DE2919578C2 - Methylguanidin-zersetzendes Enzym, Verfahren zu dessen Herstellung, sowie dessen Verwendung zur Entfernung aus Methylguanindin enthaltenden Proben - Google Patents

Description

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Die Erfindung ist in den Patentansprüchen I bis 3 angegeben.

Methylguanidin ist in gewissen Nahrungsmitteln, wie geräucherten Sardinen oder Fleischextrakt, in erheblichen Mengen enthalten. Angeblich soll Methylguanidin leicht durch Nitrosierung in Methylnitrosocyanamid im Magensaft in Gegenwart von Nitrit umgewandelt so werden, Methylnitrosocyanamid wird als karzinogen angesehen.

Obwohl Methylguanidin im Blut eines gesunden Menschen fast nicht nachweisbar ist, findet man es im Blut von Patienten mit chronischen Nierenleiden, so daß es eine Art eines urämischen Toxins ist, welches Urämie verursacht Man weiß auch, daß die in vitro Toxizität von Methylguanidin LDH-lnhibierung, ATPase-lnhibie* rung, die Inhibierung der oxidativen Phosphorylierung, die Inhibierung des Plättchenfaktors 3 und dergleichen bewirkt (Ando et al, Saishin Igaku, 31, Nr. 9, Seiten 1695 bis 1706(1976)).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Methylguanidin-zersetzendes zu zeigen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist es auch, die Herstellung eines solchen Enzyms zu zeigen und die Eignung eines solchen Enzyms zur Entfernung von Methylguanidin und gegebenenfalls quantitativen Bestimmung desselben aus bzw. in Methylguanidin-ent

haltenden Proben,

Diese Aufgabe wird durch das neue Methylguanidinzersetzende Enzym gemäß Patentanspruch 1, dessen Herstellung gemäß Patentanspruch 2 und dessen Verwendung gemäß Patentanspruch 3 gelöst

Der Erfindung liegen Untersuchungen zugrunde, ein Verfahren zu finden, mittels dessen man Methylguanidin in harmlose Substanzen umwandeln und entfernen kann.

Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein Bäktenum von Genus Alcaligenes, das aus Erde isoliert wird, ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym bildet, durch welches Methylguanidin in die harmlosen Verbindungen Methylamin und Harnstoff zersetzt wird und wobei diese Wirkung bisher nicht bekannt war. Es wurde auch festgestellt, daß man bei der Einwirkung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms auf eine Probe, die auf ihren Gehalt an Methylguanidin analysiert werden soll, die Menge des gebildeten Methylamins oder Harnstoffs gemessen werden kann, und daß man so Methylguanidin quantitativ auf sehr einfache Weise und innerhalb kurzer Zeit mit einer sehr hohen Empfindlichkeit analysieren kann und man gleichzeitig eine große Anzahl von Proben untersuchen kann.

In den Zeichnungen stellt

Fig. 1 eine grafische Darstellung dar, die den optimalen pH-Bereich des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms, das durch Kultivierung eines Stammes Alcaligenes ATCC 31369 oder Alcaligenes ATCC 31370 hergestellt wurde, angibt, wobei die Messung durchgeführt wurde unter Verwendung von Methylguanidin als Substrat

F i g. 2 (Standardkalibrierungskurve) ist eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der O. D. Zahl, die bei der Urease-Indophenol-Methode gemessen wird, und

F i g. 3 (Standardkalibrierungskurve) ist eine grafische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der O. D. Zahl, gemessen nach derTNBS-Methode, angibt

Fig.4A gibt das Flüssigchromatogramm einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1 m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (vor der enzymatischen Reaktion) an, wobei η das Peak von Methylguanidin ist

Fig.4B gibt das Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes an, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1m Tris-hydrochlorsäure-Puffer (nach der enzymatischen Reaktion).

F i g. 5A ist ein Flüssigchromatogramm von Rinderextrakt (vor der enzymatischen Reaktion), worin η das Peak von Methylguanidin ist

F i g. 5B ist ein Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit Rinderextrakt (nach der enzymatischen Reaktion), wobei η das Peak von Methylguanidin ist

F i g. 6A ist das Flüssigchromatogramm eines Heißwasserextraktes von geräucheiten Sardinen (vor der enzymatischen Reaktion), worin η das Peak von Methylguanidin ist.

F i g. 6B ist das Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einem Heißwasserextrakt von geräucherten Sardinen (nach der enzymatischen Reaktion).

F i g. 7A ist das Flüssigchromatogramm des Serums eines urämischen Patienten (vor der en/.ymatischen

Reaction), worin η das Pe&k von Metuyiguanidin ist,

F i g, 7B ist das Flüssigcbr&matogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einem Serum eines urämischen Patienten (nach der enzymatischen Reaktion),
Nachfolgend werden die physikalischen und chemi-

erfindungsgemäßes Enzym sehen Eigenschaften des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäß der Erfindung beschrieben,

(1) Wirkung

Dieses Enzym zersetzt Methylguanidjn in Methylamin und Harnstoff

NH₂-C-NH-CH₃

NH

CH₃—NH₂ + H₂N—CO—NH₂

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(2) Substratspezifität

Das Enzym zeigt keine Wirkung gegenüber Guanidinessigsäure (Glycozyamin) und Guanidinobernsteinsäure.

(3) Optimaler pH-Bereich und stabiler pH-Bereich ^m

Wie in Fig. 1 gezeigt wird, beträgt der optimale pH-Bereich 10,9 bis 123 und der stabile pH-Bireich 5,0 bis 10,6 bei der Umsetzung mit Methylguanidinsulfat als Substrat bei 30⁰C während 10 Minuten, wobei die folgenden Pufferlösungen in den folgenden pH-Bereichen verwendet wurden: pH 6,0 bis 7,0: 0,1m Zitronensäure-Pufferlösung; pH 7,0 bis 9,0: 0,1m Veronal-Pufferlösung; pH 9,0 bis 11,0:0,1m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung; pH 11,0 bis 134:0,1m Natriumcarbonat-Natriumhydroxid-Pufferlösung.

(4) Verfahren zum Messen der enzymaüschen Aktivität

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Eine Substratlösung mit einer Konzentration an Methylguanidinsulfat von 100μ§/πι1 wird hergestellt, indem man Methylguanidinsulfat in einer 0,05m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 11,0) löst Man läßt 0,8 ml der Substratlösung mit 0,2 ml der Enzymlö^ung 10 Minuten bei 30°C reagieren und dann wird die Umsetzung durch Zugabe von 1 ml O,4m-Lösung Trichloressigsäure abgebrochen. Hat sich ein Niederschlag gebildet, so wird der Niederschlag durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt Man «5 erhält so eine enzymatische ReaktionsflOssigkeit

Eine Kontrolle wird hergestellt, indem man die vorgenannte Verfahrensweise wiederholt mit der Ausnahme, daß man anstelle der 0,2 ml einer Enzymlösung 0,2 ml einer 0,05m Natriumcarbonat-Natriumbicar- bonat-Pufferlösung (pH 1 ί,0) verwendet

