DE69531007T2

DE69531007T2 - Medium zum nachweis von enterococci in einer probe

Info

Publication number: DE69531007T2
Application number: DE69531007T
Authority: DE
Inventors: Chun-Ming Chen; Haoyi Gu
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-10-23
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2015-10-24
Also published as: CA2204120C; ES2201124T3; CA2204120A1; DE69531007D1; WO1996015435A2; US5620865A; WO1996015435A3; AR000061A1; BR9505075A; ATE242476T1; EP0871854B1; EP0871854A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung behält die den Qebieten der Chemie, Biologie und Mikrobiologie und neue Mittel zum Nachweis von Target-Mikroorganismen in einer Probe eines möglicherweise verunreinigten Materials.
Hintergrund
Mikroorganismen sind in biologischen Proben und in für deren Wachstum geeigneten Umweltumgebungen ubiquitär vorhanden. Manche erweisen sich allerdings als schädlich für höhere Organismen, und Mittel zum Nachweis der Anwesenheit derartiger Mikroorganismen sind für den Schutz der öffentlichen Gesundheit von Belang. Zum Nachweis vielfältiger Arten von Mikroorganismen sind viele Mittel erhältlich, die verschiedene Vorteile hinsichtlich der Nachweisgeschwindigkeit und Spezifität aufweisen.
Sämtliche Mikroorganismen benötigen gewisse Voraussetzungen für ihr Wachstum und ihre Reproduktion. Im Allgemeinen ist für das Wachstum von Mikroorganismen folgendes erforderlich: eine Energiequelle, beispielsweise Licht und Kohlenstoffverbindungen; und eine Quelle von Rohstoffen wie Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor sowie Spurenmengen von sonstigen Mineralien. Darüber hinaus benötigen Mikroorganismen eine geeignete Umgebung, in der die Temperatur, der pH-Wert, der Salzgehalt und die Sauerstoffkonzentration auf einem angemessenen Niveau aufrecht erhalten werden.
Bei einem üblichen Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Mikroorganismen wird eine Probe in ein Kulturmedium eingebracht, das sämtliche für ein Wachstum erforderlichen Komponenten enthält. Die Probe kann naturbelassen oder beispielsweise vor dem Einbringen in das Kulturmedium durch Membranfiltration vorbehandelt sein, und es können in dem Medium Chemikalien wie Antimetaboliten oder Antibiotika enthalten oder nicht enthalten sein, die selektiv gegen von dem Targetmikroorganismus abweichende Mikroorganismen wirksam sind. Um störende Einflüsse durch kontaminierende Mikroorganismen auszuschließen, sind diese Kulturmedien bisher gewöhnlich steril, und für den Inkubationsschritt wird in der Regel eine relativ lange Zeit im Bereich von 48 bis 72 Stunden benötigt, um einen sicheren Nachweis von Enterococci zu führen. Wenn dann mittels dieser Verfahren ein Wachstum erfasst ist, muss der Target-Mikroorganismus darüber hinaus durch einen oder mehrere Tests bestätigt werden, die für vielfältige physikalische und biochemische Charakteristiken spezifiziert sind. Diese Verfahren sind daher arbeits- und zeitaufwendig.
Viele Anstrengungen wurden unternommen, um die Nachweisverfahren zu vereinfachen und zu beschleunigen. Dazu zählten Ansätze wie das Erfassen von speziellen Nebenprodukten individueller Bakterien, elektrische Impedanzversuche, ATP-Versuche und Tests auf der Grundlage von mit Kohlenstoff-14 markierten Substraten. Die meisten Verfahren erwiesen sich als nicht besonders effizient. Ferner wurden Indikatoren für das Mikroorganismenwachstum verwendet, die ihre Farbe nur bei einem Wachstum des Mikroorganismus wechseln. Diese reagieren in der Regel chemisch mit einem durch die Targetmikroorganismen erzeugten metabolischen Neben produkt. Es wurden auch Chemikalien verwendet, die die Farbe aufgrund von auf Wachstum zurückzuführende Änderungen des pH-Werts wechseln, beispielsweise Phenolrot, Bromocresolblau und Neutralrot. Beispielsweise verwendet das US Patent 3 206 317 von Golber Phenolrot in Anwesenheit eines säurehaltigen Mediums, das durch bakterielle Abfallprodukte hervorgebracht wird. In dem US Patent 3 496 066 von Berger et al., ist der Einsatz von Verbindungen beschrieben, die von Bakterien in Farbstoffe umgewandelt werden. In der US Patentschrift 4 129 483 von Bochner ist die Verwendung einer biologisch nicht abbaubaren Substanz beschrieben, die reduziert wird, um einen Farbwechsel hervorzurufen. In sämtlichen dieser Verfahren stellt der Indikator eine zusätzliche Substanz dar, die nicht gleichzeitig als Quelle eines benötigten Nährmittels dient.
Edberg beschreibt in der US Patentschrift 4 925 789 die Verwendung eines Nährmittelindikators, der nicht nur als Nährmittelquelle dient, sondern auch seine Farbe ändert, wenn er metabolisiert wird. Das Patent, auf das hier Bezug genommen ist, schafft ein Medium, das einen Nährmittelindikator enthält, der bei Metabolisierung durch ein Target-Bakterium eine Komponente freisetzt, die an dem Medium einen Wechsel der Farbe oder eine sonstige erkennbare Änderung bewirkt. Das Verfahren nutzt eine Enzymspezifität, die für spezielle Arten oder Gruppen von Bakterien eigentümlich ist. Vorgeschlagen wird die Verwendung von Antibiotika, um ein Wachstum für die Target-Mikroorganismen auszuwählen, und schafft spezielle Beispiele für auf Flüssigkeiten basierende Tests. Andere bisher verwendete Verfahren, wie beispielsweise von Kilian et al., in Acta. Path. Microbiol. Scand. Sect, B, Abs. 7 271–276 (1979) und Damare et al., in J. Food Science 50: 1736 (1985) beschreiben die Verwendung von Kulturmedien auf der Basis von Agar ohne Antibiotika.
Die Enterococcendichte ist ein Indikator für die Gefährdung der öffentlichen Gesundheit im Zusammenhang mit einer Verunreinigung von Freizeitgewässern. Es gibt zwei anerkannte Verfahren für die Analyse der Enterococcendichte in Gewässerproben, nämlich das mehrere Röhrchen verwendende Verfahren der höchstwahrscheinlichen Zahl (MPN) und die Membranfiltrationstechnik (MF) (siehe Greenberg et al., Standard methods for the evaluation of water and wastewater Eaton, A. D. (ad.) 18th ed. American Public Health Association (1992); und Mooney, K. et al., Testing the waters: a national perspective on beach closings Natural Resources Defense Council. (1992)). Die mittels der Technik der Mehrfachröhrchen zu erzielenden Ergebnisse sind nicht vor Ablauf von 72 Stunden verfügbar, und für die Ergebnisse der Membranfiltrationstechnik werden über 48 Stunden benötigt. Das "MPN Verfahren" verwendet einen 24 bis 48 Stunden dauernden unmodifizierten Test in einer Reihe von aziden Dextroseboullions, gefolgt von einem 48 Stunden dauernden Bestätigungstest, in dem selektives Enterococcus-Agar und 6,5%ige NaCl-Hirn-Herz-Infusionsboullion eingesetzt werden. Die Membranfiltrationstechnik verwendet die Membranfiltration von Gewässerproben, gefolgt von der Inkubation einer vorgefilterten sterilen Membran auf für Enterococcus spezifischen Medien. Die gewählten Medien sind entweder mE-Agar, gefolgt von einem EIA-Substrattest, oder mEnterococcus-Agar. Solche Verfahren sind gewöhnlich mühselig, arbeits- und zeitaufwendig. Hierdurch kann es zu einer verspäteten Benachrichtigung der Öffentlichkeit kommen, mit der Folge einer gesteigerten Gefährdung der öffentlichen Gesundheit.
