DE69122385T2

DE69122385T2 - Neues und verbessertes verfahren zur bestimmung von e. coli in wasser

Info

Publication number: DE69122385T2
Application number: DE69122385T
Authority: DE
Inventors: George Chang; Rosalind Lum
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1990-05-14
Filing date: 1991-05-14
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2011-05-15
Also published as: HU9203390D0; US5643743A; DE69122385D1; ATE143416T1; EP0530322B1; CA2027536C; JPH05508992A; WO1991018111A1; AU8077191A; EP0530322A1; FI925169A; FI925169A0; AU657688B2; CA2027536A1; EP0530322A4; JP3034036B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betriffi ein neues, einfaches, schnelles, empfindliches, spezifisches und billiges Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an gesamten Coliformen (Bakterien) und E. coli in Wasserproben. Das Verfahren beruht auf zwei definierten charakteristischen Eigenschaften von E. coli, namlich der Lactoseverwertung und der Indolbildung.

Hintergrund und verwandte Offenbarungen

Escherichia coli (E. coli) ist ein gram-negatives fakultativ anaerobes Bakterium, das normalerweise den Magen/Darmtrakt besiedelt und das sich in Feces von Menschen und Tieren findet. E. coli ist eine häufige Ursache von Infektionen des Urogenitaltraktes und von Diarrhea.
Da sich E. coli normalerweise in Fäzes (Kot) findet, wurde sein Vorhandensein lange Zeit als Indikator einer möglichen fakalen Kontamination von Wasser und Nahrungsmitteln angesehen und ausgenutzt. Daher wurden große Anstrengungen unternommen, Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Bakterien zu entwickeln.
E. coli besitzen jedoch einen Hauptnachteil als Indikatorbakterien für eine Wasserkontamination. Es gibt kein einfaches und spezifisches Verfahren sie nachzuweisen. Daher sind einfach coliforme Bakterien nachgewiesen worden, eine breite Untergruppe von Enterobacteriaceae, die Umgebungsorganismen ebenso umfassen wie fakale E. coli, aber Salmonellen, Shigella und Proteus ausschließen. Folglich wurden coliforme Bakterien ein Maß für die Verunreinigung von Trinkwasser durch Fäkalien.
Zur Zeit verfügbare Tests zur Bestimmung des Vorhandenseins von coliformen Bakterien, insbesondere E. coli, beruhen auf Ergebnissen von Charakterisierungstests, die einen unbekannten Organismus einer definierten Gruppe zuordnen. Die am häufigsten angewandten Tests sind enzymatische Tests, bei denen das Vorhandensein eines Enzyms, von dem bekannt ist, das es an dem Metabolismus der Bakterien beteiligt ist, subjektiv durch Beobachtung einer Veränderung des Aussehens, eine Veränderung der Farbe, eine Veränderung der Fluoreszenz oder ein anderes chemisches Zeichen nachgewiesen wird: Methods in Microbiology, 19:105 (1987).
Die meisten existierenden Tests auf coliforme Bakterien und E. coli beruhen auf der Tatsache, daß Escherichia Glucose und Lactose fermentiert und als Ergebnis einer solchen Fermentation Gas oder Säure bildet: Forsch. Med., 3:515 (1885). Ein Kompendium von Methoden, die derzeit verfügbar sind und angewandt werden zur Untersuchung von Wasserkontaminationen, ist veröffentlicht von American Public Health Association, (1985). Die meisten der zur Zeit angewandten Methoden verwenden Enzyme, die beim Metabolismus von Lactose eine Rolle spielen, wie das Enyym von coliformen Bakterien β-D-Galactosidase, das die erste Stufe des Stoffwechselweges katalysiert, in dem Lactose in Säure und Gas umgewandelt wird.
Untersuchungen in den frühen 20er Jahren führten zu einem klassischen Fäkaltest durch coliforme Bakterien, umfassend die Inkubation von Kulturen bei 44,5ºC. Bei dieser Temperatur wächst E. coli und bildet Gas oder Säure aus Lactose, aber coliforme Bakterien aus der Umgebung tun dies nicht.
Zwei Hauptnachteile sind mit dem Fäkaltest durch coliforme Bakterien verbunden. Zunächst ist das Verfahren langwierig. Aufgrund der verhältnismäßig hohen Temperaturen von 44ºC, die zur Inkubation von Bakterien angewandt werden müssen, ist das Verfahren häufig lethal für gestreßte oder geschädigte Bakterien. Daher ist es üblich, Röhrchen für fäkale coliforme Tests mit vollständig ausgewachsenen Kulturen von einem präsumptiven coliformen Test zu beimpfen. Ein solches Verfahren erfordert zwei Tage. Alternativ können Röhrchen für fakale coliforme Tests eine kurze Zeit bei 35ºC inkubiert werden und anschließend bei 44,5ºC. Der Gewinn der Verkürzung der Testzeit wird jedoch überwogen durch zusätzliche Manipulationen, umfassend die Zeitabstimmung für zwei Inkubationen und zusätzliche Handgriffe. Zweitens besitzt das Verfahren eine begrenzte Spezifität, da es als unerwünschte und schädliche E. coli auch etwa 10 % coliforme Bakterien erkennt, die nicht E. coli sind: Appl. Environ. Microb., 55:335 (1989). Drittens wird das Verfahren in Kulturröhrehen durchgeführt, die jeweils mit einem zweiten umgekehrten Röhrchen (Durham tube) versehen sind, in dem sich Gasblasen ansammeln und beobachtet werden können.
Im klinischen Laboratorium wurden viele Versuche durchgeführt, um bessere Tests für Reihenuntersuchungen auf vollständig ausgewachsene reine Kolonien von pathogenen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae zu entwickeln. In 1984, J. Clin. Microbiol., 20:136 wurde ein Mehrfachtestmedium mit einem einzigen Röhrchen zur Identifizierung von voll ausgewachsenen reinen Kulturen von Enterobacteriaceae aus enteralen und anderen klinischen Proben entwickelt. Das angewandte Medium erlaubt den Nachweis der Motilität von β-Galactosidase, Phenylalanindeaminaseaktivität und der Bildung von Schwefelwasserstoff und Indol. Der Test kann jedoch nur an vollständig ausgewachsenen reinen Kolonien durchgeführt werden und ist somit nicht geeignet für Wasserproben.
Später wurde das Vorhandensein von β-Glucuronidase (GUR) als Indikator für das Vorhandensein von E. coli in Kliniken angesehen. In 1976, Acta Pathol. Microbiol. Scand Sect. B, 84:245 (1976) wurden Erkenntnisse beschrieben, die zeigen, daß 97 % der klinischen Isolate von E. coli β-D-Glucuronidase (GUR) bilden, wahrend die meisten anderen coliformen Bakterien das nicht tun. Der Erfolg der Untersuchung auf GUR von klinischen Proben motivierte die Wissenschaftler, diese zum Nachweis von E. coli in Lebensmitteln und Wasser anzuwenden.
Ein sehr schwerer Fehler des β-Glucuronidaseverfahrens besteht darin, daß es unterstellt, daß alle oder nahezu alle E. coli in der Lage sind, β-D-Glucuronidase zu bilden. Auf der Grundlage dieser Annahme wurde eine Anzahl von Verfahren, einschließlich dem schnellen Identifikationsverfahren (Rapid Identification Method (RIM)), für E. coli entwickelt. Diese unten angegebene RIM-Technik umfaßt gleichzeitige Messungen von β-Glucuronidase und β-Galactosidase und anschließende Bestimmung des Vorhandenseins von Indol.
Ein üblicher Test zur Identifizierung von vollständig ausgewachsenen reinen Kulturen von E. coli besteht im Zusatz von O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) in Sorensen-Phosphatpuffer mit pH 7,5 zu vollständig ausgewachsenen Testisolaten und Inkubieren des Gemisches wahrend 1 h bei 35ºC. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von E. coli wird bestimmt durch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer gelben Farbe, die das Vorhandensein von β-Galactosidase anzeigt. Wenn keine Farbänderung in der ursprünglich farblosen Lösung auftritt, werden die Ergebnisse als negativ angesehen, und es wird angenommen, daß die Probe keine. coli enthält. Das übliche Verfahren ist beschrieben in J. Clin. Microbiol., 18:1287 (1983). Zwei anschließend entwickelte Tests sind MM und Schnellnachweis (Rapid Detect E. coli (RDE)). Beide beruhen auf dem Nachweis von β-Glucuronidase.
Das RIM-System besteht aus mit Reagentien imprägnierten Baumwollkissen auf Holzstäbchen, mit denen vollständig ausgewachsene bakterielle Kolonien berührt werden, und das das bakteriellen Inocolum enthaltende Kissen wird in den spezifischen RIM-Puffer, enthaltend ONPG, gegeben und 30-60 min bei 35ºC inkubiert. Die positive ONPG-Reaktion wird beobachtet durch Auftreten der gelben Farbe. Soweit sie positiv ist, wird anschließend das Vorhandensein von β- Glucuronidase bestimmt durch Nachweis von Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht von 366 nm. Wenn der β-Glucuronidase-Test positiv ist, wird Kovacs-Reagens zugegeben zum Nachweis des Vorhandenseins von Indol, was durch eine rote Farbe angezeigt wird.