Dann werden jeweils 50 μΐ der enzymatischen Reaktionsfhissigkeit oder der Kontrolle mit 14 ml einer 0,1 mmol Lösung von Phenanthrachinon in Dimethylformamid und 0,25 ml einer 1 M wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid vermischt und bei Raumtemperatur 40 bis 50 Minuten umgesetzt und dann gibt man 0,25 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure und 24 ml Wasser zu. Nachfolgend werden die relativen Fluoreszenzintensitäten der erhaltenen Reaktionsmischungen mit einem Fluorofotometer bei einer Anregungswellenlänge von 310 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 390 nm gemessen. Die Abnahme des Methylguanidingehaltes wird aus dem Unterschied der Fluoreszenzintensitäten

zwischen den einzelnen Reaktionsmischungen der 65

enzymatischen Reaktion und dem Kontrollversuch berechnet. HgCl₂

Bei der Bestimmung cat Aktivität wird eine Menge J₂

des Enzyms, die ausreicht um 1 μπιοί Methylguanidin pro Minute bei 30⁰C zu zersetzen, als eine Einheit bezeichnet

(5) Optimaler Wirkungstemperaturbereich

Läßt man dieses Enzym 10 Minuten bei pH 10 einwirken, so liegt die optimale Wirkungstemperatur im Bereich von 20 bis 75° C Die geeignetsis Temperatur ist der Temperaturbereich zwischen 55° undtjO" C.

(6) Inaktivierungs-pH und Temperaturbedingungen

(i) Inaktivierungs-pH-Bedingungen:

Dieses Enzym wird vollständig unterhalb pH 3 und oberhalb pH 13 inaktiviert

(ii) Inaktivierungstemperaturbedingungen:

Beim pH 10 wird das Enzym durch eine 30minütige bei 6O⁰C durchgeführte Wärmebehandlung vollständig inaktiviert

(7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung (i) Inhibierung:

a) Zugabe von Mercurichlorid oder Silbernitrat

Die Restaktivität des Enzyms nach einer Behandlung bei 30⁰C bei pH 10 während 60 Minuten in Gegenwart von 1 mmol HgCl₂ oder AgNO₃ wird in Tabelle 1 gezeigt wobei die Aktivität in Abwesenheit eines Inhibitors mit 100 angesetzt wird.

b) Zugabe von Kaliumcyanamid, Äthylendiamiiitetraessigsäure, Jod, Dithiothreitol oder 2-Mercaptoäthanol.

Die Restaktivität des Enzyms nach einer 6stündigen Behandlung bei 30° C und pH 9 in Gegenwart von 50 mmol KCN, die Restaktivität des Enzyms nach einer 4stündigen Behandlung bei 40° C bei pH 10 in Gegenwart von 100 mmol Äthylendiamintetraessigsäure, die Restaktivität des Enzyms nach einer Behandlung bei 40" C bei pH 7 während 1 Stunde in Gegenwart von 1 mmol J₂ und die Restaktivität des Enzyms nach einer 1 stündigen Behandlung bei 3O⁰C bei pH 9 in Gegenwart von 1 mmol Dithiothreitol oder 2-Mercaptoäthanol wird in Tabelle 1 gezeigt, wobei die Aktivität des Enzyms in Abwesenheit des Inhibitors mit 100 angesetzt wird.

Tabelle 1 Zugegebener Inhibitor

Konzentration an Inhibitor

(mmol)

Restpktivität

des Enzyms

Fortsetzung

Zugegebener Inhibitor

Konzentration
an Inhibitor

(mmol)

Reslaktivität des Enzyms

Dithiothreitol	1	0
2-Mercaptoäthanol	1	0
KCN	50	0
Äthylendiamin-	100	0
tetraessigsäure
AgNO3	1	1

Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, wird das Enzym merklich durch HgCb. I;. Dithiothreitol, 2-Mercaptoäthanol. KCN, Äthylendiamintetraessigsäure und AgNO j inhibiert.

(ii) Aktivierung:

Es wurde kein das Enzym in besonderer Weise

aktivierendes Reagenz, gefunden,
(iii) Stabilisierung:

Das Enzym wird durch Zugabe von 10% (V/W) Glyzerin stabilisiert.

(8) Reinigungsverfahren

Feuchte Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren der Kulturmischung gesammelt. Nach dem Suspendieren der Bakterienzellen in 0,05m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) werden die Zellen durch Ultrasehalliinterkühlung mit Eiswasser zerstört. Dann wird der Niederschlag durch Zentrifugieren gewonnen und die überstehende Flüssigkeit (rohe Enzymlösung) wird gesammelt.

Nach dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise, wobei sich ein Niederschlag bei einer 55%igen Sättigung bildet, wird durch Zentrifugieren die Abtrennung vorgenommen. Der Niederschlag wird in einer geringen Menge 0,01m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (pH 8.0) gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Durchleiten über eine Säule von Sephadex G-200, die zuvor mit einer 0,1m Lösung Kaliumchlorid (KCI) in 0,01m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht eingestellt wurde, einer Gelfiltrationschromatografie unterworfen.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird über eine Säule einer zuvor mit der vorerwähnten 0,01m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, enthaltend KCI, ins Gleichgewicht gebrachte Säule von DEAE-Sephacel gegeben und dann wird sie einer lonenaustauschchromatografie unterworfen und zwar zuerst (bis das Volumen des Eluats 120 ml erreicht) mit der vorerwähnten, KCI enthaltenden, 0,1m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, und dann durch Konzentrationsgradienteneluierung unter Verwendung von 0,2 bis 0,4m KCl.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird auf eine mit Hydroxyappatit gefüllte Säule gegeber. Bis zu einem Eluierungsvolumen von 200 ml eluiert man mit der vorerwähnten 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, enthaltend KCl. Anschließend eluiert man stufenweise mit einer Phosphatpufferlösung (pH 8,0), deren Konzentration stufenweise von 0,001m bis 0,005m, 0.01m, 0,03m, 0,05m üüd 0,07rn erhöht wird. Schließlich eluiert man mit einer 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 8,0) und sammelt die aktive Fraktion des Enzyms.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird gegen entionisiertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, wobei man ein gereinigtes Enzympulver erhält.

Eine elektrophorctische Messung unter Verwendung von Polyacrylamidgel bestätigt, daß das gereinigte Enzym elektrophoretisch einheitlich ist.

(9) Molekulargewicht

Das Enzym hat ein Molekulargewicht von etwa 225 000 + 9000. gemessen nach der Methode von Hedrick and SmiH> (j. L. Hedrick and A. J. Smith: Archives of Biochemistry and Biophysics. 126. 155—164 (1968)).

Bisher gab es kein Enzym, das in der Lage war, Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff zu zersetzen. Daher ist das Methylguanidinzersetzendr; Enzym gemäß der Erfindung ein neues Enzym. Werden Mcihyigiinnidin enthaltende Getränke und Nahrungsmittel, die eine schädliche Wirkung auf den menschlichen Körper ausüben, mit diesem Enzym behandelt, so kann das Methylguanidin leicht in harmlose Substanzen zersetzt und entfernt werden und dadurch kann die Sicherheit von Getränken und Nahrungsmitteln durch diese Enzymbehandlung in erheblichem Maße erhöht werden. Darüber hinaus ist es möglich, mittels dieses Enzyms neue Anwendungen zu entwickeln, wie ein Reager,-: zur Behandlung von Urämie oder als biochemisches Mittel. Die Erfindung ist deshalb wirtschaftlich und technisch von erheblichem Interesse. Nachfolgend wird die Entfernung von Methylguanidin aus Methylguanidin enthaltenden Proben beschrieben.