Von Panosian & Edberg, Journal of Clinical Microbiology 27: 1719–1722 (1989), wird ein Verfahren zum Nachweis von S. Bovis und verwandten Bakterien beschrieben, zu dem die Schritte gehören: Züchten von Kolonien von Organismen auf Platten jeweils für eine Dauer von 24 bis 98 Std. und 18 bis 24 Std. und anschließendes Übertragung von gezüchteten Kolonien auf ein Nachweismedium, das p-Nitrophenyl-α-D-Galactopyranosid und 4-Methylumbilliferyl-β-D-Glucosid enthält. Trepeta & Edberg, Antonie van Leeuwenhoek 53: 273–277 (1987), beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien die über Esculinase verfügen und das eine Nachweismedien verwendet, das p-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid enthält.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft ein Medium, das es ermöglicht, innerhalb von nur 24 Stunden den Nachweis von Enterococcen-Mikroorganismen in einer verflüssigten Umweltprobe oder einer biologischen Probe zu erbringen.
Das vorliegende Medium unterscheidet sich von Medien nach dem Stand der Technik, bei denen etwa 48 bis 72 Stunden benötigt werden, um ein Testergebnis im Falle von Enterococci zu erzielen. Das Medium ermöglicht ferner ein Quantifizieren der Menge von Enterococci, die in einer Probe anwesend sind, und lässt sich in raschen Screening-Verfahren einsetzen.
Das Medium enthält eine geeignete Menge an Zutaten wie Vitamin, Aminosäure, Spurenelementen und Salz, die geeignet sind, um die Lebensfähigkeit und Reproduktion von Enterococci in Anwesenheit eines Nährmittelindikators zu ermögli chen. Der Nährmittelindikator ist in ausreichender Menge vorgesehen, um die Erzeugung eines durch das Wachstum von Enterococci bewirkten erkennbaren charakteristischen Signals in dem Medium zu ermöglichen. Das Medium enthält ferner wirksame Mengen von selektiven Agenzien, die dazu dienen, das Wachstum von Mikroorganismen, die nicht Zielobjekt sind (d. h. nicht enterococcal sind) zu verhindern oder zu inhibieren.
Medien, die sich in dieser Erfindung als optimal für den Nachweis von Enterococci in einer Probe herausgestellt haben, enthalten (pro Liter) einen biologischen Puffer (z. B. etwa 5,0 bis 7,0 Gramm N-tris[Hydroxy-Methyl]Methyl-3-Amino-propansulfonische Säure, freie Säure (frei Säure TAPS), und etwa 5,0 bis 7,0 Gramm N-tris[Hydroxy-Methyl]Methyl-3-Amino-Propansulfonsäure, Natriumsalz (TAPS-Natrium) oder etwa 4,0 bis 5,0 Gramm freie Säure HEPES und etwa 7,0 bis 9,0 Gramm HEPES-Natriumsalz); und Natriumbicarbonat (z. B. etwa 1,5 bis 2,5 Gramm).
Darüber hinaus sind in den Medien die nachfolgende Komponenten etwa in den angegebenen Mengen vorgesehen. Dem Fachmann ist klar, dass nicht jede der Komponenten erforderlich ist. Es können Komponenten auch durch andere Komponenten mit ähnlichen Eigenschaften substituiert werden. Die Anteile der Komponenten können ebenfalls variiert werden. Insbesondere enthält das Medium einen Stickstoffgesamtanteil von etwa 1,0 bis 1,7 Gramm (pro Liter) (in erster Linie aus Ammoniumsulfat). Ferner sind Aminosäuren vorgesehen, die für ein Wachstum der nachzuweisenden Mikroorganismen erforderlich sind. Es ist nicht nötig, sämtliche der Aminosäuren vorzusehen, und der relative Anteil einer jeden kann variieren. Die Aminosäuren können in Form von unter schiedlichen Quellen vorliegen. Diese können in Form von natürlichen Quellen (z. B. Extrakten von ganzen Organismen), als Mischungen oder in gereinigter Form bereitgestellt sein. Die natürlichen Mischungen können variierende Anteile derartiger Aminosäuren und Vitamine enthalten. Spezielle Mengen derartiger Aminosäuren und Vitamine sind weiter unten angegeben. Dem Fachmann ist klar, dass viele unterschiedliche Kombinationen von Aminosäuren und Vitaminen in den erfindungsgemäßen Medien verwendet werden können. Gewöhnlich müssen lediglich Aminosäuren bereitstehen, die die nachzuweisenden Mikroorganismen nicht endogen synthetisieren können. Allerdings können, ohne von dem erfindungsgemäßen Medium abzuweichen, andere Aminosäuren vorgesehen sein. Zu den Aminosäureanteilen gehören mindestens die folgenden mit etwa in den (pro Liter) angegebenen Mengen: Alanin (0,015 bis 0,055 Gramm), Arginin (0,01 bis 0,04 Gramm), Aspartinsäure (0,04 bis 0,10 Gramm), Cystin (0,001 bis 0,005 Gramm), Glutaminsäure (0,05 bis 0,15 Gramm), Glyzin (0,01 bis 0,03 Gramm), Histidin (0,019 bis 0,06 Gramm), Isoleuzin (0,01 bis 0,10 Gramm), Leuzin (0,03 bis 0,08 Gramm), Lysin (0,03 bis 0,07 Gramm), Methionin (0,01 bis 0,04 Gramm), Phenylalanin (0,01 bis 0,04 Gramm), Prolin (0,02 bis 0,08 Gramm), Serin (0,01 bis 0,05 Gramm), Threonin (0,01 bis 0,04 Gramm), Tryptophan (0,002 bis 0,006 Gramm), Tyrosin (0,01 bis 0,02 Gramm), und Valin (0,02 bis 0,05 Gramm).
Salze können durch Dissoziation als Quelle für Ionen vorgesehen sein. Zu solchen Salzen können gehören: Kaliumphosphat (z. B. etwa 0,5 bis 1,5 Gramm);Kupfersulfat (z. B. etwa 40 bis 50 μg);Ammoniumsulfat (z. B. etwa 4,0 bis 6,0 Gramm);Kaliumjodid (z. B. etwa 50,0 bis 150,0 μg); Eisenchlorid (z. B. etwa 150,0 bis 250,0 μg);Mangansulfat (z. B. etwa 300,0 bis 500,0 μg);Natriummolybdat (z. B. etwa 150,0 bis 250,0 μμg); Zinksulfat (beispielsweise etwa 300,0 bis 500,0 μg); und Natriumchlorid (beispielsweise etwa 0,05 bis 0,15 g). Sonstige anorganische Komponenten können verwendet werden, um ein Mikroorganismenwachstum zu unterstützen. Zu diesen gehören die folgenden (bis zu der Menge, die nicht schon in den oben erwähnten Quellen vielfältiger chemischer Instanzen bereitstehen, und in Anteilen pro Liter angegeben): Phosphor (etwa 0,0005 g/l), Kalium (etwa 0,0004 g/l), Natrium (etwa 0,03 bis 0,06 g/l) und Spurenmengen von Calcium, Magnesium, Aluminium, Barium, Chlorid, Kobalt, Kupfer, Eisen, Blei, Mangan, Sulfat, Schwefel, Zinn und Zink.
Vitamine, die für ein Wachstum und die Reproduktion des Mikroorganismus erforderlich sind, deren Nachweis erbracht werden soll, können ebenfalls vorgesehen sein. Diese können in einer reinen Form oder in Kombination mit komplexeren Medien angeboten werden. Solche Vitamine können etwa in den folgenden Mengen (pro Gramm Medium) anwesend sein: Biotin (etwa 0,15 bis 0,40 μg/l), Pantothensäure (etwa 45,0 bis 65,0 μg/l), Pyridoxin (etwa 6,0 bis 9,0 μg/l), Riboflavin (etwa 10,0 bis 20,0 μg/l), Folsäure (etwa 5,00 bis 10,00 μg/l), Thiamin (etwa 10,0 bis 20,0 μg/l), Vitamin B12 (etwa 0,20 bis 0,30 μg/l), und Niazin (etwa 15,0 bis 25,0 μg/l).