Der RDE-Test ist ein etwas verbessertes System zur Bestimmung von β-Glucuronidase, bei dem eine mit Substraten imprägnierte Papierscheibe angewandt wird. Bei RDE werden vollständig ausgewachsene Bakterienkolonien in destilliertes Wasser überimpft, um eine Bakteriensuspension zu erhalten. Dann wird eine Scheibe, enthaltend sowohl β-Glucuronidase als auch ONPG-Substrate, in das Röhrchen gegeben, das bei 35ºC inkubiert wird. Die Entwicklung einer gelben Farbe zeigt das Vorhandensein von β-Galactosidase, die das synthetische Substrat ONPG hydrolysiert. Die Hydrolyse von ONPG zeigt das Vorhandensein von β-Galactosidase an und somit das Vorhandensein von Lactose-fermentierenden Organismen, wie Escherichia A-D-Gruppe, Citrobacter und Arizona. Wenn der β-Galactosidase-Test positiv ist, wird das Vorhandensein von β-Glucuronidase, wie bei dem RIM-Test bestimmt, durch Untersuchung des Röhrchens mit einer Quelle für UV-Licht von 366 nm. Wenn Fluoreszenz auftritt, handelt es sich um β-Glucuronidase, von der es sich gezeigt hat, daß sie in etwas 97 % aller klinischen Isolate von E. coli vorkommt: Acta Pathol. Mierobiol. Scand Sect. B, 84:245 (1976). Wenn der β-Glucuronidase-Test negativ ist, wird ein Indolindikator (Test) zu der Probe zugesetzt, um sie auf die Indolbildung zu untersuchen. Eine rote Farbe zeigt das Vorhandensein von Indol an. Nur wenn alle drei Tests, d.h. ONPG, β-Glucuronidase und Indol, positiv sind, wird gefolgert, daß ein Organismus vermutlich E. coli ist. Wenn einer dieser drei Tests negativ ist, wird der Test so interpretiert, daß er einen Organismus anzeigt, bei dem nur eine geringe Wahrscheinlichkeit besteht, daß es E. coli ist. In einem solchen Falle werden alternative Verfahren zur Bestätigung und Identifizierung von klinischen Isolaten durchgeführt: J. Clin. Microbiol., 24:368, (1986).
Die frühere Beobachtung, daß etwa 97 % aller klinisch vorkommenden E. coli β-Glucuronidase bilden, führte zu der Annahme, daß 97 % aller E. coli aus irgendeiner Quelle das Enzym bilden. In jüngster Zeit hat es sich jedoch gezeigt, daß eine solche Annahme falsch war, und daß etwa 30-50 % E. coli β-Glucuronidase-negativ sein können.
Trotzdem führte die Prämisse, daß 97 % E. coli Glucuronidase positiv sind, zur Entwicklung eines sogenannten MMO-MUG (Minimal Medium ONPG-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronidase)-Tests, der zur Zeit als eines der analytischen Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehalts an coliformen Bakterien vom US-EPA anerkannt wird.
Der MMO-MUG-Test verwendet eine fluoreszierende Verbindung MUG als β-Glucuronidasesubstrat. Der Test beruht auf der Einführung einer Testprobe in das MMO-MUG-Medium und auf der Beobachtung der Bildung von β-Galactosid aus ONPG, wie durch die Bildung einer gelben Farbe innerhalb von 24 h angezeigt wird, und anschließende Bildung einer fluoreszierenden Substanz aus 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid, einem Substrat für β-Glucuronidase. Der MMO-MUG-Test besteht aus einem spezifischen komplizierten Medium, bestehend aus verschiedenen Salzen in Kombination von Amphotericin B, ONPG, MUG und Solanium. Der MMO- MUG-Test in anerkannt zur Bestimmung des Gesamtgehalts an coliformen Bakterien und ist nicht spezifisch genug, um E. coli von anderen Coliformen zu unterscheiden. Zeitweise erfordert der Test die Inkubation während mindestens 24 h. Am wichtigsten ist, daß der MMO-MUG-Test eine falsch-positive Rate zwischen 13-35 % ergibt, wobei dieser Fehler aufgrund eines Mangels an einem besseren verfügbaren Test vom US-EPA als akzeptabel angesehen wurde.
Der schwerste Fehler dieses Tests liegt jedoch darin, daß nur etwa 66-70% aller E. coli aus fäkalen Proben β-Glucuronidase-positiv sind und etwa 30-34 % E. coli β-Glucuronidasenegativ sind. Folglich ergibt der MMO-MUG-Test etwa 30-34 % falsch-negative Ergebnisse. Appl. Environ. Microbiol., 55:335 (1989) zeigt, daß etwa 30-34 % aller fäkalen Isolate von E. coli β-D-Glucuronidase-negativ sind, wenn sie mit Laurylsulfat/Tryptosebrühe, enthaltend MUG, untersucht werden, und von den β-Glucuronidase-positiven hat es sich bei einer bestimmten Anzahl von β-Glucuronidase-positiven Bakterien gezeigt, daß sie temperaturabhängig sind, bezüglich der β-Glucuronidasebildung. Bei diesen temperaturabhängigen E. coli war eine derartige Bildung bei 37ºC sehr schwach, aber stark positiv bei 44,5ºC. Daruberhinaus enthielten einige fäkale Proben nur β-Glucuronidase-negative E. coli. Da die bei der obigen Studie analysierten Proben von Fäkalproben von gesunden Individuen (Tieren) stammten, ist es klar, daß die fäkale Kontamination von Wasser durch E. coli in so vielen, wie 30-35 % der Fälle, nicht nachgewiesen werden kann, wenn die oben angegebenen Tests durchgeführt werden. Diese falsch-negative Rate besitzt ernsthafte Implikationen für die öffentliche Gesundheit. Wenn Wasserproben aus Southem California, USA, untersucht wurden, hat es sich gezeigt, daß etwa 40 % der E. coli bei dem MMO- MUG-Test negativ waren (M. Stewart und B. Olson, Abstracts: Ann. Meeting Amer. Soc. Microbiol., (1990)).
Die hohe falsch-negative Rate wurde auch in anderen Studien bestätigt. Eine Sammlung von fäkalen E. coli aus vielen Teilen der Welt wurde sowohl mit dem LT-MUG- als auch dem MMO-MUG-Test untersucht, und es fanden sich 30 % falsch-negative Ergebnisse: J. Food Prot., 55:972, (1990).
Das Indol-bildende Enzym Tryptophanase war einer der ersten Enzymtests, der angewandt wurde zur Identifizierung von E. coli. In den 100 Jahren seit Kitasato den Indoltest in Zeitschrift Hyg. Leipzig, 7:515, (1989) beschrieben hat, hat er sich als einer der nützlichsten und entscheidendsten Test für E. coli erwiesen. Er wird angewandt, wie es angegeben ist in dem klassischen IMVIC-Test, veröffentlicht in Identifleation ofenterobacteriaceae, 2. Aufl., Burgess Publ. (1962), zur Unterscheidung von E. coli von anderen coliformen Arten.
Der Hauptnachteil des Indoltests besteht darin, daß er nicht mit Tests für die Lactoseverwertung kombiniert werden und als einfacher Einröhrchentest auf E. coli in Wasserproben angewandt werden kann.
Das Prinzip des Indoltests ist die Fähigkeit von E. coli, Tryptophanase zu bilden, das Enzym, das Tryptophan zu Indol metabolisiert, wobei diese Fähigkeit eng zusammenzuhängen scheint mit der Fähigkeit von E. coli, im Dann von Säugetieren zu wachsen. Die Bildung von Tryptophanase wird durch Tryptophan und seinen Analogen induziert. Da eine Anzahl von Spezies von Enterobacteriaceae die Fähigkeit besitzt, Tryptophanase zu bilden, führt das Vorhandensein dieses Enzyms zur Akkumulation von Indol als Kataboliten von Tryptophan, und so ist das Vorhandensein dieses Enzyms sehr geeignet zur Identifizierung von Enterobacteriaceae-Pathogenen.
Das zur Identifizierung der Indolbildung angewandte Standardmedium, wie es beschrieben ist in Standard Methods for Water and Wastewater Analysis, erfordert die 24 h lange Inkubation bei 35ºC in einem Kohlenhydrat-freien Medium und die Untersuchung auf Indol mit Kovacs- Reagens (Zeit. Immunitätforsch. Exp. Ther., 55:311, (1928)). Diese Reaktion beruht auf der kolorimetrischen Reaktion von Indol mit p-Dimethylaminobenzaldehyd. Bei diesem Test wird freies Indol entfernt durch Extraktion in flüssige Medien, wie Amylalkohol oder Xylol, um freies Indol von restlichem Tryptophan zu unterscheiden, das ebenfalls mit p-Dimethylaminobenzaldehyd unter geeigneten Bedingungen reagiert.
Eine alternative kolorimetrische Reaktion für Indol, wie sie beschrieben ist in J. Appl. Bacteriol., 63:329, (1987), beruht auf der Kondensation von Indol mit freien α- oder β-Stellungen in dem Pyrrolring in saurer Lösung mit Glutaconaldehyd zur Bildung von rot-violetten Polymethinfarbstoffen. Ein Mikrotest, der auf einer ähnlichen Idee beruht, und der geeignet ist zur schnellen Identifizierung von Enterobacteriaceae, ist beschrieben in Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B, 92:239, (1984).
Die US-PS 3 870 601 gibt ein Kulturmedium an, daß geeignet ist zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, das ein homogenes β-Galactosid und ein anderes Substrat umfaßt.
Die Mängel und Nachteile, die mit den Methoden, Tests und Techniken verbunden sind, die zur Zeit zugänglich sind und die oben beschrieben sind, werden durch das erfindungsgemäße Verfahren überwunden.