Als zu umirsuchende. Methylguanidin enthaltende Probe kann jede Substanz verwendet werden, die Methylguanidin enthält. Beispiele hierfür sind Extrakte von Hühner-, Rinder-, Walfisch-, Schweine- und Fischfleisch und dergleichen. Nahrungsmittel wie geräucherte Sardinen, geräucherte Makrelen, geräucherter Hering, und das Blut von urämischen Patienten.

Von den vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden

Substanzen werden Fleischextrakte entweder direkt oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit einem Lösungsmittel, wie es bei der Lebensmittelverarbeitung verwendet wird, z. B. Wasser, Alkohol, Wasser-Alkohol-Mischungen, Emulsionen, Würzlösungen behandelt. Geräucherte Fische werden z. B. in Form von Extrakten behandelt, die man erhält, indem man geräucherte Fische entweder direkt oder nach Pulveriso sieren oder Zerkleinern in üblichen Pulverisierungsvorrichtungen oder Zerkleinerungsvorrichtungen, t td falls erforderlich nach Homogenisieren in üblichen Homogenisatoren und dergleichen, mit kaltem Wasser, warmem Wasser oder dergleichen extrahiert

Blut wird entweder so wie es ist oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit einer physiologischen Kochsalzlösung verwendet

Der pH der vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen muß nicht eingestellt werden. Zweckmäßig wird er jedoch auf 5 bis 12 und insbesondere 6 bis 10 im Falle der vorerwähnten Fleischextrakte oder Nahrungsmittel, wie geräucherte Fische, und auf 7,2 bis 7,6 und insbesondere etwa 7,4 im Falle von Blut durch geeignete pH-anpassende Reagentien, wie Chlorwas-

&5 serstoffsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt

Bei der Behandlung der vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen wird die Menge des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms in geeigneter

Weise eingestellt unter Berücksichtigung des Methylguanidingehaltes in der Methylguanidin enthaltenden Substanz und der Umsetzungsbedingungen.

Die Temperatur, bei welcher eine Methylguanidin enthaltende Substanz durch Methylguanidin-zersetzendes Enzym zersetzt wird, beträgt 80°C oder weniger und zweckmäßig 20 bis 6O⁰C im Falle von Fleischextrakt oder Nahrungsmitteln, wie geräucherten Fischen, und sit beträgt 50⁰C oder weniger, und zweckmäßig 35 bis 40" C im Falle von Blut. Bei diesen Temperaturen läßt man die Methylguanidin enthaltenden Substanzen stehen oder rührt eine ausreichende Zeit, während der sie einer enzymatischen Reaktion unterliegen und harmlose enzymatische Zersetzungsprodukte ergeben.

Nach der Zersetzung von Methylguanidin und Entfernung aus einer Methylguanidin enthaltenden Substanz ist es. sofern erforderlich, zulässig, das Enzym durch abschließende Maßnahmen, wie Erhitzen, Abtrennen iirlpr Fntfprnpn 711 inaktiviprrn und dann dpn nH dp* Produktes mit Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid oder dergleichen auf einen geeigneten Wert einzustellen.

Schließlich wird das bei der enzymatischen Reaktion verwendete Lösungsmittel in üblicher Weise abgetrennt und entfernt, sofern dies erforderlich ist.

Wie gezeigt, kann Methylguanidin vollständig aus Methylguanidin enthaltenden Nahrungsmitteln abgetrennt und entfernt werden und dadurch kann die Sicherheit des Nahrungsmittels in erheblichem Maße erhöht werden. Weiterhin ist es auch möglich, das im BIu' von urämischen Patienten enthaltene Methylguanidin, das auf den menschlichen Körper einen schädlichen Einfluß ausübt, zu zersetzen und es vollständig aus dem Blut zu entfernen.

Nachfolgend wird ein Verfahren zur quantitativen Analyse von in einer Probe enthaltendem Methylguanidin durch Umsetzung des vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Enzyms mit der auf Methylguanidin zu analysierenden Probe und Messen der durch diese Umsetzung gebildeten Menge an Methylamin oder Harnstoff gezeigt.

Die Substanz, die quantitativ auf Methylguanidin untersucht werden soll, kann jede der vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen sein.

Beim Analysieren von Methylguanidin in geräucherten Fischen verwendet man z. B. einen Extrakt, der erhältlich ist. indem man die geräucherten Fische mit kaltem Wasser, heißem Wasser und dergleichen entweder direkt extrahiert oder nachdem man sie pulverisiert oder zerkleinert hat mittels eines Pulverisators oder eines Zerkleinerungsgerätes mit anschließendem, sofern erforderlich, Homogenisieren mittels eines Homogenisators und dergleichen.

Der pH der vorerwähnten Proben muß nicht eingestellt werden. Zweckmäßig wird er jedoch auf pH 5 bis 12 und insbesondere pH 9 bis 11 durch geeignete pH-anpassende Mittel, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid eingestellt

Die vorerwähnten Proben werden für die quantitative Analyse entweder direkt oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit Wasser, einer Pufferlösung und dergleichen verwendet

Dann läßt man das Methylguanidin-zersetzende Enzym mit der wie vorher angegeben vorbereiteten Probe zur Zersetzung von Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff reagieren.

Läßt man eine auf Methylguanidin zu analysierende Probe mit Methylguanidin-zerset/endem Enzym reagieren, so wird die Menge des zugegebenen Enzyms entsprechend variiert unter Berücksichtigung des Methylguanidingehaltes der auf Methylguanidin zu analysierenden Probe und der Umsetzungsbedingungen.

Anschließend kann man den Gehalt an Methylamin oder Harnstoff in dem enzymatischen Zersetzungsprodukt der vorerwähnten Verfahrensweise bestimmen.

Enthält eine mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym umzusetzende Probe schon vorher Methylamin, Harnstoff oder analoge Produkte, so wird der Anfangsgehalt, der vorher gemessen wurde, von dem Gehalt an Methylamin oder Harnstoff, der nach der vorerwänten enzymatischen Zersetzungsreaktion gemessen wurde, abgezogen.

Zur Bestimmung von Methylamin können hierzu geeigneten Verfahren angewendet werden. Dazu gehören beispielsweise (1) ein Verfahren, bei dem man Methylamin nvt einer alkalischen, wäßrigen Lösung von T. N. B. S. (Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat) umsetzt und colorimetrisch bei 420 nm bestimmt (T. N. B. S. Verfahren von T. Okuyama et al: J. Biochem. 47, 454 (I960), (2) ein Verfahren, bei dem man Methylamin mit Ninhydrinreagenz in einer Zitronensäure-Pufferlösung (pH 5) bei erhöhter Temperatur umsetzt und dann bei 570 nm colorimetrisch bestimmt (E. Yemm et al: Analyst, 80, 209 (1955); und (3) ein Verfahren, bei dem man ein primäres Amin mit o-Phthalaldehyd umsetzt und die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 455 nm bestimmt (M. Roth; Anal. Chem. 43, 880(197I)).