Selektive Agenzien und insbesondere Antibiotika, die ein Wachstum von Organismen, die nicht Zielobjekt sind, inhibieren oder verhindern, können ebenfalls vorgesehen sein. Viele selektive Agenzien können vorgesehen sein, und die Art der verwendeten selektiven Agenzien hängt von dem Target-Mikroorganismus ab. Vorzugsweise gehören zu den selektiven Agenzien ein oder mehrere der folgenden Substanzen in Konzentrationen innerhalb der folgenden Bereiche: Amikazinsulfat (etwa 0,0045 bis 0,0055 Gramm/Liter), Amphoterizin B (etwa 0,00198 bis 0,00242 Gramm/Liter), und Bacitrazin (etwa 0,000476 bis 0,00794 Gramm/Liter). Alternativ können Thalliumazetat, Neomyzinsulfat, Cycloheximid, Tetracyclin, Colistin, Ansiomyzin oder Clindamyzin substituiert sein.
Der Fachmann erkennt, dass Kohlenstoff, Stickstoff, Spurenelemente, Vitamine, Aminosäuren und selektive Agenzien in vielfältigen Formen vorgesehen sein können.
Einige Zutaten können in reduzierter Menge oder verdünnt vorgesehen sein, falls sie von dem Mikroorganismus, dessen Anwesenheit nachzuweisen ist, endogen erzeugt werden können.
Der Nährmittelindikator ist in dem Medium in einer Menge anwesend, die ausreicht, um das Wachstum des Target-Mikroorganismus zu unterstützen, bis während des Wachstums in dem Medium ein erkennbares charakteristisches Signal erzeugt wird. Zusammen ermöglichen die Zutaten an Vitaminen, Aminosäuren, Spurenelementen, Salzen und Nährmittelindikatoren ein ausreichendes Wachstum des Organismus, so dass eine erfassbare Änderung in der Probe beobachtet werden kann. Der Nährmittelindikator verändert eine erfassbare Charakteristik der Probe lediglich dann, wenn er durch einen Organismus metabolisiert wird. Vorzugsweise verändert er eine erfassbare Charakteristik lediglich dann, wenn er durch den Target-Mikroorganismus metabolisiert wird. Folglich lässt er sich dafür einsetzen, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Target-Mikroorganismus in der Probe zu be stätigen. Es ist bevorzugt, dass der Nährmittelindikator so gewählt wird, dass er nur durch den Target-Mikroorganismus in dem Medium gespalten wird, um den Indikatorabschnitt freizugeben. D. h. falls sonstige in der Probe anwesende Mikroorganismen den Nährmittelindikator spalten könnten, wird das Medium so gestaltet, dass derartige andere Mikroorganismen nicht in der Lage sind, ein bedeutendes Wachstum in dem Medium zu erzielen. Außerdem kann das Medium, andere derartige Quellen enthalten, jedoch nur in Mengen, die die Spezifität des Mediums nicht herabsetzen. Obwohl es bevorzugt ist, dass der Nährmittelindikator die einzige Quelle für den speziellen Nährmitteltyp für den Target-Mikroorganismus ist. Beispielsweise kann der Nährmittelindikator die einzige Kohlenstoffquelle für diesen Mikroorganismus sein. Alternativ können andere Kohlenstoffquellen anwesend sein (beispielsweise Aminosäuren), die von dem Target-Mikroorganismus nicht bevorzugt verwendet werden. Falls gewünscht, kann eine gewisse geringe Menge einer weiteren Kohlenstoffquelle anwesend sein, die durch dem Target-Mikroorganismus bevorzugt verwendet werden könnte, jedoch ist die vorgesehene Menge so bemessen, dass die Spezifität des Mediums ohne eine derartige Kohlenstoffquelle nicht verringert wird. Am meisten bevorzugt ist der Nährmittelindikator 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid. Zu sonstigen Nährmittelindikatoren, die in der Erfindung eingesetzt werden können, gehören die folgenden: 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl-β-D-Glucopyranosid, o-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid, p-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid, Resofuran-β-D-Glucopyranosid, 6-Brom-2-Naphthyl-D-Glucopyranosid, Roseβ-D-Glucopyranosid, VQM-Glc(2-{2-[4-(D-Glucopyranosyloxy}-3-Methoxyphenyl]vinyl)-1-Methyl-Quinolinium-Jodid, und VBzTM-Gluc(2-{2-[4-(-D-glucopyranosyloxy}3methoxyphenyl]vinyl)-3- Methylbenzothiazolium-Jodid.
Zu dem Begriff "Enterococci" zählen die nachfolgenden Mikroorganismen: Enterococcus avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. saccharolyticus, E. seriolicida, E. solitarius, und E. sulfureus. Unter diesen sind E. avium, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum und E. hirae die Stämme fäkalen Ursprungs. Die Bedeutung des Begriffs beschränkt sich nicht auf eine gegebene Zahl dieser Arten und soll nicht Arten ausschließen, die zwar noch nicht entdeckt sind, jedoch möglicherweise in der Zukunft durch den Fachmann identifiziert und dieser Gattung zugeordnet werden.
Der Begriff "Fäkalstreptokokken" schließt Arten der Streptokokkenbakterien ein, wie sie in dem gastrointestinalen Trakt höherer Organismen vorkommen. Hierzu zählen Organismen wie S. faecalis, S. faecium, S. avium und S. gallinarum. S. faecalis, S. faecium, S. avium und S. gallinarum werden allgemeiner als Enterococci bezeichnet und sind hier in jenem Begriff mit einbezogen.
Der Begriff "24 Stunden" bezeichnet die Zeit, die benötigt wird, bis etwa 95% der Flüssigkeitsproben, die lediglich etwa ein bis zehn Enterococci pro 100 ml enthalten, einen erkennbaren Wechsel des Charakteristikums anzeigen. Die Temperatur, der Anteil und der Typ des anwesenden Enzyminducers, der Anteil an in dem Medium vorgesehenen Nährmitteln und die relative Gesundheit der Bakterien wirken sich jeder für sich auf die Nachweiszeit aus. Die Menge an vorgesehenen Nährmitteln wie Aminosäuren, Vitaminen und Spurenelementen kann die Wachstumsrate der Target-Mikroorganismus und auf diese Weise die Nachweiszeit beeinflussen. Ein Einstellen der Temperatur der Probe auf eine Inkubationstemperatur von etwa 35°C nach einem Hinzufügen des Mediums kann die für einen Nachweis erforderliche Zeit verkürzen. Der Anteil an Enzyminducer kann ebenfalls die Nachweiszeit reduzieren. In dem Medium vorzufindende Enzyminducer sind Agenzien, die als Inducer des Enzyms wirken, das den Nährmittelindikator spaltet. Der Enzyminducer kann beispielsweise ein Homolog des Nährmittelindikators sein. Beispiele solcher Inducer sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die relative Gesundheit der Mikroorganismus beeinflusst ebenfalls die für einen Nachweis benötigte Zeit. Ein Hinzufügen von Agenzien wie Pyruvat, das die Erholung geschädigter Organismen möglicherweise unterstützt, kann daher den Nachweis beschleunigen. Falls die Anzahl der in der Probe vorhandenen Bakterien groß ist, ist ebenfalls ein rascherer Nachweis möglich. In dieser Erfindung ermöglichen die geschaffenen Medien den Nachweis von geringen Mengen von Target-Mikroorganismen (d. h. weniger als 10/100 ml) in der Zeitspanne von 24 Stunden, in wenigstens 95% der Fälle. Standardverfahren können verwendet werden, um diese Fähigkeit zu ermitteln.
Der Begriff "Medium" bezeichnet eine feste, pulverförmige oder flüssige Mischung, die sämtliche oder weitgehend alle der Nährmittel enthält, die erforderlich sind, um einer Mikroorganismus Wachstum und Vermehrung zu ermöglichen. Die Erfindung umfasst sowohl Medien, die sterilisiert sind, als auch Medien, die nicht steril sind.
Der Begriff "verflüssigt" bedeutet weitgehend flüssig, schließt aber auch pulverisierte oder homogenisierte Proben fester Stoffe ein, die einen Flüssigkeitsanteil von wenigstens 10% enthalten. Der Begriff soll ein geliertes Medium ausschließen, wie es im Falle von Agar vorliegt.
