DE3417360C2

DE3417360C2 -

Info

Publication number: DE3417360C2
Application number: DE19843417360
Authority: DE
Inventors: Motoo Nakajima; Yoshio Noda Jp Shirokane
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1983-05-11
Filing date: 1984-05-10
Publication date: 1987-05-21
Also published as: DE3417360A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Guanidin-Verbindungen im Urin oder Blut, sowie Reagenzien dafür.

Guanidinessigsäure ist ein bekannter Vorläufer für Kreatin und wird zum größten Teil in der Niere gebildet und Guanidinessigsäure wird im Urin in verhältnismäßig großen Mengen ausgeschieden. Wird der Metabolismus der Nieren vermindert, dann nimmt die Menge an Guanidinessigsäure im Urin ab. Man kann von diesem Phänomen klinisch Gebrauch machen, weil es eine Indikation für die Diagnose von Nierenerkrankungen ist. Durch Messung der Menge an Guanidinessigsäure im Urin oder Blut eines Patienten, bei dem eine Nierentransplantation durchgeführt wurde, kann man den Zustand des Patienten nach der Transplantation bewerten. Im Blut von Patienten, die unter chronischem Nierenversagen leiden, stellt man Methylguanidin fest, das im Blut von gesunden Personen praktisch nicht nachgewiesen wird. Man nimmt an, daß dieses Methylguanidin eines der urämischen Gifte darstellt, durch welche eine Urämie verursacht wird. Es ist bekannt, daß Methylguanidin in vitro Toxizitäten zeigt, wie eine LDH-Inhibierung, ATPase-Inhibierung, eine oxidative Phosphorylierungs- Inhibierung oder eine Plättchenfaktor-III-Inhibierung. Daher ist die Bestimmung von Guanidinessigsäure oder Methylguanidin im Urin oder im Blut eine wichtige Maßnahme zur Diagnose der Nierenfunktionen oder von Urämie.

In der DE-PS 29 19 578 wird ein Methyl-Guanidin- zersetzendes Enzym mit der Fähigkeit, Methyl-Guanidin in Methylamin und Harnstoff zu zersetzen, beschrieben. Den Harnstoff kann man dann in bekannter Weise bestimmen, z. B. indem man ihn mit Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt und den Ammoniak dann colorimetrisch mißt. Wenn in den zu untersuchenden Proben aber bereits Harnstoff enthalten ist, wird die Genauigkeit der Messung beeinträchtigt.

Weitere Methoden zur Bestimmung von Methylguanidin beruhen auf komplizierten und aufwendigen Adsorptionsverfahren und chromatographischen Verfahren.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine schnelle und genaue Methode zur Bestimmung von Guanidin-Essigsäure und Methylguanidin, in dem Urin oder Blut enthalten sind, zur Verfügung zu stellen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, ein Reagenz-Set, das für diese Bestimmung verwendet werden kann, zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 und einem Reagenz-Set gemäß dem Patentanspruch 4 gelöst.

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 den optimalen pH für das Guanidinessigsäure zersetzende Enzym, das bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, wenn man Guanidinessigsäure als Substrat verwendet;

Fig. 2 die Optimaltemperatur für das gleiche Enzym;

Fig. 3 die Stabilität des gleichen Enzyms bei einem bestimmten pH-Wert;

Fig. 4 die Wärmestabilität des gleichen Enzyms;

Fig. 5 bis 10 Standardkalibrierungslinien, die die Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und dem O.D.-Wert, gemäß der Diacetylmonoxim-semithiocarbazid- Methode darstellen;

Fig. 11 und 12 jeweils Standardkalibrierungslinien, die die Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der relativen Fluoreszenzintensität bei der Diacetylmonoxim-Methode darstellen.

Durch die Erfindung wird es ermöglicht, Guanidinessigsäure oder Methylguanidin, die im Urin oder Blut vorkommen, innerhalb einer kurzen Zeit und mit einer guten Genauigkeit mittels eines sehr einfachen Verfahrens zu bestimmen. Außerdem kann man eine ganze Anzahl von Proben gleichzeitig überprüfen.

Der pH-Wert der Probe muß nicht eingestellt werden, jedoch wird er vorzugsweise auf einen pH-Wert von 4 bis 12 z. B. mit Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid eingestellt. Die Probe wird so wie sie ist verwendet oder gegebenenfalls nach Verdünnung mit Wasser oder einer Pufferlösung.

Zu der so hergestellten Probe gibt man Urease, durch welche der in der Probe enthaltene Harnstoff, der einen Fehler verursachen würde, zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt wird. Die hierzu verwendete Urease kann aus irgendeinem Mikroorganismus stammen (z. B. Bacillus pasteurii), aus Tieren oder Pflanzen (z. B. Jack-Bohnen). Die Temperatur, bei welcher man die Urease auf den Harnstoff einwirken läßt, liegt zwischen 10 und 80°C und vorzugsweise 20 bis 60°C. Der pH beträgt dabei etwa 4 bis 11 und vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Umsetzung wird mit oder ohne Umrühren durchgeführt und zwar während einer ausreichend langen Zeit (z. B. 5 bis 60 Minuten).

Die verbleibende Urease würde einen Fehler bei der Bestimmung von Guanidin-Verbindungen verursachen. Deshalb wird sie inaktiviert oder entfernt oder durch die Zugabe eines Ureaseinhibitors inhibiert. Für die Inaktivierung der Urease kann man beispielsweise eine Methode anwenden, bei der man in siedendem Wasser eine ausreichend lange Zeit eine Hitzeanwendung durchführt oder eine Methode, bei der man ein geeignetes pH-Wert-Regelungsmittel (Salzsäuzre, Schwefelsäure, Salpetersäure, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) zugibt. Für die Entfernung von Urease kann man beispielsweise Ultrafiltrationsmembranen verwenden oder ein Entproteinisierungsmittel (Trichloressigsäure, Perchloressigsäure) etc. Die Aktivität der Urease kann durch die Zugabe eines Inhibitors, wie Acetohydroxamsäure, Caprylhydroxamsäure, Chloramphenicol, D-Phenylalanin, Dimethylsulfoxid, Chinon, Quecksilberchlorid oder Quecksilber-p-chlorobenzoat inhibiert werden.

Verwendet man eine immobilisierte Urease, so kann man diese einfach aus der Testlösung entfernen.

Die für die Immobilisierung verwendete Urease kann beliebigen Ursprungs sein und aus Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen stammen.

Die Harnstoffzersetzung kann man beispielsweise durchführen, indem man immobilisierte Urease direkt einer Probe zugibt und die Mischung dann zur besseren Umsetzung schüttelt oder rührt oder indem man immobilisierte Urease in einem Reaktor in Form eines Films, einer Säule oder eines Rohres verwendet. Beispielsweise kann die Harnstoffzersetzung mit immobilisierter Urease durchgeführt werden indem man eine Säule mit körniger immobilisierter Urease füllt oder indem man poröse glasartige Teilchen an die Innenseite eines Rohres anbringt und Urease an diese Glasteilchen immobilisiert, oder indem man die Säule oder ein Rohr in ein Analysensystem von kontinuierlichen Fließtyp einbringt und kontinuierlich den Harnstoff in der Probe zersetzt.

Die Temperatur, bei welcher man die immobilisierte Urease einwirken läßt, beträgt 10 bis 80°C und vorzugsweise 20 bis 60°C. Der pH-Wert beträgt dabei etwa 4 bis 11 und vorzugsweise 6 bis 8. Die Umsetzung wird während einer geeigneten Zeit, z. B. 5 bis 60 Minuten, durchgeführt.

Auf diese Weise erhält man eine Testlösung, in welcher die restliche Urease inaktiviert oder entfernt wurde oder zu welcher ein Ureaseinhibitor gegeben wurde oder man erhält eine Testlösung, in welcher der Harnstoff durch die Verwendung der immobilisierten Urease zersetzt worden ist. Auf diese Testlösung läßt man ein Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym oder ein Methylguanidin zersetzendes Enzym einwirken, wodurch Harnstoff gebildet wird. Der Mechanismus dieser Enzymreaktion ist der folgende:

Das bei der obigen Umsetzung verwendete Guanidinessigsäure zersetzende Enzym kann beliebigen Ursprungs sein und aus Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen etc., stammen. Man erhält es beispielsweise aus Corynebacterium sp. N-19-1 oder Arthrobacter sp. N-12-1. Oder man kann es aus Pseudomonas sp. ATCC 14676 erhalten (Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 41, Seite 959, 1977).

Das Guanidinessigsäure zersetzende Enyzm hat die Wirkung, daß es Guanidinessigsäure unter Bildung von Glycin und Harnstoff zersetzt.