Zur Bestimmung von Harnstoff kann man alle hierfür geeigneten Verfahren anwenden. Dazu gehören beispielsweise (1) ein Verfahren, bei dem Harnstoff mit Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt wird, worauf man dann den Ammoniak durch die Berthelot-Reaktion (Indopheno-Reaktion) colorimetrisch bestimmt (Urease-Indophenol-Methode (R. L Searcy und F. M. Cor: Clin. Chem. Acta, 8, 810 (!963)); (2) das Verfahren, bei dem man Harnstoff mit Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt und dann den Ammoniak colorimetrisch mit Nessler-Reagenz (Urease-Nessler-Methode) bestimmt (M. Saito, T. Uchida, E. Suzuki: Rinsho Kensa, 8, 878 (1964)); und (3) ein Verfahren, bei dem man Harnstoff in Gegenwart von Diacetylmonoxim in einer sauren Lösung unter Ausbildung einer gelben Farbe erhitzt und dann die gelbe Farbe colorimetrisch bestimmt (Fearon-Methode) (W. R. Fearon: Biochem. J. 33,902(1939)).

Als nächstes ist es erforderlich, die Beziehung zwischen der Menge an Methylamin oder Harnstoff und dem O. D.-Wert zu bestimmen und eine Kalibrierungskurve auf Basis dieser Beziehung herzustellen. Daher wurden die folgenden Versuche zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin in Proben und dem O. D.-Wert durchgeführt

Versuchsbeispiel 1

Bestimmung von Harnstoff
nach der Urease-Indophenol-Methode

I. Herstellung des Reagens
(1) Methylguanidin-zersetzende Enzymlösung

21 eines Mediums (pH 7,2) aus 1,0% (WAO Glyzerin, 0,2% (WAQ Methylguanidinsulfat, 0,1% (WAQ Dinatri-

umphosphat, 0,1% (W/V) Magnesiumsulfat, 0,05% (W/V) Hefeextrakt, 0,01% (W/V) Eisen(ll)sulfat, 0,01% (W/V) Manganchlorid und Wasser wurden in einem Kultivierungsgefäß eines kleinen Fermentationsgefäßes eingefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Das Medium wurde mit 20 ml einer Keimkultur von Alcaligenes N-243 ATCC 31370), das zuvor 48 Stunden in einem Medi :m (pH 7,2) der gleichen Zusammensetzung wie oben kultiviert worden war, inokuliert. Dann wurde es einer belüfteten Tauchkultur während 48 Stunden bei 30"C unterworfen.

Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert, wobei man 17 g feuchte Bakterienzellen erhielt; diese Zellen wurden in 50 ml einer 0,05m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und dann durch einen Ultraschallzerkleinerer 10 Minuten unter Eiskühlung zerstört.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und 48 ml einer überstehenden Flüssigkeit (rohe Enzymlösung) (Enzymaktivität: 43,3 Einheiten/ml) wurden gewonnen.

Die rohe Enzymlösung wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen. Die erhaltene Niederschlagsfraktion wurde in 25 ml Wasser gelöst und gegen 0,05m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) dialysiert, wobei man eine Methylguanidin-zersetzende Enzymlösung (Enzymaktivität: 60.5 Einheiten/ml) erhielt.

(2) Reagens A (Urease-Pufferlösung)

40 mg Urease und 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz (EDTA-2Na) wurden in 20 ml einer 50 mmol Phosphatpufferlösung (pH 6.5) gelöst.

(3) Reagens B (Phenol-Reagens)

5,0 g Phenol und 25 mg Natriumnitroprussid wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 500 ml eingestellt.

(4) Reagens C (Alkaii-hypochlorid-Reagens)

2,5 g Natriumhydroxid und 2.5 ml einer Natrium-hypochloridlösung mit einer effektiven Chlorkonzentration von 5%. wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 500 ml eingestellt.

II. Bestimmung des aus Methylguanidin
gebildeten Harnstoffs

Methylguanidinsulfat wurde in 0.05m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) in einer solchen Menge gelöst, daß die Konzentration an Methylguanidin 0, 0,01. 0,02. 0,04, 0.06. 0.08 bzw. 0,10 Mikromol betrug. Jeweils 90 μΙ der so erhaltenen Lösung wurden gründlich mit 10 μΐ des vorerwähnten Methylguanidin-zersetzenden Enzyms vermischt und die Mischung wurde 30 Minuten bei 37° C stehen und reagieren gelassen.

Dann wurden lOO μΐ einer 02m Phosphatpufferlösung und 200 μΐ des Reagens A zu dem so erhaltenen enzymatischen Reaktionsprodukt gegeben. Die entstehende Mischung wurde gründlich gerührt und dann unter Stehenlassen bei 37° C während 20 Minuten umgesetzt.

Zu dem Reaktionsprodukt wurden 5 ml Reagens B und 5 ml Reagens C gegeben. Die Mischung wurde unmittelbar darauf kräftig gerührt und dann 15 Minuten bei 37° C stehen gelassen und dann wurde die Farbe mit einem Colorimeter bei 625 nm bestimmt

Die Blindprobe wurde bewertet, indem man das vorerwähnte Verfahren wiederholte, mit der Ausnahme, daß 10 μΙ der vorerwähnten Methylguanidin-zersetzenden Enzymlösung in einem siedenden Wasserbad bei 100°C 5 Minuten lang behandelt wurde und darauf zu

: 90 μΙ einer 0,05m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) gegeben wurde und die erhaltene Mischung wurde gründlich gerührt und 30 Minuten bei 37°C unter Stehenlassen umgesetzt.

Der Wert der Blindprobe wurde von den O. D.-Wer-

ίο ten bei allen Mischungen abgezogen. Die Beziehung zwischen den O. D.-Werten nach dem Abziehen der Menge von Methylguanidin wird in F i g. 2 gezeigt. Fig. 2 zeigt deutlich, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und dem

O. D.-Wert nach dem Abzug vorliegt, so daß man diese Beziehung befriedigend als Standard-Eichkurve verwenden kann.

Versuchsbeispiel 2

Bestimmung von Methylamin
nach der T. N. B. S.-Methode

Methylguanidinsulfat wurde in 0,1m Natriumcarbonat-Bicarbonat-Pufferlösung (pH 10.0) gclös!. so daß die Menge an Methylguanidisulfat 0,0.01.0.02. 0.05,0,1,0.15. 0,2, 0,25 bzw. 0.3 Mikromol betrug. Jeweils 900 μΙ der so erhaltenen Lösung wurden gleichmäßig mit 100 μΙ der gleichen in Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Enzymlösung vermischt. Die erhaltene Mischung wurde 30

jo Minuten bei 37"C unter Stehenlassen umgesetzt.

Zu dem so erhaltenen enzymatischen Reaktionsprodukt wurden 2 ml einer 0.1m Borax-Natriumhydroxid-Pufferlösung (pH 9.6) zum Abbrechen der enzymatischen Reaktion gegeben. Dann wurde 1 ml einer 0,4%igen wäßrigen Lösung von T. N. B. S. zugegeben und die erhaltene Mischung wurde gründlich gerührt und dann genau 23 Minuten bei 37° C umgesetzt und dann wurde die Farbe colorimetrisch bei 420 nm bestimmt.

•ίο Diese Farbbildungsreaktion wurde mit einem automatischen Analysator durchgeführt.

Die Blindprobe wurde gemessen, inden man das vorerwähnte Verfahren wiederholte mit der Ausnahme, daß 100 μΙ der gleichen Methylguanidin-zersetzenden Enzymlösung wie in Beispiel 1 5 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100°C behandelt wurde und dann gleichmäßig mit 900ul einer 0.1m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) vermischt wurde, worauf die Mischung dann 30 Minuten bei 37° C unter Stehenlassen umgesetzt wurde.