Zusammenfassung

Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft ein empfindliches, schnelles, spezifisches, genaues und billiges Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von gesamten coliformen Bakterien und E. coli in Wasserproben.
Das Verfahren kann angewandt werden zur quantitativen Bestimmung der am wahrscheinlichsten in Wasserproben vorhandenen Anzahl E. coli.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Testmethoden zur schnellen visuellen Bestimmung des Vorhandenseins von E. coli und coliformen Bakterien in Wasser (ECOTAG), zur Bestimmung von den gesamten coliformen Bakterien und E. coli in Wasserproben (COLITAG) und zur Bestimmung der Anzahl von coliformen Bakterien und E. coli, die worhanden sind (ECOTAGQUANTI).
Folglich liefert die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und E. coli in einer Wasserprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Zusammenbringen der Probe mit einem Medium, umfassend
(i) ein Lactosesurrogat, das ein β-D-Galactosidasesubstrat ist,
(ii) Tryptophan oder einen Tryptophanersatz, das/der ein Tryptophanase substrat ist,
(iii) ein Protein- oder Peptidhydrolysat in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von E. coli zu beschleunigen,
(b) Inkubieren der Bakterien bei einer Temperatur von 44,5ºC während 2 bis 24h, an schließend
(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorbandenseins eines β-D-Galactosidasereaktionsproduktes des β-D-Galactosidasesubstrats,
(d) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Tryptophanase reaktionsproduktes des Tryptophanasesubstrats,
wobei das Vorhandensein des β-D-Galactosidasereaktionsproduktes das Vorhandensein eines coliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandenseins des Tryptophanasereaktionsproduktes das Vorhandensein von E. coli in der Probe anzeigt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und E. coli in einer Wasser- oder Lebensmittelprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bildung eines wäßrigen Probenlmedium-Gemisches durch Zusammenbringen der Probe mit einem Medium umfassend
(i) ein Indol-bildendes Tryptophanasesubstrat,
(ii) ein chromogenes oder fluorogenes β-D-Galactosidasesubstrat,
(iii) ein Protein- oder Peptidhydrolysat in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von E. coli in dem Gemisch zu beschleunigen,
(b) Inkubieren des Gemisches bei einer Temperatur von 44,5ºC während 2 bis 24 h, anschließend
(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer ersten Färbung oder einer ersten Fluoreszenz in dem Gemisch,
(d) Zugabe eines Indolnachweisreagens zu dem Gemisch und anschließend
(e) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtworhandseins einer zweiten Färbung in dem Gemisch, wobei das Vorhandensein der ersten Färbung oder der ersten Fluoreszenz in dem Gemisch das Vorhandensein eines coliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandensein der zweiten Färbung in dem Gemisch das Vorhandensein von E. coli in der Probe anzeigt.
Bei einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und E. coli in einer Wasserprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bildung eines wäßrigen Proben/Medium-Gemisches durch Zusammenbringen der Probe mit einem Medium, umfassend:
(i) Tryptophan,
(ii) o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid,
(iii) ein Protein- oder Peptidhydrolysat in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von E. coli zu beschleunigen,
(b) Inkubieren des Gemisches bei einer Temperatur von 44,5ºC während 2 bis 24 h, anschließend
(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer gelben Färbung in dem Gemisch,
(d) Zugabe von p-Dimethylaminobenzaldehyd in angesäuertem n-Butylalkohol oder angesäuertem Isoamylalkohol zu dem Gemisch und anschließend
(e) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer rot-purpurnen Färbung in dem Gemisch,
wobei das Vorhandensein der gelben Farbe in dem Gemisch das Vorhandensein eines coliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandensein der rot-purpurnen Färbung in dem Gemisch das Vorhandensein von E. coli in der Probe anzeigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Ansicht von E. coli (ECOTAG)-Teströhrchen nach 18 h Ihkubation.
Fig. 2 ist eine Ansicht von coliformen (COLITAG)-Teströhrchen nach 18 h Inkubation.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß E. coli die einzige Hauptgruppe von Enterobacteriaceae-Bakterien ist, die zwei sehr entscheidende Eigenschaften ihrer Spezies besitzt, nämlich die Lactoseverwertung und Indolbildung. Durch Kombination der Methode zur Messung der Lactoseverwertung mit der Methode zur Messung der Indolbildung, wurde ein neuer, verbesserter, schneller, empfindlicher, spezifischer, billiger, zuverlassiger und genauer Test entwickelt zur Bestimmung von E. coli und coliformen Bakterien in Wasser.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß Tryptophanase, das für die Indolbildung verantwortliche Enzym, in Gegenwart von Lactose stark unterdrückt wird (Abstract: Ann. Meet. Arner. Soc. Microbiol., Q12, (1990)). Daher kann diese Unterdrückung vermieden werden durch einfaches Weglassen von Lactose aus dem Medium und Ersatz durch ein geeignetes synthetisches β-D-Galactopyranosid, wie ONPG (in dieser Beschreibung wird der Ausdruck "Galactosid" und "Galactopyranosid" austauschbar verwendet). ONPG dient dazu, die Fähigkeit eines Bakteriums anzuzeigen, Lactose zu verwerten. Im Gegensatz zu Lactose unterdrückt es Tryptophanase oder die Indolbildung jedoch nicht. Daher kann die Indolbildung bestimmt werden durch einfache Zugabe eines geeigneten Reagens, wie Kovac's- oder Ehrlich's-Reagens, und Beobachtung der charakteristischen Farbänderung
