DE69228289T2 - Verfahren zur Herstellung von 3'-Phosphoadenosin 5'-phosphosulfat - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 3'-Phosphoadenosin 5'-phosphosulfatInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (nachfolgend der Einfachheit halber als PAPS bezeichnet).
- Es wird gesagt, daß PAPS mit einer Struktur, die durch die Formel:
- dargestellt wird, als der Sulfatdonor für alle Sulfatierungsreaktionen, von denen bekannt ist, daß sie in den Zellen höherer Tiere stattfinden, dient. Bei höheren Tieren sind Sulfatierungsreaktionen in einer Vielzahl von biochemischen/physiologischen Prozessen, welche die Entgiftung von Xenobiotika, den Metabolismus von Neurotransmittern des Catecholamin-Typs, die Biosynthese sulfatierter Proteine und sulfatierter Proteoglykane einschließen, enthalten. Es gab auch Berichte, die eine Korrelation zwischen dem Sulfatierungsniveau von Biomolekülen und der zellularen onkogenen Transformation zeigen. Namentlich spielt PAPS sehr wichtige Rollen in vivo und ist deshalb höchst brauchbar in den Bereichen von zum Beispiel Medikamenten. Keines der bekannten Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung ist jedoch in einem industriellen Maßstab anwendbar, oder wurde einer praktischen Anwendung zugeführt. Als ein Beispiel für die chemische Synthese von PAPS kann diejenige, die von Robert et al. berichtet wird, angeführt werden [es wird Bezug genommen auf R. Cherniak et al., J.B.C., 239, 2986 (1964)]. Als ein Beispiel für ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von PAPS wird über ein Verfahren unter der Verwendung eines Bakteriums, welches zu dem Genus Streptomyces gehört, berichtet [es wird Bezug genommen auf JP-B-41-17632; der Ausdruck "JP-B", wie er hier verwendet wird, bedeutet "geprüfte Japanische Patentveröffentlichung"]. Beispiele bekannter Verfahren zur enzymatischen Herstellung von PAPS schließen jene ein, bei denen PAPS hergestellt wird aus Adenosin-5'-triphosphat (nachfolgend der Einfachheit halber als ATP bezeichnet) durch eine Zweistufenreaktion unter der Verwendung von Adenosin-5'-triphosphat-Sulfurylase (nachfolgend der Einfachheit halber als ATP-Sulfurylase bezeichnet) und Adenosin-5'-phosphosulfat-Kinase (nachfolgend der Einfachheit halber als APS-Kinase bezeichnet), welche aus Bäckerhefe extrahiert werden [es wird Bezug genommen auf "Methods in Enzymology", herausgegeben von S.P. Colowick, N.O. Kaplan, P.W. Robbins, 5, 964, Academic Press Inc., New York und London, 1962, 964], oder aus Rattenleber [es wird Bezug genommen auf S.S. Singer, Anal. Biochem., 196, 34 (1979)].
- C. Statishchandrant und G.D. Markham, Journal of Biological Chemistry 264, 15012-21 (1989) berichten über die Reinigung, Charakterisierung und Identifizierung des phosphorylierten Enzym-Zwischenprodukts Adenosin-5'-phosphosulfat-Kinase aus Escherichia coli K 12. Nach Inkubation mit MgATP wird ein phosphoryliertes Enzym gebildet, welches seine Phosphorylgruppe auf Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) unter Ausbildung von PAPS, oder auf ADP unter Ausbildung von ATP übertragen kann.
- Jede dieser Methoden macht es möglich, jedoch nur einige bis einige Zehntel Milligramm von PAPS herzustellen, und ist deshalb von keiner praktischen Bedeutung vom industriellen Gesichtspunkt aus. Es muß gesagt werden, daß die chemischen Verfahren nicht einfach vergrößert werden können, weil Reagentien, welche schwierig zu handhaben sind und eine komplizierte Reaktion dabei benötigt werden. Bei den Fermentationsverfahren wird nur eine Spurenmenge von PAPS angesammelt, und es ist sehr schwierig, dieses Produkt von Zellen oder Medien zu trennen. Bei der enzymatischen Synthese von PAPS wird ein Molekül PAPS aus zwei Molekülen ATP gebildet und ein Molekül Adenosin-5'-diphosphat (nachfolgend der Einfachheit halber als ADP bezeichnet) wird gleichzeitig als ein Seitenprodukt gebildet, wie nachfolgend (chemische Gleichung 4) gezeigt wird. Deshalb sind die enzymatischen Verfahren dahingehend nachteilig, daß die Ausbeute an PAPS, bezogen auf ATP, im höchsten Fall 50% ist.
- In den obigen chemischen Gleichungen ist PPi Pyrophosphorsäure, und Pi ist Phosphorsäure. Wie oben beschrieben, ist es sehr schwierig, PAPS in industriellem Maßstab herzustellen.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von PAPS aus ATP durch eine Zweistufenreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Enzymen, d. h. ATP- Sulfurylase und APS-Kinase bereitzustellen, durch das PAPS in einer großen Menge hergestellt und leicht isoliert werden kann.