Der Wert für die Blindprobe wurde vom O. D.-Wert der jeweiligen Mischung abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O. D.-Wert nach dem Abzug und der Menge von Methylguanidin wird in Fig.3 gezeigt.

Fig.3 zeigt deutlich, daß eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und dem O. D.-Wert nach dem Abzug besteht, so daß man diese Beziehung befriedigend als Standard-Eichkurve verwenden kann.

Wenn der in der vorerwähnten Weise bestimmte O. D.-Wert für Methylguanidin oder der O. D.-Wert für Harnstoff in eine Standard-Eichkurve eingesetzt wird, die auf Methylamin beruht oder in eine Standard-Eichkurve, die auf Harnstoff beruht kann man die Menge an Methylguanidin in der Probe bestimmen.

Die Erfindung ist wirtschaftlich und technisch sehr wertvoll, weil man gegenüber bekannten Verfahren ein sehr einfaches Verfahren hat und weil die Zeit die zur

Messung einer Probe erforderlich ist, gegenüber dem Stand der Technik erheblich verkürzt wird. Die Verfahrensweise ist vorteilhaft, weil sie sehr empfindlich ist und weil man eine große Anzahl von Proben gleichzeitig untersuchen kann.

Nachfolgend wird ein konkretes Verfahren zur Herstellung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäß der Erfindung beschrieben.

Als Bakterien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, kommen alle Bakterien in Frage, die zum Genus Alcaligenes gehören und die Fähigkeit haben, ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden. Auch Varianten- oder Mutantanstämme dieser Bakterien können verwendet werden. Beispiele für Bakterien vom Genus Alcaligenes mit der Fähigkeit ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden, sind Alcaligenes ATCC 31369 und Alcaligenes ATCC 31370.

Alcaligenes ATCC 31369 und Alcaligenes ATCC 31370 sind Bakterien, die von den Erfindern neu aus Bodenproben isoliert wurueii. ihre bäkieriöiügiscricn Figenschaften werden nachfolgend beschrieben. Die meisten der bakteriologischen Eigenschaften sind gemessen worden aufgrund der im Manual of Microbiological Methods (1959, McGraw-Hill Book Co.) beschriebenen Methoden.

Bakteriologische Eigenschaften
von Alcaligenes ATCC 31369

(a) Morphologie

Mikroskopische Untersuchung (kultiviert in einem Boullion-Agarmedium während 48 Stunden bei 30⁰C):

1. Form und Größe der Zellen: kurze Stäbchen mit einer Größe von 1 — 2 χ 0,5 μίτι.

2. Polymorphisms der Zelle: Es wird kein Polymorpnismus festgestellt.

3. Motilität: Beweglich mittels einer oder mehrerer peritrizioser Geiseln.

4. Sporen: keine Sporenbildung

5. Gramfärbung: negativ

6. Säureresistenz: negativ

(b) Wachstum in verschiedenen Medien

1. Boullion-Agar-Plattenkultur: Kreisförmige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm werden bei 48stündiger Kultivierung bei 30⁰C gebildet. Die Oberfläche ist flach und hat konvexe runde hervorstehende Stellen. Die Peripherie ist rund. Die Kolonien erscheinen gelblich glänzend.

2. Boullion-Agar-Schrägkultur: Zeigt ein fadenförmiges mittleres Wachstum bei 48stündiger Kultivierung bei 3O⁰C. Die Oberfläche ist flach und gelblich glänzend.

3. Boullion-Tauchkultur: Beim 48stündigen Stehen der Kultur bei 3O⁰C wird eine geringe Trübung mit Sedimenten gebildet

4. Boullion-Gelatine-Stichkultur: Bei 42tägigem Stehen bei 20⁰C wächst es etwa 1 cm von der Oberfläche des Mediums ohne Verflüssigung von Gelatine.

5. Lakmus-Milchkultur: Bei 14tägigem Stehen bei 30⁰C wird das Medium etwas alkalisch ohne Koagulierung der Lakinus-Milch.

(c) Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nitraten: beobachtet
Z Denitrifizierungsreaktion: geringfügig

3. MR-Test: negativ

4. VP-Test: negativ

5. Bildung von Indol: nicht beobachtet

6. Rildung von Was« r.loffiulfii!· nicht beobachtet
7. Hydrolyse von Stärke: nicht beobachtet

8. Verwendung von Zitronensäure; beobachtet (Anwendung des Christensen-Mediums)

9. Anorganische Stickstoffquellen: verwendet (Nitra- ;e, Ammoniumsalze)

ίο 10. Bildung von Pigmenten: nicht beobachtet

11. Urease: positiv

12. Katalase: negativ

13. Bereich der Wachstumsbedingungen:
Temperatur: 15—40⁰C

pH:6-10

14. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

15. O-F-Test(Hugh Leifson-Methode): negativ

16. Verwendung von Kohlenstoffquellen: Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Xylose. D-Glucose,

in D Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose. D-Sorbit, D-Mannit. Inosit, Glyzerin, Stärke und dergleichen werden verbraucht. Es bildet sich weder eine Säure noch ein Gas.

Alcaligenes ATCC 31369 ist bei American Type Culture Collection als ATCC 31369 hinterlegt worden.

Bakteriologische Eigenschaften

von Alcaligenes ATCC 31370

(a) Morphologie

Mikroskopbeobachtung (kultiviert in einem Boullion-Agarmedium bei 30^s C während 48 Stunden)

1. Form und Größe der Zellen: kurze Stäbchen mit einer Größe von 1 —2 χ 0,5 mm

2. Polymorphisms der Zelle: Kein Polymorphismus beobachtet.

3. Motilität: Beweglich mittels einer oder mehrerer peritrizioser Geiseln.

4. Sporen: keine Sporenbildung
5. Gramfärbung: negativ

6. Säureresisienz: negativ

(b) Wachstum in verschiedenen Medien

1. Boullion-Agar-Plattenkultur: Beim 48stündigem Kultivieren bei 30°C bilden sich kreisförmige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm. Die Oberfläche ist flach und hat konvexe runde hervorstehende Stellen. Die Peripherie ist kreisförmig. Alle Kolonien haben einen gelblichen Glanz.
2. Boullion-Agar-Schrägkultur: Beim 48stündigen Kultivieren bei 30⁰C erfolgt fadenförmiges Wachstum. Die Oberfläche ist flach mit einem gelblichen Glanz.

3. Boullion-Tauchkultur: Bei einer bei 30⁰C während 48 Stunden stehenden Kultur bildet sich eine schwache Trübung mit Sedimenten.

4. Boullion-Gelatine-Stichkultur: Bei 42stündigem Stehen bei 20⁰C findet ein Wachstum bis zu etwa 1 cm von der Oberfläche des Mediums statt ohne Verflüssigung von Gelatine.

5. Lakmus-Milch-Kultur: Beim 14tägigen Stehen bei 30⁰C wird das Medium etwas alkalisch ohne

koagulieren.