Methode zum Messen der Enzymaktivität

Guanidinessigsäure als Substrat wird in 0,05 M Bistrispropan- HCl-Pufferlösung (pH 9,0) so gelöst, daß die Substratkonzentration 10 mMol beträgt. Zu 1,0 ml dieser Substratlösung gibt man 0,05 ml der vorliegenden Enzymflüssigkeit und die Mischung wird dann 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Dann gibt man 2,5 ml einer 5%igen Natriumtetraboratlösung hinzu, um die Reaktion abzustoppen und wenn ein Niederschlag auftritt, wird der Niederschlag durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, wodurch man eine Enzymreaktionsflüssigkeit erhält.

Eine Kontrolle wird nach dem gleichen Verfahren wie oben hergestellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von 0,05 ml der Enzymflüssigkeit 0,05 ml destilliertes Wasser verwendet werden.

Dann wird zu der obigen Enzymreaktionsflüssigkeit und zu der Kontrolle 1,0 ml einer 0,2%igen Natriumpicrylsulfonatlösung gegeben. Jede Mischung wird bei 37°C 23 Minuten umgesetzt und die Extinktion der enzymatischen Reaktionsflüssigkeit und der Kontrolle bei 420 nm gemessen. Durch Berechnen des Unterschiedes der Extinktion zwischen der enzymatischen Reaktionsflüssigkeit und der Kontrolle kann die Menge des gebildeten Glycins bestimmt werden.

Ausgedrückt als Enzymaktivität wird die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 µMol Guanidinessigsäure pro Minute bei 37°C zu zersetzen als eine Einheit bezeichnet.

Das Methylguanidin zersetzende Enzym kann beliebigen Ursprungs sein und von Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen etc. stammen. Man erhält es beispielsweise aus Alcaligenes N-81 (FERM-P Nr. 4369, ATCC 31369) Alcaligenes N-243 (FERM-P Nr. 4369, ATCC 31370) (vgl. dazu US-PS 42 47 632 und DE-AS 29 19 578).

Wird ein Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym oder ein Methylguanidin zersetzendes Enzym aus den oben erwähnten Bakterienstämmen hergestellt, so kann man zwar eine übliche Festkultur verwenden, jedoch wird vorzugsweise eine Flüssigkultur angewendet. Als Kulturmedium verwendet man beispielsweise ein Medium, dem man wenigstens eine Art einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maismeische, Einweichflüssigkeit von Sojabohnen, von Weizenkoji, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und dergleichen zugegeben wurde und wenigstens auch eine Art eines anorganischen Salzes, wie Mangansulfat, Manganchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III)sulfat, Eisen(II)sulfat, Phosphate und dergleichen und erforderlichenfalls indem man auch eine geeignete Kohlenstoffquelle (z. B. Saccharide), Vitamine und dergleichen zugab. Zusätzlich zu dem obigen Medium wird durch die Zugabe von Guanidinessigsäure oder einem Hydrochlorid oder Sulfat von Methylguanidin in einer Menge von wenigstens 0,01% (w/v) und vorzugsweise etwa 0,02 bis 1,0% (w/v) relativ zur Gesamtmenge des Mediums die Ausbeute an Guanidinessigsäure zersetzenden Enzym oder Methylguanidin zersetzenden Enzym wirksam erhöht.

Die Herstellung eines Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms oder eines Methylguanidin zersetzenden Enzyms unter Verwendung eines flüssigen Mediums, das in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde, wird vorzugsweise aerob in einer Submerskultur, einer Schüttelkultur oder einer ähnlichen Kultur durchgeführt. Die Kultur wird während 10 Stunden oder länger bei einer Temperatur von 25 bis 37°C und vorzugsweise etwa 30°C bei einem Anfangs-pH-Wert des Mediums von etwa 4,5 bis 9,0 durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung kann man das Guanidinessigsäure zersetzende Enzym oder das Methylguanidin zersetzende Enzym aus dem Kulturmedium nach üblichen Enzymsammelverfahren gewinnen.

Das so gebildete Enzym liegt hauptsächlich innerhalb der Bakterienzellen vor. Deshalb werden die Bakterienzellen vorzugsweise aus dem Kulturgemisch abgetrennt, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und dann wird das Guanidinessigsäure zersetzende Enzym oder ein Methylguanidin zersetzendes Enzym aus den Bakterienzellen gewonnen. Hierzu kann man die Bakterienzellen so wie sie sind verwenden, vorzugsweise werden sie jedoch vorher zerstört, z. B. durch Ultraschall, durch eine French-Presse, eine Dynomühle oder dergleichen, oder indem man die Bakterienzellenwandlung mittels eines die Zellwandung auflösenden Enzyms, wie Lysozym, auflöst.

Anschließend werden die Bakterienzellen oder deren Abbauprodukte oder Produkte, die man erhält, indem man die Zellwandungen aufgelöst hatte, mit Wasser, einer Pufferlösung oder einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Das Extrakt wird so wie es ist als rohe Enzymflüssigkeit verwendet oder man kann es in ein rohes Enzympulver mittels geeigneter Maßnahmen überführen, z. B. durch Lyophilisierung, Ausfällen mit Alkohol, Ausfällen mit Aceton oder Aussalzen mit Ammoniumsulfat. Zur Herstellung eines gereinigten Enzyms aus der rohen Enzymflüssigkeit und dem rohen Enzympulver gibt es zahlreiche Methoden, z. B. die Gelfiltrationsmethode, eine Adsorptions- Eluierungs-Methode mittels eines Ionenaustauschers, eine elektrophoretische Methode unter Verwendung von Polyacrylamidgel, eine Adsorptions-Eluierungs- Methode unter Verwendung von Hydroxyapatit, eine Sedimentierungsmethode (z. B. eine Saccharose-Dichtegradienten- Zentrifugierungsmethode), eine Affinitätschromatografie und eine Fraktionierungsmethode unter Verwendung von Molekularsiebmembranen oder Hohlfasermembranen. Die jeweiligen Methoden können einzeln oder in Kombination angewendet werden.

Die Menge des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms oder des Methylguanidin zersetzenden Enzyms, die der Testlösung zugesetzt wird, wird in Abhängigkeit von der Menge der Guanidinessigsäure oder des Methylguanidins in der Testlösung und den Bedingungen der Enzymreaktion ausgewählt. Im allgemeinen gibt man das Enzym in einer Menge von 0,5 bis 100 Einheiten und vorzugsweise von 1 bis 50 Einheiten zu 1 µMol der zu zersetzenden Verbindung zu. Die Temperatur, bei welcher man das Enzym auf die Testlösung einwirken läßt, beträgt 10 bis 80°C und vorzugsweise 20 bis 60°C. Der pH-Wert beträgt dabei 7 bis 12 und liegt vorzugsweise bei 8 bis 11. Diese Enzymreaktion wird während einer ausreichenden Zeit (z. B. 5 bis 60 Minuten) unter statischen Bedingungen oder unter Rühren durchgeführt und dabei wird Harnstoff gebildet. Anschließend wird der Harnstoff nach einer der bekannten Meßmethoden bestimmt.

Dann stellt man eine Beziehung auf zwischen einer bekannten Menge an Harnstoff und dem O.D.-Wert oder der relativen Fluoreszenzintensität. Unter Verwendung von diesen Daten erstellt man eine Standardkalibrierungskurve. Hierzu wurden folgende Versuche durchgeführt.

Versuch 1

Harnstoff wurde nach der Diacetylmonoxim-thiosemicarbazid- Methode, wodurch die Menge an Guanidinoessigsäure bestimmt wurde, gemessen.

(I) Herstellung der Reagentien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Als Grundmedium wurde ein Medium aus 0,5% (w/v) Glycerin, 0,1% (w/v) Ammoniumnitrat, 0,2% (w/v) Natriumchlorid, 0,1% (w/v) sekundäres Kaliumphosphat, 0,05% (w/v) Hefeextrakt, 0,002% (w/v) Magnesiumsulfat und Wasser verwendet. Dazu wurden 0,04% (w/v) Guanidinessigsäure gegeben. 15 l der erhaltenen Mischung wurden in einen Glasfermentor mit einer Kapazität von 30 l gegeben und in einem Autoklaven sterilisiert. Dazu wurden 30 ml einer Saatkultur aus Pseudomonas sp. ATCC Nr. 14676 (erhalten von ATCC), die 8 Stunden bei 30°C in obigem Grundmedium plus 0,04% Pepton kultiviert worden war, zum Inokulieren gegeben. Die erhaltene Mischung wurde 15 Stunden bei 30°C submerskultiviert.

Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert, wobei man Bakterienzellen erhielt. Die Zellen wurden in 0,02 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,1 mMol Manganchlorid und 1,0 mMol 2- Mercaptoethanol (diese Pufferlösung wird nachfolgend als Pufferlösung A bezeichnet), suspendiert und dann in üblicher Weise mittels Ultraschall zerstört. Die Debris wurde durch Zentrifugieren entfernt, wobei man eine überstehende Flüssigkeit, nämlich die rohe Enzymflüssigkeit erhielt. Die rohe Enzymflüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen und der Niederschlag, der sich bei einer 30% igen Sättigung bildete, wurde abfiltriert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde nochmals mit Ammoniumfulfat ausgesalzen und der bei 70%iger Sättigung gebildete Niederschlag wurde gesammelt. Diese Fraktion wurde in der Pufferlösung A gelöst und die Lösung wurde gegen die gleiche Pufferlösung zur Entfernung des Salzes unter Verwendung eines nahtlosen Celluloserohres dialysiert. Die durch Dialyse erhaltene Enzymflüssigkeit wurde auf eine Säule, die mit DEAE-Cellulose, mit Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, enthielt, adsorbiert. Die gleiche Pufferlösung wurde durch die Säule für eine gründliche Eluierung und Entfernung von unreinen Proteinen laufen gelassen. Anschließend wurde eine Ionenaustauschchromatografie durchgeführt, indem man stufenweise mit der Pufferlösung A, enthaltend jeweils 0,15 M, 0,2 M und 0,3 M KCl, eluierte und wodurch man eine Enzymflüssigkeit, enthaltend eine aktive Fraktion, erhielt.

Diese Enzymflüssigkeit wurde in üblicher Weise mit Ammoniumsulfat ausgesalzen und der bei 70%iger Sättigung gehaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert. Der abgetrennte Niederschlag wurde in einer kleinen Menge der Pufferlösung A gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule, die mit Sephadex® G-150, ins Gleichgewicht gebracht mit der Pufferlösung A, gefüllt war, laufen gelassen und dadurch erhielt man eine aktive Fraktion, nämlich ein Standardenzymprodukt, welches keine Urease enthielt, das durch Gelfiltrationschromatographie abgetrennt wurde. Die Enzymaktivität wird definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 µMol Guanidinessigsäure kpro 1 Minute bei 30°C zu zersetzen und diese Menge wird als eine Einheit bezeichnet.

(2) Reagenz A (Urease-Pufferlösung)

100 mg Urease (Typ IX hergestellt von Sigma Co.) wurde in 10 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gelöst.

(3) Reagenz B

6,0 g Diacetylmonoxim und 0,3 g Thiosemicarbazid wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 1000 ml eingestellt.

(II) Messung

Fünf Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 1,0 ml dieser Lösungen 100 µ Mole Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, bzw. 1,6 µ Mole Guanidinessigsäure enthielten, sowie 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Zu jeweils 1,0 ml dieser Lösungen wurden 0,2 ml des Reagenzes A gegeben und gründlich durchmischt. Die Mischung wurde ohne Bewegen bei 37°C 15 Minuten umgesetzt. Das entstandene enzymatische Reaktionsprodukt wurde einer Zentrifugenultrafiltration unter Verwendung einer CF 25 Centriflo Membrane, hergestellt von Amicon Co. zur Entfernung der Urease unterworfen. Zu 0,6 ml des von Urease freien Filtrates wurden 0,1 ml (10 Einheiten) der Guanidinessigsäure zersetzenden Enzymflüssigkeit, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde ohne weiteres Bewegen während 30 Minuten bei 37°C die Umsetzung durchgeführt. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung und 0,5 ml des Reagenzes B gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Mischung 20 Minuten auf einem Wasserbad bei 100°C erwärmt und anschließend mit fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine colorimetrische Messung bei 540 nm durchgeführt, um den O.D.-Wert zu erhalten.

Als Kontrolle wurde eine 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 100 µMol Harnstoff, und keine Guanidinessigsäure verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie vorher durchgeführt wurde.

Der Wert für die Kontrolle (Blindprobe) wurde von den obigen O.D.-Werten bei allen der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D.-Wert nach dem Abziehen und der Menge an Guanidinessigsäure wird in Fig. 5 gezeigt. Wie aus Fig. 5 hervorgeht, besteht eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und dem O.D.-Wert nach dem Abziehen und deshalb kann man diese Beziehung in befriedigender Weise als Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 2

Harnstoff wurde mittels der Diacetylmonoxim-thiosemicarbazid- Methode bestimmt und dadurch wurde die Menge an Guanidinessigsäure gemessen.

(I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wird in gleicher Weise wie beim Versuch 1 hergestellt.

(2) Reagenz C (immobilisierte Urease)

200 mg Urease (aus Jack-Bohnen, Typ IX hergestellt von Sigma Co.) wurden zu 30 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0), in welcher 10 g nasse DEAE- Toyopearl 650S (Anionenaustauscher hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co.) suspendiert worden waren, gegeben. Die Urease wurde an dem DEAE-Toyopearl 650S während 1 Stunde bei 4°C unter gelegentlichem Rühren adsorbiert. Das mit Urease beladene DEAE-Toyopearl 650S wurde auf einem Glasfilter gesammelt. Das Filter wurde gründlich mit 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) zur Entfernung von nicht adsorbierter Urease gewaschen. Das Waschen wurde nochmals wiederholt und dann wurde DEAE-Toyopearl 650S in 30 ml einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) suspendiert. Dazu wurden 3,5 ml einer 25%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung gegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 4°C gerührt und auf diese Weise wurde die Immobilisierung der Urease durchgeführt. Das DEAE-Toyopearl 650S, auf dem Urease immobilisiert worden war, wurde auf einem Glasfilter gesammelt, gründlich mit 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) zur Entfernung von nicht-umgesetztem Glutaraldehyd gewaschen und dann kräftig abgesaugt, wodurch man eine trockene immobilisierte Urease (0,045 Einheiten/mg) erhielt.

Der Ausdruck Ureaseaktivität beinhaltet, daß die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 µMol Harnstoff pro Minute bei 37°C zu zersetzen, als eine Einheit bezeichnet wird.

(3) Reagenz D

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise hergestellt wie das Reagenz B im Versuch 1.

(II) Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei 0,2 ml dieser Lösungen jeweils 30 µMol Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2 bzw. 1,6 µMol Guanidinessigsäure enthielten, sowie destilliertes Wasser. Zu jeder der 0,2 ml-Lösungen wurden 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben. Diese Mischung wurde auf eine kleine Säule aus Polyethylen, die mit 1,0 g des Reagenzes C gefüllt war, gegeben. In dem erhaltenen System wurde 30 Minuten bei 37°C die Umsetzung vorgenommen.

Aus der obigen Säule wurden 0,6 ml eines Reaktionsgemisches eluiert. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl- Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Umsetzung bei 37°C während 30 Minuten unter stationären Bedingungen vorgenommen. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung, 0,5 ml des Reagenzes C gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde 20 Minuten auf einem Wasserbad bei 100°C erhitzt und dann wurde mit fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine Colorimetrie bei 540 nm mit einem Colorimeter durchgeführt, wobei man den O.D.-Wert erhielt.

Als Kontrolle wurde destilliertes Wasser, enthaltend 30 µMol Harnstoff und keine Guanidinessigsäure verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt wurde.

Der Wert für die Kontrolle (Blindlösung) wurde von dem obigen O.D.-Wert bei den jeweiligen fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D.-Wert nach dem Abziehen und der Menge der Guanidinessigsäure wird in Fig. 6 gezeigt. Aus Fig. 6 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und dem O.D.-Wert nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 3

Harnstoff wurde nach der Diacetylmonoxim-thiosemicarbazid- Methode gemessen, wobei die Menge an Guanidinessigsäure festgestellt wurde.