- Um den obigen Gegenstand zu erhalten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreiche Untersuchungen durchgeführt. Als Ergebnis haben sie herausgefunden, daß, wenn hitzestabile Enzyme als die beiden Enzyme verwendet werden, namentlich ATP-Sulfurylase und APS-Kinase in der enzymatischen Synthese von PAPS verwendet werden, die Ausbeute des Produkts überraschenderweise und beachtlich erhöht ist, das PAPS leicht isoliert und gereinigt werden kann, und des weiteren das Substrat ATP in einer hohen Konzentration verwendet werden kann, was vorteilhaft ist für die industrielle Produktion von PAPS. So wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat, welches umfaßt: (1) die Umsetzung von Adenosin-5'-triphosphat mit einem Sulfatdonor in der Gegenwart von hitzestabiler Adenosin-5'-triphosphat-Sulfurylase, um Adenosin-5'-phosphosulfat herzustellen, und (2) die Umsetzung besagten Adenosin-5'-phosphosulfats mit Adenosin-5'-triphosphat in der Gegenwart von hitzestabiler Adenosin-5'-phosphosulfat-Kinase, wobei besagte hitzestabile Adenosin-5'-triphosphat-Sulfurylase und hitzestabile Adenosin-5'-phosphosulfat-Kinase eine optimale Temperatur von 40ºC oder höher für die Aktivität derselben haben.
- Demgemäß liegt der Kern der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von PAPS, das dadurch gekennzeichnet ist, daß, wenn PAPS aus ATP in einer zweistufigen Reaktion unter Verwendung von ATP-Sulfurylase und APS-Kinase als Katalysatoren hergestellt wird, die beiden Enzyme, welche als Katalysatoren verwendet werden, hitzestabil sind.
- Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend in größerem Detail beschrieben.
- Wie oben beschrieben, umfaßt die enzymatische Reaktion, die sich auf das Verfahren zur Herstellung von PAPS bezieht, die Umwandlung von ATP in ein Sulfat, d. h. in Adenosin-5'-phosphosulfat (nachfolgend als APS bezeichnet) unter der katalytischen Wirkung einer nicht-hitzestabilen oder hitzestabilen (in Abhängigkeit von dem Ausführungsbeispiel) ATP-Sulfurylase (chemische Gleichung 1), und die Phosphorylierung der 3'-Hydroxyl-gruppe des so gebildeten APS unter Verwendung von ATP als einem Phosphatdonor unter der katalytischen Wirkung von nicht-hitzestabiler oder hitzestabiler (in Abhängigkeit von dem Ausführungsbeispiel) APS-Kinase (chemische Gleichung 2).
- Es wird im allgemeinen bevorzugt, daß das Enzym, das in der Lage ist, Pyrophosphorsäure in Phosphorsäure zu hydrolysieren, namentlich Pyrophosphatase (nachfolgend der Einfachheit halber als PPase bezeichnet) gegenwärtig ist, um so das Gleichgewicht weiter zur Bildung von PAPS zu verschieben, wie die chemische Gleichung 3 zeigt.
- In der vorliegenden Erfindung sollten beide, die ATP- Sulfurylase und die APS-Kinase, hitzestabil sein. Obgleich die Ursprünge dieser Enzyme nicht besonders beschränkt sind, können diejenigen, welche aus thermophilen Bakterien erhalten werden, als Beispiele derselben genannt werden. Das hitzestabile Enzym der vorliegenden Erfindung hat eine optimale Temperatur für seine Aktivität von etwa 40ºC oder höher, vorzugsweise von etwa 40ºC bis etwa 100ºC. Beispiele von thermophilen Bakterien, die brauchbar sind, um die hitzestabilen Enzyme zu erhalten, schließen diejenigen ein, die zu dem Genus Bacillus wie Bacillus stearothermophilus, Bacillus brevis, Bacillus coagulans, Bacillus thermoproteolytics und Bacillus acidocaldarius, diejenigen, die zu den Genera Clostridium, Thermoactinomyces, Achromobacter, Streptomyces und Micropolyspora, diejenigen, die zu dem Genus Thermus wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus und Thermus flavus und diejenigen, die zu den Genera Thermomicrobium und Cardelia gehören. Beispiele bestimmter Arten schließen Bacillus stearothermophilus (NCA 1503; ATCC 29609), Thermus flavus (ATCC 33923) und Bacillus coagulans (ATCC 7050) ein.
- Zusätzlich werden auch Bakterien, welche bei Zimmertemperatur wachsen und Arten hitzestabiler ATP- Sulfurylase und hitzestabiler APS-Kinase zur Erzeugung solcher Enzyme enthalten, umfaßt.