Die vorliegende Erfindung beruht auch auf der Erkenntnis der Rolle der Katabolitrepression. Die Katabolitrepression durch eine leicht zugängliche Kohlenhydrat-Energiequelle, wie Lactose oder einen Lactoseersatz in großem Überschuß, verschlechtert den Metabolismus, die Umwandlung und Verwertung einer weniger wirksamen Energiequelle, in diesem Falle von Tryptophan.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Medium, das eine derartige Katabolitrepression vermeidet durch Einführung eines Mehrfach-Indikatormediums TAG (Tryptophan-Galactosid), bei dem Ersatzenergiequellen in minimalen Mengen verwendet werden, die eine derartige Katabolitrepression nicht hervorrufen oder erlauben.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, das Vorhandensein von coliformen Bakterien und E. coli gleichzeitig in Wasserproben nachzuweisen. Sie kann angewandt werden als schneller Einröhrchentest, sie erfordert keine Isolierung einer reinen Kultur oder Bildung von voll ausgewachsetien Kolonien und ist in der Lage, das Vorhandensein nur eines einzigen E. coli- Bakteriums nachzuweisen.
Die Erfindung beruht folglich auf der Beobachtung, daß die Aminosäure Tryptophan zu Indol, Brenztraubensäure und Ammoniak metabolisiert wird, und das Indol in einer aquimolaren Menge, wie Ammoniak, gebildet wird. Der Test ist schnell, erfordert 2-24 h, abhängig von dem Grad der Kontamination, um schlüssig das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von E. coli zu bestimmen; er ist genau, da er mit nahezu 100 %-iger Genauigkeit bestimmt, ob in der Wasserprobe E. coli vorhanden sind oder nicht, ohne daß er zu falsch-negativen oder -positiven Ergebnissen führt; er ist empfindlich, da er durch Anwendung eines Verdünnungsverfalirens eine wahrscheinliche Anzahl von kontaminierenden E. coli und sogar ein einziges E. coli-Bakterium in Wasser nachweisen kann, und er ist spezifisch gegenüber E. coli, da er in der Lage ist, zwischen harmlosen Coliformen und E. coli zu unterscheiden. Der Test bestimmt gleichzeitig das Vorhandensein von β-Galactosidase, einem Enzym, das die Lactoseverwertung anzeigt, und Tryptophanase, einem Enzym, das die Bildung von Indol anzeigt. Bei Anwendung dieses Test geben nur solche Bakterien positive Ergebnisse, die gleichzeitig Indol bilden und Lactose verwerten. In Wasserproben ist eine solche Fähigkeit im wesentlichen nur bei den Bakterien E. coli vorhanden.
Der Test ist spezifisch gegenüber solchen Enterobacteriaceae, die gleichzeitig Indol bilden und Lactose fermentieren können, und die somit in der Lage sind, in einem spezifischen Medium, enthaltend minimale Mengen Tryptophan und Galactosid, zu wachsen und Farbe und/oder Fluoreszenz zu erzeugen. In Wasserproben sind diese Enterobacteriaceae ganz überwiegend E. coli.
Die Indolbildung wird allgemein durch Glucose, Lactose oder irgendeinen anderen leicht verwertbaren Zucker unterdrückt. Folglich ist der Indoltest nicht anwendbar in Gegenwart von Lactose, von der bekannt ist, daß sie ein Substrat darstellt, das bei dem normalen Metabolismus von E. coli eine Rolle spielt.
Es ist eine bekannte Tatsache, daß, wenn E. coli in ein Kulturmedium gebracht werden, enthaltend Lactose, ein induzierbares Enzym β-Galactosidase in großer Menge gebildet wird. Die induzierte β-Galactosidase hydrolysiert Lactose (1) nach dem Reaktionsschema 1 zu den Produkten D-Glucose (II) und D-Galactose (III), die direkt als Energiequelle (fuel) und Kohlenstoffquelle verwendet werden können. Reaktionsschema 1 β-Galactosidase Lactose D-Glucose D-Galactose
Diese deutlichen Eigenschaften von E. coli werden angewandt als eines der Hauptmerktnale der Erfindung, die eine schnelle und genaue Abtrennung von Enterobacteriaceae mit dieser Eigenschaft von solchen, die diese Eigenschaft nicht besitzen, ermöglicht. Bei dem Test wird die Fähigkeit, Lactose zu verwerten, nachgewiesen durch die Hydrolyse von chromogenen oder fluorogenen β-D-Galactosiden.
Die zweite deutliche Eigenschaft von E. coli ist ihre Fähigkeit, Tryptophan als Stickstoffquelle zu verwerten und es mit dem Enzym Tryptophanase zu metabolisieren. Die Reaktion wird durch den Indoltest nachgewiesen. Die Grundlage des Indoltests ist die in dem Reaktionsschema II angegebene Reaktion. Tryptophan (IV) wird mit E. coli-Tryptophanase zu freiem Indol (V), Pyruvat (VI) und Ammonium (Ammoniak) (VII) metabolisiert. Reaktionsschema II E. coli Tryptophan freies Indol Pyruvat Ammoniak Tryptophanase
Sowohl die erste als auch die zweite deutliche Eigenschaft von E. coli beruhen auf der metabolischen Flexibilität von E. coli-Zellen. E. coli sind chemoorganotroph, indem sie eine organische Kohlenstoffquelle und metabolische Energie erfordern, innerhalb dieser Katagorie sind sie jedoch metabolisch wandelbar. Wie im Falle von Lactose gezeigt, verwertet E. coli, wenn keine Glucose vorhanden und leicht als Energie- und Kohlenstoffquelle verfügbar ist, Lactose und orientiert seine enzymatische Synthese schnell um, um ausreichend β-Galactosidase zu bilden, die ausreicht, um Lactose zu D-Glucose und D-Galactose zu metabolisieren.
Ähnlich wie Lactose als Kohlenstoffquelle, kann E. coli auch verschiedene Stickstoffquellen, außer Ammoniak, verwerten. Tatsächlich stoppen E. coli-Zellen, wenn sie eine große Menge exogener Aminosäuren zur Verfügung haben, die Synthese von Aminosäuren de novo aus Ammoniak und verwerten stattdessen die vorgebildeten Aminosäuren.
Anstelle von Lactose oder Glucose können E. coli bestimmte Aminosäuren als Energiequelle (fuel) und Kohlenstoffquelle verwerten, wenn dies erforderlich ist. Die vorliegende Erfindung erkennt diese Eigenschaft von E. coli an und verwendet vorteilhafterweise die Aminosäure Tryptophan, die in ihrem Molekul ein Indol enthält. Tryptophan kann durch das spezifische Enzym Tryptophanase zu freiem Indol, Pyruvat und Ammonium metabolisiert werden. Da sehr spezifische Tests zur Bestimmung von Indol zur Verfügung stehen, nutzt die vorliegende Erfindung dieses Merkmal aus, um E. coli von allen anderen Bakterien zu isolieren, die nicht sowohl Lactose fermentieren als auch Indol bilden.
Da es jedoch bekannt ist, daß die Indolbildung durch die Lactosefermentation gehemmt wird, verwendet die vorliegende Erfindung das Lactosesurrogat, um eine derartige metabolische Hemmung auszuschalten.