Die Begriffe "Umwelt-" und "biologisch" bedeuten aus einer Substanz entnommen oder herrührend, die in der Lage ist, eine oder mehrere Lebensformen wie Algen, Hefe und Bakterien zu fördern. Die Beispiele schließen Freizeitgewässer, salzhaltige Gewässer, Trinkwasser, Abwasser und Nahrungsmittel ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Begriff "Impfung" bezieht sich auf den Zeitpunkt oder engeren Zeitraum, in dem die verflüssigte Umweltprobe oder biologische Probe mit dem Medium dieser Erfindung zusammengebracht wird. Er soll den Zeitpunkt bezeichnen, in dem die beiden Stoffe im Wesentlichen vermischt werden.
Der Begriff "effektive Menge" bezeichnet eine Menge innerhalb des Bereichs, der ein Wachstum und die Reproduktion eines Target-Mikroorganismus ermöglicht oder fördert. D. h. eine Menge, die Mikroorganismen oder anderen Organismen erlaubt, sich an das Medium anzupassen, die erforderlichen Substanzen für eine Reproduktion zu synthetisieren und sich anschließend zu vermehren. Diese Menge ist nicht als spezifisch zu bewerten und kann abhängig von Faktoren wie der Größe der Probe und der Konzentration der Mikroorganismen variieren. Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff die Menge, die erforderlich ist, um weniger als 100 Target-Mikroorganismen pro 1 ml einer Probe, am meisten bevorzugt weniger als 100 Mikroorganismen pro 100 ml einer Probe oder sogar 1 Mikroorganismus pro 100 ml einer Probe zu erfassen.
Die Begriffe "Vitamine", "Aminosäuren", "Spurenelemente" und "Salze" sollen sämtliche Moleküle, Verbindungen und Stoffe einschließen, die vom Fachmann jeweils einer Kategorie zugeordnet werden, seien diese organisch oder anorganisch, und die Kategorien sollen keinen Stoff ausschließen, der möglicherweise zum Aufrechterhalten des Lebens erforderlich oder förderlich ist.
Der Begriff "Nährmittelindikator" bezeichnet ein Molekül oder eine Substanz, die eine als Quelle eines essentiellen Nährmittels dienende Komponente und eine Komponente aufweist, die eine beobachtbare charakteristische Veränderung in dem Medium oder in der Probe verursacht oder hervorbringt. Ein Nährmittelindikator umfasst Nährmittelquellen, die an Chromogene oder Fluorogene gebunden oder mit diesen konjugiert sind. Nährmittelquellen können essentielle Vitamin-, Mineral-, Spurenelement- oder Aminosäurenzutaten oder Kohlenstoff zur Verfügung stellen. Gewöhnlich steigt der Bedarf an Nahrung an, wenn ein Mikroorganismus die Phase verlässt, in der Nährmittel für eine Reproduktion akkumuliert werden (Verzögerungsphase), und in die Phase eintritt, in der eine Reproduktion mit einer relativ hohen Rate effektiv erfolgt (log-Phase). Folglich werden erhöhte Mengen des Nährmittelindikators metabolisiert und eine erfassbare und charakteristische Änderung hervorgerufen. Vorzugsweise umfasst der Nährmittelindikator eine Nährmittelkomponente sowie ein Chromogen oder ein Fluorogen. Zu den Chromogenen zählen beliebige Komponenten, die einen merklichen Farbwechsel im sichtbaren Bereich hervorbringen. Zu den Fluorogenen zählen beliebige Komponenten, die fluoreszieren, wenn sie einer anregenden Lichtquelle ausgesetzt werden. Beispiel hierfür sind Orthonitrophenyl-, Phenolphthalein- und 4-Methylumbelliferon-Komponenten, je doch sind diese nicht als beschränkend zu bewerten. Der Nährmittelindikator kann die alleinige Quelle eines essentiellen Nährmittels darstellen, es können jedoch auch andere Quellen derartiger Nährmittel vorgesehen sein, solange eine geeignete Selektivität und ein empfindliches Ansprechen des Mediums aufrecht erhalten bleiben.
Der Begriff "erkennbares charakteristisches Signal" bezeichnet jede Veränderung in einer Probe, die sich durch einen oder mehrere menschliche Sinne erfassen lässt. Der Begriff schließt beispielsweise einen Farbwechsel in den sichtbaren oder nicht sichtbaren Wellenlängenbereichen, eine Veränderung des Rggregatszustands wie z. B. zwischen festem, flüssigen und gasförmigen Zustand, eine Emission von Gas oder eine Änderung des Geruchs ein.
Der Begriff "Target-Mikroorganismus" bezeichnet den Mikroorganismus dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nachgewiesen werden soll. Vorzugsweise sind Arten von Enterococcen und Fäkalstreptokokken einbezogen, die in dem gastrointestinalen Trakt höherer Organismen leben können.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel verändert der Nährmittelindikator die Farbe des Mikroorganismenspezifischen Mediums. Der Farbwechsel kann im Bereich der Wellenlängen des sichtbaren Lichts oder als Fluoreszenz auftreten, die in einem Wellenlängenbereich aufscheint, der bei Bestrahlen mit einer anregenden Lichtquelle sichtbar ist. Dies wird durch die Spaltung einer chromogenen Komponente oder einer fluoreszierenden Komponente erreicht. Eine chromogene Komponente ist eine Komponente, die die Farbe der Probe im sichtbaren Bereich verändert, wenn sie in einer nichtkonjugierten Form vorliegt, in der sie nicht mehr mit einer Nährmittelkomponente konjugiert oder an diese gebunden ist. Eine fluoreszierende Komponente ist eine Komponente, die die Farbe der Probe in dem nicht sichtbaren Bereich verändert, wenn sie in einer nichtkonjugierten Form vorliegt, in der sie nicht mehr mit einer Nährmittelkomponente konjugiert oder an diese gebunden ist. Zu den Beispielen chromogener Komponenten, die mit einer Nährmittelkomponente konjugiert sein können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Orthonitrophenylkomponenten, die eine gelbe Farbe entwickeln, wenn sie von dem Nährmittelindikator gelöst sind, und Phenolphthaleinkomponenten, die eine rote Farbe hervorbringen, wenn sie von dem Nährmittelindikator gelöst sind. Zu den Beispielen fluoreszierender Komponenten zählen Methylumbelliferylkomponenten, die bei etwa 366 nm fluoreszieren, wenn sie von dem Nährmittelindikator gelöst sind, und BromoChlor-Indol-Komponenten, die blau werden, wenn sie von dem Nährmittelindikator gelöst sind. Am meisten bevorzugt verwendet das Medium die fluoreszierende Komponente 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid.
Vorzugsweise enthält das Medium ferner ein oder mehrere selektive Agenzien als Antibiotika, die mit Ausnahme der Target-Mikroorganismen andere Mikroorganismen an der Metabolisierung des Nährmittelindikators hindern oder dabei hemmen. D. h. das Medium enthält vorzugsweise Agenzien, die für andere Mikroorganismen als Enterococci oder Fäkalstreptokokken spezifisch sind und zumindest bei einigen jener Mikroorganismen ein Wachstum effektiv verhindern oder hemmen. Der Begriff soll Agenzien wie Natriumazid, Thalliumazetat, Nalidixinsäure, Neomyzinsulfat, Gentamizinsulfat, Gallensalz, Natriumchlorid, Lycloheximid, Tetracyclin, Colistin, Ansiomyzin, Clindamyzin und Polymyzin B mit einbeziehen. Vorzugsweise sind Amikazinsulfat (beispielsweise etwa 0,0045 bis 0,0055 g/l), Amphoterizin B (beispielsweise etwa 0,00198 bis 0,00242 g/l) und Bacitrazin (beispielsweise etwa 0,000476 bis 0,000794 g/l) eingeschlossen.