10 ml eines Mediums (pH 6,0), bestehend aus 0,5% (w/v) Guanidinessigsäure, 1,0% (w/v) Melasse, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,4% (w/v) primäres Kaliumphosphat, 0,05% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,001% (w/v) Ferrosulfat und Wasser wurden in ein großes Reagenzglas gefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Dazu wurde eine Platinspitze voll Corynebacterium sp. N-19-1 (FERM BP-506) aus einer aufbewahrten Schräg- und Saatkultur gegeben und die Inokulierung wurde 20 Stunden bei 30°C unter Erhalt einer Saatbakterienflüssigkeit durchgeführt. Getrennt davon wurden 2 l eines Mediums (pH 5,0) aus 0,5% (w/v) Guanidinessigsäure, 1,0% (w/v) Melasse, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 1,0% (w/v) primäres Kaliumphosphat, 0,05% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,001% (w/v) Ferrosulfat, 0,0005% (w/v) Zinksulfat und Wasser in einen Glasfermentator eingefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Dazu wurden 20 ml der obigen Bakterien-Saatflüssigkeit gegeben und dann wurde eine Submerskultur bei 30°C während 26 Stunden durchgeführt.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde zum Sammeln der feuchten Bakterienzellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1,0 l einer 0,05 M KH₂PO₄-NaOH- Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,02% (w/v) Lysozym, suspendiert. Die Zellen wurden durch 1- stündiges Erhitzen auf 37°C gelöst und die Nucleinsäure wurde durch Zugabe von Ethyleniminpolymer bei einer Endkonzentration des Polymers von 0,003% (v/v) entfernt. Das Gesamtgemisch wurde zum Sammeln der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule, die mit DEAE-Sephadex A-50 gefüllt war, laufen gelassen. Das DEAE-Spehadex A-50 war zuvor mit 0,05 M KH₂PO₄-NaOH-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,3 M KCl, ins Gleichgewicht gebracht worden. Das Enzym wurde auf der Säule adsorbiert. Die Säule wurde gründlich mit der gleichen Pufferlösung, enthaltend 0,35 M KCl, gewaschen und anschließend wurde unter Verwendung der gleichen Pufferlösung, enthaltend 0,4 M KCl, die aktive Fraktion des vorliegenden Enzyms gesammelt. Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration (ACL-1010 hergestellt von Asahi Chemical Industry Co.) konzentriert, wobei man ein Standardenzymprodukt erhielt. Die Enzymaktivität ist die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 Mol Guanidinessigsäure pro Minute bei 37°C zu zersetzen. Diese Menge wird als eine Einheit bezeichnet.

Reagenz E (Urease-Pufferlösung)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie Reagenz A im Versuch 1 hergestellt.

(3) Reagenz F

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das Reagenz B im Versuch 1 hergestellt.

(II) Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 1,0 ml dieser Lösungen 100 µMol Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2 bzw. 1,6 µMol Guanidinessigsäure sowie 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) enthielten. Zu jeweils 1,0 ml der Lösungen wurden 0,2 ml des Reagenzes E gegeben und gründlich vermischt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 37°C unter statischen Bedingungen umgesetzt. Das erhaltene Enzymreaktionsprodukt wurde einer Ultrafiltrationszentrifugenbehandlung unter Verwendung von CF-25 Centriflo-Membran, hergestellt von der Amicon Co., zur Entfernung der Urease unterworfen. Zu 0,6 ml des von Urease freien Filtrates wurden 0,1 ml (10 Einheiten) der Guanidinessigsäure zersetzenden Enzymflüssigkeit, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde unter stationären Bedingungen die Umsetzung 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung und 0,5 ml Reagenz F gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde die Mischung 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad auf 100°C erwärmt und dann unter fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine Colorimetrie bei 540 nm unter Verwendung eines Colorimeters zur Bestimmung des O.D.-Wertes durchgeführt.

Als Kontrolle wurde eine 0,01 M Phosphatpufferlösung, enthaltend 100 µMol Harnstoff und keine Guanidinessigsäure, verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt wurde.

Der Wert der Kontrolle (Blindprobe) wurde von dem obigen O.D.-Wert für jede der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D-Wert nach dem Abziehen und der Menge der Guanidinessigsäure wird in Fig. 7 gezeigt. Aus Fig. 7 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und dem O.D.-Wert nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 4

Harnstoff wurde nach der Diacetylmonoxim-thiosemicarbazid- Methode gemessen, wobei die Menge an Guanidinessigsäure bestimmt wurde.

Die Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie in Versuch 3 hergestellt.

(2) Reagenz G (immobilisierte Urease)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das Reagenz C in Versuch 2 hergestellt.

(3) Reagenz H

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das Reagenz B in Versuch 1 hergestellt.

(II) Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 0,2 ml dieser Lösungen 30 µMol Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2 bzw. 1,6 µMol Guanidinessigsäure sowie destilliertes Wasser enthielten. Zu jeweils 0,2 ml dieser Lösungen wurden 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben. Diese Mischung wurde auf Sepacol-Mini-Säulen, gefüllt mit 1,0 g des Reagenzes G, gegeben. Das erhaltene System wurde 30 Minuten bei 37°C umgesetzt.

Aus den obigen Mini-Säulen wurden 0,6 ml des Reaktionsgemisches eluiert. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde die Umsetzung bei 37°C 30 Minuten unter stationären Bedingungen durchgeführt. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung und 0,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung und 0,5 ml des Reagenzes H gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad auf 100°C erhitzt und dann wurde mit fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine Colorimetrie bei 540 nm mit einem Colorimeter (Stasar III der Gilford Co.) zum Erhalt der O.D.- Werte durchgeführt.

Als Kontrolle wurde destilliertes Wasser, enthaltend 30 µMol Harnstoff und keine Guanidinessigsäure, verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt wurde.

Der Wert für die Kontrolle (Blindprobe) wurde von den obigen O.D.-Werten für jede der Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen den O.D.-Werten nach dem Abziehen und der Menge an Guanidinessigsäure wird in Fig. 8 gezeigt. Aus Fig. 8 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und dem O.D.-Wert nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 5

10 ml eines Mediums (pH 6,0), bestehend aus 0,5% (w/v) Guanidinessigsäure, 0,2% (w/v) Hefeextrakt, 0,4% (w/v) primäres Kaliumphosphat, 0,05% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,001% (w/v) Manganchlorid, 0,001% (w/v) Ferrosulfat und Wasser, wurden in ein großes Reagenzglas gefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Dazu wurde eine Platinspitzenmenge Arthrobacter sp. N-12-1 (FERM BP-505) aus einer aufbewahrten Schrägkultur zum Inokulieren gegeben. Das System wurde 24 Stunden bei 37°C einer Schüttelkultivierung mittels eines Reagenzglasrüttlers unterworfen.

Die Kulturflüssigkeit wurde dann zentrifugiert, wobei man die Bakterienzellen erhielt. Die Zellen wurden in 4 ml einer 0,1 M KH₂PO₄-NaOH-Pufferlösung (pH 8,0) suspendiert und dann 10 Minuten mittels eines Ultraschallgerätes unter Eiskühlung zerstört.

Die zerstörten Zellen wurden zentrifugiert, wobei man den Niederschlag entfernte und die überstehende Flüssigkeit sammelte.

Diese überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule laufen gelassen, die mit DEAE-Sephadex® A-50, ins Gleichgewicht gebracht mit 0,05 M KH₂PO₄-NaOH- Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,3 M KCl, gefüllt war und dabei wurde das vorliegende Enzym in der Säule adsorbiert. Die Säule wurde gründlich mit der gleichen Pufferlösung, enthaltend 0,35 M KCl gewaschen und dann wurde unter Verwendung der gleichen Pufferlösung, enthaltend 0,4 M KCl, die aktive Fraktion des vorliegenden Enzyms gesammelt. Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert, wobei man ein Standardenzymprodukt erhielt. Die Enzymaktivität ist die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 µMol Guanidinessigsäure pro Minute bei 37°C zu zersetzen. Diese Menge wird als eine Einheit bezeichnet.

(2) Reagenz I (Urease-Pufferlösung)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das Reagenz A in Versuch 1 hergestellt.

(3) Reagenz J

Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 1,0 ml dieser Lösungen 100 µMol Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2 bzw. 1,6 µMol Guanidinessigsäure und 0,01 M Phosphorpufferlösung (pH 7,0) enthielten. Zu jeweils 1,0 ml dieser Lösungen wurden 0,2 ml des Reagenzes I gegeben und dann wurde gründlich gemischt. Die Mischung wurde stationär 15 Minuten bei 37°C umgesetzt. Das erhaltene Enzymreaktionsprodukt wurde einer Zentrifugen-Ultrafiltration zur Entfernung der Urease unterworfen. Zu 0,6 ml des ureasefreien Filtrats wurden 0,1 ml (10 Einheiten) der Guanidinessigsäure zersetzenden Enzymflüssigkeit, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde unter stationären Bedingungen die Umsetzung bei 37°C 30 Minuten durchgeführt. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml 57%ige Phosphorsäurelösung und 0,5 ml Reagenz J gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Mischung 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C erwärmt und dann mit fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine Colorimetrie bei 549 nm mittels eines Colorimeters durchgeführt, wobei man die O.D.-Werte erhielt. Zur Kontrolle wurde eine 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 100 µMol Harnstoff und keine Guanidinessigsäure, verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt wurde.

