DE69535722T2

DE69535722T2 - Medium zum Nachweis bestimmter Mikroben in einer Probe

Info

Publication number: DE69535722T2
Application number: DE69535722T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Falmouth Ehrenfeld; Colin Fricker; David E. Scarborough Townsend
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: US5610029A; PT1528106E; DE69535747D1; DK1528106T3; ES2305912T3; PT1403378E; DE69535747T2; DE69535722D1

Description

Erfindungsgebiet
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Chemie, Biologie und Mikrobiologie und betrifft ein neues Mittel zum Nachweis der Gegenwart von Zielmikroben in einer Probe eines möglicherweise kontaminierten Materials.
Hintergrund
Mikroorganismen sind in biologischen Proben und in Umweltmedien, die für ihr Wachstum geeignet sind, ubiquitär vorhanden. Jedoch sind einige schädlich für höhere Organismen und Mittel zum Nachweis ihres Vorhandenseins sind wichtig, um die öffentliche Gesundheit zu schützen. Viele Mittel zum Nachweisen verschiedener Arten von Mikroorganismen sind verfügbar, welche zahlreiche Vorteile bezogen auf die Geschwindigkeit und Spezifität bieten.
Alle Mikroorganismen haben bestimmte Anforderungen an das Wachstum und die Reproduktion. Im Allgemeinen benötigen Mikroorganismen das Vorhandensein der folgenden Dinge für das Wachstum: eine Energiequelle, wie beispielsweise Licht oder Kohlenstoffverbindungen; und eine Quelle für Ausgangsmaterialien, einschließlich Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, wie auch Spurenelmengen anderer Mineralien. Des Weiteren müssen Mikroorganismen in einer geeigneten Umgebung vorhanden sein, wobei eine angemessene Temperatur, pH-Wert, Salinität und Sauerstoffkonzentration bewahrt wird.
Ein gewöhnliches Verfahren, das verwendet wird, um das Vorhandensein von Mikroorganismen nachzuweisen, schließt das Zugeben einer Probe zu einem Kulturmedium ein, welches alle notwendigen Elemente enthält, um das Wachstum zu unterstützen. Die Probe kann natürlich oder vorbehandelt sein, beispielsweise durch Membranfiltration, bevor sie zum Kulturmedium zugegeben wird. Das Medium kann Chemikalien, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel oder Antibiotika enthalten oder nicht, welche das Wachstum von Mikroorganismen unterdrücken, die nicht die Zielmikroorganismen sind. Für gewöhnlich werden diese Kulturmedien sterilisiert, um sicher zu stellen, dass es keine Störungen durch kontaminierende Mikroben gibt, und eine eher lange Inkubationszeit von 24 bis 48 Stunden wird für gewöhnlich benötigt, um die Mikroben in nachweisbaren Konzentrationen wachsen zu lassen. Zusätzlich müssen, sobald das Wachstum in diesen Verfahren nachgewiesen wird, die Ziel-Mikroorganismen unter Verwendung von einem oder mehreren Tests identifiziert werden, die für eine Vielzahl physikalischer oder biochemischer Eigenschaften, die für die Zielmikroben einzigartig sind, spezifisch sind. Diese Verfahren sind daher arbeitsintensiv und zeitaufwändig.
Es sind Anstrengungen unternommen worden, um das Nachweisverfahren zu vereinfachen und zu beschleunigen. Unter diesen Anstrengungen waren Versuche, die spezifischen metabolischen Nebenprodukte individueller Mikroorganismen zu messen. Diese Verfahren schließen ein: elektrische Impedanztests, ATP-Test, auf Antikörpern basierende Tests und Tests auf mit Kohlenstoff-14 markiertem Substrat. Indikatoren des mikrobiellen Wachstums sind ebenfalls verwendet worden, um das Wachstum von Zielmikroben zu überwachen, welche die Farbe nur ändern, wenn Wachstum der Zielmikroben nachgewiesen wird. Die Indikatoren reagieren normalerweise chemisch mit einem metabolischen Nebenprodukt, das durch die Zielmikroben hergestellt wird, was zu einer Farbänderung in dem Medium führt. Beispiele für Chemikalien, die die Farbe in Gegenwart von pH-Änderungen, die mit Wachstum assoziiert sind, ändern, schließen Phenolrot, Bromcresolblau und Neutralrot ein. Beispielsweise siehe Golber, U. S. Patent Nr. 3,206,317 , welcher Phenolrot verwendet, eine Chemikalie, die die Farbe in Gegenwart von sauren Abfallprodukten ändert, welche von der Zielmikrobe hergestellt werden. Berger et al., U. S. Patent Nr. 3,496,066 , beschreibt die Verwendung von Verbindungen, die Bakterien in Farbstoffe umwandeln, z. B. Tropinone und Dioxane, Bochner, U. S. Patent Nr. 4,129,483 , beschreibt die Verwendung einer nicht biologisch abbaubaren Substanz (Tetrazolium), welche chemisch reduziert wird, um eine Farbänderung hervorzurufen. In all diesen Beispielen ist der Indikator eine Verbindung, die nicht als Quelle eines benötigten Nährstoffs dient.
Edberg, U. S. Patent Nr. 4,925,789 , beschreibt die Verwendung eines Nährstoffindikators, der nicht nur als Nährstoffquelle dient, sondern auch die Farbe ändert, wenn er metabolisiert wird. Das Patent stellt ein Medium bereit, das einen Nährstoffindikator enthält, welcher, wenn er durch ein Zielbakterium metabolisiert wird, einen Rest freisetzt, der dem Medium eine Farbe oder eine andersartige nachweisbare Änderung verleiht. Das Verfahren profitiert von einer Enzymspezifität, die für eine bestimmte Spezies oder Gruppen von Bakterien einzigartig ist. Es legt die Verwendung von Antibiotika, um das Wachstum der Mikroorganismen zu selektieren, nahe, welche ins Ziel genommen werden, und stellt spezifische Beispiele für auf Flüssigkeiten basierende Tests bereit. Andere kürzlich verwendete Verfahren, wie beispielsweise Kilian et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Sect. B § 7, 271–276 (1979) und Damare et al., J. Food Science 50: 1736 (1985) berichten über die Verwendung von auf Agar basierenden Medien ohne Antibiotika. WO 94/20638 betrifft ein schnelles polyformes Nachweissystem, EP 574 977 betrifft ein direktes Verfahren zum Nachweisen sehr geringer Konzentrationen einer coliformen Kontaminierung und EP 591 554 betrifft ein schnelles Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medium, das den Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer verflüssigten Umwelt- oder biologischen Probe ermöglicht, welche in nur 18 bis 24 Stunden durchgeführt werden kann. Beispielsweise können Escherichia coli und andere Coliforme innerhalb von ungefähr 18 Stunden nach dem Beginn der Inkubationsdauer mit großer Spezifizität nachgewiesen werden. Daher ist das vorliegende Medium von den Medien des Stands der Technik verschieden, bei denen ungefähr 24 Stunden benötigt werden, um für E. coli ein Testergebnis zu gewinnen. Ein derartiges Medium kann unter Verwendung verschiedener Mengen von sowohl Nährstoffen als auch Wachstumsindikatoren hergestellt werden. Jedoch stellt die Erfindung Aminosäuren, Vitamine und elementare Inhaltsstoffe in größeren Mengen dar, als die zuvor verwendeten. Andere Merkmale der erfindungsgemäßen Medien schließen die Verwendung von Natriumpyruvat ein, um bei der Erholung metabolisch verletzter Bakterien zu helfen, die Verwendung einer Thermoäquilibrierungsdauer, die Verwendung von weniger Natriumchlorid und das Bereitstellen anderer Metabolite in geeigneten Mengen.
Das Medium enthält eine wirksame Menge an Vitaminen, Aminosäuren, Spurenelementen und Salzen, die so funktionieren, dass sie die Lebensfähigkeit und Reproduktion der Zielmikrobe in Gegenwart eines Nährstoffindikators unterstützen. Medien, die sich in dieser Erfindung als optimal herausgestellt haben, um alle Coliformen und E. coli in einer Probe nachzuweisen, schließen eine Quelle für Ammoniumionen ein (z. B. in einer endgültigen Probenkonzentration von ungefähr 4,5 bis 5,5 g/l Ammoniumsulfat), einen Puffer (z. B. ungefähr 6,0 bis 6,5 g/l HEPES freie Säure, und 4,7 bis 5,8 g/l HEPES Natriumsalz), ungefähr 0,13 bis 0,16 g/l D-Gluconsäure, eine Sulfitquelle (z. B. ungefähr 0,036 bis 0,044 g/l Natriumsulfit), ein Antipilzmittel (z. B. ungefähr 0,0009 bis 0,0011 g/l Amphotericin B), eine Quelle für Magnesiumionen (z. B. ungefähr 0,09 bis 0,11 g/l Magnesiumsulfat), einen Nährstoffindikator (z. B. ungefähr 0,450 bis 0,550 g/l ortho-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG) und ungefähr 0,067 bis 0,085 g/l 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid (MUG)), eine Quelle für Zinkionen (z. B. ungefähr 0,00045 bis 0,00055 g/l Zinksulfat), und eine Quelle für Manganionen (z. B. ungefähr 0,00045 bis 0,00055 g/l Mangansulfat).
Zusätzlich werden die folgenden Bestandteile in den folgenden minimalen Mengen bereitgestellt. Die maximalen oder optimalen Mengen jedes Inhaltsstoffs können vielfach größer (z. B. 3- bis 10- oder sogar 20-fach) sein als die unten angegebenen. Genauer gesagt, hat ein derartiges Medium einen Gesamtstickstoffgehalt von mindestens ungefähr 1,1 bis 1,7 g/l. Aminosäuren, die für das Wachstum der Zielmikrobe benötigt werden, werden bereitgestellt. Nicht alle Aminosäuren müssen bereitgestellt werden, und die relativen Mengen jeder davon können variieren. Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass natürliche Quellen für derartige Aminosäuren statt reiner Quellen verwendet werden können. Aminosäuren können durch eine Vielzahl an Quellen bereitgestellt werden. Normalerweise müssen nur wesentliche Aminosäuren, die nicht endogen durch die Zielmikroben synthetisiert werden können, bereitgestellt werden. Diese können durch natürliche Quellen bereitgestellt werden (z. B. durch Extrakte gesamter Organismen), als Gemische oder in gereinigter Form. Die natürlichen Gemische können variierende Mengen derartiger Aminosäuren und Vitamine (siehe unten) enthalten. Genaue Mengen derartiger Aminosäuren und Amine sind unten angegeben. Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass viele verschiedene Kombinationen aus Aminosäuren und Vitaminen in Medien dieser Erfindung verwendet werden können. Die Listen, die unten angegeben werden, stellen nur beispielhaft ein derartiges Beispiel dar. Aminosäuregehalte schließen mindestens die folgenden in Mengen in mindestens ungefähr den angegebenen Mengen dar: Alanin (0,025 g/l), Arginin (0,03 g/l), Asparginsäure (0,056 g/l), Glutaminsäure (0,1 g/l), Glycin (0,015 g/l), Prolin (0,09 g/l), Cystin (0,002 g/l), Histidin (0,006 g/l), Isoleucin (0,01 g/l), Leucin (0,03 g/l), Lysin (0,03 g/l), Methionin (0,01 g/l), Phenylalanin (0,018 g/l), Serin (0,029 g/l), Threonin (0,018 g/l), Tryptophan (0,003 g/l), Tyrosin (0,0064 g/l) und Valin (0,023 g/l).