(c) Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nitraten: beobachtet

2. Denitrifizierungsreaktion: etwas beobachtet

3. MR-Test: negativ

4. VP-Test: negativ

5. Bildung von Indol: nicht beobachtet

6. Bildung von Wasserstoffsulfid: nicht beobachtet

7. Stärkehydrolyse: nicht beobachtet

8. Verwendung von Zitronensäure: beobachtet (Christensen-Medium wurde verwendet)

9. Anorganische Stickstoffquellen: verwendet (Nitrate und Ammoniumsalze)

10. Bildung von Pigmenten: nicht beobachtet

11. Urease: positiv

12. Katalase: negativ

13. Bereich der Wachstumsbedingungen: Temperatur: 15—40⁰C

pH: 6,5-9.0

14. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

15. O-F-Test (Hugh Leifson-Methode): negativ

16. Verwendung von Kohlenstoffquellen: Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Xylose, D-GIncose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit. Inosit, Glyzerin, Stärke und dergleichen werden verwendet Es bildet sich dabei weder Säure noch ein Gas.

Alcaligenes ATCC 31370 ist bei American Type Culture Collection als ATCC 31370 hinterlegt worden. - Vergleicht man die vorerwähnten charakteristischen bakteriologischen Eigenschaften von Alcaligenes ATCC 31369 und Alcaligenes ATCC 31370 mit der Klassifizierung gemäß Berge/s Mannual of Determination Bacteriology, 7. Ausgabe (1957) und 8. Ausgabe (1974), so kann man feststellen, daß diese beiden Bakterien zum Genus Alcaligenes gehören, weil sie hinsichtlich der Gramfärbung negativ sind, mittels peritriziöser Geiseln beweglich sind, Lakmus-Milch etwas alkalisch machen und kurze aerobe Bazillen sind.

Weiterhin werden diese beiden Bakterietmämme als analog zu Alcaligenes faecalis angesehen, weil sie Nitrate und Ammoniumsalze als einzige anorganische Stickstoffquellen verwenden, während sie keine Indole bilden und weil sie verschiedene Kohlenstoffquellen ohne Bildung von Säuren oder Gasen verwenden. Jedoch sind diese beiden Bakterienstämme unterschiedlich von Alcaligenes faecalis darin, daß sie Urease bilden und daß sie Harnstoff hydrolysieren. Sie sind deshalb neue Stämme und gehören zum Genus Alcaligenes.

Bei der Herstellung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms unter Verwendung der beiden genannten Stämme können übliche Pestkulturen angewendet werden, Besser ist es jedoch, Flüssigkulturen anzuwenden.

Als Kulturmedien können solche verwendet werden, wie sie zur Kultivierung von Bakterien vom Genus Alcaligenes verwendet werden. Ein gutes Medium erhält man z. B, indem man wenigstens eine Art eines anorganischen Salzes, wie Mangansulfat, Manganchlo= rid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(ll)sulfat. Eisen(III)sulfat, Eisen(Il)chlorid, Eisen(III)chlorid, Phosphate und dergleichen zu wenigstens einer Art einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Pepton. Fleischextrakt, Maismeische, Sojabohnenmeische, Weizenkleie, Ammoniumsulfat oder Aminiumnitrat und erforderlichenfalls eine geeignete

Kohlenstoffquelle, zugibt

Gibt man das Hydrochlorid oder Sulfat von Methylguanjdin zu dem vorerwähnten Kulturmedium in einer Menge von etwa 0,01% (G/V) oder mehr und besser von 0,1 bis 1,0% (G/V), bezogen auf die Gesamtmenge des Mediums, so kann die Ausbeute an Methylguanidin-zersetzendem Enzym erheblich erhöht werden.

Der Anfangs-pH-Wert des Mediums wird auf 6,5 bis

ίο 9,0 eingestellt Die Temperatur bei der Kultivierung beträgt 25 bis 37°C und am besten etwa 30⁰C Die Dauer der Kultivierung beträgt 10 Stunden oder mehr. Zweckmäßig wird die Kultivierung aerob in einem flüssigen Medium, beispielsweise unter Anwendung

einer belüfteten Tauchkultur oder Schüttelkultur, durchgeführt

Nach Beendigung der Kultivierung wird das Methylguanidin-zersetzende Enzym aus dem Kulturmedium gesammelt und hierfür kann man übliche Verfahren zum

Sammeln von Enzymen anwenden.

Da das erfindungsgemäße Enzym ein solches ist, das hauptsächlich in den Bakterienzdlen vorkömmt, ist es normal, die Bakterienzellen aus dem Kulturmedium durch Filtrieren, Zentrifugieren und dergleichen abzu-

trennen und dann das Enzym aus den Bakterienzellen zu gewinnen. Obwohl man die Bakterienzellen so wie sie sind verwenden kann, ist es besser sie zu zerstören, oder die Bakterienzellwände durch ein die Zellwände löslich machendes Enzym, wie Lysocynvaufzulösea

Die erwähnten Bakterienzellen oder deren Zerstörungsprodukte oder die Produkte, die man durch Auflösung der Zellwandungen erhält, werden dann mit Wasser, einer Pufferlösung oder einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert Das Extrakt kann so, wie es ist

als rohe Enzymlösung verwendet werden. Sonst wird ein rohes Enzympulver aus dem Extrakt durch eine geeignete Verfahrensweise, wie Gefriertrocknung, Ausfällen mit Alkohol, Ausfällen mit Aceton oder dergleichen hergestellt Um eine gereinigte Zubereitung

des Enzyms aus der vorerwähnten rohen Enzymlösung oder dem rohen Enzympulver zu erhalten, können verschiedene Verfahren angewendet werden, wie Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex oder Biogel, eine Adsorptions-Eluierungs-Methode unter

Verwendung von Ionenaustauschern, elektrophoretische Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamidgel, eine Adsorptions-Eluierungs-Methode unter Verwendung von Hydroxyappatit, eine Sedimentierungsmethode, wie Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifu- gierung, Affinitätschromatografie und Fraktionierungsverfahren unter Verwendung von Molekularsieben, Membranen, Hohlfädenmembranen und dergleichen oder einer Kombination solcher Verfahren, und auf diese Weise erhalt man gereinigte Enzymproben.

Beispiet 1

21 eines Kulturmediums (pH 7,2) aus 1,0% (G/V) Glyzerin, 0,2% (G/V) Methylguanidinsulfat, 0,1% (G/V)

Dinatriumphosphat, 0,1% (G/V) Magnesiumsulfat, 0,05% (QW) Hefeesfrakt, 0,01% (G/V) Eisen(II)sulfat, 0,01% (G/V) Manganchlorid und Wasser wurden in einen gerührten kleinen Fermentator gefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Das Ganze wurde dann mit 20 ml einer Keimbakterienlösung, hergestellt durch Kultivierung von Alcaligenes ATCC 3t370 in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie vorher angegeben (pH 7,2) während 48 Stunde inokuliert und

dann einer belüfteten Tauchkultur bet 30⁰C während 48 Stunden unterworfen.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde abzentrifugiert wobei man 17 g feuchter Bakterienzellen erhielt Diese Zellen wurden in üblicher Weise zerstört und dann zentrifugiert, wobei man 85 ml einer rohen Enzymlösung (Enzymaktivität: 27 Einhshen/ral) als überstehende Flüssigkeit erhielt

Die rohe Enzymlösung wurde in üblicher Weise mit Ammoniumsulfat ausgesalzen. Der bei einer 55%igen Sättigung gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und einer Gelfiltrationschromatografie unterworfen, indem man ihn über eine mit Sephadex G 200 gefüllte Säule gab, die vorher mit einer geringen Menge einer Lösung von HCl (0,1m) in 0,01m Tris-hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird über eine mit DEAE-Sephacel gefüllte Säule, die vorher mit der gleichen Lösung von KCl in Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung wie vorstehend erwähnt ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben und einer Ionenaustauschchromatografie unterworfen unter Verwendung der gleichen KCl-Lösung in Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung wie vorher angegeben, bis die Menge des Eluats 120 ml erreicht hatte und anschließend durch die Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode bei einer Kaliumchloridkonzentration von 0,2 bis 0,4m.