Die Werte für die Kontrolle (Blindprobe) wurden von den obigen O.D.-Werten für jede der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D.-Wert nach dem Abziehen und der Menge der Guanidinessigsäure wird in Fig. 9 gezeigt. Aus Fig. 9 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und den O.D.-Werten nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 6

Harnstoff wurde nach der Diacetylmonoxim-thiosemicarbazidmethode gemessen, wobei die Menge an Guanidinessigsäure bestimmt wurde.

Diese Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie die in Versuch 5 verwendete hergestellt.

(2) Reagenz K (immobilisierte Urease)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie Reagenz C in Versuch 2 hergestellt.

(3) Reagenz L

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie Reagenz B in Versuch 1 hergestellt.

(II) Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 0,2 ml dieser Lösungen 30 µMol Harnstoff und 0,2, 0,4, 0,8, 1,2 bzw. 1,6 µMol Guanidinessigsäure sowie destilliertes Wasser enthielten. Zu jeder der 0,2 ml-Lösungen wurden 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben. Diese Mischung wurde auf Mini-Säulen, die mit 1,0 g des Reagenzes K gefüllt waren, gegeben. Das erhaltene System wurde 30 Minuten bei 37°C umgesetzt.

Aus den obigen Mini-Säulen wurden 0,6 ml Reaktionsmischung eluiert. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach gründlichem Vermischen erfolgte die Umsetzung bei 37°C 30 Minuten lang unter stationären Bedingungen. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 57%igen Phosphorsäurelösung und 0,5 ml des Reagenzes L gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C erwärmt und dann wurde mit fließendem Wasser gekühlt. Anschließend wurde eine Colorimetrie bei 540 nm unter Verwendung eines Colorimeters durchgeführt, wobei man einen O.D.-Wert erhielt.

Zur Kontrolle wurde destilliertes Wasser, enthaltend 30 µMol Harnstoff, und keine Guanidinessigsäure verwendet und die Messung wurde in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt.

Der Wert für die Kontrolle (Blindprobe) wurde von den obigen O.D.-Werten bei jeder der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D.-Wert nach dem Abziehen und der Menge der Guanidinessigsäure wird in Fig. 10 gezeigt. Aus Fig. 10 wird deutlich, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Guanidinessigsäure und den O.D.-Werten nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 7

Harnstoff wurde bestimmt durch Umsetzen mit Diacetylmonoxim unter Ausbildung einer fluoreszierenden Substanz, wodurch man die Menge an Methylguanidin bestimmte.

(I) Herstellung der Reagenzien (1) Methylguanidin zersetzende Enzymflüssigkeit

2 l eines Mediums (pH 7,2), bestehend aus 1,0% (w/v) Glycerin, 0,2% (w/v) Methylguanidinsulfat, 0,1% (w/v) sekundäres Natriumphosphat, 0,1% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,05% (w/v) Hefeextrakt, 0,01% (w/v) Ferrosulfat, 0,01% (w/v) Manganchlorid und Wasser, wurden in einen Glasfermentator eingefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Zum Inokulieren wurden 20 ml einer Saatbakterienflüssigkeit gegeben, wobei diese Flüssigkeit erhalten worden war, indem man Alcaligenes N-243 (FERM-P Nr. 4369, ATCC Nr. 31370) in einem Medium (pH 7,2) der obigen Zusammensetzung während 48 Stunden kultivierte. Das System wurde dann einer Submerskultur während 48 Stunden bei 30°C unterworfen.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde zum Sammeln der Bakterienzellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,05 M Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und dann 10 Minuten mittels Ultraschall unter Eiskühlung zerstört. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit (die rohe Enzymflüssigkeit) wurde gesammelt. Die überstehende Flüssigkeit (rohe Enzymflüssigkeit) wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen und der bei einer 55%igen Sättigung erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert. Dieser Niederschlag wurde in einer kleinen Menge 0,01 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule, die mit Sephadex 200 gefüllt war und zuvor mit 0,01 M Tris- HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,1 M KCl, ins Gleichgewicht gebracht worden war, laufen gelassen, wodurch eine Gelfiltrations-Chromatografie durchgeführt wurde.

Die so erhaltene aktive Fraktion wurde durch eine Säule mit DEAE-Sephacel, ins Gleichgewicht gebracht mit 0,01 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,1 M KCl, laufen gelassen. Es wurde eine Ionenaustauschchromatografie mittels einer KCl-Konzentrationsgradienten- Eluierungsmethode durchgeführt. Das heißt, daß eine 0,01 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,1 M KCl, als Eluiermittel verwendet wurde, bis die Menge des Eluates 120 ml erreichte und anschließend wurde die gleiche Pufferlösung, enthaltend 0,2 bis 0,4 M KCl, verwendet.

Die aktive Fraktion wurde auf einer Säule, die mit Hydroxyapatit gefüllt war, adsorbiert. Beim Eluieren der aktiven Fraktion des vorliegenden Enzyms verwendete man als Eluiermittel eine 0,001 M Tris- HCl-Pufferlösung, enthaltend 0,1 M KCl, bis die Menge des Eluats 200 ml erreichte, und anschließend wurden 0,001, 0,05, 0,01, 0,03, 0,05 und 0,07 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) in der genannten Reihenfolge und schließlich eine 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) verwendet.

Die auf diese Weise erhaltene aktive Fraktion wurde gegenüber entionisiertem Wasser unter Verwendung eines nahtlosen Celluloserohres dialysiert und dann lyophilisiert, wobei man ein ureasefreies gereinigtes Enzympulver erhielt.

Die Enzymaktivität ist die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1µMol Methylguanidin pro Minute bei 30°C zu zersetzen, wobei diese Menge als eine Einheit bezeichnet wird.

(2) Reagenz M (Urease-Pufferlösung)

(3) Reagenz N

5 g Diacetylmonoxim und 150 g Natriumchlorid wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 1.000 ml eingestellt.

(II) Messung

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, so daß jeweils 1,0 ml dieser Lösungen 100 µMol Harnstoff und 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 bzw. 0,16 µMol Methylguanidin und 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) enthielten. Zu jeweils 1,0 ml dieser Lösungen wurden 0,2 ml des Reagenzes M gegeben und dann wurde gründlich gemischt. Die Mischung wurde unter stationären Bedingungen bei 37°C 15 Minuten umgesetzt. In gleicher Weise wie bei Versuch 1 wurde die Enzymreaktionsmischung von Urease befreit, wobei man 0,6 ml einer ureasefreien Reaktionsmischung erhielt. Dazu wurden 0,1 ml (10 Einheiten) der Methylguanidin zersetzenden Enzymflüssigkeit, gelöst in 0,2 M Na₂CO₃-NaHCO₃- Pufferlösung (pH 10) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde die Mischung bei 37°C unter stationären Bedingungen 30 Minuten lang umgesetzt.

Dazu wurden 0,4 ml destilliertes Wasser, 0,8 ml des Reagenzes M und 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Mischung 40 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C erwärmt und anschließend mit fließendem Wasser gekühlt. Bei der erhaltenen Flüssigkeit wurde die relative Fluoreszenzintensität bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 525 nm mittels eines Spektrofluoro-Fotometers gemessen.

Zur Kontrolle wurde eine 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 100 µMol Harnstoff und kein Methylguanidin, verwendet, wobei die Messung in gleicher Weise wie oben angegeben durchgeführt wurde. Die Werte für die Kontrolle (Blindprobe) wurden von den obigen relativen Fluoreszenzintensitäten bei jeder der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen der relativen Fluoreszenzintensität nach dem Abziehen und der Menge an Methylguanidin wird in Fig. 11 gezeigt. Aus Fig. 11 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der relativen Fluoreszenzintensität nach dem Abziehen besteht und deshalb kann man diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Versuch 8

Harnstoff wurde mittels der Methode gemessen, bei welcher man die Umsetzung mit Diacetylmonoxim unter Ausbildung einer fluoresziierenden Substanz durchführt, woraus dann die Menge an Methylguanidin bestimmt wird.

(I) Herstellung der Reagenzien (1) Methylguanidin zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wird in gleicher Weise wie die in Versuch 7 verwendete hergestellt.

(2) Reagenz O (immobilisierte Urease)

Dieses Reagenz wird in gleicher Weise wie das Reagenz C in Versuch 2 hergestellt.

(3) Reagenz P

Dieses Reagenz wird in gleicher Weise wie das Reagenz N in Versuch 7 hergestellt.