Andere anorganische Verbindungen sind eingeschlossen, um dem Wachstum der Zielmikrobe zu helfen. Diese schließen die folgenden ein (insofern als sie nicht bereits in den oben genannten Quellen der zahlreichen chemischen Stoffe bereitgestellt werden): Eisen (z. B. mindestens ungefähr 0,00165 μg/l), Calcium (z. B. mindestens ungefähr 0,0003 g/l), Phosphat (z. B. mindestens ungefähr 0,1 g/l), Kalium (z. B. mindestens ungefähr 0,007 g/l, vorzugsweise ungefähr 0,05 g/l), Natrium (z. B. mindestens unge fähr 0,03 g/l) und Spurenmengen an Kobalt, Kupfer, Blei, Magnesium, Mangan, Chlor, Zinn und Zink.
Vitamine, die von der Zielmikrobe für das Wachstum benötigt werden, werden ebenfalls bereitgestellt. Diese können in reiner Form oder als Teil eines eher komplexen Mediums bereitgestellt werden. Solche Vitamine können in mindestens den folgenden Mengen vorhanden sein: Biotin ((0,00005 g/l), Cyanocobalamin (Spur), Cholin (0,05 g/l), Inositol (0,060 g/l), Nicotinsäure (0,014 g/l), Niacin (0,00385 g/l), PABA (0,02 g/l), Folsäure (0,000075 g/l), Pantothensäure (0,01095 g/l), Pyridoxin (0,0015 g/l), Riboflavin (0,0028 g/l), Thiamin (0,0037 g/l) und Thymidin (0,010 g/l).
Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass organischer Kohlenstoff, Stickstoff, Spurenelemente, Vitamine und Aminosäuren in vielen Formen bereitgestellt werden können. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, eine Menge an Vitaminen und Aminosäuren zu haben, die mindestens so groß ist, wie die genauen Mengen, die oben angegeben sind, aber Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass die tatsächliche Konzentration jedes Inhaltsstoffs variiert werden kann, so dass eine Reduzierung der Menge eines Inhaltsstoffs durch einen Anstieg der Menge eines anderen kompensiert werden kann. Dies ist besonders relevant, wenn die Wachstumsanforderungen einer bestimmten Zielmikrobe bekannt sind. Einige Inhaltsstoffe können in reduzierten Mengen bereitgestellt werden oder weggelassen werden, wenn sie endogen durch die Zielmikroorganismen synthetisiert werden können. Am bevorzugtesten ist die Gesamtmenge solcher Inhaltsstoffe in einem großen Überschuss der Gesamtmenge vorhanden, die in dem oben erwähnten Beispiel bereitgestellt wird. Mengen in der Größenordnung von fünf bis zehn Mal derer, die oben beschrieben worden sind, sind besonders wirksam beim Ermöglichen des Nachweises von Mikroorganismen innerhalb eines kurzen Zeitraums (18 Stunden), wobei die Nachweis-Spezifizität bewahrt wird.
Andere Inhaltsstoffe eines derartigen Mediums schließen Antibiotika ein, die gegen Gram-positive nicht anvisierte Mikroben wirksam sind, Antibiotika, die gegen Gram-negative nicht anvisierte Mikroben wirksam sind, Induktoren für Enzyme, die den Metabolismus des Nährstoffindikators katalysieren, DNA-Vorläufermoleküle, Aminosäure-Vorläufermoleküle und ergänzende Quellen für Kalium und Phosphor.
Der Nährstoffindikator ist in dem Medium in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um das Wachstum der Zielmikrobe zu unterstüzen, bis ein nachweisbares charakteristisches Signal in dem Medium während des Wachstums hergestellt wird. Zusammen ermöglichen das Vitamin, die Aminosäure, das Spurenelement, das Salz und die Nährstoffindikator-Inhaltsstoffe das ausreichende Wachstum der Zielmikrobe, so dass eine nachweisbare Änderung in der Probe in weniger als ungefähr 24 Stunden beobachtet werden kann. Der Nährstoffindikator ändert eine nachweisbare Eigenschaft der Probe nur dann, wenn sie durch die Zielmikrobe metabolisiert wird. Daher kann sie verwendet werden, um die Gegenwart oder die Abwesenheit einer Mikrobe in der Probe zu bestätigen. Der Nährstoffindikator muss nur durch die Zielmikrobe in dem Medium metabolisiert werden. Wenn andere Mikroben in der Probe vorhanden sind, die den Nährstoffindikator metabolisieren können, dann muss ihr Wachstum durch die Verwendung spezifischer Antibiotika unterdrückt werden. Zusätzlich kann das Medium, obwohl es bevorzugt ist, dass der Nährstoffindikator die einzige Quelle des spezifischen Typs an Nährstoff für die Zielmikrobe ist, andere derartige Quellen enthalten, aber in Mengen, die nicht die Spezifizität des Mediums reduzieren. Beispielsweise kann der Nährstoffindikator die einzige Kohlenstoffquelle der Zielmikrobe sein. Alternativ dazu können andere Kohlenstoffquellen vorhanden sein (z. B. Aminosäuren), welche von der Zielmikrobe vorzugsweise nicht verwendet werden. Falls gewünscht, kann eine kleinere Menge einer anderen Kohlenstoffquelle vorhanden sein, die durch die Zielmikrobe vorzugsweise verwendet wird, aber die Menge, die bereitgestellt wird, ist derart, dass sie nicht die Spezifizität des Mediums gegenüber einem ohne eine derartige Kohlenstoffquelle reduziert.
Der Begriff „Zielmikrobe" bedeutet eine oder mehrere Mikroben, deren Gegenwart oder Abwesenheit zu bestimmen ist. Der Begriff kann sich auf eine einzelne Mikrobe beziehen (z. B. Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum und Klebsiella pneumonia), einen Genus an Mikroben, eine Anzahl verwandter von Mikroben-Spezies (z. B. Coliforme), oder noch eine größere Gruppe an Mikroben, die eine gemeinsame Eigenschaft haben (z. B. alle Gram-negativen Bakterien). Die Erfindung zieht den Entwurf des Mediums und des Verfahrens in Erwägung, um einzigartige Enzym-Spezifizitäten oder andere Eigenschaften, die für verschiedene Gruppen, Familien oder Arten von Mikroben spezifisch sind, auszunutzen. Daher kann der Nährstoffindikator in Abhängigkeit davon, welche Mikrobe als Ziel ausgewählt ist, variieren. Jedoch wird nicht beabsichtigt, dass der Begriff „Zielmikrobe" alle Mikroben einschließt.
Der Begriff „18 Stunden" meint die Zeitspanne, die für ungefähr 95% der Flüssigproben benötigt wird, die nur ungefähr ein bis zehn Coliforme pro 100 ml enthalten, um eine nachweisbare Änderung der Eigenschaft zu zei gen. Die Temperatur, Menge und Art des Enzym-Induktors, der vorhanden ist, die Menge der Nährstoffe, die im Medium bereitgestellt werden, und die relative Gesundheit der Bakterien betreffen alle den Nachweisdauer. Die Menge an Nährstoffen, wie beispielsweise Aminosäuren, Vitaminen und Spurenelementen, die bereitgestellt wird, kann die Wachstumsrate der Zielmikrobe beeinflussen, und daher die Nachweisdauer. Die thermische Äquilibrierung der Probe auf eine Inkubationstemperatur von ungefähr 35°C nach der Zugabe des Mediums kann die Zeit, die zum Nachweis benötigt wird, verkürzen. Die Menge des Enzyminduktors kann ebenfalls die Nachweisdauer verkürzen. Die Enzyminduktoren, die im Medium gefunden werden, sind Mittel, die so wirken, dass sie die Aktivität oder Expression des Enzyms induzieren, welches den Nährstoffindikator metabolisiert. Solche Induktoren schließen Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), welcher β-D-Galactosidase-Aktivität induziert, und Ethyl-β-D-thioglucosid, welcher β-Glucosidase-Aktivität induziert. Die relative Gesundheit der Mikrobe betrifft ebenfalls den Zeitraum, der für den Nachweis benötigt wird. Die Zugabe von Mitteln, wie Pyruvat, welches bei der Gewinnung verletzter Organismen helfen kann, kann daher den Nachweis beschleunigen. Wenn große Mengen an Zielmikroben in der Probe vorhanden sind (d. h. mehr als 10 Mikroben/100 ml Probe), ist ebenfalls ein schnellerer Nachweis möglich. In dieser Erfindung ermöglicht das bereitgestellte Medium den Nachweis geringer Mengen an Zielmikroben (d. h. weniger als 10/100 ml) in dem 18 bis 24 Stunden-Zeitraum, mindestens 95% des Zeitraums. Standardverfahren können verwendet werden, um eine derartige Fähigkeit zu bestimmen.
Der Begriff „Medium" meint ein festes, pulveriges oder flüssiges Gemisch, welches alle oder im Wesentlichen alle notwendigen Nährstoffe enthält, um das Wachstum und die Reproduktion von Zielmikroben zu unterstützen. Diese Erfindung schließt sowohl Medien ein, die sterilisiert sind (d. h. in denen nach Inkubation des Mediums alleine oder mit einem sterilen Verdünnungsmittel kein Wachstum stattfindet), wie auch Medien, die nicht steril sind.
Der Begriff „verflüssigt" meint im Wesentlichen in flüssiger Form, obwohl es ebenfalls pulverisierte oder homogenisierte Proben fester Substanzen einschließen soll, die mindestens einen 10%igen Flüssigkeitsgehalt haben. Diese Formulierung soll ein geliertes Medium ausschließen, welches beispielsweise mit Agar gebildet wird.
Die Begriffe „Umwelt" und „biologisch" bedeuten, dass sie von einer Substanz stammen oder kommen, die in der Lage ist, eine oder mehrer Lebens formen zu unterstützen, einschließlich Algen, Pilzen und Bakterien. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Freizeitgewässer, Meerwasser, Trinkwasser, Abwasserabläufe und Nahrungsmittelsubstanzen.
Der Begriff „Inokulierung" bedeutet, dass zum oder nahe dem Zeitpunkt die verflüssigte Umwelt- oder biologische Probe mit dem Medium dieser Erfindung gemischt wird. Es soll den Zeitpunkt beschreiben, bei dem zwei Substanzen im Wesentlichen miteinander vermischt werden.