- Das angereicherte Medium, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird zur Inkubation eines Bakteriums oder einer Hefe, kann Kohlenstoffquellen enthalten, zum Beispiel Zucker wie Glucose, Sucrose, Fructose, Stärkehydrolysate, Melassen und Sulfitablaugen, organische Säuren wie Essigsäure und Milchsäure und Alkohole, Fette und Öle, Fettsäuren und Glycerine, die durch das angewendete Bakterium umgesetzt werden können. Es kann des weiteren Stickstoffquellen enthalten, zum Beispiel organische und anorganische Substanzen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Aminosäuren, Peptone, Fleischextrakt und Hefeextrakt und des weiteren anorganische Salze wie Kalium, Natrium, Phosphorsäure, Zink, Eisen, Magnesium, Mangan, Kupfer, Calcium und Kobaltsalze. Des weiteren kann es Spurenmetalle, Getreideeinweichflüssigkeit, Vitamine und Nukleinsäuren, falls erforderlich, enthalten. So können angereicherte Medien, welche im allgemeinen für die Inkubation von Bakterien anwendbar sind, verwendet werden.
- Das Bakterium kann in einem solchen Medium bei einer Temperatur von 20 bis 80ºC, vorzugsweise von 40 bis 70ºC, und noch mehr bevorzugt bei etwa 60ºC für 2 bis 6 Stunden unter aeroben Bedingungen inkubiert werden. Die Hefe kann in einem solchen Medium bei einer Temperatur von 25ºC bis 35 ºC, vorzugsweise von 27ºC bis 33ºC, inkubiert werden.
- Um die oben-erwähnten Enzyme aus den Bakterien oder der Hefe zu erhalten, werden die Zellen zuerst von dem Kultursubstrat gesammelt und dann zerkleinert, zum Beispiel durch Behandlung mit einer Homogenisiermaschine, einem Mischer, einer Dynomühle oder einer Flachpresse, durch Behandlung mit Ultraschall, Gefrieren und Tauen oder durch Behandlung mit Lysozym.
- Als nächstes wird ein kationisches polymeres Koaguliermittel zu der oben-erwähnten zerkleinerten Zellsuspension (Zellextrakt) gegeben, um dadurch die zerkleinerten Zellenfragmente und die Nukleinsäuren auszufällen.
- Beispiele für das polymere Koaguliermittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, schließen Polyaminoalkyl-methacrylate, Polyaminoalkyl-methacrylat/ acrylamid-Copolymere, Mannich-modifizierte Polyacrylamide, Polydimethyldiallyl-ammoniumsalze, Polyvinylimidazoline, Polyacrylamide und Aminpolykondensate ein.
- Die Menge des polymeren Koaguliermittels, welches zugefügt wird, kann vorzugsweise von 1 bis 40 Gewichtsteilen pro 100 Gewichtsteile der zerkleinerten mikrobiellen Zellen auf einer Trockenbasis reichen, obgleich sie in Abhängigkeit von dem polymeren Koaguliermittel variieren kann. Dieses kationische polymere Koaguliermittel wird zuvor in Wasser gelöst und dann zu der zerkleinerten Zellsuspension gegeben, gefolgt von einem Rühren für 10 Minuten bis 24 Stunden. Falls erforderlich, kann der pH Wert wahlweise kontrolliert werden durch Zugabe von 10 bis 200 mM einer Pufferlösung. Des weiteren können von 1 bis 50 Gewichtsteile, auf 100 Gewichtsteile der zerkleinerten Zellsuspension, Glucose zugegeben werden, um das Protein zu stabilisieren.
- Anschließend werden die zerkleinerten Zellfragmente und Nukleinsäure, die so ausgefällt wurden, getrennt, indem man zum Beispiel die Mischung stehen läßt, zentrifugiert oder filtriert.
- Auf diese Weise kann eine rohe Enzympräparation erhalten werden. Eine weiter gereinigte Enzympräparation kann erhalten werden durch Anwendung verschiedener chromatographischer Techniken, zum Beispiel Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Ionenaustauschchromatographie, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
- Das Verfahren zur Herstellung von PAPS gemäß der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem zum Beispiel eine Pufferlösung, ATP, ein Sulfatdonor, der in der Lage ist, Sulfationen (SO&sub4;²&supmin;) zu erzeugen, Magnesiumionen (Mg²&spplus;), hitzestabile ATP-Sulfurylase und hitzestabile APS- Kinase in einen Einzelreaktor zusammen eingebracht und miteinander umgesetzt werden. Darin aktiviert das Magnesiumion ATP, und sein Vorhandensein wird bevorzugt, um die Reaktion zu beschleunigen. Beispiele für den Sulfatdonor schließen Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Lithiumsulfat und Berylliumsulfat ein. Des weiteren kann PPase koexistieren, falls erforderlich oder erwünscht.