(II) Messungen

Fünf verschiedene Lösungen wurden hergestellt, wobei jeweils 0,2 ml dieser Lösungen 30 µMol Harnstoff und 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 bzw. 0,16 µMol Methylguanidin sowie destilliertes Wasser enthielten. Zu jeweils 0,2 ml dieser Lösungen wurden 1,0 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben. Diese Mischung wurde auf Mini-Säulen, die mit 1,0 g des Reagenzes O gefüllt waren, gegeben. Dann wurde eine Umsetzung bei 37°C während 30 Minuten durchgeführt. Aus den obigen Mini-Säulen wurden jeweils 0,6 ml einer Reaktionsmischung eluiert. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) der Methylguanidin zersetzenden Enzymflüssigkeit, gelöst in 0,2 M Na₂CO₃-NaHCO₃-Pufferlösung (pH 10) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde die Mischung 30 Minuten unter stationären Bedingungen bei 37°C umgesetzt.

Dazu wurden 0,4 ml destilliertes Wasser, 0,8 ml des Reagenzes P und 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure gegeben. Nach gründlichem Vermischen wurde die Mischung 40 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C erwärmt und dann mit fließendem Wasser gekühlt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde auf die relative Fluoreszenzintensität bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 525 nm mittels eines Spektrofluoro-Fotometers untersucht.

Zur Kontrolle wurde destilliertes Wasser, enthaltend 30 µMol Harnstoff und kein Methylguanidin, verwendet und die Messung wurde in gleicher Weise wie oben durchgeführt. Der Wert für die Kontrolle (Blindprobe) wurde von der obigen relativen Fluoreszenzintensität bei jeder der fünf Lösungen abgezogen. Die Beziehung zwischen der relativen Fluoreszenzintensität nach dem Abziehen und der Menge an Methylguanidin wird in Fig. 12 gezeigt. Aus Fig. 12 geht hervor, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der relativen Fluoreszenzintensität nach dem Abziehen besteht. Man kann deshalb diese Beziehung befriedigend für eine Standardkalibrierungskurve verwenden.

Die Reagenzien für die Bestimmung der Guanidinessigsäure oder von Methylguanidin, die bei den Bestimmungsmethoden gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen (a) ein Enzymsystem, enthaltend Urease und ein Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym oder ein Methylguanidin zersetzendes Enzym, (b) ein Färbemittelsystem für Harnstoff oder ein Reagenzsystem, welches mit Harnstoff unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz sowie erforderlichenfalls (c) einen Ureaseinhibitor ein.

Die Reagenzien zur Bestimmung von Guanidinessigsäure oder Methylguanidin können gemäß der vorliegenden Erfindung auch aus (a) einem Enzymsystem, enthaltend immobilisierte Urease und ein Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym oder Methylguanidin zersetzendes Enzym und (b) einem Färbemittelsystem für Harnstoff oder einem Reagenz, das mit Harnstoff unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz reagiert, bestehen.

Die in diesen Reagenzien verwendeten Enzymsysteme können in Form eines Pulvers, einer Flüssigkeit oder einer Suspension vorliegen. Liegt das Enzym als Pulver vor, dann besteht das System (1) aus einem Enzympulver und einem getrockneten immobilisierten Enzym und (2) einem Puffermittel für einen pH-Wert von 6 bis 11, welches den optimalen pH-Bereich für das Enzym darstellt, wobei das Puffersystem beispielsweise ein Phosphatpuffer, ein Tris-HCl-Puffer oder ein Na₂CO₃- NaHCO₃-Puffer sein kann. Ist das Enzymsystem eine Flüssigkeit oder eine Suspension, dann wird das obige Enzym in einer Pufferlösung, wie einer Phosphatpufferlösung, einer Tris-HCl-Pufferlösung oder einer Na₂CO₃-NAHCO₃-Pufferlösung gelöst, so daß diese Lösung oder Suspension einen pH-Wert von 6 bis 11 hat.

Wird eine sehr genaue Bestimmung gefordert, dann kann man einen Ureaseinhibitor verwenden. Als Ureaseinhibitor kommt jede Substanz in Frage, die die Ureaseaktivität inhibieren kann. Dazu gehören beispielsweise Acetohydroxamsäure und Caprylohydroxamsäure.

Das Färbemittel für Harnstoff kann jedes System sein, das mit Harnstoff unter Entwicklung einer Farbe reagiert. Dazu gehört beispielsweise ein Reagenz aus (a) einer Lösung, enthaltend 6 g Diacetylmonoxim, 0,3 g Thiosemicarbazid und 1000 ml destilliertes Wasser, und (b) 57% (w/w) Phosphorsäurelösung. Das Reagenzsystem, welches mit Harnstoff unter Bildung von fluoreszierenden Substanzen reagiert, schließt beispielsweise ein Reagenz ein aus (a) einer Lösung, bestehend aus 5 g Diacetylmonoxim, 150 g Natriumchlorid und 1000 ml destilliertem Wasser, und (b) konzentrierte Schwefelsäure.

Von den Reagenzien für die Bestimmung von Guanidinessigsäure oder Methylguanidin wird das Enzymsystem wünschenswerterweise in der Kälte und in der Dunkelheit insbesondere bei Temperaturen von 5°C oder weniger aufbewahrt.

Wie vorher erwähnt, beruht die vorliegende Erfindung auf einer Methode zur Bestimmung von Guanidinessigsäure oder Methylguanidin im Urin oder Blut, wobei diese Bestimmung genau, schnell und wirksam in einfacher Weise möglich ist, und die Erfindung auch die Reagenzien, die bei dieser Methode angewendet werden, umfaßt. Die Methode und die Reagenzien können in der klinischen Medizin und insbesondere bei der Diagnose der Nephropatie angewendet werden und stellen ein wertvolles diagnostisches Mittel dar.

Die Erfindung wird ausführlich in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit war die gleiche wie in Versuch 1.

(2) Reagenz A (Urease-Pufferlösung)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise hergestellt wie das in Versuch 1 verwendete.

(3) Reagenz B

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das in Versuch 1 verwendete hergestellt.

(II) Messung

Zu 1,0 ml Urin einer gesunden Person wurden 0,2 ml des Reagenzes A (Urease-Pufferlösung) gegeben und das Ganze gründlich vermischt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen umgesetzt. Dann wurde, wie in Versuch 1, die Resturease entfernt, wobei man 0,2 ml des ureasefreien Reaktionsgemisches erhielt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach dem Mischen erfolgte die Umsetzung bei 37°C unter stationären Bedingungen während 30 Minuten. Dazu wurden 0,7 ml destilliertes Wasser gegeben und in gleicher Weise wie in Versuch 1 wurde die Extinktion gemessen. Es wurde ein O.D.-Wert von 0,696 gemessen.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die durch Behandeln von 0,1 ml der Guanidinessigsäure zersetzenden Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten erhalten worden war. In gleicher Weise wie oben wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, wobei der O.D.-Wert 0,326 betrug.

Die Differenz zwischen den beiden obigen O.D.-Werten (0,696-0,326) wurde in die Standardkalibrierungskurve, die in Versuch 1 erhalten wurde, eingetragen, um die Menge an Guanidinessigsäure in der obigen Urinprobe zu erhalten. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß diese Menge 1,29 µMol pro 1 ml Urin betrug. Dies entspricht 15,1 mg pro 100 ml Urin.

Beispiel 2 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie die in Versuch 1 verwendete hergestellt.

(2) Reagenz C (immobilisierte Urease)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie das in Versuch 2 verwendete hergestellt.

(3) Reagenz D

(II) Messung

0,2 ml des Urins einer gesunden Person wurden mit 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Die erhaltene Mischung wurde auf eine Mini-Säule, gefüllt mit 1,0 g Reagenz C, gegeben. Das System wurde 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Dann wurden 0,6 ml einer Reaktionsmischung eluiert. Zu der Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung 30 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser gegeben und wie in Versuch 2 wurde die Extinktion gemessen. Es wurde ein O.D.-Wert von 0,353 gemessen.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die durch Behandeln von 0,1 ml Guanidinessigsäure zersetzender Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten erhalten worden war. In gleicher Weise wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, wobei der O.D.-Wert 0,156 betrug.

Der Unterschied zwischen den beiden obigen O.D.- Werten (0,353-0,156) wurde in die Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäß Versuch 2, eingetragen, wobei man die Menge an Guanidinessigsäure in der obigen Urinprobe erhielt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß diese Menge 1,4 µMol pro 1 ml Urin betrug, was 13,4 mg pro 100 ml Urin entspricht.

Beispiel 3 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie die in Versuch 3 verwendete hergestellt.