Der Begriff „wirksame Menge" ist eine Menge innerhalb eines Bereichs, welche das Wachstum und die Reproduktion eines Zielorganismus ermöglicht oder fördert, die innerhalb einer spezifischen Zeit stattfinden. Das bedeutet, dass eine Menge, die Mikroben ermöglicht, sich an das Medium anzupassen, die notwendigen Bestandteile für die Reproduktion zu synthetisieren und sich anschließend zu reproduzieren, gemeint ist. Das soll nicht genau gemeint sein und kann in Abhängigkeit von Faktoren, wie beispielsweise der Probengröße und der Konzentration der Zielmikroben variieren. Im Allgemeinen gibt der Begriff die Menge an, die benötigt wird, um weniger als 100 Zielmikroben pro 1 ml Probe nachzuweisen, mehr bevorzugt weniger als 100 Mikroben pro 100 ml Probe oder sogar 1 Mikrobe pro 100 ml Probe.
Die Begriffe „Vitamine", „Aminosäuren", „Spurenelemente" und „Salze" sollen alle Moleküle, Verbindungen und Substanzen einschließen, die durch Fachleute auf dem Gebiet in die jeweilige Kategorie eingeordnet werden, ob sie organisch oder anorganisch sind, und die Kategorien sollen keine Substanz ausschließen, welche notwendig oder förderlich für die Aufrechterhaltung des Lebens sind.
Der Begriff „Antibiotika" bedeutet ein Molekül oder Peptid, welches das Wachstum und die Reproduktion einer oder mehrerer Spezies oder Gruppen von Nicht-Zielmikroorganismen verhindert oder inhibiert. Beispiele sind im Fachgebiet gut bekannt, jedoch soll dieser Begriff alle Detergentien ausschließen, welche spezifisch oder unspezifisch bakterielles Wachstum inhibieren oder verhindern. Beispiele spezifischer Antibiotika, die in der Erfindung nützlich sein können, schließen Colistin, Nalidixinsäure und Ansiomycin ein.
Der Begriff „Nährstoffindikator" bedeutet ein Molekül oder eine Substanz, die einen Rest enthält, welcher eine Quelle für einen wesentlichen Nährstoff der Zielmikrobe ist, und ein Rest, welcher eine charakteristische Änderung im Medium oder der Probe verursacht oder hervorruft. Ein Nährstoffindikator schließt Nährstoffquellen ein, an die Chromogene angehängt sind oder diese konjugiert haben. Nährstoffquellen können essentielle Vita mine, Mineralstoffe (z. B. Phosphat), Spurenelemente, Aminosäuren, oder Kohlenhydrat-Energiequellen (z. B. Lactose) bereitstellen. Die Nährstoffanforderungen eines Mikroorganismus steigen, wenn der Mikroorganismus aus der Phase, in der Nährstoffe für die Reproduktion angehäuft werden (Lag-Phase) in die Phase voranschreitet, während der die Reproduktion tatsächlich mit einer relativ schnellen Rate stattfindet (Log-Phase). Konsequenterweise werden die Nährstoffindikatoren optimalerweise während ihrer Wachstumsphasen metabolisiert, welche eine nachweisbare und charakteristische Änderung in der Probe hervorruft. Vorzugsweise schließt der Nährstoffindikator einen Nährstoffrest und ein Chromogen ein. Chromogene schließen irgendwelche Reste ein, die eine Farbänderung hervorrufen, welche im sichtbaren Bereich oder unter Fluoreszenz beobachtbar ist, wenn diese mit einer geeigneten Energiequelle angeregt wird. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Orthonitrophenyl, Phenolphthalein und 4-Methylumbelliferonreste. Während der Nährstoffindikator die einzige Quelle eines wesentlichen Nährstoffs bereitstellen kann, können auch andere Quellen derartiger Nährstoffe bereitgestellt werden, sofern die adäquate Selektivität und Sensitivität des Mediums bewahrt wird.
Der Begriff „nachweisbares charakteristisches Signal" schließt jede Änderung in einer Probe ein, die durch einen oder mehrere der menschlichen Sinne nachgewiesen werden kann. Der Begriff schließt beispielsweise eine Farbänderung in sichtbaren oder nicht sichtbaren Wellenlängenbereichen ein, eine Änderung des Zustands, wie beispielsweise zwischen fest, flüssig und gasförmig, eine Emission von Gas oder eine Geruchsveränderung.
Das Medium schließt ausreichend Natriumpyruvat ein, um beim Wachstum metabolisch verletzter Zellen zu helfen. Der Begriff „metabolisch verletzt" schließt Umstände ein, bei denen der zelluläre Metabolismus durch ein externes Trauma vom optimalen oder homöostatischen Zustand verändert wurde. Beispiele einer „metabolischen Verletzung" schließen Vorgänge ein, wie beispielsweise die Exposition der Zelle gegenüber zu übermäßiger Wärme, Kälte, Chlor oder Trockenbedingungen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ändert der Nährstoffindikator die Farbe des mikrobenspezifischen Mediums. Die Farbänderung kann im sichtbaren Wellenlängenbereich auftreten, oder sie kann Fluoreszenz sein, welche in einem sichtbaren Wellenlängenbereich nach Exposition gegenüber einer externen UV-Quelle auftritt. Die Farbe stammt im Allgemeinen aus der enzymatischen Freisetzung eines chromogenen Restes vom Nährstoffindikator. Dieser Rest ist gefärbt, wenn er an den Nährstoffanteil des Nährstoffindi kators konjugiert ist, und ist farblos, wenn er in nicht konjugierter Form vorliegt (d. h. wenn er nicht länger konjugiert ist an den Nährstoffrest oder daran gebunden ist). Beispiele chromogener Reste, die an einen Nährstoffrest konjugiert werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Orthonitrophenylreste, die eine gelbe Farbe hervorrufen, wenn sie vom Nährstoffindikator freigesetzt werden, Phenolphthaleinreste, die eine rote Farbe hervorrufen, wenn sie von dem Nährstoffindikator freigesetzt werden, 4-Methylumbelliferonreste, welche fluoreszieren, wenn sie bei ungefähr 366 nm angeregt werden, wenn sie vom Nährstoffindikator freigesetzt werden, und Brom-Chlor-Indol-Reste, welche blau werden, wenn sie vom Nährstoffindikator freigesetzt werden.
Der Begriff „mikrobenspezifisches Medium" bedeutet ein Medium, das im Wesentlichen nur das Wachstum der Zielmikrobe ermöglicht. Dies schließt Medien ein, die ein oder mehrer Antibiotika enthalten, die spezifisch für die Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen sind, die nicht die Zielmikrobe sind, und schließt Medien ein, die alternativ oder zusätzlich einen oder mehrere Nährstoffindikatoren enthalten, welche vorzugsweise nicht in wesentlichem Ausmaß durch Mikroorganismen, abgesehen von der Zielmikrobe, metabolisiert werden. Der Begriff „wesentlich", in diesem Zusammenhang verwendet, bedeutet, dass das Medium immer noch das spezifische (d. h. mindestens 95% oder sogar 98% genau) und sensitive (d. h. mindestens 95% oder sogar 98% Nachweisniveaus) des Nachweises der Zielmikrobe ermöglichen, wenn mit Standardverfahren gemessen wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Mikrobe ein coliformes Bakterium, oder noch spezifischer ist die Zielmikrobe Escherichia coli. Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen die Wahl des Nährstoffindikators ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Nährstoffindikator β-D-Glucuronidasesubstrat, Beispiele hierfür schließen Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid, β-Naphthalamid-β-D-Glucuronid, α-Naphthol-β-D-Glucuronid und 4-Methylumelliferyl-β-D-Glucuronid ein. Alternativ dazu ist der Nährstoffindikator ein β-D-Galactosidase-Substrat, wobei Beispiele hierfür Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid und 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactopyranosid einschließen. Der Nährstoffindikator kann ein β-D-Glucosidase-Substrat sein, wobei Beispiele hierfür Orthonitrophenyl-β-D-Glucose einschließen. In noch einer weiteren Ausführungsform kann der Nährstoffindikator ein L-Pyronidonylaminopeptidase-Substrat sein, wie beispielsweise Orthonitrophenyl-β-L-pyronidonyl, β-Naphthalamid-β-L-pyronidonyl, α-Naphthol-β-L-pyronidonyl und Methylumbelliferyl-β-L-pyronidonyl oder der Nährstoff indikator kann ein L-Alaninaminopeptidase-Substrat sein, wie beispielsweise L-Alanin-β-L-orthonitrophenyl, β-Naphthalamid-β-L-alanin, α-Naphthol-β-L-alanin und 4-Methylumbelliferyl-β-L-alanin.
Der Begriff „Coliform" kennzeichnet irgendeine Gruppe nicht-sporenbildender Gram-negativer, oxidase-negativer, stäbchenförmiger Bakterien, die β-Galactosidase-Aktivität aufweisen und normalerweise den Gastrointestinaltrakt von Menschen besiedeln. Die Gruppe schließt Klebsiella pneumonia und Escherichia coli ein, deren Vorhandensein in Wasser von Fachleuten als vermutlicher Beweis einer fäkalen Kontamination verstanden wird, so wie Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii und Serratia plymuthica.