- In dem Verfahren zur Herstellung von PAPS gemäß der vorliegenden Erfindung wird noch bevorzugt, daß ein Enzym, welches in der Lage ist, ADP in ATP umzuwandeln und ein Phosphatdonor des weiteren gemeinsam vorhanden sind und umgesetzt werden.
- Jeder Reaktor kann in dem oben-beschriebenen Verfahren verwendet werden, solange er einen gleichmäßigen Verlauf der Reaktion gestattet. Die Größe und der Typ des Reaktors können in Abhängigkeit von zum Beispiel der Menge jedes Enzyms, der Substratkonzentration, des pH Werts, der Zuführgeschwindigkeiten und der Reaktionstemperatur bestimmt werden. In Anbetracht des Reaktortyps kann entweder ein Membranreaktor oder ein Säulenreaktor verwendet werden. Insbesondere kann in der vorliegenden Erfindung ein Membranreaktor effektiv verwendet werden, weil das Reaktionsprodukt ein niedriges Molekulargewicht hat. In diesem Fall können die Enzyme, welche hochmolekulare Substanzen sind, während des Verbleibs in dem Reaktor verwendet werden. Im Falle eines Säulenreaktors können die zu verwendenden Enzyme zu sogenannten immobilisierten Enzymen formuliert werden, indem sie gebunden werden an, eingeschlossen in, oder adsorbiert werden an einen geeigneten Träger (zum Beispiel Polysaccharid-Derivate wie Cellulose, Dextran oder Agarose; Vinylpolymer-Derivate wie Polystyrol, Ethylen/Maleinsäure-Copolymer oder vernetztes Polyacrylamid; Poly(aminosäure)- oder Polyamidderivate wie L-Alanin-L-Glutaminsäure-Copolymer oder Polyasparaginsäure; oder an anorganischen Substanzen wie Glas, Aluminiumoxid oder Hydroxyapatit und dann in die Säule gepackt werden.
- Die oben-beschriebenen Reaktoren werden unter der Annahme eines kontinuierlichen Betriebs beschrieben. Alternativ können andere Reaktoren, die auf den obigen Überlegungen basieren, verwendet werden. Es ist auch möglich, daß eine chargenweise Reaktion durchgeführt werden kann unter Verwendung eines Reaktors vom chargenweisen Reaktionstyp.
- Nun werden die Reaktionsbedingungen für die Herstellung von PAPS beschrieben. Der pH Wert der Reaktion kann in Abhängigkeit von den Enzymen variieren. Im allgemeinen wird die Reaktion unter fast neutraler Bedingung durchgeführt, namentlich bei pH 5 bis 11, vorzugsweise bei pH 6 bis 9. Der pH Wert kann mit einer Pufferlösung kontrolliert werden. Die Pufferlösung kann aus üblicherweise verwendeten gewählt werden, die für den oben-erwähnten pH Wert geeignet sind.
- Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt, solange die Enzyme nicht inaktiviert sind und die Reaktion gleichmäßig verlaufen kann. Eine Reaktionstemperatur von 20 bis 70ºC, insbesondere von 25 bis 45ºC, wird bevorzugt.
- Die Konzentration von ATP ist nicht besonders eingeschränkt. Eine Konzentration von 200 mM oder niedriger, vorzugsweise von 100 mM oder niedriger, wird bevorzugt. Des weiteren ist die Konzentration von ATP vorzugsweise nicht weniger als 0,01 mM.
- Die Sulfat- und Magnesiumionen können in jeder Form zugegeben werden. Es wird bevorzugt, daß die Sulfationen- Konzentration ungefähr zweimal so hoch ist wie die ATP-Konzentration, während die Magnesium-Konzentration von 1 mM (Equivalent) bis 100 mM (Equivalent) reicht.
- Die ATP-Sulfurylase kann in einer Menge von 5 mU/ml bis 200 mU/ml verwendet werden. Die APS-Kinase kann vorzugsweise in einer Menge, die zweimal so hoch ist (nach der Einheit = Unit) wie die der ATP-Sulfurylase, verwendet werden. Die PPase wird vorzugsweise in einer Menge von 5 U/ml bis 100 U/ml verwendet werden. Die Acetat-Kinase, oder andere Enzyme, die in der Lage sind, ADP in ATP umzuwandeln, können vorzugsweise in einer Menge von 1 U/ml bis 100 U/ml verwendet werden.
- Als der Phosphatdonor wird Acetylphosphat verwendet. Acetylphosphatsäure kann in der Form von Ammonium, Kalium/Lithium oder Natriumsalzen verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt der Verfügbarkeit wird Dinatriumacetylphosphat vorzugsweise verwendet. Es wird bevorzugt, Acetylphosphat in einer Menge von 1/10 bis 100 Equivalenten, noch bevorzugter von 1 bis 50 Equivalenten zu der ATP-Konzentration zu verwenden. Es kann nach einem beliebigen Verfahren zugefügt werden. Namentlich kann es entweder auf einmal bei Beginn der Reaktion oder in Portionen zugegeben werden.