Auf der Grundlage des obigen Hintergrundes beruht die vorliegende Erfindung in der Praxis auf der Bestimmung des Vorhandenseins des Enzyins β-Galactosidase und auf dem Vorhandensein von freiem Indol.
Wie oben angegeben, wird, wenn eine große Menge Lactose in dem Medium vorhanden ist, Lactose katalysiert und induziert die Bildung des Enzyms β-Galactosidase, das deutliche chemische Eigenschaften besitzt und leicht gemessen oder anderweitig bestimmt werden kann. Da es jedoch bekannt ist, daß Lactose die Bildung von Indol aus Tryptophan hemmt, kann Indol selbstverständlich nicht gebildet und gemessen werden, wenn Lactose vorhanden ist. Durch Ersatz der Lactose durch eine Surrogatverbindung, die ebenfalls durch β-Galactosidase gehemmt wird, wird die Hemmwirkung von Lactose aufgehoben, und Indol bildet sich und kann gleichzeitig mit der Verwertung des Lactosesurrogats gemessen werden.
Die Erfindung nutzt ferner vorteilhafterweise die Tatsache aus, daß E. coli ein konvertibler Organismus ist, der schnell auf alle metabolischen Anforderungen reagieren kann. So reagiert, wenn das spezielle Lactosesurrogat, das gemessen werden kann, als einzige Kohlenstoffquelle zur Verfügung steht, E. coli schnell durch sofortige Bildung von β-Galactosidase. Wenn jedoch alle anderen leichter zugänglichen Kohlenstoffquellen aus dem Medium entfernt werden, erkennt das metabolische Regulationssystem von E. coli Tryptophan als Kohlenstoffquelle an. So wird, wenn das Tryptophan zur Verfügung steht und alle anderen Kohlenstoffquellen entweder vollständig ausgeschlossen sind oder in einer solchen Weise kontrolliert werden, daß sie vorteilhafterweise bei dem Test verwertet werden, Tryptophanase von E. coli in einer großen Menge gebildet zur Umwandlung von Tryptophan zu dem leicht meßbaren freien Indol. Zur Untersuchung der Erfindung wurden drei grundlegende bakteriologische Versuchsanordnungen mit internen Variationen getestet.
Anordnung 1: Kontrollproben, enthaltend Salmonellen, aber keine coliformen oder E. coli-Bakterien.
Anordnung 2: Experimentelle Proben, enthaltend nur E. coli-Bakterien. Diese Gruppe enthielt unterschiedliche Arten von E. coli, wie E. coli ATCC 25922, ECOR 13, ECOR 8, ECOR 5, ECOR 4, ECOR 6, ECOR 47, ECOR 13, alle erhalten von der American Type Culture Collection. TC 244, TC 234, TC 218, TC 217, intern isoliert an der University of California, Berkeley oder PF 226, PF 222, erhalten von Peter Feng, FDA Laboratory.
Anordnung 3: Experimentelle Proben, enthaltend andere coliforme Bakterien, wie TC 257, Klebsiella Pneumoniae, Enterobacter cloacae oder Citrobacter freundii.
Salmonella typhimurium, erhalten von B. Ames, ist normalerweise sowohl Lactose-als auch Indol-negativ. E. coli TC 224, 234, 218 und 217 sind Indol und Lactose-positiv. E. coli PF 222 und 226 sind Indol-positiv und Lactose-positiv.
Für einen schnellen Test auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit von E. coli, wurden die Anordnungen 1, 2 und 3 angewandt. Zur Bestimmung der gesamten coliformen und E. coli- Bakterien, wurden die Anordnungen 1, 2 und 3 angewandt. Zur Halbquantifizierung kann jede Anordnung angewandt werden.
Es wurden verschiedene Grundmedien hergestellt und untersucht: Das grundlegende Erfordernis für das Grundmedium war, daß es mindestens eine optimale minimale Menge Tryptophan oder Tryptophansubstitut und eine optimale minimale Menge Lactosesurrogat enthält.
Eines der wichtigsten Merkmale der vorliegenden Erfindung ist die neue Art von Medium, enthaltend Tryptophan und β-Galactosid, das speziell so ausgebildet ist, daß es die Katabolitrepression durch seine eigenen Bestandteile vermeidet. Eine derartige Katabolitrepression tritt auf, wenn ein Überschuß einer leicht verfügbaren Kohlenhydrat-Energiequelle (Lactosesurrogat) vorhanden ist, die den Metabolismus, die Umwandlung und Verwertung von weniger wirksamen Energiequellen (Tryptophan) verhindert.
Die Einzigartigkeit der erfindungsgemäßen Medien liegt in ihrer Zusammensetzung von Bestandteilen, die so ausgewogen sind, daß eine Katabolitrepression vermieden und ausgeschaltet wird. So unterdrücken, wenn MMO-MUG oder andere zur Zeit verfügbaren Medien verwendet werden, diese katabolisch das zweite einzigartige Merkmal von E. coli, nämlich die Indolbildung durch die β-Glucuronidase oder ein anderes Lactosesubstitut, das im Überschuß zugesetzt wird. Das erfindungsgemäße TAG-Medium ergibt andererseit ausgewogene Energiequellen, so daß sowohl die Lactoseverwertung als auch die Indolbildung gleichzeit ablaufen können, und so gleichzeitig in dem gleichen Röhrchen bestimmt werden können. Folglich enthält das TAG- Medium im wesentlichen das Lactosesubstitut und die Indolquelle. Ebenfalls zugesetzt sind wachstumsbeschleunigende Komponenten und andere Komponenten.
Das zweite wichtigste Erfordernis für das Medium, das bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angewandt wird, besteht darin, daß es nicht wachstumsbeschränkend ist, sondem wachstumstördernd. Zu diesem Zweck enthält das erfindungsgemäße TAG-Medium die wachstumsunterstutzende und -fördernde Komponente Protein oder Peptidhydrolysat, wie Tryptose, und kann außerdem Hefeextrakt enthalten.
Diese Komponenten werden in Mengen zugesetzt, die ausreichen, um das Wachstum von E. coli zu fördern und zu unterstützen, so daß ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung eine signifikante Beschleunigung des Wachstums von E. coli ist, was den Nachweis sogar einer kleinen Anzahl von E. coli und in vielen Fällen sogar einer einzigen E. coli-Zelle in einer stark verdünnten Wasserprobe ermöglicht. Das kann erreicht werden, da das Wachstum von E. coli beschleunigt wird durch Zusatz von anderen Nährstoffkomponenten, wie Hefeextrakt oder Tryptose. So ist das Wachstum von E. coli in dem erfindungsgemäßen TAG-Medium nicht beschränkt durch die Verfügbarkeit von ONPG und MUG als Nährstoff, wie bei den anderen zur Zeit verfügbaren Medien.