Der Begriff "mikroorganismenspezifisches Medium" bezeichnet ein Medium, das lediglich dem Target-Mikroorganismus ein wesentliches Wachstum erlaubt. Dazu zählen Medien, die ein oder mehrere Antibiotika enthalten, die spezifisch das Wachstums von Mikroorganismen mit Ausnahme der Target-Mikroorganismen hemmen, und Medien, die alternativ oder zusätzlich ein oder mehrere Nährmittelindikatoren enthalten, die vorzugsweise mit Ausnahme der Target-Mikroorganismen nicht in wesentlichem Ausmaß von anderen Mikroorganismen metabolisiert werden. Der Begriff "wesentlich" in dem hier verwendeten Sinne bedeutet, dass das Medium nach Maßgabe von Standardverfahren noch einen spezifischen (d. h. mit einer Genauigkeit von wenigstens 95% oder sogar 98 %) und einen empfindlichen (d. h. auf einem Nachweisniveau von wenigstens 95% oder sogar 98%) Nachweis der Target-Mikroorganismen erlaubt.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das Medium ein Agens, das als Enzyminducer wirkt, der den Nährmittelindikator spaltet. Dieses Agens kann beispielsweise ein Homolog zu dem Nährmittelindikator sein. Zu solchen Inducern zählen Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG), das β-Galactosidaseaktivität induziert, und Ethyl-β-D-Thioglucosid, das eine Glukosidaseaktivität induziert.
Vorzugsweise ermöglicht das Medium einen Nachweis von Enterococci (einschließlich Fäkalstreptokokken) innerhalb von 24 Stunden. Das Medium liegt ferner bevorzugt in Form eines nicht sterilen, wasserlöslichen Pulvers vor, um ein problemloses Hinzufügen zu Flüssigkeitsproben zu ermöglichen.
In einem weiteren Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Erkennen des Vorhandenseins oder Fehlens von Enterococci und Fäkalstreptokokken in einer verflüssigten Probe, wobei die Probe mit dem oben beschriebenen Medium zusammengebracht wird, die Mischung, die die Probe und das Medium enthält, inkubiert wird und das Gemisch aus Probe und Medium beobachtet wird, um das Auftreten oder Nichtauftreten des erkennbaren charakteristischen Signals zu erfassen. Die Inkubation kann bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden, jedoch wird sie vorzugsweise zwischen 35°C und 45°C durchgeführt. Vorzugsweise kann das erkennbare charakteristische Signal innerhalb von 24 Stunden beobachtet werden. Die Erfindung beinhaltet das Schaffen von Proben vorzugsweise aus einer Wasserquelle, einschließlich Süßwasser, Salzwasser, Trinkwasservorräten oder Abwasser.
Eine weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren zum Erkennen des Vorhandenseins oder Fehlens eines Target-Mikroorganismus in einer Umweltprobe oder einer biologischen Flüssigkeitsprobe, zu dem bevorzugt nach einem Hinzufügen des mikroorganismenspezifischen Mediums der Schritt des Erwärmens der Probe auf die Inkubationstemperatur in einem Flüssiginkubator gehört. Am meisten bevorzugt beträgt die Inkubationstemperatur etwa 35°C. Der Begriff "Flüssiginkubator" bezeichnet eine Flüssigkeit, die auf eine spezifizierte Temperatur oder einen spezifizierten Temperaturbereich erwärmt wird. Hierzu kann beispielsweise jede Art von Wasserbad zählen. Ein derartiger Inkubator ist den bisher verwendeten Luftinkubatoren überlegen, da das Medium eine geeignete Inkubationstemperatur rascher erreicht.
In noch einem weiteren Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Quantifizieren der Menge oder Anzahl von Enterococci, die in einer Flüssigkeitsprobe anwesend sind, durch die Schritte: Zusammenbringen einer Flüssigkeitsprobe mit dem oben beschriebenen Medium, Anordnen der Flüssigkeitsprobe, die das Medium enthält, in Behältern, Inkubieren des Gemisches aus Flüssigkeitsprobe und Medium, Beobachten der Quantität und der Qualität eines erkennbaren charakteristischen Signals und Vergleichen der Quantität und der Qualität eines erkennbaren charakteristischen Signals mit wahrscheinlichsten Werten. Dieses Quantifizierungsverfahren beinhaltet einen Vergleich der Quantität und der Qualität der Charakteristik die verändert wurde, vorzugsweise eines Farbwechsels, mit höchstwahrscheinlichen Zahlenwerten, die mit Proben erlangt wurden, bei denen die Konzentration und eine charakteristische Änderung mit Proben korreliert worden war, deren Enterococci- oder Bakterienkonzentration bekannt war. Siehe z. B. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3. Ausgabe, herausgegeben von Vanderzant und Splittstoesser, 1992. Das Verfahren der höchstwahrscheinlichen Zahl erlaubt ein Ermitteln von bakteriellen Konzentrationen, die unterhalb der Nachweisgrenzen sonstiger Verfahren liegen.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen verwendet die Erfindung die von Naqui et al. in der US Patentschrift 5 518 892 beschriebene Vorrichtung. Der Schritt des Quantifizierens umfasst: Zubereiten einer Probe einer Umweltprobe oder einer biologischen Probe in einer flüssigen Form, Anordnen oder Verteilen der Probe in dem von Naqui beschriebenen Probenhaltebeutel, Mischen der Probe mit einem Medium, um ein Wachstum von lebensfähigen Bakterien zu ermöglichen und zu fördern, Inkubieren der Probe, Erfassen der Quantität und der Qualität des Farbwechsels und Vergleichen der Quantität und der Qualität mit Ergebnissen, die anhand einer Reihe von Proben erlangt wurden, deren Bakterienkonzentration bekannt war. Mehr bevorzugt wird der Inkubationsschritt mittels des oben beschriebenen Mediums für eine Dauer von 24 Stunden bei 41°C durchgeführt.
Die Erfindung schafft das optimale Medium zum Ermitteln der Anwesenheit von Mikroorganismen wie Enterococci (einschließlich Fäkalstreptokokken). Enterococci lassen sich in diesem Medium erheblich rascher als in den gegenwärtig verfügbaren Medien nachweisen. Die Testergebnisse liegen somit rascher vor. Rasche Ergebnisse senken sowohl die Kosten als auch den Zeitaufwand für das Labor. Eine Beschleunigung des Tests reduziert außerdem die Gefährdung der öffentlichen Gesundheit, ermöglicht eine frühe Alarmierung der Öffentlichkeit und das Ergreifen von Gegenmaßnahmen, um auf das Vorhandensein gewisser Mikroorganismen an Orten wie in Trinkwasservorräten und Freizeitgewässern zu reagieren. Darüber hinaus erfordert das Verfahren dieser Erfindung im Allgemeinen keine Bestätigungstests, da Nährmittelindikatoren verwendet werden können, die für den Mikroorganismus spezifisch sind. Weiter ist die Erfindung nicht auf den Einsatz eines sterilen Mediums angewiesen, wie es bei vielen anderen Verfahren der Fall ist.
Sonstige Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung und aus den Ansprüchen offenkundig.
Kurzbeschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels
In der nachfolgenden Beschreibung wird auf vielfältige Verfahrensweisen verwiesen, die dem auf den Gebieten der Chemie, Biologie und Mikrobiologie ausgebildeten Fachmann bekannt sind. Die Zusammensetzungen, Verfahren und Produkte dieser Erfindung lassen sich auf biologische Proben und Umweltproben anwenden und dienen auf den Gebieten der Chemie, Biologie und Mikrobiologie zum Nachweis von Mikroorganismen.
Auf Enzymspezifität basierender Nachweis von Mikroorganismen
Spezielle Mikroorganismen gewinnen ihre Nährmittel aus einer Reihe von Quellen jedoch können manche Quellen für einen speziellen Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen spezifisch sein. Familien, Gruppen oder Arten von Mikroorganismen kann eine Enzymspezifität für gewisse Nährmittel gemeinsam sein, die anderen Mikroorganismen fehlt. Durch Ausnutzen der metabolischen Charakteristiken spezieller Mikroorganismen ist es möglich, deren Anwesenheit festzustellen. Viele für spezielle Gruppen oder Arten spezifische Enzyme wurden bisher identifiziert und es werden wahrscheinlich weitere in der Zukunft identifiziert werden.