- Ein Bestimmungsverfahren, das in der vorliegenden Erfindung angewendet wird, wie auch Verfahren zur Bestimmung der Aktivitäten der verwendeten Enzyme wird nachfolgend beschrieben.
- Eine Reaktionslösung der Zusammensetzung, wie unten angegeben, wird auf 30ºC gehalten und eine geeignete Menge einer Enzymprobenlösung wird zugefügt, um dadurch die Reaktion in Gang zu bringen. Nach 10 Minuten wird die Reaktion beendigt durch Zugabe von 0,05 ml 3 N Schwefelsäure. Nach der Vollendung der Reaktion wird die Konzentration der Phosphorsäure bestimmt unter Verwendung eines Reagens zur Bestimmung anorganischer Phosphorsäure (Phospha C-Test Wako, ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Inc.).
- Die Menge an ATP-Sulfurylase, die in der Lage ist, 2 umol Phosphorsäure, d. h. 1 umol Pyrophosphorsäure pro Minute zu bilden, wird als 1 U (Unit = Einheit) bezeichnet.
- Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) 100 mM
- Magnesiumchlorid 10 mM
- Natriummolybdat 10 mM
- ATP 10 mM
- Pyrophosphatase 0,4 U/ml
- Probe (ATP-Sulfurylaselösung) q. s. (Reaktionsformeln)
- Eine Reaktionslösung zur Bestimmung der APS-Kinaseaktivität, wie unten angegeben, wird auf 30ºC gehalten, und eine geeignete Menge einer Enzymprobenlösung wird zugefügt, um dadurch die Reaktion in Gang zu bringen. Nach 10 Minuten wird die Reaktion beendigt durch Erhitzen der Mischung in einem kochenden Wasserbad für 1 Minute. Nach Vollendung der Reaktion wird die Menge des so gebildeten PAPS durch HPLC (high-pressure liquid chromatography = Hochdruckflüssigchromatographie) bestimmt. Die Menge an APS-Kinase, die in der Lage ist, 1 umol PAPS pro Minute zu bilden, wird als 1 U (Unit = Einheit) bezeichnet.
- Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) 100 mM
- Magnesiumsulfat 10 mM
- ATP 1 mM
- ATP-Sulfurylase 0,5 U/ml
- Probe (APS-Kinaselösung) q. s. (Reaktionsformeln)
- Eine Reaktionslösung der Zusammensetzung, wie unten angegeben, wird auf 30ºC gehalten, und eine geeignete Menge einer Enzymprobenlösung wird zugefügt, um dadurch die Reaktion in Gang zu bringen. Nach 10 Minuten wird die Reaktion beendigt durch Zugabe von 0,05 ml 3 N Schwefelsäure. Nach Vollendung der Reaktion wird die Konzentration der Phosphorsäure bestimmt unter Verwendung eines Reagens für die Bestimmung anorganischer Phosphorsäure (Phospha C-Test Wako, ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Inc.). Die Menge an Pyrophosphatase, die in der Lage ist, 2 umol Phosphorsäure zu bilden, d. h. 1 umol Pyrophosphorsäure pro Minute, wird als 1 U (Unit = Einheit) bezeichnet.
- Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) 100 mM
- Magnesiumchlorid 5 mM
- Natriumpyrophosphat 5 mM
- Probe (Pyrophosphatase) q. s. (Reaktionsformel)
- Eine Reaktionslösung der Zusammensetzung, wie unten angegeben, wird auf 30ºC gehalten und 3 Minuten lang vorerhitzt.
- Imidazolhydrochlorid-Pufferlösung (pH 7,2) 70 mM
- Magnesiumchlorid 250 mM
- Kaliumchlorid 94mM
- ATP 12,5 mM
- Phosphoenolbrenztraubensäure (PEP) 4,2 mM
- NADH 3,3 mM
- Pyruvatkinase (PK) 240 U
- Laktatdehydrogenase (LDH) 330 U
- Zu dieser Reaktionslösung werden 0,6 ml einer 2 M Natriumacetatlösung zugegeben.
- Eine Probe (Acetatkinase) wird in 50 mM Phosphatpuffer in einer solchen Weise gelöst, daß sich eine Konzentration von 5 bis 10 U/ml ergibt. 0,01 ml der erhaltenen Probenlösung werden dann zu der oben-erwähnten Reaktionslösung zugegeben.
- Die UV-Absorbanz bei 340 nm wird jede zweite Minute gemessen, und die Neigung des linearen Teils wird bestimmt.
- Spezifische Aktivität (U/mg Protein) =Aktivität (U/ml)/aktive Konz. (mg/ml)
- d. f.: Koeffizient der Verdünnung.
- 6,22: Molekularer Absorptionskoeffizient von NADH (cm²/umol).
- Enzymkonz.: bestimmt nach dem Bradford-Verfahren.