Durch sorgsam überlegte Förderung des Wachstums von E. coli mit Tryptose, verwendet die vorliegende Erfindung ein Medium oder eine Gruppe von Medien, das sehr wirksam ist zur Gewinnung einer kleinen Anzahl oder von einzelnen E. coli-Zellen.
Vergleichsergebnisse, die erhalten worden sind unter Verwendung des Standard-EC- Mediums des MMO-MUG-(Colilert)-Mediums und des TAG-(Colitag)-Mediums, sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben und in Beispiel 9 diskutiert.
Die Möglichkeit, Proben mit einer minimalen Anzahl an E. coli zu untersuchen und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, d.h. eine positive Reaktion von einer einzigen bakteriellen E. coli- Zelle, ist ein sehr wichtiges Merkmal bei der Wasseruntersuchung, wo die Verdünnung der Kontaminanten so extrem ist, daß eine Kultur oder Flasche nur eine oder wenige E. coli-Zellen enthalten kann.
Eine weitere wichtige Verbesserung gegenüber bekannten Nachweisverfahren für E. coli ist die Zeitersparnis, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht wird.
Das erfindungsgemäße Medium gibt schnellere Ergebnisse an als irgendein anderes, einschließlich dem MMO-MUG-Medium. Das triffi besonders zu, wenn stark verdünnte Wasserproben untersucht werden, die nur eine oder wenige E. coli-Zellen enthalten. In solchen Fällen kann man aufgrund der wachstumsbeschleunigenden Komponenten, die in dem Medium vorhanden sind, die positive oder negative Antwort in 2-24 h erhalten, verglichen mit 2448 h oder mehr, die bei anderen Tests erforderlich sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Medium wird ein sorgfältig ausgewähltes Gleichgewicht von Komponenten angewandt, die das Wachstum von E. coli-Zellen beschleunigen und unterstützen, aber gleichzeitig die Katabolitrepression vermeiden und unterdrücken. Diese Merkmale machen es möglich, die Kohlenhydratverwertung unter Verwendung von Lactosesubstituten (β-Galactosiden) und die Indolbildung unter Verwendung von sekundären Stickstoffquellen zu kombinieren, was die Untersuchung beider Merkmale, die für das Vorhandensein von E. coli charakteristisch sind, nämlich die Lactoseverwertung und Indolbildung, zu testen. Da unter normalen Umständen die Lactosefermentation die Indolbildung unterdrückt, da Tryptophan ein Energielieferant mit niedrigerer Priorität ist, wird bei anderen Tests der Metabolismus von Tryptophan zu Indol durch die Lactosefermentation wirksam eliminiert und unterdrückt, und das Vorhandensein von Indol kann nicht gleichzeitig in dem gleichen Röhrchen gemessen werden.
Als Lactosesubstitute wurden die nicht-fluoreszierenden Verbindungen ONPG, Indolyl-β- galactosid, X-Galactosid, (5-Brom-6-chlorindolyl-β-D-galactosid (X-GAL)), 8-Hydroxychinolinβ-D-galactopyranosid (HQDG) und andere bekannte Lactosesubstitute in einer Menge von 0,05- 10 g/l, vorzugsweise 0,5 g/l, einer normalen Lösung und 0,1-30 g/l, vorzugsweise 1,5 g/l, einer konzentrierten Lösung, oder fluoreszierendes Methylumbellyferylgalactosid-(MU-GAL)-Substitut in einer Menge von 0,05-5 g/l, vorzugsweise 0,25 g/l, verwendet, vorzugsweise ONPG oder MU- GAL.
Nicht-fluoreszierende Lactosesubstitute bilden normalerweise eine gelbe Farbe (ONPG) oder blaue Farbe (X-GAL oder Indolyl-β-D-Galactosid). Hydrochinolin bildet ein intensiv schwarzes Pigment in Gegenwart irgendeines Eisen(III)salzes, wie Eisen(III)chlorid. MU-GAL bildet unter UV sichtbare Fluoreszenz.
Als Indolquelle, die E. coli eine rote Farbe verleiht, werden Tryptophan und andere Indolquellen oder nicht-Indoltryptophananaloge, wie S-o-Nitrophenyl-1-cystein (SOPC), das, wenn es ionisiert ist, eine hellgelbe Farbe besitzt, aber wenn es deprotonisiert ist, farblos ist, verwendet. Tryptophan wird als bevorzugte Quelle in einer Menge von 0,1-20 g/l, vorzugsweise 1 g/l, normale Lösung und 0,1-30 g/l, vorzugsweise 3 g/l, konzentrierte Lösung verwendet. O-Nitrothiophenol, das von Tryptophan abgeleitet ist, bildet eine rote Farbe. Indol von SOPC bildet eine gelbe Farbe, aber wenn es in Kombination mit X-Galactosid verwendet wird, das eine blaue Farbe erzeugt, ist die resultierende Farbe grün. So ist es möglich, eine Farbe des Tests durch Ersatz von Tryptophan durch SOPC zu bestimmen und auszuwählen.
Das Medium enthält als wachstumsbeschleunigende Komponente hydrolysiertes Proteinoder Peptidgemisch, vorzugsweise Tryptose oder irgendeine andere stickstoffhaltige Brühe als zusätzliche Stickstoffquelle in einer Menge von 0,05-30 g/l, vorzugsweise 3-30 g/l, konzentrierte Lösung. Zusätzlich kann Hefe in einer Menge von 10 mg bis 10 g/l, vorzugsweise 50 mg/l, zugesetzt werden.
Ferner können ein β-Galactosidaseenyyminduktor, wie Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), Methylthiogalactosid, Melibiose, in einer Menge von 0,01-1 g/l, vorzugsweise 0,1 g/l, für eine normale Mediumbasis und 0,03-3 g/l, vorzugsweise 0,3 g/l, für konzentriertes Medium zugesetzt werden. Um das Wachstum von störenden Bakterien zu verhindern, kann das Medium gegebenenfalls auch Inhibitoren für das Bakterienwachstum, wie Natriumlaurylsulfat, Gallensalz, Detergentien, Tergitol-7, Antibiotika Monensin, Nalidixinsäure oder einige andere, in einer Menge von 0,01-1 g/l, vorzugsweise 0,1 g/l, für ein normales Medium und 0,03-3 g/l, vorzugsweise 0,3 g/l, für ein konzentriertes Medium enthalten.
Um das TAB-Medium herzustellen, werden die obigen Bestandteile in 11 steriler Flüssigkeit, wie destilliertem oder entionisiertem Wasser, gelöst. Zu dem endgültigen Medium können zusätzliche Mengen Natriumchlorid oder irgendeines anderen geeigneten Salzes, wie Natriumdiphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumdiphosphat, Natriumiaurylsulfat, Magnesiumsulfat, Dinatriumphosphat, Mononatriumglutamat oder andere, in einer Menge von 0,01-10 g/l, die für Bakterien nicht toxisch sind, bis zu einer Konzentration von 50 mmol zugesetzt werden.
Es wurden verschiedene Basen hergestellt.