Das Medium enthält ebenfalls ein oder mehrere Antibiotika, die Mikroben, die nicht die Zielmikroben sind, daran hindern, den Nährstoffindikator zu metabolisieren. Das bedeutet, dass das Medium Antibiotika enthält, die spezifische Inhibitoren des Wachstums von Mikroben sind, welche nicht die Zielmikrobe sind, und wirksam das Wachstum von mindestens einigen dieser Mikroben verhindern. Am meisten bevorzugt wirken diese Antibiotika gegen ein oder mehr Gram-positive und Gram-negative nicht-coliforme Bakterien. Beispiele dieser Anti-Mikrobizide, welche gegen andere Bakterien und Hefen nützlich sind, schließen Colistin, Nalidixidinsäure, Ansiomycin und Amphotericin-B ein.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer Umwelt- oder biologischen Flüssigkeitsprobe, vorzugsweise, einschließlich des Schritts des Aufwärmens der Probe auf Inkubationstemperatur in einem Flüssigkeitsinkubator nach der Zugabe des mikroben-spezifischen Mediums. Am bevorzugtesten ist die Inkubationstemperatur ungefähr 35°C. Der Begriff „Flüssigkeitsinkubator" kennzeichnet eine Flüssigkeit, die auf eine spezifische Temperatur oder einen Temperaturbereich aufgewärmt wurde. Diese kann beispielsweise jede Art von Wasserbad einschließen. Ein derartiger Inkubator ist gegenüber zuvor verwendeten Luftinkubatoren vorteilhaft, da das Medium schneller in einem Flüssiginkubator als in einem Luftinkubator die optimale Inkubationstemperatur erreichen kann.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer Umwelt- oder biologischen Flüssigkeitsprobe innerhalb von 24 Stunden. Escherichia coli und andere Coliforme können unter Verwendung dieses Verfahrens innerhalb von nur ungefähr 18 Stunden nachgewiesen werden. Dieses Verfahren umfasst zuerst das Mischen der Probe mit dem erfindungsgemäßen Medium, das Aufwärmen der Probe und der Mediummischung auf eine Inkubationstemperatur, vorzugsweise 35°C, für ungefähr 20 Minuten. Die Probe wird dann in einen Luftinkubator überführt, vorzugsweise bei 35°C für ungefähr 18 Stunden. Das Medium schließt eine wirksame Menge an Vitaminen, Aminosäuren, Elementen und Salzen ein, so dass coliforme Mikroben wachsen und sich reproduzieren. Das Medium schließt auch eine wirksame Menge eines Nährstoffindikators ein, um das Wachstum der coliformen Bakterien zu unterstützen, und welcher ein nachweisbares charakteristisches Signal erzeugt, wenn er durch die Zielmikrobe metabolisiert wird. Als nächstes wird die Probe überwacht, um festzustellen, ob die nachweisbare Eigenschaft sich verändert hat. Vorzugsweise enthält das Medium ebenfalls ein oder mehrere Antibiotika in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum nicht coliformer Organismen, welche möglicherweise in der Testprobe vorhanden sind, zu inhibieren oder zu verhindern.
Der Quantifizierungsschritt schließt das Bereitstellen einer Umwelt- oder biologischen Probe in einer flüssigen Form bereit. Die Probe wird in das Probeaufnahmegefäß gegeben oder darin eingefüllt, das von Naqui et al. beschrieben wurde, und mit einem Medium gemischt, um das Wachstum der Zielbakterien zu ermöglichen und zu fördern. Das Gemisch wird inkubiert und die Menge und Qualität der Farbänderung wird nachgewiesen. Die Menge und Qualität, die gewonnen wird, wird mit einer Reihe an Proben verglichen, bei denen die Konzentration an Bakterien bekannt war.
Die Erfindung stellt ein optimiertes Medium zur Bestimmung des Vorhandenseins von Zielmikroben bereit. Mikroben, z. B. Bakterien, wachsen in diesem Medium, infolge der erhöhten Menge an Vitamin und darin bereitgestellten Aminosäuren, viel schneller als in den gegenwärtig verfügbaren. Daher sind die Testergebnisse schneller verfügbar. Schnelle Ergebnisse sparen sowohl Geld als auch Zeit im Labor. Die Geschwindigkeit verringert auch die Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, was frühe Warnungen und Umkehrmaßnahmen ermöglicht, um mit dem Vorhandensein einiger Mikroorganismen umzugehen, die beispielsweise an solchen Stellen gefunden werden, wie Trinkwasserreservoirs und Freizeitgewässern. Des Weiteren benötigt das erfindungsgemäße Verfahren im Allgemeinen keine bestätigenden Tests, da Mikroorganismen-spezifische Nährstoffindikatoren verwendet werden können. Zusätzlich benötigt die Erfindung nicht die Verwendung eines sterilen Mediums.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hierfür und aus den Ansprüchen klar.
Kurzbeschreibung der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen In der folgenden Beschreibung wird auf zahlreiche Methoden Bezug genommen, die Fachleuten auf dem chemischen, biologischen und mikrobiologischen Gebiet bekannt sind. Die Zusammensetzungen, Verfahren und Produkte dieser Erfindung sind auf biologische und Umwelt-Proben anwendbar, und sind auf dem chemischen, biologischen und mikrobiologischen Gebiet zum Nachweis von Mikroorganismen nützlich.
Nachweisen von Mikroorganismen auf Grundlage der Enzymspezifizität Spezifische Mikroorganismen erhalten ihre Nährstoffe aus einer großen Anzahl an Quellen. Jedoch kann die Fähigkeit, bestimmte Quellen zu metabolisieren, für einen bestimmten Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen einzigartig sein. Familien, Gruppen oder Arten von Mikroorganismen können eine Enzymspezifität für bestimmte Nährstoffe teilen, welche anderen Mikroorganismen fehlt. Indem von den metabolischen Eigenschaften spezifischer Mikroorganismen profitiert wird, ist es möglich, auf die Gegenwart dieser Enzymsysteme zu testen, und daher auf die Mikroorganismen, die diese Enzymsysteme selbst herstellen. Siehe Edberg, supra. Viele Enzyme sind identifiziert worden, welche für eine bestimmte Gruppe von Mikroorganismen spezifisch sind, und andere werden wahrscheinlich in der Zukunft identifiziert werden.
Gram-negative Bakterien
Gram-negative Bakterien enthalten ein Endotoxin als Teil ihrer äußeren Zellmembran. Sie können Umwelt- oder biologische Proben, wie auch Pharmazeutika und andere medizinische Präparate kontaminieren. Daher ist es wichtig, wirksame Screeningverfahren zu besitzen, die zur Verfügung stehen, um zu bestimmen, ob Gram-negative Bakterien vorhanden sind.
Einige Gram-negative Bakterien als Gruppe haben eine L-Alaninaminpeptidase-Enzymaktivität. Nährstoffindikatoren, wie beispielsweise L-Alanin-β-orthonitrophenyl, β-Naphthalamid-β-L-alanin, α-Naphthol-β-L-alanin und 4-Methylumbelliferyl-β-L-alanin können in dem Medium als Nährstoffindikatoren verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Gram-negativen zu testen. Antibiotika, die für das Eliminieren aller Gram-positiven Bakterien aus dem Medium nützlich sind, sind im Fachgebiet ebenfalls gut bekannt. Daher ist es möglich, die Gegenwart von irgendwelchen Gram-negativen Bakterien unter Verwendung von Nährstoffindikatoren mit L-Alaninaminopeptidase-Aktivität in einem Medium nachzuweisen, welches ein Antibiotikum enthält, das Gram-positive Bakterien eliminiert.
Enterococcus
Das Enzym β-D-Glucosidase wird in der Gruppe der Enterococcen der Bakterien gefunden. Das Enzym kann die Hydrolyse eines geeigneten Nährstoffindikators katalysieren, welcher chromogene oder fluorogene Reste an ein β-Glucosid gebunden enthält. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Enterococcen in einer Probe anzuzeigen. Nährstoffindikatoren, wie beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid können verwendet werden, um die Gegenwart von Enterococcen anzuzeigen. Das Wachstum anderer Mikroorganismen, die β-D-Glucosidase-Aktivität exprimieren, kann durch das Bereitstellen eines Mediums inhibiert werden, welches Antibiotika enthält, die das Wachstum der Nicht-Zielmikroorganismen unterstützt, aber das Wachstum von Enterococcen nicht wesentlich inhibiert. Amikacinsulfat, Bacitracin und Amphotericin B sind Beispiele für derartige Antibiotika. Zusätzlich kann das Wachstum anderer Organismen durch das Bereitstellen einer Wachstumsumgebung inhibiert werden, welche einen hohen pH-Wert von ungefähr 9,6 hat, oder eine erhöhte Temperatur von ungefähr 45°C. Enterococcen können bei diesem hohen pH-Wert und der erhöhten Temperatur wachsen, was einen spezifischen Nachweis von Enterococcen unter diesen Bedingungen ermöglicht.
Staphylococcus aureus
Diese Spezies ist in der Lage, Orthonitrophenylphosphat zu metabolisieren. Daher wächst Staphylococcus aureus, wenn das Wachstumsmedium diesen Nährstoffindikator als einzige Phosphatquelle enthält, während Mikroorganismen, die nicht in der Lage sind, Orthonitrophenylphosphat zu metabolisieren, es nicht können. Eine Farbänderung wird durch Freisetzung des Orthonitrophenylrestes erzeugt.
Mycobacterium fortuitum
Diese Art benötigt SO₄ als Schwefelquelle und kann Phenolphthaleinsulfat metabolisieren. Auf diese Weise wächst diese Art in einem Selektionsmedium, dessen einzige Schwefelquelle Phenolphthaleinsulfat ist, und erzeugt eine charakteristische Farbänderung durch Freisetzung des Farbrestes.
Nachweis von Escherichia coli
Das Enzym β-D-Glucuronidase ist in E. coli vorhanden. Nährstoffindikatoren, wie beispielsweise Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid, β-Naphthalamid-β-D-glucuronid, α-Naphthol-β-D-Glucuronid oder Mehtylumbelliferyl-β-D-Glucuronid sind Beispiele für Nährstoffindikatoren, die in einem Medium zum Nachweis von E. coli verwendet werden können. Die Antibiotika Vancomycin und Ansiomycin können hinzugegeben werden, um E. coli aus Gram-positiven Bakterien und Hefen in Mengen von ungefähr 0,0001% bis 0,01% w/w zu selektieren.
Edberg, U. S. Patent Nr. 4,925,789 , beschreibt ein auf einer Flüssigkeit basierendes bakterielles Wachstumsmedium, welches einen spezifischen Nachweis von E. coli in einer Probe nach ungefähr 24 Stunden Inkubation erlaubt. Es hat eine beschriebene Spezifizität, das die Gegenwart von einer CFU (Kolonien-bildenden Einheit) in 100 ml Volumen nachzuweisen. Jedoch ist im Gegensatz zu den spezifischen Beispielen in Edberg der Nachweis der gesamten Coliformen einschließlich solcher Bakterien wie E. coli, welche in ungefähr 18 Stunden erzielt werden kann, wenn andere Medien oder Methoden, die in dieser Erfindung beschrieben sind, verwendet werden und überraschenderweise eine Spezifizität, um eine CFU pro 100 ml Volumen nachzuweisen, immer noch zu erreichen. Genauer gesagt, beschreibt diese Erfindung Medien, die die Anzahl an Vitaminen und Aminosäuren, die vorhanden sind, erhöhen, um das Zellwachstum zu erleichtern. Beispielsweise werden kürzere Nachweisdauern erreicht, wenn die Menge an Vitaminen und Aminosäuren über die in dem Medium, das von Edberg beschrieben wurde, erhöht wird. Ein Medium, das die folgenden Verbindungen einschließt, ist besonders nützlich zum Nachweis von Escherichia coli, was aufgrund der schnelleren Wachstumsrate und der genaueren Spezifizität einen Nachweis innerhalb von 24 Stunden ermöglicht. Das Bereitstellen der Mengen des Bestandteils I in Konzentrationen von 5 bis 10 Mal derer, die angegeben sind, ermöglicht den Nachweis von Escherichia coli innerhalb von 18 Stunden.