- Die Menge an Acetatkinase, die 1 umol ADP pro Minute zu bilden vermag, wird als 1 Einheit (unit = Einheit) bezeichnet. (Reaktionsformeln)
- PAPS wird bestimmt unter Verwendung einer uBondapak C18 Säule (einem Produkt von Waters Co.).
- Tetrabutylammoniumperchlorat 3 mM
- Monokaliumphosphat 30 mM
- Methanol 25 Vol. %
- Wasser 75 Vol. %.
- Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,6 ml/Min., und das Produkt wird nachgewiesen durch Messung der UV Absorption (λ = 254 nm).
- Um die vorliegende Erfindung näher in größerem Detail zu erläutern, werden die folgenden Beispiele angegeben.
- Ein Medium, welches 1 Gew.-% Glucose, 1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Phosphorsäure und eine kleine Menge an Mineralien enthielt, wurde sterilisiert und auf einen pH von 6,5 eingestellt. Dann wurde Bacillus thermophilus (NCA 1503 Art) in dasselbe eingeimpft und inkubiert.
- Nach Inkubation bei 60ºC für 3 Stunden wurde bestätigt, daß die Glucose in dem Medium aufgebraucht war, und dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt.
- Nasse Zellen, die nach dem gleichen Verfahren wie demjenigen, das in dem obigen Bezugsbeispiel 1 beschrieben wurde, erhalten wurden, wurden zerkleinert durch das Gefrier- und Tauverfahren. Als nächstes wurden Nukleinsäuren entfernt unter Verwendung eines Polyacrylamidkoagulans. Das so gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugieren entfernt, und auf diese Weise wurde eine rohe Enzymlösung erhalten.
- Die rohe Enzymlösung wurde auf eine DEAE-Sepharose Säule gebracht, welche zuvor mit einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die ATP-Sulfurylase, die so adsorbiert wurde, wurde sorgfältig mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und dann durch lineare Gradientelution mit 0 bis 500 mM Natriumchlorid unter Verwendung der gleichen Pufferlösung entwickelt. Die aktive Fraktion wurde gesammelt und Ammoniumsulfat wurde in einer solchen Weise zugefügt, daß eine Konzentration von 1 M erhalten wurde.
- Diese aktive Fraktion wurde auf eine Phenyl-Sepharose Säule gebracht, die mit einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), die 1 M Ammoniumsulfat enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach sorgfältigem Waschen mit der gleichen Pufferlösung wurde Elution gemacht unter Verwendung einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0).
- Die so erhaltene aktive Fraktion wurde gesammelt, konzentriert, dialysiert und dann auf eine Matrex Gel Blau A Säule gebracht, welche mit einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach sorgfältigem Waschen mit der gleichen Pufferlösung wurde Elution gemacht unter Verwendung der gleichen Pufferlösung, welche 1 M Kaliumchlorid enthielt.
- Die aktive Fraktion wurde gesammelt, konzentriert und dann einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Als Ergebnis wurde eine einzelne Bande erhalten.
- Die spezifische Aktivität der Enzympräparation war 11,1 U/mg.
- Nasse Zellen, die nach dem gleichen Verfahren wie demjenigen, das in dem obigen Bezugsbeispiel 1 beschrieben wurde, erhalten wurden, wurden zerkleinert durch das Gefrier- und Tauverfahren. Als nächstes wurden Nukleinsäuren unter Verwendung eines Polyacrylamid-Koagulans entfernt. Der so gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, und auf diese Weise wurde eine rohe Enzymlösung erhalten.
- Die rohe Enzymlösung wurde auf eine DEAE-Sepharose Säule gebracht, die zuvor mit einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die so adsorbierte APS-Kinase wurde sorgfältig mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und dann durch lineare Gradientelution mit 0 bis 500 mM Natriumchlorid unter Verwendung der gleichen Pufferlösung entwickelt. Die aktive Fraktion wurde gesammelt und Ammoniumsulfat wurde in einer solchen Weise zugefügt, daß eine 70% Sättigung erhalten wurde. Nach dem Zentrifugieren wurde das Präzipitat in der gleichen Pufferlösung gelöst und dialysiert.
- Nach dem Aufbringen auf eine Matrex Gel Blau A Säule, welche mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, und nach sorgfältigem Waschen mit der gleichen Pufferlösung, wurde eine Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2), welche 1,5 M Kaliumchlorid enthielt, durch die Säule gelassen.
- Zu der so erhaltenen aktiven Fraktion wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Weise zugefügt, daß eine Konzentration von 800 mM erhalten wurde. Dann wurde die erhaltene Mischung auf eine Phenyl-Cellulofine Säule, welche mit einer 50 mM Tris- HCl-Pufferlösung (pH 8,0), welche 800 mM Ammoniumsulfat enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war, gebracht. Nach sorgfältigem Waschen mit der gleichen Pufferlösung, wurde eine 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) durch die Säule gelassen.