1) Normale TAG-Mediumbasis

1 g Tryptophan und Mineralsalze, Dinatriumphosphat (3 g), Magnesiumsulfat (0,1 g) und Kaliumdiphosphat (0,5 g) wurden in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC sterilisiert. ONPG wurde in destilliertem Wasser in einer Menge von 5 g/l gelöst, durch Filtration bei Raumtemperatur sterilisiert und auf das 10-fache mit der Tryptophan/Salz-Lösung verdünnt. Die erhaltene Ausgangslösung wurde im Kühlschrank bei 2-8ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

2) Verbesserte TAG-Mediumbasis

Die normale TAG-Mediumbasis wurde ergänzt durch 0,1 g/l IPTG, das als durch Filtration sterilisierte Lösung zugegeben wurde. Die Lösung wurde vorsichtig vermischt, um eine Lösung aller Bestandteile zu erreichen. Bis zur Verwendung wurde das Medium im Kühlschrank aufbewahrt.

3) 3x konzentrierte TAG-Mediumbasis

Dieses Medium enthält 3 g Tryptophan, 1,5 g ONPG, 0,3 g IPTG und 3-fach größere Menge an Mineralsalzen als die normale TAG-Mediumbasis. Tryptophan und die Salze wurden in der Hitze sterilisiert. ONPG und IPTG wurden durch Filtration sterilisiert. Das Medium wurde anschließend im Kühlschrank aufbewahrt.

4) Natriumlaurylsulfat-TAG-Mediumbasis

1 g Tryptophan, 0,5 g ONPG, 0,1 g Natriumlaurylsulfat, 0,1 g Isopropylthio-β-D-galactopyranosid und Natriumchlorid auf 50 mmol, und Dinatriumphosphat, Kaliumdiphosphat und Magnesiumsulfat wurden wie oben zubereitet. Das Natriumiaurylsulfat wurde mit Tryptophan und anderen wärmestabilen Bestandteilen vor der Sterilisation durch Wärme vermischt.

5) Konzentrierte TAG-Mediumbasis

1 g Tryptophan, 0,5 g ONPG, 3 g Tryptose, 0,1 g Natriumlaurylsulfat, 0,1 g Isopropyl-β- D-thiogalactopyranosid und Natriumchlorid bis auf 50 mmol wurden in 1000 ml 0,85 %-iger Natriumchloridlösung (Salzlösung) gelöst.