Die Enterococcus-Gruppe der Bakterien verfügt über ein eindeutiges konstitutives Enzym, nämlich β-Glukosidase (Lintel, et al., Appl. Environ. Microbiol. 45: 622–627 (1983). Dieses katalysiert die Hydrolyse geeigneter chromogener oder fluorogener Substrate in geeigneten selektiven Umgebungen, wodurch ein Farb- oder Fluoreszenzsignal erzeugt wird, das sich entweder visuell oder auf spektralphotometrischem Wege erfassen lässt. Ein spezifisches β- Glukosidase-Substrat kann als der Nährmittelindikator in Medien dienen, die geeignet gestaltet sind, um Enterococcen zu erfassen, und eine Hauptquelle für Kohlenstoff in der Mediumformulierung bilden. Eine Reihe von Nährmittelindikatorsubstraten sind erhältlich. Allerdings ist das Substrat, das vorzugsweise für den Nachweis von Enterococcen verwendet wird, das fluorogene Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid. Wenn lebensfähige Enterococcusbakterien in einer Probe anwesend sind, wird der Nährmittelindikator metabolisiert, wodurch der Indikatorabschnitt abgespalten wird, der nach dem Spalten fluoresziert. Die freigegebene Glucosekomponente wird anschließend von den Enterococcenbakterien zur Förderung ihres Wachstums verwendet.
Enterococci
Die Bakteriengruppe Enterococcus und FäkalStreptococcus ist ein wertvoller Bakterienindikator zum Erfassen des Ausmaßes fäkaler Verunreinigung in Freizeitgewässern (Greenberg, et al., Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18. Ausgabe, Baton, A. D. (ed.) American Public Health Association (1992)). Zur Gattung Enterococcus zählen heute 18 Arten: Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus decorum, Enterococcus columbae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus raffinosus, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus seriolicida, Enterococcus solitarius und Enterococcus sulfureus. Unter diesen stellen Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum und Enterococcus hirae die Verunreini gungen fäkalen Ursprungs dar (Hernandez, et al., Wat. Res. 27: 597–606 (1993)). Diese Bakterien überleben in Meerwasserumgebungen erheblich länger als sonstige Indikatoren. Enterococci sind außerdem gegenüber Abwasseraufbereitung wie Chlorierung resistent und eignen sich daher als empfindliche Indikatoren für das Überleben enterischer Krankheitserreger und Viren in Gewässerproben. Eine unmittelbare Korrelation zwischen der Konzentration von Enterococcen in salzhaltigen Gewässern und dem Risiko von durch Baden ausgelöster Gastroenteritis ist erwiesen (Cabelli, Wat. Sci. Tech. 21: 13–21 (1989); und Cabelli et al., Journal WPCF (1983)). Seitens der United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA) wird empfohlen, die Enterococcengruppe von Bakterien als Bakterienindikatoren für Süßwasser und salzhaltige Gewässer zu verwenden. Gegenwärtig sind für Freizeitgewässer als auf der Enterococcusdichte basierende Sicherheitsrichtwerte für Süßwasser 33 Enterococcen pro 100 ml bzw. für Salzwasser 35 Enterococcen pro 7,00 ml vorgegeben.
Herkömmliche Standardverfahren zum Erfassen der Enterococcendichte in Süß- oder Salzwassererhohlungsgewässern sind sowohl arbeits- als auch zeitaufwendig. Die auf MPN-Tests basierenden Ergebnisse benötigen mindestens 72 Stunden und für MF sind 48 Stunden erforderlich. Obwohl Enterococcen relativ empfindliche Bakterienindikatoren für Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit Baden sind, hat die Zeitdauer, die für eine Interpretation des Ergebnisses benötigt wird, deren Akzeptanz für ein praktikables Überwachen beeinträchtigt. Das auf β-Glukosidase basierende diagnostische System ermöglicht einen frühen Nachweis von Enterococcusarten in Gewässerproben innerhalb von 24 Stunden. Rasch vorliegende Ergebnisse erlauben ein rasches Rea gieren der Behörden, um zum Schutz der öffentlichen Gesundheit Maßnahmen wie das Sperren eines Strandes zu ergreifen.
Selektivität
Im Allgemeinen stellt die β-Glukosidaseaktivität eine spezifische Eigenschaft dar, die zum Nachweis von Enterococcen und Fäkalstreptokokken dient. Allerdings weisen auch andere Bakterien eine derartige Enzymaktivität auf. Zu diesen zählen die Gattungen der Familie von Enterobacteriaceae (Enterobacter aerogenes, E. colacae) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes und Bacterioides fragilis. Ein oder mehrere gewisse selektive Faktoren können dafür eingesetzt werden, um das Wachstum von derartigen anderen β-Glukosidase-positiven Bakterien (d. h. anderen als den Enterococcusarten) zu verhindern.
Ein für spezielle Mikroorganismen selektives Medium kann erzeugt werden, indem eine Kombination von Enzymspezifität und selektiven Umgebungen verwendet wird. Beispielsweise werden in einem Medium dieser Erfindung von den Target-Mikroorganismen abweichende Mikroorganismen unterdrückt, die keine β-Glukosidaseaktivität aufweisen und nicht in der Lage sind, den Nährmittelindikator zu verdauen. Heterotrope Bakterien oder sonstige Mikroorganismen, die nicht Target-Mikroorganismen sind und die β-Glukosidase aufweisen, werden während der Testperiode gezielt durch die Kombination von spezifisch formulierten chemischen/antibiotischen Reagenzien und anderen physikalischen Parametern (pH-Wert und Temperatur) unterdrückt. Zu typischen selektiven Agenzien, die in dem Medium dieser Erfindung verwendet werden können, zählen Natriumazid, Thalliumazetat, Nalixidinsäure, Neomyzinsulfat, Gentamizin sulfat, Gallensalz, Natriumchlorid, und Polymyzin B (Hernandez et al., Wat. Res. 27: 597–606 (1993); Knuntson, et al., Appl. Environ. Microbiol. 59: 936–938 ((1993); und Littel et al., Appl. Environ. Microbiol. 45: 622–627 (1983)).
Die Kombination einer Enzymspezifität und einer Antibiotikumselektivität schafft mehrere Hürden, die verhindern, dass die konkurrierenden, nicht zu den Enterococci gehörenden Mikroorganismen innerhalb der Testperiode von 24 Stunden erfasst werden. Hierdurch wird der Einsatz eines einzelnen, stark toxischen Elements vermieden, das möglicherweise nicht nur die von den Target-Mikroorganismen abweichenden Mikroorganismen hemmt, sondern auch die Target-Mikroorganismen unterdrückt.
Nährmittelindikator
Im Falle von Enterococci katalysiert die β-Glukosidase die Konvertierung des fluoreszierenden Substrats 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid (MUD) zu 4-Methylumbelliferon und Glucose. Das Fluorophor 4-Methylumbelliferon fluoresziert blau, wenn es mit 365 nm angeregt wird (dies lässt sich mittels einer 365 nm UV-Lampe beobachten). Die freigegebene Zuckerkomponente Glucose dient als eine Hauptkohlenstoffquelle, um das Wachstum von Enterococci zu unterstützen. Eine erhöhter Nährmittelindikatorpegel kann zwar ein Mikroorganismenwachstum verbessern und deutlichere Fluoreszenz bewirken, allerdings können hohe Nährmittelindikatorpegel auch Zytotoxizität der Zellen und einen höheren Pegel der Hintergrundfluoreszenz hervorrufen. 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid (MUD) in einer Konzentration von 25 mg/l verhindert das Wachstum von Enterococcusarten nicht.
Enzyminducer
Die meisten glucoseabbauenden Hydrolasen (β-Glukosidase, β-Galaktosidase und β-Glucuronidase) sind induzierbar. Die Induzierung von β-Galactosidaseaktivität durch Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG) ist ein klassisches Beispiel. Das in einer ähnlichen Weise funktionierende Ethyl-β-D-Thioglucosid ist eine β-Glucosidaseinducer.
