収し、２℃に保存した。この反応を
４０時間おこない、２．０ＬのＰＡＰＳ水溶液を得た。

【００５１】このときのＰＡＰＳの転化率はＡＴＰに対
して６５％であった。実施例５と同様にＰＡＰＳを単離
精製したところ、単離収率９５％となり、純度９９％の
ＰＡＰＳ・４Ｎａが３６．７ｇ得られた。

【００５２】比較例２ 実施例５と同じ反応器により、実施例５と同様に、しか
し酢酸キナーゼを加えずに反応を行った。２４時間後の
ＰＡＰＳの転化率はＡＴＰに対して３３％であった。実
施例５と同様にＰＡＰＳを単離精製したところ、単離収
率９４％となり純度９９％のＰＡＰＳ・４Ｎａが０．３
６ｇ得られた。

【００５３】比較例３ 実施例６と同じ反応器により、実施例６と同様に、しか
し酢酸キナーゼを加えずに反応を行った。４０時間後に
２．０ＬのＰＡＰＳ水溶液を得た。このときのＰＡＰＳ
の転化率はＡＴＰに対して２９％であった。実施例５と
同様にＰＡＰＳを単離精製したところ、単離収率９２％
となり、純度９９％のＰＡＰＳ・４Ｎａが１５．９ｇ得
られた。

【００５４】比較例４ 実施例６と同じ反応器により実施例６と同様に、しかし
酵母（Saccharomycescerevisiae,ATCC 7752）由来のＡ
ＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼを用いて反応を行
った。６０時間の反応により３．０ＬのＰＡＰＳ水溶液
が得られた。このときのＰＡＰＳの反応率１／２ＡＴＰ
に対して４．４％であった。実施例５と同様にＰＡＰＳ
を単離精製したところ単離収率９７％で純度９９％の
１．９１ｇのＰＡＰＳ・４Ｎａが得られた。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、従来のＰＡＰＳ製造法
に比べ飛躍的にＰＡＰＳが増産でき、また容易にこれを
単離精製できるので、本発明は工業的なＰＡＰＳの製造
法としてきわめて有利である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アデノシン−5'−３リン酸からアデノシ
   ン−5'−３リン酸スルフリラーゼ及びアデノシン−5'−
   ホスホ硫酸キナーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反
   応により3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホ硫酸を製造
   するに際し、触媒として用いる二つの酵素が耐熱性酵素
   であることを特徴とする3'−ホスホアデノシン−5'−ホ
   スホ硫酸の製造方法。
2. 【請求項２】 アデノシン−5'−３リン酸からアデノシ
   ン−5'−３リン酸スルフリラーゼ及びアデノシン−5'−
   ホスホ硫酸キナーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反
   応により3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホ硫酸を製造
   するに際し、アデノシン−5'−２リン酸をアデノシン−
   5'−３リン酸に変換する酵素を共存させることを特徴と
   する3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホ硫酸の製造方
   法。
3. 【請求項３】 アデノシン−5'−３リン酸スルフリラー
   ゼ及びアデノシン−5'−ホスホ硫酸キナーゼの二種の酵
   素が耐熱性酵素である請求項２記載の3'−ホスホアデノ
   シン−5'−ホスホ硫酸の製造方法。