- Die aktive Fraktion wurde gesammelt, konzentriert und dann einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Als ein Ergebnis wurde eine einzelne Bande erhalten.
- Die spezifische Aktivität der Enzympräparation war 1,1 U/g.
- Nun werden Beispiele angegeben, um die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu erläutern.
- In einem Thermostatreaktor von 150 l Inhalt wurden 100 l einer wässrigen Lösung, welche 5 mM einer Tris-HCl-Pufferlösung, 100 mM ATP, 100 mM Magnesiumsulfat und 100 mM Natriumsulfat enthielt, hergestellt. Nach Einstellung auf einen pH von 8 mit Natriumhydroxid wurde die wässrige Lösung auf 30ºC gehalten. Dann wurden 25.000 U hitzestabiler ATP-Sulfurylase, hervorgegangen aus Bacillus stearothermophilus NCA-1503 (ATCC 29609), 50.000 U APS-Kinase des gleichen Ursprungs und 50.000 U Pyrophosphatase, hervorgegangen aus Hefe (Boehringer, Mannheim & Yamanouchi) zugegeben und die Reaktion in Gang gesetzt. Nach einer Umsetzung von 24 Stunden wurden die Enzyme von dem Rückstand unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran abgetrennt. Die so erhaltene Enzymlösung wurde bei 4ºC bis zur nachfolgenden Verwendung aufbewahrt. Die Analysenergebnisse der Reaktionsmischung durch HPLC (high-pressure liquid chromatography = Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie) zeigten an, daß 4,46 Mol PAPS gebildet wurden, und das Umwandlungsverhältnis, auf ATP basierend, war 44,6 Mol%. Die von der Enzymlösung freie Reaktionsmischung wurde durch 500 l einer DEAE-Sepharose-Säule gelassen und durch lineare Gradientelution mit 0 bis 400 mM Natriumchloridlösung entwickelt, um dadurch PAPS von der Reaktionsmischung abzutrennen. Die wässrige PAPS-Lösung wurde weiter konzentriert und entsalzt unter Verwendung einer reversen Osmosemembran NTR-7250 (einem Produkt von Unitika Ltd.) und dann gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 2.522 g eines weißen Pulvers erhalten (Isolationsausbeute: 95 Gew.-%). Nach Analyse mit NMR und ESCA wurde gefunden, daß das Produkt PAPS.4Na in einer Reinheit von 99 Mol% umfaßte.
- Zwei Anschlüsse eines Dreihals-Glasenzymreaktors (Fassungsvermögen: 150 ml) wurden jeweils mit einer Röhre versehen und an eine Flachmembran-Ultrafiltrations- Vorrichtung (einem Produkt von Millipore Co.) angeschlossen. Dann wurden 250 ml einer 5 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) zugefügt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 l/h zirkuliert. Der ganze Reaktor wurde auf 40ºC gehalten. Über einen anderen Einlaß dieses Reaktors wurden 250 U ATP-Sulfurylase und 500 U APS-Kinase, jede hervorgegangen aus Thermus Flavus (ATCC 33923), und 500 U Pyrophosphatase, hervorgegangen aus Bacillus stearothermophilus, zugefügt. Dann wurde dieser Einlaß mit einer Röhre versehen und eine Mischung aus 50 mM ATP, 50 mM Magnesiumsulfat und 50 mM Natriumsulfat, gelöst in der gleichen Pufferlösung wie die zirkulierende Lösung, mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/h zugegeben. Ein Teil der Lösung, welche die oben-erwähnte Ultrafiltrationsmembran passierte, wurde kontinuierlich gesammelt mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/h und bei 2ºC aufbewahrt. Diese Reaktion wurde 62 Stunden lang durchgeführt, und so wurden 3,1 l einer wässrigen Lösung von PAPS erhalten. Das Umwandlungsverhältnis von PAPS, welches auf ATP basierte, war 39 Mol%. Dann wurde PAPS isoliert und in der gleichen Weise, die in dem obigen Beispiel 1 angewendet wurde, gereinigt. Auf diese Weise wurden 34,9 g PAPS.4Na mit einer Reinheit von 99 Mol% erhalten (Isolationsausbeute: 97 Gew.-%).
- Unter Verwendung des gleichen Reaktors wie demjenigen, der in dem obigen Beispiel 2 verwendet wurde, wurde das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt, mit der Ausnahme, daß ATP-Sulfurylase und APS-Kinase, jede hervorgegangen aus Bacillus Stearothermophilus (NCA-1503; ATCC 29609), verwendet wurden. Die Reaktionstemperatur wurde auf 30ºC gehalten. Nach einer Reaktion von 108 Stunden wurden 5,4 l einer wässrigen Lösung von PAPS erhalten. Das Umwandlungsverhältnis von PAPS, welches auf ATP basierte, war 42 Mol%. Dann wurde PAPS isoliert und in der gleichen Weise, die in dem obigen Beispiel 1 angewendet wurde, gereinigt. Auf diese Weise wurden 64,1 g PAPS.4Na mit einer Reinheit von 99% erhalten (Isolationsausbeute: 95 Gew.-%).