Wachstumsstimulatoren
NaHCO₃ (2 g/l), Tween-80^® (0,75 ml/Liter), und KHP₂O₄ (5 g/l) stimulieren ein Wachstum von aus Gewässern entnommenen Fäkalstreptokokkenarten (siehe beispielsweise Lachica et al., J. Appl. Bacteriol. 31: 151–156 (1968)). Andere Spurenelemente wie spezielle Aminosäure(n) (Glutaminsäure), Vitamin(r) (Lipoinsäure), und Nukleotid(e) (Kinetinribosid) können jeweils wachstumsfördernde Aktivitäten für Enterococcusarten aufweisen.
Das erfindungsgemäße Medium zum Nachweis von Enterococci ist in Tafel 1 dargestellt.
TAFEL 1 KOMPONENTE I
KOMPONENTE II
Verfahren des Einsatzes
Das Medium dieser Erfindung kann in drei unterschiedliche Formaten verwendet werden. Erstens kann es zum Erfassen des Vorhandenseins oder Fehlens von Enterococci eingesetzt werden. Zweitens kann es eingesetzt werden, um die Menge von in einer Probe anwesenden Enterococci zu quantifizieren. Drittens lässt es sich in einem Screeningformat verwenden, um eine Beziehung zwischen der Zeit bis zum Erhalt eines positiven Testergebnisses und der Konzentration der Enterococci in einer Probe herzustellen.
Anwesenheit/Abwesenheit
Das Verfahren zum Erfassen der Anwesenheit oder des Fehlens von Enterococcusarten in Gewässerproben wird im folgenden beschrieben.

1. Als Erstes werden mittels vorkalibrierter steriler Gefäße eine oder mehrere Gewässerproben aufgenommen. Das Volumen der Proben kann abhängig von der Anwendung unterschiedlich sein, beispielsweise 100 ml, 10 ml oder 1 ml. Das Medium dieser Erfindung kann der entnommenen Gewässerprobe in Pulverform zugefügt werden. Alternativ kann das Medium vor dem Aufnehmen der Proben in Pulverform in den Gefäßen vorhanden sein.
2. Die Probengefäße werden anschließend auf eine gleich mäßige Temperatur (die auf Inkubationstemperatur in einem Wasserbad gebracht wird) von vorzugsweise entweder 35°C oder 41°C ± 1°C eingestellt, und zwar vorzugsweise für eine Zeitdauer von 20 Minuten.
3. Für die Anwesenheit von Enterococcus-Arten in der getesteten Gewässerprobe ist eine blaue Fluoreszenz kennzeichnend, wenn 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid der Nährmittelindikator ist. Die Fluoreszenz lässt sich mittels einer 365 nm UV-Lampe visuell erfassen. Alternativ kann das Signal mittels eines Fluoreszenzspektralphotometers beobachtet werden, das eine Anregungswellenlänge von 365 nm und eine Emissionswellenlänge von 440–450 nm verwendet.

Eine positive Reaktion kann zu einem beliebigen Zeitpunkt innerhalb von 24 Stunden auftreten, falls lebensfähige Bakterien in der Probe anwesend sind. D. h. etwa 95% der Proben, die 10 cfu/l00 ml enthalten, zeigen innerhalb von 24 Stunden einen erkennbaren Wechsel des Charakteristikums. Die Nachweiszeit, die sich im Bereich zwischen etwa 12 bis 24 Stunden bewegt, variiert mit der Konzentration und der Anwesenheit von verschiedene Arten oder Stämmen von Enterococcen.
Quantifizierung
Das gleiche Medium kann zum Quantifizieren der Target-Moleküle verwendet werden. Der Versuch kann mit dem regulären 5 oder 10 Röhrchen aufweisenden MPN-Format oder dem MPN-Format "Quanti-Tray" mit 50 bis 100 Näpfchen durchgeführt werden (siehe Naqui, US Patentanmeldung 08/201 110). Das Verfahren zum Quantifizieren der Enterococcen, das das Medium von Tafel I verwendet, wird im folgenden beschrieben.

1. Aufnehmen einer Gewässerprobe mit einem oder mehreren vorkalibrierten sterilen Gefäßen. Das Volumen der Proben kann abhängig von der Anwendung variieren, beispielsweise 100 ml, 10 ml oder 1 ml. Das erfindungsgemäße Medium kann der gesammelten Gewässerprobe in Pulverform hinzugefügt werden. Alternativ kann das Medium der Erfindung vor der Aufnahme der Probe in Pulverform in dem Gefäß vorliegen.
2. Die Probe wird anschließend in ein "Quanti-Tray" gegossen und anschließend in erzeugten 50 oder 100 MPN-Näpfchen heißversiegelt. Alternativ können Probenaliquote in 5 oder 10 MPN-Röhrchen aufgeteilt werden.
3. Die Probengefäße werden vorzugsweise bei 35°C oder 41°C ± 1°C inkubiert.
4. Die Fluoreszenz kann mittels einer 365 nm UV-Lampe visuell erfasst werden. Eine blaue Fluoreszenz ist für eine positive Reaktion kennzeichnend, wenn als Nährmittelindikator 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid verwendet wird. Die Enterococcendichte in Gewässerproben kann unmittelbar mit der Anzahl von positiven Näpfchen des "Quanti-Trays" oder der Anzahl von positiven Röhrchen korreliert werden, und zwar mittels der MPN-Berechnungformel MPN = Nln (N/N-X), wobei N für die Gesamtzahl der getesteten Röhrchen oder Probenvertiefungen steht und X die Gesamtzahl der positiven Röhrchen oder Probenvertiefungen repräsentiert. Die maximale Nachweiszeit beträgt 24 Stunden.

Rasches Screenen
Das oben beschriebene Medium kann ferner für den Einsatz einer gut/schlecht Schnellentscheidung verwendet werden. Dieses Format verwendet die direkt proportionale Beziehung zwischen der Enterococcendichte in einer getesteten Gewässerprobe und der Nachweiszeit der positiven Ergebnisse. Das Verfahren zum raschen gut/schlechtscreeningtest, das dieselbe Formel verwendet, umfasst die Schritte:

1. Eine Gewässerprobe wird mittels vorkalibrierter steriler Gefäße aufgesammelt. Das Volumen der Proben kann abhängig von der Anwendung unterschiedlich sein, beispielsweise 100 ml, 10 ml oder 1 ml. Das Medium dieser Erfindung kann der aufgenommenen Gewässerprobe in Pulverform zugefügt werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Medium vor dem Aufnehmen der Proben in Pulverform in den Gefäßen vorhanden sein.
2. Die Probengefäße werden vorzugsweise bei 35°C oder 41°C ± 1°C inkubiert.
3. Die Fluoreszenz kann visuell oder mittels Fluorospektrophometrie beobachtet werden. Eine blaue Fluoreszenz ist für eine positive Reaktion kennzeichnend. Die für ein positives Ergebnis erforderliche Zeit wird als ein Indikator verwendet, um zu bestimmen, ob die getestete Gewässerprobe als "gefährlich", "bedenklich" oder "unbedenklich" einzustufen ist.

Experiment 1
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um den Nährmittelindikator zu ermitteln, der den raschesten Nachweis ermöglicht.
Materialien und Verfahren
Die verwendeten Enterococcus-Stämme wurden auf TSAI-Blutagarplatten gezüchtet. Die folgenden Mikroorganismen wurden gezüchtet: E. faecalis ATCC 19433, ATCC 33012, ATCC 331$6, ATCC 35550, ATCC 29212; E. faecium ATCC 19434, ATCC 35667; E. durans ATCC 6056, ATCC 11576, RTCC 19432; E. avium ATCC 14025, ATCC 35665; E. gallinarium ATCC 49573; Streptococcus bovis ATCC 9809, ATCC 35034; und S. equinus ATCC 9812. Zellsuspensionen wurden präpariert, indem die Zellen mittels eines (vorher befeuchteten) sterilen Baumwolltupfers von Platten abgenommen und in 50 mm HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bis zu einer dem MacFarland-Standard äquivalenten Trübung resuspendiert wurden. Die folgenden Enzymsubstrate wurden auf ihr Ansprechen auf β-Glukosidase getestet: o-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid (ONPD) und 4-Methylumbelliferon-β-D-Glucopyranosid (MUD).