(2) Reagenz E (Urease-Pufferlösung)

(3) Reagenz F

(II) Messung

Zu 1,0 ml Urin einer gesunden Person wurden 0,2 ml Reagenz E (Urease-Pufferlösung) gegeben und das Ganze wurde gründlich vermischt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen umgesetzt. Dann wurde wie in Versuch 3 die Resturease entfernt, wobei man 0,2 ml einer ureasefreien Reaktionsmischung erhielt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung bei 37°C während 30 Minuten unter stationären Bedingungen. Dazu wurden 0,7 ml destilliertes Wasser gegeben und dann wurde in gleicher Weise wie in Versuch 3 die Extinktion gemessen. Es wurde ein O.D.- Wert von 0,553 erhalten.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die erhalten worden war, indem man 0,1 ml Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C 5 Minuten behandelte. In gleicher Weise wie oben wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, wobei der O.D.-Wert 0,310 betrug.

Der Unterschied bei den obigen O.D.-Werten (0,554- 0,310) wurde in eine Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäß Versuch 3, eingetragen, wobei man die Menge an Guanidinessigsäure in der obigen Urinprobe erhielt. Diese Menge betrug 0,847 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 9,92 mg pro 100 ml Urin.

Beispiel 4 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie in Versuch 3 hergestellt.

(2) Reagenz G (immobilisierte Urease)

(3) Reagenz H

(II) Messung

0,2 ml des Urins einer gesunden Person wurden mit 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Die erhaltene Mischung wurde auf eine Sepacol- Mini-Säule, die mit 1,0 g des Reagenzes G gefüllt war, gegeben. Das System wurde 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Dann wurden 0,6 ml der Reaktionsmischung eluiert. Zu der Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung 30 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen. Dazu wurden 0,3 ml destilliertes Wasser gegeben und es wurde in gleicher Weise wie in Versuch 4 die Extinktion gemessen. Es wurde ein O.D.-Wert von 0,314 erhalten.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die man erhielt durch Behandeln von 0,1 ml der Guanidinessigsäure zersetzenden Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad von 100°C während 5 Minuten. In gleicher Weise wie oben wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, wobei der Wert 0,187 betrug.

Der Unterschied zwischen den beiden obigen O.D.- Werten (0,314-0,187) wurde in die Standardkalibrierungskurve des Versuchs 4 eingetragen, wobei man die Menge an Guanidinessigsäure in der obigen Urinprobe erhielt. Diese Menge betrug 0,735 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 8,64 mg kp pro 100 ml Urin.

Beispiel 5 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

Diese Flüssigkeit wurde in gleicher Weise wie in Versuch 5 hergestellt.

(2) Reagenz I (Urease-Pufferlösung)

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie Reagenz A in Versuch 1 hergestellt.

(3) Reagenz J

Dieses Reagenz wurde in gleicher Weise wie Reagenz B in Versuch 1 hergestellt.

(II) Messung

Zu 1,0 ml des Urins einer gesunden Person wurden 0,2 ml Reagenz I (Urease-Pufferlösung) gegeben und gründlich vermischt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen umgesetzt. In gleicher Weise wie in Versuch 5 wurde die Resturease entfernt, wobei man 0,2 ml einer ureasefreien Reaktionsmischung erhielt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung während 30 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen. Dazu wurden 0,7 ml destilliertes Wasser gegeben und in gleicher Weise wie in Versuch 5 wurde die Extinktion gemessen. Der O.D.-Wert betrug 0,648.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die erhalten worden war durch Behandeln von 0,1 ml Guanidinessigsäure zersetzender Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten. In gleicher Weise wie oben wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, wobei der Wert 0,297 betrug.

Die Differenz der beiden obigen O.D.-Werte (0,648- 0,297) wurde in die Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäß Versuch 5, eingetragen, wobei man die Menge an Guanidinessigsäure in der Urinprobe erhielt. Diese Menge betrug 1,22 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 14,3 mg pro 100 ml Urin.

Beispiel 6 Bestimmung von Guanidinessigsäure in Urin (I) Herstellung der Reagenzien (1) Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit

(2) Reagenz K (immobilisierte Urease)

(3) Reagenz L

(II) Messung

0,2 ml des Urins einer gesunden Person wurden mit 1,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Die erhaltene Mischung wurde auf eine Mini-Säule, die mit 1,0 g des Reagenzes K beladen war, gegeben. Das System wurde bei 37°C 30 Minuten umgesetzt. Dann wurden 0,6 ml eines Reaktionsgemisches eluiert. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms, gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung 30 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen. Dann wurden 0,3 ml destilliertes Wasser zugegeben und in gleicher Weise wie in Versuch 6 wurde die Extinktion gemessen. Der O.D.-Wert betrug 0,335.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die man erhielt, indem man 0,1 ml Guanidinessigsäure zersetzende Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten behandelt. Wie oben wurde die Extinktion der Kontrolle (Blindprobe) gemessen und der O.D.-Wert betrug 0,164.

Die Differenz der beiden obigen O.D.-Werte (0,335- 0,164) wurde in die Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäß Versuch 6, eingetragen, wobei man die Menge an Guanidinessigsäure in der obigen Urinprobe erhielt. Diese Menge betrug 0,990 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 11,6 mg pro 100 ml Urin.

Beispiel 7 Bestimmung von Methylguanidin in Urin

1,0 ml des Urins eines unter chronischem Nierenversagen leidenden Patienten wurden mit 0,2 ml des Reagenzes M (Urease-Pufferlösung) von Versuch 7 vermischt.

Die Mischung wurde 15 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen umgesetzt. Dann wurde in gleicher Weise wie in Versuch 7 die Resturease entfernt, unter Erhalt von 0,4 ml einer ureasefreien Reaktionsmischung. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Methylguanidin zersetzenden Enzyms von Versuch 7, gelöst in 0,2 M Na₂CO₃-NaHCO₃-Pufferlösung (pH 10) zugegeben. Nach dem Mischen wurde unter stationären Bedingungen bei 37°C während 30 Minuten umgesetzt. Dazu wurden 0,6 ml destilliertes Wasser gegeben und in gleicher Weise wie in Versuch 7 wurde die relative Fluoreszenzintensität gemessen und ein Wert von 1,24 erzielt.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die erhalten worden war, indem man 0,1 ml der Methylguanidin zersetzenden Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten behandelte. In gleicher Weise wie oben wurde die Fluoreszenzintensität der Kontrolle (Blindprobe) gemessen, die 0,93 betrug.

Die Differenz zwischen den beiden obigen Werten (1,24- 0,93) wurde in die Standardkalibrierungskurve, erhalten in Versuch 7, eingetragen, wobei man die Menge an Methylguanidin in der Urinprobe erhielt. Diese Menge betrug 0,055 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 402 µg pro 100 ml Urin.

Beispiel 8 Bestimmung von Methylguanidin in Urin

0,5 ml Urin eines unter chronischem Nierenversagen leidenden Patienten wurden mit 0,7 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Die Mischung wurde auf eine Mini-Säule, die mit 1,0 g des Reagenzes O aus Versuch 8 gefüllt war, gegeben. Es erfolgte die Umsetzung bei 37°C während 30 Minuten. Dann wurden 0,8 ml eines Reaktionsgemisches aus der Mini-Säule eluiert. Zum Reaktionsgemisch wurden 0,1 ml (10 Einheiten) des Methylguanidin zersetzenden Enzyms aus Versuch 7, gelöst in 0,2 M Na₂CO₃- NaHCO₃-Pufferlösung (pH 10) gegeben. Nach dem Vermischen erfolgte die Umsetzung während 30 Minuten bei 37°C unter stationären Bedingungen. Dann wurden 0,2 ml destilliertes Wasser zugegeben und wie in Versuch 8 die relative Fluoreszenzintensität gemessen. Es wurde ein Wert von 1,29 erzielt.

Zur Kontrolle (Blindprobe) wurde eine Substanz verwendet, die erhalten worden war, indem man 0,1 ml der Methylguanidin zersetzenden Enzymflüssigkeit auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 5 Minuten behandelte. In gleicher Weise wie oben wurde die relative Fluoreszenzintensität der Kontrolle (Blindprobe) gemessen. Sie betrug 1,06.

Die Differenz der obigen beiden Werte (1,29-1,06) wurde in die Standardkalibrierungskurve, erhalten in Versuch 8, eingetragen, wobei man die Menge an Methylguanidin in der obigen Urinprobe erhielt. Sie betrug 0,040 µMol pro 1 ml Urin, entsprechend 292 µg pro 100 ml Urin.

Beispiel 9 Reagenz für die Bestimmung von Guanidinessigsäure (a) Enzymsystem

Urease (hergestellt von Sigma Co.), 10 mg (gelöst in 1 ml 0,01 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0).

Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym, erhalten auf gleiche Weise wie in Versuch 3, 100 Einheiten (gelöst in 1 ml, 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung, pH 8,0).