Während spezifische Aminosäuren und Vitamine, wie auch einige Elemente, angegeben sind, erkennen Fachleute auf dem Gebiet, wie oben beschrieben wurde, dass die relativen Mengen jedes Bestandteils ohne Spezifizitätsverlust signifikant variieren können. Tabelle 1 Bestandteil I

Inhaltsstoff	Quelle	Menge
Stickstoff		1,10 bis 1,70 g/l
Aminosäuren	Alanin	0,025 bis 0,08 g/l
	Arginin	0,030 bis 0,08 g/l
	Asparaginsäure	0,056 bis 0,085 g/l
	Cystin	0,002 bis 0,005 g/l
	Glutaminsäure	0,102 bis 0,207 g/l
	Glycin	0,015 bis 0,15 g/l
	Histidin	0,005 bis 0,020 g/l
	Isoleucin	0,0145 bis 0,046 g/l
	Leucin	0,030 bis 0,079 g/l
	Lysin	0,034 bis 0,068 g/l
	Methionin	0,011 bis 0,023 g/l
	Phenylalanin	0,018 bis 0,037 g/l
	Prolin	0,088 bis 0,093 g/l
	Serin	0,028 bis 0,044 g/l
	Threonin	0,018 bis 0,032 g/l
	Tryptophan	0,0036 bis 0,005 g/l
	Tyrosin	0,0064 bis 0,018 g/l
	Valin	0,023 bis 0,056 g/l
Elemente	Kobalt	in Spuren
	Kupfer	in Spuren
	Eisen	0,00165 bis 0,00165 mg/l
	Blei	in Spuren
Vitamine	Biotin	0,00005 bis 0,00016 mg/l
	Cholin	0,050 bis 0,10 mg/l
	Cyanocobalamin	in Spuren
	Folsäure	0,000075 bis 0,0014 mg/l
	Inositol	0,060 bis 0,12 mg/l
	Niacin	0,00385 bis 0,0070 mg/l
	Nicotinsäure	0,014 bis 0,03 mg/l
	PABA	0,020 bis 0,038 mg/l
	Pantothensäure	0,01 bis 0,013 mg/l
	Pyridoxin	0,0015 bis 0,0021 mg/l
	Riboflavin	0,0028 bis 0,0058 mg/l
	Thiamin	0,0037 bis 0,026 mg/l
	Thymidin	0,010 bis 0,02 mg/l
Enzym	Induktoren	0,015 g/l

Bestandteil II	Konzentration (g/l)*
Ammoniumsulfat (wasserfrei)	5,000
HEPES (freie Säure)	6,864
HEPES (Na⁺-Salz)	5,292
D-Gluconsäure (Hämicalciumsalz)	0,145
Natriumsulfit (wasserfrei)	0,040
Amphotericin B (gelöst)	0,0010^A
Magnesiumsulfat (wasserfrei)	0,100
ONPG	0,500
Methylumbilliferyl-β-D-Glucuronid	0,075
Zinksulfat (Heptahydrat)	0,0005
Mangansulfat	0,0005
Pyruvatsäure (Na⁺-Salz)	0,005
Natriumchlorid	0,100
DNA-Vorläufer	0,005
Antibiotika gegen Gram-positive	0,005
Antibiotika gegen Gram-negative (nicht-coliform)	0,01
Aminosäure-Vorläufer	0,001
Phosphatquellen	0,1

*Spurenmengen an Elementen sind optional, und schließen Mengen von weniger als 0,001 g/l ein. Spurenmengen von Vitaminen sind ebenfalls optional und schließen Mengen von weniger als 0,5 μg/g ein.
^A Endkonzentration von Amphotericin B nach Inbetrachtziehen der Konzentration der Lösung.