Die so erhaltene aktive Fraktion wurde auf einer mit Hydroxyappatit gefüllten Säule adsorbiert Unter Verwendung einer 03m Lösung von KCI in 0,01m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 20OmI erreichte, einer 0,01m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 350 ml erreichte, einer 0,05m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 500 ml erreichte, einer 0,01m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 650 ml erreichte, einer 0,03m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 840 ml erreichte, einer 0.05m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis es 990 ml erreichte, einer 0,07m Phosphat-Pufferlösung bis es 1120 ml erreichte und einer 0,1m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) wurde anschließend eine aktive Fraktion des Enzyms gewonnen.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man 5 mg des reinen Pulvers des Enzyms (Enzymaktivität: 46 Einheiten/mg) erhielt

Beispiel 2

10 ml eines Kulturmediums (pH 7,2) aus 1,0% (G/V) Glyzerin, 0,4% (G/V) Methylguanidinsulfat, 0,1% (G/V) Dinatriumphosphat, 0,1% (G/V) Magnesiumsulfat 0,05% (G/V) Hefeextrakt 0,0t % (G/V) Eisen(ll)sulfat, 0,01 % (G/V) Manganchlorid und Wasser wurden in ein großes Reagenzglas gegeben und in einem Autoklaven sterilisiert Diese Lösung wurde mit einer Platinspatelspitzmenge Alcaligenes ATCC 31369 aus einer vorhandenen Schragkultur inokuliert und einer Schottelkultur während 72 Stunden bei 30°C in einem Reagenzglasrüttler unterworfen.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde abzentrifugiert und die Bakterienzellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden in 4 ml einer 0,05m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und dann 10 Minuten durch einen Ultraschallzersetzer unter Eiskühlung zerstört. Dann wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei man 3,8 ml einer rohen Enzymlösung (Enzymaktivität; 0,252 Einheiten/ml) ajs überstehende Flüssigkeit erhielt

Beispiel 3

Zersetzungsversuch von Methylguanidin Versuchsverfahren

Die gemäß Beispiel 2 erhaltene rohe Enzymlösung wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen und dann in Wasser gelöst wobei man eine wäßrige Lösung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms (67,2

t ι Einheiten/ml) erhielt

50 μ] dieser wäßrigen Lösung wurden zu 035 ml einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung mit einer Methylgu&rdinsulfat-Konzentration von 834 μg/dl (berechnete Konzen-

jii tration von Methylguanidin: 500μ§Λϋ) gegeben. Die Mischung wurde gründlich gerührt und dann 60 Minuten unter Stehenlassen enzymatisch bei 37° C umgesetzt Die Menge an Methylguanidin vor und nach der enzymatischen Reaktion wurde nach der nachfolgend

ji beschriebenen Verfahrensweise bestimmt Fig.4A zeigt das Flüssigchromatogramm einer Probe vor der enzymatischen Reaktion und Fig.4B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Reaktion. Die zu analysierenden Proben wurden hergestellt

κι indem man 100 μΐ einer 0,6m Perchlorsäure zu 100 μΙ jeder Probe gab, die Mischung mit 8000 Upm während 10 Minuten in üblicher Weise zentrifugierte und dann ΙΟΟμΙ einer 0,5 η Lösung von Natriumhydroxid in 50%tgem Methanol zu 100 μΙ der deproteinisierten

r. überstehenden Flüssigkeit gab.

Die Analyse von Methylguanidin wurde nach der auf Seite 79 der Synopsis des 3. Symposiums über analytische Chemie von biologischen Komponenten (14. Oktober 1977, veröffentlicht von der Japanese Pharma-

ID cological Society) durchgeführt mit der Ausnahme, daß anstelle der 0,15m Acetat-Pufferlösung eine 04 η Natriumhydroxidlösung in 50%igem Methanol verwendet wurde, daß anstelle der 1 η Lösung von Natriumhydroxid in 50%igem Äthanol eine 1 η wäßrige

J^-. Lösung von Natriumhydroxid verwendet wurde und daß die 1 mmo! äthanolische Lösung von 9,10-Phenanthrachinon durch eine 0,2 mmol Lösung von 9,10-Phenanthrachinon in Dimethylformamid ersetzt wurde.

'" Ergebnis der Messung

Wie in dem Flüssigchromatogramm der F i g. 4A und 4B gezeigt wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M bei einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in

.'< der Probe festgestellt die durch Auflösen von Methylguanidinsulfat in 0,1m Tris-Chlorwasserstoffsäurc-Pufferlösung hergestellt worden war, und zwar vor der Umsetzung mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym (Fig.4A), während man kein Methylguanidin-

fo Peak nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe feststellte, nachdem die Umsetzung mit dem Enzym stattgefunden hat (F i g. 4B). Dies zeigt, daß das Methylguanidin zersetzt und vollständig durch Umsetzung mit dem Methylguanidin-

""' zersetzenden Enzym in einer Lösung, die hergestellt wurde durch Auflösen von Methylguanidinsulfat, in einer O₁Im Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung, zersetzt und entfernt werden kann.

, Beispiel 4

¹ Prüfverfahren

, I g Rindfleischextrakt wurde mit Wasser verdünnt und der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 10,0 eingestellt und das Gesamtvolumen wurde auf 10 ml mit Wasser eingestellt

Zu 0,95 ml dieser wäßrigen Lösung von Rindfleischextrakt wurden 50 μΐ einer wäßrigen Lösung von Methylguanidin-zersetzendem Enzym gemäß Beispiel 3 in (67,2 Einheiten/ml) gegeben. Die Mischung wurde gründlich gerührt und dann enzymatisch bei 40⁰C 20 Minuten unter Stehenlassen umgesetzt Die Mengen an Methylguanidin vor und nach der Umsetzung wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren π gemessen. Fig.5A zeigt das Flüssigchromatogramm vor der enzymatischen Umsetzung und Fig.5B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Umsetzung.

' Ergebnis der Messung

Wie in den Flüssigchromatogrammen in den F i g. 5A und 5B gezeigt wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe vor der Umsetzung mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym (F i g. 5A) gefunden, während kein Methylguanidin-Peak nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe nach der Umsetzung mit dem Enzym (Fig.5B) gefunden wurde. Dies zeigt daß man Methylguanidin sn zersetzen und 'Ollständig entfernen kann durch Umsetzung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit Rindfleischextrakt

Beispiel 5 Ji Prüfverfahren

25 g geräucherte Sardinen wurden mit einem üblichen Zerkleinerungsgerät zerkleinert mit 100 ml heißem Wasser von 6O⁰C vermischt und 5 Minuten mit einem Homogenisator homogenisiert Das homogenisierte Produkt wurde unter Rühren 30 Minuten bei 50° C extrahiert und der Extraktionsrückstand wurde abgesaugt wobei man ein Heißwasserextrakt von geräucherten Sardinen (pH 6,1) erhielt.