Die Daten zeigten, dass 4-Methylumbelliferyl β-D-Glucopyranosid das am stärksten auf β-Glukosidaseaktivität von Enterococcus ansprechende Substrat war. Dieses Substrat bringt bei Hydrolyse durch β-Glukosidase blaue Fluoreszenz hervor, wenn es mit 315 μm angeregt wird (zu beobachten mit UV-Licht).
Experiment 2
Eine Untersuchung wurde durchgeführt, wobei die in Tafel 1 vorgesehene Nährmittelformel verwendet wurde. Die Untersuchung ermöglichte den Nachweis von Enterococci in einer Konzentration von 1–2 cfu/100 ml innerhalb von 16 bis 22 Stunden (siehe untenstehende Tafel). Gewässerproben wurden aufgenommen und dem oben beschriebenen Medium hinzugefügt. Die Probengefäße wurden anschließend bei 41°C ± 1°C inkubiert. Die Probengefäße wurden hinsichtlich des Aufscheinens einer blauen Fluoreszenz beobachtet. Die Ergebnisse sind nachstehend dargestellt und weisen ein empfindliches Erfassen von Enterococci in einem Medium dieser Erfindung nach.
Nachweis von Enterococcus mit einem Prototyp eines Enterococcus-Tests
Andere Ausführungsbeispiele sind im Rahmen des Gegenstands der nachfolgenden Patentansprüche möglich.

Claims

Medium um das Vorhandensein oder Fehlen von Enterococci in einer verflüssigten nichtgellierten Probe festzustellen: a) mit Alanin (0,015–0,55 g/l), Arginin (0,01–0,04 g/l), Aspartinsäure (0,04–0,10 g/l), Cystin (0,001– 0,005 g/l), Glutaminsäure (0,05–0,15 g/l), Glyzin (0,01– 0,03 g/l), Histidin (0,010–0,06 g/l), Isoleuzin (0,01– 0,10 g/l), Leuzin (etwa 0,03–0,08 g/l), Lysin (etwa 0,03– 0,07 g/l), Methionin (etwa 0,01–0,04 g/l), Phenylalanin (etwa 0,1–0,04 g/l), Prolin (etwa 0,02–0,08 g/l), Serin (0,01–0,05 g/l), Threonin (etwa 0,01–0,04 g/l), Tryptophan (etwa 0,002–0,006 g/l), Tyrosin (etwa 0,01–0,02 g/l) und Valin (etwa 0,02–0,05 g/l); Biotin (etwa 0,15 bis 0,40 μg/l), Pantothensäure (etwa 45.0–65.0 μg/l), Pyridoxin (etwa 6.0–9.0 μg/l), Riboflavin (etwa 10,0–20,0 μg/l), Folsäure (5.00–10,00 μg/l), Thiamin (10,0–20,0 μg/l), Vitamin B₁₂ (etwa 0,20– 0,30 μg/l) und Niazin (15,0–25,0 μg/l); Phosphat (0,0005–0,005 g/l), Kalium (etwa 0,0004– 0,004 g/l), Natrium (etwa 0,03 bis 0,06 g/l) und Spurenmengen von Calcium, Magnesium, Aluminium, Barium, Chlorid, Kobalt, Kupfer, Eisen, Blei, Mangan, Sulfat, Schwefel, Zinn und Zink; b) mit einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Nährmittelindikatoren, die in einer solchen Menge beigefügt sind, dass sie ausreichen um ein erkennbares charakteristisches Signal in dem Medium während des Wachstums von Enterococci zu erzeugen, wobei der Nährstoffindikator eine Nährstoffmenge in Anwesenheit von β-Glukosidase abgibt und c) mit einer wirksamen Menge eines oder mehrerer se lektiver Wirkstoffe, die in der Lage sind, das Wachstum von anderen Mikroorganismen als Enterococci zu verhindern oder zu inhibieren, wobei das Medium einen erkennbaren charakteristischen Wechsel innerhalb von 24 Stunden zeigt, wenn in der Probe, ein bis zehn Enterococci pro 100 ml enthalten sind.
Medium nach Anspruch 1, das ferner enhält: einen Puffer, 4,0 bis 6,0 g/l Amoniumsulfat, eine Quelle für Kohlendioxid und Phosphorionen, eine wirksame Menge eines β-glukosidaseinducers, eine wirksame Menge von Antibiotika, um das Wachsen von Pilzen und anderen grampositiven und gramnegativen Bakterien als Enterococci zu inhibieren.
Medium nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Nährmittelindikator bis zu einer Menge metabolisiert ist, die das als Nährstoffquelle dient, und einer Menge, die ein beobachtbares Characteristikum des Mediums verändert.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Nährmtelindikator die Farbe des Mediums in einem sichtbaren Wellenlängenbereich in Folge der Wirkung der β-glukosidase-Aktivität verändert.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Nährmittelindikator die Farbe des Mediums in einem nicht sichtbaren Wellenlängenbereich in Folge der Wirkung der β-glukosidase-Aktivität verändert.
Medium nach Anspruch 5, bei dem der Nährmittelindikator 4-methylumbelliferyl-β-D-glycopyranosid ist.
Medium nach Anspruch 1, das ferner enthält: einen Puffer, 4,000 bis 6,000 g modifizierte Stickstoffhefebase, 1,0 bis 2,5 g/l Natriumbikarbonat, 0,01 bis 1,0 g/l Kaliumphosphat, 0,009 bis 0,011 g/l Ethyl-β-D-Thioglucosid, 0,02 bis 0,03 g/l 4-methylumbelliferyl-β-D-glycolpyranosid, 0,0045 bis 0,0055 g/l Amikazinsulfat, 0,00198 bis 0,00242 g/l Amphoterizin B und 0,00476 bis 0,00794 g/l Bacitrazin.
Verfahren zum Erkennen des Vorhandenseins oder Fehlens von Enterococci in einer verflüssigten nichtgelierten Probe, mit den Schritten: a) eine Flüssigkeitsprobe wird mit dem Medium nach einem der Ansprüche 1–7 zusammengebracht, b) die Flüssigprobe und das Medium werden inkubiert und c) die Flüssigkeitsprobe wird beobachtet, um das Vorliegen eines erkennbaren Wechsels bei einem physikalischen Charakteristikum festzustellen, wobei das Medium einen erkennbaren Wechsel des Charakteristikums innerhalb von 24 Stunden im Falle einer Probe zeigt, die zwischen 1 bis 10 Enterococci pro 100 ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Beobachtungsschritt maximal 24-Stunden andauert.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Flüssigkeitsprobe aus einer Frisch- oder Meerwasserquelle entnommen ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Flüssigkeitsprobe aus einer Abwasserquelle entnommen ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Flüssigkeitsprobe aus einer Trinkwasserquelle entnommen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bei dem es sich bei dem erkennbaren Wechsel des physikalischen Charakteristikums um einen Farbwechsel handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bei dem es sich bei dem erkennbaren Wechsel des physikalischen Charakteristikums um einen sichtbaren Farbwechsels in Anwesenheit einer anregenden Lichtquelle handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14, bei dem der Inkubationsschritt bei 35°C bis 45°C durchgeführt wird.
Verfahren zum Quantifizieren der Menge oder Anzahl von Enterococci, die in einer flüssigen nicht gelierten Probe enthalten sind, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: a) die flüssige Probe wird mit dem Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammengebracht, b) die Flüssigkeitsprobe und das Medium werden in einem Behälter untergebracht; c) die Mischung aus Medium und Flüssigkeitsprobe werden inkubiert; d) die Quantität und die Qualität eines erkennbaren Wechsels eines physikalischen Charakteristikum werden beobachtet; c) die Qualität und die Quantität des erkennbaren Wechsels des physikalischen Charakteristikums werden mit höchstwahrscheinlichen Zahlenwerten verglichen, wobei das Medium einen erkennbaren Wechsel des Charakteristikums innerhalb von 24 Stunden bei der Probe zeigt, die 1 bis 10 Enterococci pro 100 ml enthält.