In einem spezifischeren Beispiel eines Mediums dieser Erfindung wird Bestandteil I in zehnfach höheren Mengen bereitgestellt als in Tabelle 1 (+/–10%) bezüglich Bestandteil II angegeben. Dieses wird hier als Medium 2 bezeichnet.
Gesamte coliforme Bakterien
Ein Enzym basiertes Nährstoffindikator-Detektionssystem hat die Spezifizität, ein coliformes Bakterium in einem Volumen von 100 ml in 18 Stunden nachzuweisen. Die gesamten Coliformen können durch Überwachung des Mediums hinsichtlich des Auftretens einer intensiven gelben Färbung im Testmedium nach 18 Stunden beobachtet werden, wenn Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG) in dem Medium als primäre Kohlenstoffquelle verwendet wird. Das Enzym β-D-Galactosidase wird in allen coliformen Bakterien gefunden und wirkt so, dass es die Hydrolyse von Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid katalysiert. Diese Reaktion ist sowohl nicht reversibel als auch extrem sensitiv bezüglich des Vorhandenseins von coliformen Bakterien. Wenn E. coli unter den gesamten Coliformen vorhanden ist, wird das Medium Fluo reszenz-Blau, wenn eine ultraviolette Lampe im Bereich von 366 nm in der Nähe der Testprobe platziert wird. Diese Fluoreszenz beruht auf der Hydrolyse von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid (MUG), um die fluoreszierende Verbindung von 4-Methylumbelliferon (MU) herzustellen, und die Reaktion wird durch das Enzym β-D-Glucuronidase katalysiert, welche in über 97% der E. coli-Stämme gefunden wird.
Der Nachweis kann mit höchster Geschwindigkeit und zu geringsten Kosten erzielt werden, wenn das Medium optimiert wurde, um die schnellste Rate bakteriellen Wachstums und der Enzymaktivität zu erzeugen. Zusätzlich kann Natriumpyruvat zu dem Medium hinzugegeben werden, um bei der Erholung und dem Wachstum von metabolisch verletzten Bakterien zu helfen. Eine Menge von ungefähr 0,0005% des Gewichts ist normalerweise ausreichend. Gleichermaßen senkt das thermische Äquilibrieren der Probe und der Medienmischung auf ungefähr 35°C durch Platzieren der Probe in ein Wasserbad bei ungefähr 35°C für 20 Minuten vor dem Platzieren in einem Trockeninkubator signifikant die für den Nachweis benötigte Zeit.
Analyse von Wasser auf Coliforme
Es ist wichtig, das Vorhandensein von coliformen Bakterien in Trinkwasser und in Freizeitgewässern nachzuweisen. Wenn antibakterielle Mittel in dem Wasser vorhanden sind, kann es nützlich sein, neutralisierende Mittel zuzugeben, wie beispielsweise Natriumthiosulfat oder Natrium-EDTA. Sonst kann das Vorhandensein von Coliformen durch Herstellen der Probe gemäß Standardtechniken nachgewiesen werden. Eine 100 ml Wasserprobe wird gesammelt, das Wachstumsmedium wird zu der Probe zugegeben, die Probe wird bei einer Temperatur, die dem bakteriellen Wachstum förderlich ist, inkubiert (welches normalerweise bei 35°C auftritt), und das Vorhandensein von Coliformen wird durch eine Änderung der Farbe der Probe nach ungefähr 18 Stunden angezeigt. Ein positives Ergebnis kann zu jedem Zeitpunkt bis 22 Stunden nach Mischung der Probe und des Mediums auftreten. Es kann viel schneller in Gegenwart einer relativ hohen Konzentration an Coliformen auftreten. Das Vorhandensein einer Coliformen in einem 100 ml Volumen kann unter Verwendung des Mediums und des Verfahrens, das in dieser Erfindung beschrieben ist, bestimmt werden.
Chromogene Reste
Zahlreiche Substrate, die einen chromogenen Rest einschließen, sind nachweislich in der Lage, eine charakteristische Farbänderung in Proben zu zeigen, die Zielmikroorganismen enthalten, welche eine spezifische Enzymaktivität aufweisen. Beispielsweise erzeugt in Gegenwart von β-D-Glucuroni dase Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid eine Farbänderung zu gelb, 4-Methylumbelliferylglucuronid erzeugt eine Fluoreszenz nach Anregung bei 366 nm, und Bromchlorindol-β-D-Glucuronid erzeugt eine Farbänderung nach blau, wenn E. coli vorhanden ist. In Gegenwart von β-D-Galactosidase erzeugt Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid eine Farbänderung nach gelb, und 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactopyranosid erzeugt eine Fluoreszenz nach Anregung bei 360 nm.
Einige Kombinationen haben sich als wirksam zum Nachweis des Vorhandenseins von E. coli wie auch gesamter coliformer Bakterien herausgestellt. 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid kann zusammen mit Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid verwendet werden. Wenn irgendwelche Coliformen vorhanden sind, verändert die Lösung ihre Farbe im sichtbaren Wellenlängenbereich in gelb. Wenn sowohl E. coli als auch andere Coliforme vorhanden sind, ändert sich die Probenlösung in ihrer Farbe nach gelb und fluoresziert nach Anregung bei 366 nm.
Die Nährstoffindikatoren können durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Die Verfahren schließen im Allgemeinen das Verbinden oder Konjugieren eines Nährstoffrestes an einen chromogenen Rest ein, wodurch ein Nährstoffindikator hergestellt wird. Beispiele solcher Verfahren werden von Edberg in U. S. Patent Nr. 4,925,789 beschrieben.
Derzeit verfügbare Nachweisverfahren
Die zwei allgemein akzeptierten Standard-Verfahren zum Untersuchen auf das Vorhandensein von Mikroorganismen in Trinkwasser schließen eine Fermentierung in mehreren Röhrchen gekoppelt mit dem (MPN-)Test für die Analyse der wahrscheinlichen Anzahl („most probable number analysis test") und den Membranfiltrations (MF)-Test ein. Das Protokoll dieser Verfahren zum Nachweisen coliformer Bakterien schließt vorausschauende Tests ein, die mit bestätigenden Tests gekoppelt werden, welche 48 bis 96 Stunden für die Durchführung benötigen. Die Ergebnisse dieser Tests werden auch durch das Vorhandensein nicht-coliformer Bakterien kompliziert, welche, wenn sie zu mehr als 500 Mikroorganismen pro Milliliter vorhanden sind, falsch positive oder falsch negative Ablesungen verursachen können.
Die Erfindung des COLILERT^®-Test, welche von Edberg, U. S. Patent Nr. 4,925,789 beschrieben ist, stellt eine beachtliche Verbesserung gegenüber den zuvor verfügbaren Verfahren bereit. Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, Coliforme in Proben in Konzentrationen bis zu einem Mikroorganismus pro 100 ml Probe nachzuweisen. Sie umfasst eine Kombination aus dem Mutmaßungsschritt und dem Bestätigungsschritt der mikrobiellen Identifizierung. Daher ist die Geschwindigkeit des Nachweises viel schneller, und die Wahrscheinlichkeiten des Erzielens falsch negativer oder falsch positiver Ableseergebnisse sind viel geringer, da zahlreiche Selektionsmittel in dem Medium vorhanden sind, welche das Wachstum von nicht coliformen Bakterien stark einschränken. Die Medien der vorliegenden Erfindung fassen jedoch die Verwendung von mindestens einem zweifachen Anstieg der Konzentration an Aminosäuren, Vitaminen, Spurenelementen und Salzen gegenüber zuvor verwendeten Medien ins Auge. Überraschenderweise erzeugt diese Änderung des Mediums einen viel schnelleren Nachweis ohne Verlust der Spezifizität.
Die vorliegende Erfindung wurde mit bereits existierenden Verfahren zum Nachweis von Coliformen und E. coli in Proben verglichen.
Nachweisverfahren
Die Anzahl an Zielmikroben, die in einer Flüssigkeitsprobe vorhanden sind, kann durch Mischen einer Flüssigkeitsprobe mit dem oben beschriebenen Medium quantifiziert werden, indem die Flüssigkeitsprobe einschließlich des Mediums in geeignete Container zur Inkubation platziert wird, durch Inkubieren der Flüssigkeitsprobe und des Mediengemischs, durch Beobachten der Menge und Qualität eines nachweisbaren charakteristischen Signals, und Vergleichen der Quantität und Qualität eines nachweisbaren charakteristischen Signals mit den am meisten wahrscheinlichen numerischen Werten. Dieses Quantifizierungsverfahren umfasst das Vergleichen der Quantität und Qualität der Eigenschaft, die geändert worden ist, vorzugsweise eine Farbänderung, mit den am meisten wahrscheinlichen numerischen Werten, die aus Proben gewonnen wurden, bei denen die Konzentration und die charakteristischen Änderungen mit Proben korreliert worden sind, bei denen die bakterielle Konzentration bekannt ist. Siehe z. B. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3. Ausg., herausgegeben von Vanderzant und Splittstoesser, 1992. Die Technik der am meisten wahrscheinlichen Anzahl erlaubt Schätzungen bakterieller Konzentration, die unter nachweisbaren Grenzen anderer Verfahren liegen. Die am meisten wahrscheinliche Anzahl wird aus Reaktionen abgeschätzt, wobei die Ergebnisse in einer oder mehreren Verdünnungen der Probe als positiv oder negativ beschrieben werden. Das Verfahren setzt voraus, dass nicht alle Proben ein positives Ergebnis bereitstellen, und für gewöhnlich werden mindestens drei Proben jeder Verdünnung benötigt. Listen der am meisten wahrscheinlichen Mengen sind verfügbar. Eine derartige Reihe wird von de Man, European Journal of Applied Microbiology, 1:67 (1975) bereitgestellt. Abschätzungen der am meisten wahr scheinlichen Anzahl können unter Verwendung der allgemeinen Formel durchgeführt werden, die von Thomas, J. Am. Water Works Assoc., 34: 572 (1942) beschrieben worden ist und wie folgt lautet: MPN/g = P/(NT)worin P die Anzahl positiver Röhrchen ist, N die Gesamtmenge der Probe in allen negativen Röhrchen ist, und T die Gesamtmenge einer Probe in allen Röhrchen ist. Die Mengen werden in Gramm ausgedrückt.
Die Erfindung verwendet einen neuen Apparat zum Halten einer Flüssigkeitsprobe. Der Apparat umfasst ein Gefäß, welches so entworfen ist, dass es eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann und anschließend die Flüssigkeitsprobe in verschiedene Abteile innerhalb des Gefäßes verteilt, so dass verschiedene Aliquots von einer oder mehreren Größen getestet werden können. Die in dieser Anmeldung beschriebene Erfindung ermöglicht ebenfalls die Quantifizierung der Mikroorganismen, die in der Probe vorhanden sind, durch die Zugabe eines Mediums, um das Wachstum von Mikroorganismen zu fördern, durch die Wärmeversiegelung des Gefäßes der Erfindung für ungefähr fünf Sekunden bei einer Temperatur von ungefähr 21,1°C bis 176,7°C (250°F bis 350°F), Inkubieren der Probe bei einer geeigneten Temperatur über einen ausreichenden Zeitraum, um das Wachstum der Mikroorganismen zu ermöglichen, und Aufzeichnen und Analysieren der Ergebnisse. Der Quantifizierungsschritt schließt das Nachweisen der Quantität und Qualität der Farbänderung ein, unter Vergleichen der Quantität und Qualität mit Ergebnissen, die für eine Reihe von Proben gewonnen wurden, bei denen die Konzentration der gesamten lebensfähigen Bakterien bekannt war.
Beispiel 1
Protokoll zu beschädigten Organismen
Das folgende Protokoll folgt dem U. S. EPA-Verfahren. Dem Verfahren zum Einsammeln von Proben beschädigter Mikroorganismen wurde gefolgt. Es wird als Mittel zur Sicherung des richtigen Probenziehens und der Behandlung von Proben, die in Vergleichen der Spezifizität und Zeit, die für ein Ergebnis benötigt wird, für Medien dieser Erfindung und der Medien des Stands der Technik verwendet werden, bereitgestellt.