- 100 U ATP-Sulfurylase, hervorgegangen aus Thermus flavus (ATCC 33923) wurden mit 10 ml einer 10 Gew.-%igen Gelatine geknetet und dann mit einem Drahtnetz von einer feinen Maschenweite abgeklärt. Die so erhaltenen Partikel wurden bei 4ºC für eine Stunde in 5 Gew.-%igen Glutaraldehyd getaucht und dann sorgfältig mit Wasser gewaschen, um dadurch ein immobilisiertes Enzym zu erhalten. Des gleichen wurden 200 U APS-Kinase des gleichen Ursprungs und 200 U Pyrophosphatase des gleichen Ursprungs jeweils in der gleichen Weise in ein immobilisiertes Enzym formuliert. Jedes dieser immobilisierten Enzyme wurde in eine Säule von 3 cm Durchmesser und 6 cm Höhe gepackt. Dann ließ man 200 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), die 100 mM ATP, 100 mM Magnesiumsulfat und 100 mM Natriumsulfat enthielt, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. passieren. Die Säule wurde auf 40ºC gehalten. Wenn die Lösung, welche die Säule passierte, geprüft wurde, war das Reaktionsverhältnis von PAPS, welches auf ATP basierte, 46 Mol%. Nach einem Durchgang der Lösung für 7 Stunden wurde PAPS aus der Reaktionsmischung isoliert und nach dem gleichen Verfahren wie demjenigen, das in dem obigen Beispiel 1 beschrieben wurde, gereinigt. Als ein Ergebnis wurden 5,31 g PAPS.4Na mit einer Reinheit von 99 Mol% erhalten (Isolationsausbeute: 97 Gew.-%).
- Unter Verwendung des gleichen Reaktors wie demjenigen, der in dem obigen Beispiel 2 verwendet wurde, wurde das Verfahren von Beispiel 3 wiederholt, mit der Ausnahme, daß ATP-Sulfurylase und APS-Kinase, jeweils hervorgegangen aus einer Hefe Saccharomyces cerevisiae (ATCC 7752), verwendet wurden. Nach einer Reaktion von 60 Stunden wurden 3,0 l einer wässrigen Lösung von PAPS erhalten.
- Das Umwandlungsverhältnis von PAPS, das auf ATP basierte, war 2,2 Mol%. Dann wurde PAPS isoliert und in der gleichen Weise, die in dem obigen Beispiel 1 angewendet wurde, gereinigt. Auf diese Weise wurden 1,91 g PAPS.4Na mit einer Reinheit von 99 Mol% erhalten (Isolationsausbeute: 97 Gew.-%).
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht, die Produktion von PAPS beachtlich zu erhöhen und das Produkt leicht zu isolieren und zu reinigen, verglichen mit konventionellen Verfahren zur Herstellung von PAPS. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein höchst vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von PAPS in einem industriellen Maßstab zur Verfügung.
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von
3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat, welches umfaßt:
(1) die Umsetzung von Adenosin-5'-phosphosulfat mit
einem Sulfatdonor in der Gegenwart von hitzestabiler
Adenosin-5'-triphosphat-Sulfurylase, um
Adenosin-5'-phosphosulfat herzustellen, und
(2) die Umsetzung besagten Adenosin-5'-phosphosulfats
mit Adenosin-5'-triphosphat in der Gegenwart von
hitzestabiler Adenosin-5'-phosphosulfat-Kinase, wobei
besagte hitzestabile Adenosin-5'-triphosphat-
Sulfurylase und hitzestabile Adenosin-5'-phosphosulfat-
Kinase eine optimale Temperatur von 40ºC oder höher
für die Aktivität derselben haben.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
besagter Sulfatdonor ein Glied gewählt aus der Gruppe
bestehend aus Magnesiumsulfat, Natriumsulfat,
Kaliumsulfat, Lithiumsulfat und Berylliumsulfat ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 11
durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9
durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis
70ºC durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis
45ºC durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einer Adenosin-5'-triphosphat-
Konzentration von 200 mM oder niedriger durchgeführt
wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reaktion bei einer Adenosin-5'-triphosphat-
Konzentration von 100 mM oder niedriger durchgeführt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
besagte hitzestabile Adenosin-5'-triphosphat-
Sulfurylase und hitzestabile Adenosin-5'-phosphosulfat-
Kinase die Enzyme sind, welche von einem thermophilen
Bakterium erhalten werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes thermophile Bakterium ein Bakterium, welches
zu dem Genus Bacillus gehört, ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes thermophile Bakterium Bacillus
stearothermophilus (ATCC 29609) ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes thermophile Bakterium Bacillus coagulans (ATCC
7050) ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes Bakterium Thermus flavus (ATCC 33923) ist.
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