(b) Färbemittelsystem

Reagenz I:Diacetylmonoxim, 600 mg, und Thiosemicarbazid, 30 mg (gelöst in 100 ml destilliertem Wasser). Reagenz II:57%ige (w/w) Phosphorsäurelösung, 100 ml.

Unter Verwendung dieser Reagenzien wurde Guanidinessigsäure in Urin wie folgt bestimmt:

Zu 1 ml Urin wurden 0,2 ml Urease gegeben. Die Umsetzung wurde 15 Minuten bei 37°C durchgeführt. Restliche Urease wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran entfernt, wobei man 0,2 ml des ureasefreien Reaktionsgemisches erhielt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 ml des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms gegeben. Die Umsetzung erfolgte 30 Minuten bei 37°C. Dann wurden 0,7 ml destilliertes Wasser, 0,5 ml des Reagenzes I und 1,5 ml des Reagenzes II zugegeben. Man erhitzte 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C bis zur Farbentwicklung. Dann wurde der O.D.-Wert der erhaltenen Flüssigkeit bei 540 nm gemessen. Getrennt davon wurde eine Standardlösung von Guanidinessigsäure einer Enzymreaktion und einer Farbentwicklung unterworfen und der O.D.-Wert der erhaltenen Flüssigkeit wird bei der gleichen Wellenlänge gemessen. Aus dem Verhältnis dieser beiden O.D.-Werte wird die Menge an Guanidinessigsäure in dem vorliegenden Urin bestimmt.

Beispiel 10 Reagenz für die Bestimmung von Guanidinessigsäure (a) Enzymsystem

10 g immobilisierte Urease, erhalten in gleicher Weise wie in Versuch 2 (vor der Anwendung werden 1,0 g der immobilisierten Urease auf 10 Mini-Säulen aufgebracht); 20 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0).

Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym, erhalten gemäß Versuch 5, 100 Einheiten (gelöst in 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung, pH 8) 20 ml.

(b) Färbemittelsystem

Reagenz I:Diacetylmonoxim, 600 mg, und Thiosemicarbazid, 30 mg (gelöst in 100 ml destilliertem Wasser). Reagenz II:100 ml 57%ige (w/w) Phosphorsäurelösung.

Unter Anwendung dieser Reagenzien wird Guanidinessigsäure in Urin wie folgt bestimmt.

0,2 ml Urin werden mit 1,0 ml der 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Diese Mischung wird auf Mini-Säulen, die mit 1,0 g der immobilisierten Urease beladen sind, aufgegeben. Das System wird bei 37°C umgesetzt. Dann werden 0,6 ml eines Reaktionsgemisches aus der Mini-Säule eluiert. Zu diesem Reaktionsgemisch gibt man 0,1 ml des Guanidinessigsäure zersetzenden Enzyms und setzt das Ganze bei 37°C 30 Minuten um. Dazu gibt man 0,3 ml destilliertes Wasser, 0,5 ml Reagenz I und 1,5 ml Reagenz II. Die erhaltene Mischung wird 20 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bis zur Farbentwicklung erhitzt. Der O.D.-Wert der gefärbten Flüssigkeit wird bei 540 nm gemessen. Getrennt davon wird eine Standardlösung von Guanidinessigsäure einer Enzymreaktion unterworfen und die Farbentwicklung und der O.D.-Wert der erhaltenen Flüssigkeit werden bei der gleichen Wellenlänge gemessen. Aus dem Verhältnis der beiden O.D.-Werte wird die Menge an Guanidinessigsäure in einem bestimmten Urin ermittelt.

Beispiel 11 Reagenz für die Bestimmung von Methylguanidin (a) Enzymsystem

10 mg Urease (gelöst in 1 ml 0,01 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0).

100 Einheiten Methylguanidin zersetzendes Enzym, erhalten gemäß Versuch 7 (gelöst in 1 ml 0,2 M Na₂CO₃- NaHCO₃-Pufferlösung, pH 10).

(b) Reagenzsystem

Reagenz I:Diacetylmonoxim, 0,5 g, und Natriumchlorid, 15 g (gelöst in 100 ml destilliertem Wasser). Reagenz II:konzentrierte Schwefelsäure, 10 ml.

Mit diesen Reagenzien wird Methylguanidin im Urin wie folgt bestimmt.

Zu 1 ml Urin werden 0,2 ml Urease gegeben. Durch Entfernen der Resturease erhält man 0,4 ml der ureasefreien Mischung. Zu dieser Reaktionsmischung gibt man 0,1 ml des Methylguanidin zersetzenden Enzyms. Die Umsetzung erfolgt 30 Minuten bei 37°C. Dazu gibt man 0,6 ml destilliertes Wasser, 0,8 ml Reagenz I und 0,2 ml Reagenz II. Man erhitzt auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C während 40 Minuten. Dann wird die relative Fluoreszenzintensität der erhaltenen Flüssigkeit gemessen. Getrennt davon wird eine Standardlösung von Methylguanidin einer Enzymreaktion unterworfen und anschließend einer Fluoreszenzentwicklung. Die relative Fluoreszenzintensität der erhaltenen Flüssigkeit wird gemessen. Aus dem Verhältnis der beiden Werte wird die Menge von Methylguanidin in einem gegegebenen Urin bestimmt.

Beispiel 12 Reagenzien für die Bestimmung von Methylguanidin (a) Enzymsystem

10 g immobilisierte Urease, erhalten wie in Versuch 2 (vor der Anwendung werden 1,0 g dieser immobilisierten Urease auf 10 Sepacol-Mini-Säulen gegeben), 20 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0.

100 Einheiten Methylguanidin zersetzendes Enzym, erhalten in gleicher Weise wie in Versuch 7 (gelöst in 1 ml 0,2 M Na₂CO₃-NaHCO₃-Pufferlösung, pH 10).

(b) Reagenzsystem

Reagenz I:Diacetylmonoxim, 0,5 g und Natriumchlorid 15 g (gelöst in 100 ml destilliertem Wasser). Reagenz II:konzentrierte Schwefelsäure, 10 ml.

Unter Verwendung dieser Reagenzien wird Methylguanidin in Urin wie folgt bestimmt.

0,5 ml Urin werden mit 0,7 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) vermischt. Diese Mischung wird auf eine Mini-Säule, die mit 1,0 g der immobilisierten Urease beladen ist, aufgegeben. Das System wird bei 37°C umgesetzt. Dann eluiert man von der Mini-Säule, wobei man 0,8 ml eines Reaktionsgemisches erhält. Zu diesem Reaktionsgemisch gibt man 0,1 ml des Methylguanidin zersetzenden Enzyms. Es erfolgt die Umsetzung bei 37°C während 30 Minuten. Dazu gibt man 0,2 ml destilliertes Wasser, 0,8 ml des Reagenzes I und 0,2 ml Reagenz II. Die Mischung wird 40 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C erwärmt. Die relative Fluoreszenzintensität der erhaltenen Flüssigkeit wird gemessen. Getrennt davon wird eine Standardlösung von Methylguanidin einer Enzymreaktion und einer anschließenden Fluoreszenzentwicklung unterworfen und dann prüft man in der erhaltenen Flüssigkeit die relative Fluoreszenzintensität. Aus dem Verhältnis dieser beiden Werte kann man die Menge an Methylguanidin in der gegebenen Urinprobe bestimmen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von im Blut oder Urin vorhandenen Guanidin-Verbindungen, wobei diese mit einem Guanidinoessigsäure zersetzenden Enzym oder einem Methylguanidin zersetzenden Enzym unter Ausbildung von Harnstoff umgesetzt werden und die dabei entstandene Menge an Harnstoff bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man den in Urin oder Blut vorhandenen Harnstoff vorher mit Urease zersetzt und dann die Urease inaktiviert oder entfernt oder einen Ureaseinhibitor auf sie einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Urease in immobilisierter Form verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Guanidinessigsäure zersetzende Enzym oder das Methylguanidin zersetzende Enzym in einer Menge von 0,5 bis 100 Einheiten pro 1 µMol der zu zersetzenden Verbindung zugibt.

4. Reagenz-Set zur Bestimmung von Guanidin-Verbindungen, die im Urin oder Blut vorhanden sind, enthaltend (a) Urease, (b) ein Guanidinessigsäure zersetzendes Enzym oder ein Methylguanidin zersetzendes Enzym, und (c) ein Färbemittelsystem für Harnstoff oder ein Reagenzsystem, welches mit Harnstoff unter Ausbildung einer fluoreszierenden Substanz reagiert.

5. Reagenz-Set gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es auch einen Ureaseinhibitor enthält.

6. Reagenz-Set nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) die Urease in immobilisierter Form enthält.