Dann wurde der Extrakt mit 1 ml einer wäßrigen Lösung des in Beispiel 3 verwendeten Methylguanidinzersetzenden Enzyms vermischt und 18 Stunden bei 5° C unter Stehenlassen enzymatisch umgesetzt Die Msngen an Methylguanidin vor und nach der Umsetzung wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Fig.6A zeigt das Flüssigchromatogramm vor der enzymatischen Umsetzung und F i g. 6B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Umsetzung.

55

Ergebnisse der Messung

Wie aus dem Flüssigchromatogramm der F i g. 6A und 6B ersichtlich wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 on Sekunden in der Probe des Heißwasserextraktes von geräucherten Sardinen gefunden, bevor diese mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym umgesetzt worden waren (Fig. 6A), während kein Methylguanidin nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 ίϊ Sekunden in der Probe nach der Umsetzung mit dem Enzym (Fig.6B) gefunden wurde. Dies zeigt, daß man Methylguanidin durch Umsetzung eines Methylguani din-zersetzenden Enzyms mit einem Heißwasserextrakt von geräucherten Sardinen zersetzen und vollständig entfernen kann.

Beispiel 6 Herstellung von fixiertem Enzym

Die wäßrige Lösung des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Enzyms wurde bei 4°C gegen eine 0,1m Natriumrirbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0), enthaltend 0,5m Natriumchlorid, dialysiert, wobei man eine Enzymlösung mit einer Enzymaktivität von 63,8 Einheiten/ml erhielt Zu 10 ml dieser Lösung wurde 1 g aktivierte CH-Sepharose 4B, angequollen mit 0,001m CMorwasserstof fsäure, gegeben.

Die Mischung wurde bei 20⁰C 2 Stunden unter schwachem Rühren umgesetzt und dabei kombinierte sich das Methylguanidin-zersetzende Enzym mit dem Träger. Das erhaltene Produkt wurde mit der gleichen Pufferlösung wie vorher gewaschen, in einer Im Lösung von Äthanolamin (pH 8,0) suspendiert und 2 Stunden bei 25° C stehen gelassen und dann auf einem Glasfilter filtriert

Das beim Filtrieren gesammelte Produkt wurde mit 0,1m Acetat-Pufferlösung (pH 6,2) gewaschen und anschließend mit einer 0,1m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 7,4), wobei man ein fixiertes Enzym (212 Einheiten/g) erhielt

Prüfverfahren

0,2 g des obigen fixierten Enzyms wurden zu 1 ml Serum eines urämischen Patienten (Methylguanidin-Konzentration 196μg/dl; pH 7,4) gegeben und die Mischung wurde dann enzymatisch bei 37°C während 30 Minuten unter schwachem Rühren umgesetzt Die enzymatische Umsetzung wurde durch Abfiltrieren des fixierten Enzyms abgebrochen.

Die Menge an Methylguanidin vor und nach der enzymatischen Umsetzung wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. F i g. 7A zeigt das Flüssigchromatogramm vor der enzjraiatischen Umsetzung und Fig.7B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Umsetzung.

Ergebnisse der Messung

Aus den Flüssigchromatogrammen von F i g. 7A und 7B wird ersichtlich, daß man ein Methylguanidin-Peak M nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in dem Semm des urämischen Patienten vor dessen Umsetzung mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym findet (F i g. 7A), während kein Methylguanidin-Peak nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe gefunden wurde, die mit dem Enzym umgesetzt worden war (F i g. 7B). Dies zeigt daß man durch Umsetzung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit dem Serum eines urämischen Patienten Methylguanidin zersetzen und vollständig entfernen kann.

Beispiel 7

i g Rindfleischextrakt wurde mit 1 ml einer 1 η Natriumhydroxidlösung vermischt und dazu wurde noch eine 0,05m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) zum vollständigen Auflösen des Rinderextraktes gegeben. Das Gesamtvolumen wurde mit der Pufferlösung auf 10 ml eingestellt.

0,9 ml der so erhaltenen Lösung wurden gründlich mit 100 μΙ der in Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Methyl-

guaniditi-zersetzender, »!»ymlösung vermischt und die erhaltene Mischung wurde unter Stehenlassen 30 Minuten bei 37° C umgesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch gründlich mit 200 μΐ einer 1 η Phosphorsäure und 0,8 ml einer 0,05m Phosphat-Puffer- ί lösung (pH 6,6) vermischt Nach der im Beispiel 1 erwähnten Urease-Indophenol-Methode wurden 200 μΐ Reagens A zu 200 μΐ der vorerwähnten Mischung gegeben und dann wurde diese in der gleichen Weise wie im Versuchsbeispiel 1 beschrieben und behandelt, um den O. D.-Wert zu messen. Der O. D.-Wert wurde mit 0398 bestimmt

Die Blindprobe wurde gemessen, indem man das vorerwähnte Verfahren wiederholte, mit der Ausnahme,

daß ΙΟΟμΙ der Methylguanidin-zersetzenden Ensymlösung verwendet wurden, die vorher 5 Minuten auf einem siedenden Wasserbad mit 100⁰C behandelt worden waren. Der O, D,-Wert der Blindprobe betrug 0,774.

Dann wurde die Menge an Methylguanidin bestimmt, indem man den Rest-O, D,-Wert, erhalten nach Abzug des Blind-O,D,-Wertes von dem gefundenen O.D.Wert, mit der Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäß Vergleichsbeispiel 1, verglich. Dabei wurde festgestellt, daß 200 μΐ des Rindfleischextraktes 0,011 Mikromol Methylguanidin enthielten und daß der Gehalt an Methylguanidin 89,3 μg/l g Rindfleischextrakt betrug.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1, Methylguanidin-zersetzendes Enzym mit der Fähigkeit, Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff zu zersetzen, einem optimalen pH-Bereich von 10,9 bis 12^, einem stabilen pH-Bereich von 5,0 bis 10,6 das vollständig unterhalb einem pH von 3 und oberhalb einem pH 13 inaktiviert wird, das bei einem pH von 10 durch 30min0tige bei 6O⁰C durchgeführte Wärmebehandlung vollständig inaktiviert wird,

   das durch HgCI₂, J₂, Dithiothreitol, 2-Mercaptoäthanol, KCN, Ethylendiamintetraessigsäure und AgNCb is inhibiert wird,

   ein Molekulargewicht von etwa 225 000 ±9000, gemessen nach der Methode von Hedrick and Smith hat und

   dadurch erhältlich ist, daß man Alcaligenes ATCC 31369 oder ATCC 31370 bei 25 bis 37°C während 10 Stunden oder mehr in einem für Bakterien der Gattung Alcaligenes üblichen Kulturmedium kultiviert und aus der Kulturmischung das gebildete Methylguanidin-zersetzende Enzym nach üblichen Verfahren zum Sammeln von Enzymen sammelt

   Z Verfahren zur Herstellung des Methylguanidinzersetzenden Enzyms gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Verfahrensschritte.

   3. Verwendung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäß Anspruch 1 zur Entfernung von Methylguanidin aus Methyi^uanidin-enthaltenden Proben oder zur Entfernung von Methylguanidin aus Methylguanidin-enthaltenden F oben und Messung an bei dieser Umsetzung gebildetem Methylamin oder Harnstoff.