1. Abnahme von 2 Litern frischen primären Abwasserausflusses aus einer externen Quelle (z. B. einer Abwasserbehandlungseinrichtung).
2. Durchlauf des Abwassers durch einen Whatman-40 (150 mm Durchmesser) Filter.
3. Filtrat Raumtemperatur erreichen lassen vor der Chlorbeschädigungsbehandlung.
4. Überprüfe den pH-Wert und die Temperatur des Abwassers, und fülle dann 49,5 ml Aliquots in 21 Polystyrolgefäße, die kein Natriumthiosulfat enthalten.
5. Schüttel die Proben auf einer Roto-Mix 50800 Plattform (Einstellung 2) bei Raumtemperatur.
6. Aliquotiere NaOCl (Natriumhypochlorid)-Lösung (5 bis 6% in jede Probe bei einer Endkonzentration von 5 ppm). Sofortiges Überprüfen der freien Chlorkonzentration in einer Probe.
7. Zugeben von 25 μl einer 10% Lösung Natriumthiosulfat zur ersten Probe nach 2 Minuten. Zugabe der gleichen Menge Natriumthiosulfat zu den restlichen Proben in zweiminütigen Intervallen nach der ersten Zugabe.
8. Messung der gesamten und freien Chlorkonzentration zum mittleren Zeitpunkt der Beschädigung in mindestens einer Probe, direkt vor der Zugabe von Natriumthiosulfat.
9. Bestimmen der Anzahl überlebener Coliformer in jeder Probedurch Membranfiltration auf mEndo-Platten, und Bestimmung der ursprünglichen Konzentration an Coliformen in dem nicht behandelten Abwasser durch Membranfiltration (Verdünnungen benötigt) auf mEndo-Platten.
10. Zählen der Anzahl an Coliformen auf jeder mEndo-Platte (ein Selektionsmedium für E. coli) nach 22 bis 24 Stunden Inkubationszeit. Auswählen der geeigneten Probe, die eine 2 Log 10 bis 4 Log 10 Reduzierung der gesamten Coliformen-Konzentration erlitten hat, und Herstellen einer Reihe aus Zweifachverdünnungen dieser Probe. Die Anzahl an Verdünnungen, die durchgeführt werden, hängt von der Anzahl überlebender Coliformer ab, die vorhanden sind, und muss mindestens zwei Verdünnungen ermöglichen, die keine Coliformen enthalten.

Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit beschädigter Organismen.
Dieses Experiment ist darauf ausgerichtet, die relative Leistungsfähigkeit von Medium 2 und Colilert^®-Medium beim Nachweis des Vorhandenseins beschädigter Coliformer und E. coli aus chlorinierter primärer Abwasserflüssigkeit zu vergleichen. Das Verfahren, das befolgt wird, um die zwei Medien zu vergleichen, schloss zunächst das Inokulieren jeder verdünnten chlorierten Abwasserprobe in Testmedium mit 1 ml jeder Verdünnung in 3 Colilert^®-Tests ein und 1 ml jeder Verdünnung in 3 Medium 2-Tests. Als nächstes wurden die Medium 2-Tests thermisch für 20 Minuten in einem 35°C +/–0,5°C Wasserbad äquilibriert und die anderen Tests wurden in einem 35°C +/–0,5°C Trockeninkubator platziert. Nach 20 Minuten wurden die Medium 2- Tests in dem 35°C Trockeninkubator platziert. Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht und die Ergebnisse wurden nach 18 Stunden für Medium 2 und nach 24 Stunden für Cholilert-Medium aufgezeichnet. Zufällige positive Medium 2-Proben wurden aus EMB-Agar zur Isolierung und weiteren Identifizierung unter Verwendung von API 20E ausgestrichen.
Ergebnisse
Sieben Abwässer aus vier getrennten, geographisch unterschiedlichen Stellen in Georgia, Maine, Connecticut und Kalifornien wurden in diesen Studien verwendet. Insgesamt 201 Medium 2 und 201 Colilert^®-Gefäße wurden mit den behandelten Abwässerverdünnungen inokuliert. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt:

Test Zeit # der Coliformen positiven # der E. coli positiven

Medium 2 18 Stunden 91 6

Colilert 24 Stunden 92 5
Eine Analyse durch den Chi-Quadrat-Test zeigte, dass diese Werte innerhalb eines 95% Vertrauens-Intervalls nicht signifikant verschieden waren. Insgesamt 43 positive Medium 2 Proben wurden unter Verwendung des API 20E-Kits spezifiziert und alle 43 Proben enthielten coliforme Bakterien.
Diese Daten zeigen, dass Medium 2 nach 18 Stunden Inkubation eine ähnliche Anzahl beschädigter Coliformer und E. coli, wie Colilert-Medium nach 24 Stunden Inkubation nachwies. Das Medium dieser Erfindung ist daher genauso spezifisch wie das Colilert^®-Medium und es ermöglicht den Nachweis von Mikroorganismen innerhalb von 18 Stunden, während das Colilert-Medium den Nachweis in 24 Stunden ermöglicht.
Experiment 2
MPN-Verfahren für verletzte Mikroorganismen gegenüber LTB-Verfahren Dieses Experiment ist darauf ausgerichtet, die Leistungsfähigkeit von Medium 2 gegenüber der Lauryl-Tryptose-Nährflüssigkeit (LTB)-Methode (EPA Referenz) beim Nachweis des Vorhandenseins beschädigter Coliformer und E. coli aus chlorierten primären Abwässern zu vergleichen. Die Testergebnisse wurden zuerst durch das Inokulieren jeder verdünnten Probe in das Testmedium erzielt, indem 100 μl jeder Verdünnung in 10 Medium 2-Röhrchen gegeben wurden (jeweils 10 ml) und 100 μl jeder Verdünnung in 10 LTB-Röhrchen (Einfach-Konzentration). Als nächstes wurden die Medium 2-Tests bei 20 Minuten in einem 35°C Wasserbad thermisch äquilibriert. Die LTB-Röhrchen wurden direkt in den 35°C Trockeninkubator gestellt. Nach 20 Minuten wurden die Medium 2-Tests in den 35°C Trockeninkubator gestellt. Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht und die Ergebnisse wurden nach 18 Stunden für Medium 2 aufgezeichnet. Zufällige positive Medium 2-Proben wurden auf EMB-Agar zur Isolierung und weiteren Identifizierung unter Verwendung von API 20E ausgestrichen. Die LTB-Proben wurden dann auf das Vorhandensein von Gas nach 24 und 48 Stunden Inkubationszeit überprüft. Wenn Gas vorhanden war, wurden die Proben in 10 ml BGLB (Brilliant Green Lactose Broth) und 10 ml E. coli und 4-Methylumbelliferonglucuronid-Nährlösung (EC-MUG) inokuliert. Die BGLB-Röhrchen wurden bei 35°C in einem Trockeninkubator für zwischen 24 und 48 Stunden inkubiert. Die EC-MUG-Röhrchen wurden in einem 44,5°C Wasserbad für 24 Stunden inkubiert. Das Vorhandensein von Gas in BGLB-Röhrchen zeigte das Vorliegen von Coliformen an. Das Vorhandensein von Gas und Fluoreszenz in den EC-MUG-Röhrchen zeigte das Vorliegen von E. coli an. Das Experiment ist fertig, nachdem die Inkubation der BGLB und EC-MUG-Röhrchen beendet war.
Ergebnisse
Zwei Abwässer aus zwei primären Abwasserstellen in Maine und Kalifornien wurden in dieser Studie verwendet. Insgesamt 240 Medium 2 MPN-Röhrchen wurden mit 240 LTP-Röhrchen verglichen. Die Ergebnisse sind wie folgt:

Test Zeit # der Coliformen positiven # der E. coli positiven

Medium 2 18 Stunden 104 33

Colilert 96 Stunden 75 16
Eine Analyse durch den Chi-Quadrat-Test zeigte, dass diese Ergebnisse innerhalb eines 95% Vertrauens-Intervalls signifikant verschieden waren.
Insgesamt 46 positive Medium 2-Proben wurden unter Verwendung des API 20E-Kits identifiziert und alle 46 Proben enthielten coliforme Bakterien. Daher ist Medium 2 besser als das LTB-Verfahren beim Gewinnen beschädigter Coliformer und E. coli aus primären Abwässerflüssigkeiten.
Beispiel 3
Heterotrophe Interferenz
Dieses Experiment wurde entworfen, um die Leistungsfähigkeit von Medium 2 und Colilert^®-Medium beim Nachweis nicht beschädigter Coliformer und E. coli in Gegenwart einer hohen Konzentration heterotropher Bakterien zu untersuchen. Das folgende Verfahren wurde befolgt. Zunächst wurden jeweils 100 ml Medium 2 und Colilert^®-Testgefäße mit 1 bis 10 CFU der folgenden Bakterien inokuliert: Escherichia coli ATCC 25922, Citrobacter freundii ATCC 8090, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 und Enterobacter cloacae ATCC 33457. Dieser Schritt wurde dann mit einem zweiten Probensatz wiederholt.
Aeromonas hydrophilia ATCC 35654, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) oder Pseudomonas putrefaciens (ein natürliches Isolat) wurden in den zweiten Satz an Gefäßen in einem Konzentrationsbereich von 16.000 bis 10.000 CFU/ml inokuliert. Medium 2 und Colilert^®-Testgefäße wurden mit A. hydrophilia, Pseudomonas aeruginosa oder P. putrefaciens alleine inokuliert, um falsch positive Ergebnisse zu untersuchen. Die Medium 2-Tests wurden thermisch für 20 Minuten in einem 35°C Wasserbad äquilibriert und die Colilert-Tests in einen 35°C Trockeninkubator gestellt. Nach 20 Minuten wurden die Medium 2-Tests in den 35°C Trockeninkubator gestellt. Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht und die Ergebnisse nach 18 Stunden für Medium 2 und nach 24 Stunden für Colilert^® aufgezeichnet.
Ergebnisse
Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: Coliforme mit und ohne heterotrophe Bakterien

Test Zeit # der Coliformen positiven # der E. coli positiven

Medium 2 18 Stunden 33 9

Colilert 24 Stunden 33 6
Insgesamt 36 Medium 2- und 36 Colilert^®-Tests wurden in dieser Studie durchgeführt. Neun aus jedem Satz der 36 Tests enthielten E. coli. Heterotrophe Bakterien allein

Test Zeit # der Coliformen positiven # der E. coli positiven

Medium 2 18 Stunden 0 0

Colilert 24 Stunden 0 0
Insgesamt wurden 24 Medium 2- und 24 Colilert^®-Tests in dieser Studie durchgeführt.
Weitere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen.

Claims

Flüssiges nichtgeliertes Coliform-spezifisches Medium, das den Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Zielmikroben in einer verflüssigten Umwelt- oder biologischen Probe ermöglicht, umfassend: Vitamine, eine Quelle für Ammoniumionen, einen Puffer, ein Antipilzmittel, einen Nährstoffindikator, ein Antibiotikum, das das Wachstum und die Reproduktion von einer oder mehr Arten oder Gruppen von Nichtzielmikroben verhindert oder inhibiert, einen Induktor eines Enzyms, das den Stoffwechsel des Nährstoffindikators katalysiert, einen DNA-Vorläufer, 0,13 bis 0,16 g/l D-Gluconsäure, eine Quelle für Sulfit, Aminosäuren in einer Konzentration von mindestens: 0,025 g/l Alanin, 0,030 g/l Arginin, 0,056 g/l Asparaginsäure, 0,1 g/l Glutaminsäure, 0,015 g/l Glycin, 0,09 g/l Prolin, 0,002 g/l Cystin, 0,006 g/l Histidin, 0,01 g/l Isoleucin, 0,030 g/l Leucin, 0,03 g/l Lysin, 0,01 g/l Methionin, 0,018 g/l Phenylalanin, 0,029 g/l Serin, 0,018 g/l Threonin, 0,003 g/l Tryptophan, 0,0064 g/l Tyrosin und 0,023 g/l Valin, Eisen, Calcium, Phosphat, Kalium, Natrium, Kobalt, Kupfer, Blei, Magnesium, Mangan, Chlorid, Zinn und/oder Zink und Natriumpyruvat, verwertbar, um eine Lebensfähigkeit und Reproduktion der Zielmikroben in einer Rate zu ermöglichen, so daß jede nachweisbare Veränderung in der Probe innerhalb von 18 Stunden für eine Probe mit weniger als 10 Zielmikroben pro 100 ml beobachtbar ist.
Medium gemäß Anspruch 1, wobei die Quelle für Ammoniumionen Ammoniumsulfat ist, der Puffer ist HEPES-freie Säure oder HEPES-Natriumsalz, das Antipilzmittel ist Amphotericin-B und der Induktor ist Isopropyl-β-D-thiogalactosid oder Ethyl-β-D-thioglucosid.
Medium gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Nährstoffindikator ein β-D-Glucuronidasesubstrat oder β-D-Galactosidasesubstrat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Orthonitrophenyl-β-D-glucuronid, β-Naphthalamid-β-D-glucuronid, α-Naphthol-β-D-glucuronid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid.
Medium gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Nährstoffindikator ein β-Glucosidasesubstrat oder ein L-Pyronidonylaminopeptidasesubstrat oder ein L-Alaninaminopeptidasesubstrat ist.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Konzentration des Ammoniumsulfats 4,5 bis 5,5 g/l beträgt, der HEPES-freien Säure 6,0 bis 7,5 g/l, des HEPES-Natriumsalzes 4,7 bis 5,8 g/l, des Amphotericins-B 0,0009 bis 0,0011 g/l, des ONPG 0,450 bis 0,550 und des MUG 0,067 bis 0,085 g/l.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Gesamtstickstoffgehalt mindestens 1,1 bis 1,7 g/l beträgt.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Konzentration der Aminosäuren bei 5x bis 10x liegt.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Eisenkonzentration mindestens 0,00165 μg/l, die von Calcium mindestens 0,0003 g/l, die von Phosphat mindestens 0,1 g/l, die von Kalium mindestens 0,007 g/l, die von Natrium mindestens 0,03 g/l beträgt und/oder mit Spuren von Kobalt, Kupfer, Blei, Magnesium, Mangan, Chlorid, Zinn und Zink.
Medium gemäß Anspruch 8, wobei die Konzentration der Aminosäuren, von Eisen, Calcium, Phosphat, Kalium, Natrium, Kobalt, Kupfer, Blei, Magnesium, Mangan, Chlorid, Zinn und/oder Zink 5x bis 10x ist.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Nährstoffindikator die Farbe des Coliform-spezifischen Mediums verändert.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Nährstoffindikator die Farbe des Coliform-spezifischen Mediums im sichtbaren Wellenlängenbereich verändert.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Nährstoffindikator einen Bestandteil umfaßt, der zum Fluoreszieren in der Lage ist und in einem Wellenlängenbereich nachweisbar ist, der nach Belichtung mit einer anregenden Lichtquelle sichtbar ist.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei dem Medium um ein nichtsteriles wasserlösliches Pulver handelt.
Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zielmikroben entweder E. coli oder Gesamt-Coliforme sind.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit coliformer Bakterien, vorzugsweise von E. coli, in einer Umwelt- oder biologischen Flüssigprobe, umfassend die folgenden Schritte: a) Vermischen der Flüssigprobe mit dem Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, b) Erwärmen der Mischung aus flüssiger Probe und Medium auf eine Inkubationstemperatur von 30 bis 41°C, wobei die flüssige Probe bei der Inkubationstemperatur 10 Minuten oder mehr gehalten wird, und c) Überwachung der Probe, um zu bestimmen, ob die nachweisbare Eigenschaft verändert wurde.