Andere Variationen von TAG-Medium

6) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat und 0,1 g Natriumlaurylsulfat wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g durch Filtration sterilisiertes ONPG zugegeben.
7) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 50 mg Hefeextrakt wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g durch Filtration sterilisiertes ONPG zugegeben.
8) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumiaurylsulfat und 20 g Tryptose wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g durch Filtration sterilisiertes ONPG zugegeben.
9) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatrium phosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 0,5 g Mononatriumglutamat wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g durch Filtration sterilisiertes ONPG zugegeben.
10) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumiaurylsulfat und 0,25 g Annnoniumsulfat und 0,5 g Mononatriumglutamat wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g durch Futration sterilisiertes ONPG zugegeben.
11) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 0,25 g Ammoniumsulfat wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g sterilisiertes ONPG zugegeben.
12) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 100 mg Hefeextrakt wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g sterilisiertes ONPG zugegeben.
13) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 25 mg Hefeextrakt wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g sterilisiertes ONPG zugegeben.
14) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 5 g Tryptose wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g sterilisiertes ONPG zugegeben.
15) 1 g Tryptophan, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat und 2,5 g Tryptose wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC im Autoklaven behandelt und 0,5 g sterilisiertes ONPG zugegeben.
16) TAG-Ausgangslösung
0,285 g Tryptophan, 0,855 g Dinatriumphosphat, 0,1425 g Kaliumdiphosphat, 0,0285 g Natriumlaurylsulfat, 0,0285 Magnesiumsulfat und 0,7125 g Ammoniumsulfat wurden in 285 ml Salzlösung gelöst und als Ausgangslösung verwendet.
17) TAG/Hefe-Ausgangslösung
Zu 50 ml TAG-Ausgangslösung wurden 0,05 g Hefeextrakt zugegeben, um eine Hefe-Ausgangslösung mit 1 g/l zu erhalten. Diese wurde zur Verwendung auf das 10-fache verdünnt.
18) TAG/ONPG-Lösung
Zu 25 ml TAG-Ausgangslösung (16) wurden 0,125 g ONPG zugegeben. Die Lösung wurde durch Filtration sterilisiert.
Die Ausgangslösungen wurden als bequeme Basis/TAG-Lösungen hergestellt, die zur Herstellung vieler spezifischer TAG-Lösungen verwendet wurden, die während der Optimierung des TAG-Mediums getestet wurden.
Diese und andere Variationen der TAG-Medien auf der Basis der oben angegebenen Bestandteile oder anderer Bestandteile, die in zufriedenstellender Weise einen oder mehrere der oben angegebenen Bestandteile ersetzen, sollen auch im Rhhinen dieser Erfindung liegen.
TAG-Medium-Basislösungen werden entweder durch Behandlung im Autoklaven, durch Mikroporfiltration, Bestrahlung oder durch irgendein anderes für diese Zwecke geeignetes Verfahren sterilisiert, wobei das Verfahren die einzelnen Bestandteile nicht angreift. Die Sterilisierung kann erreicht werden unter Verwendung von sterilen Glasgeräten, Lösungen und Bestandteilen, oder ein Teilgemisch kann im Autoklaven behandelt werden oder ein vollständiges TAG-Medium kann durch Filtration sterilisiert werden.
Die Ausgangslösungen oder fertig zubereiteten Lösungen werden vorzugsweise bei 2-8ºC im Kühlschrank aufbewahrt oder sie können gefriergetrocknet, trocken vermischt und bestrahlt, im Vakuum getrocknet, lyophilisiert oder auf irgendeine andere geeignete industriell bekannte Weise konserviert werden.
Die Bestandteile irgendeines TAG-Mediums oder ännlichen Mediums können auch als trockenes Gemisch oder in irgendeinem geeigneten flüchtigen organischen oder anorganischen Lösungsmittel vermischt werden. Die Sterilisierung kann erreicht werden durch Bestrahlung oder durch das Lösungsmittel selbst.
Wenn es zur bakteriologischen Untersuchung auf das Vorhandensein von E. coli verwendet wird, wird eine entsprechende Menge des sterilen TAG-Mediums mit einer zu untersuchenden Wasserprobe in einem Verhältnis von 1:10 bis 10:1, vorzugsweise einem Verhältnis von 2:1, von Wasserprobe zu TAG-Medium vermischt. Die Lösung wird leicht geschwänkt oder vermischt und vorzugsweise bei 35ºC 4 h und bei 44,5ºC während eines zusätzlichen Zeitraums bis zu 24 h inkubiert. Wenn die Inkubation des Gemisches bei höheren Temperaturen als 50ºC durchgeführt wird, können schwache oder geschädigte E. coli nicht überleben, und die Ergebnisse können falsch-negativ sein. Wenn die Inkubation nur bei niedrigeren Temperaturen, wie 35ºC, durchgeführt wird, werden falsch-positive Ergebnisse für Indol erhalten. Die Proben werden 2-24 h inkubiert. Wenn nach 24 h keine Farbbildung auftritt, sind keine E. coli vorhanden. Normalerweise kann eine leichte E. coli-Kontamination zu einem so frühen Zeitpunkt wie nach 2 h, üblicherweise nach 15-18 h, spätestens nach 24 h, bemerkt werden. Andererseits tritt bei einer Wasserprobe, die mit einer großen Anzahl von coliformen Bakterien oder E. coli kontaminiert ist, schnell eine Färbung des Mediums auf, und positive Ergebnisse können 50 fi jih wie nach etwa 2-6 h bei Inkubation bei 44,5ºC erhalten werden.
Die Tests zur Bestimmung des Gesamtgehalts an coliformen und E. coli-Bakterien wurden als COLITAG bzw. ECOTAG bezeichnet. Beide Tests sind in den Fig. 1 und 2 angegeben. Fig. 1 (Anordnung 2, Seite 21) zeigt die Ergebnisse des ECOTAG-Tests, der an vier Stämmen von E. coli durchgeführt wurde, nämlich E. coli Stamm ATCC 25922 Röhrchen 1 und 2, ECOR 4, Röhrchen 3 und 4, ECOR 5, Röhrchen 5 und 6, ECOR 6, Röhrchen 7 und 8. Alle Röhrchen wurden 18 h bei 35ºC inkubiert nach dem Vermischen der Wasserprobe, enthaltend E. coli, mit dem TAG-Medium Nr.3. Die gelbe Farbe, die sich in der wäßrigen unteren Phase in den Röhrchen 1, 3, 5 und 7 entwickelte, zeigt β-Galactosidaseaktivität an. Nach Zugabe von zwei Tropfen Kovacs-Reagens, zeigt ein rötlich-purpurfarbener Ring am oberen Ende der Lösung (organische Phase in den Röhrchen 2,4, 6 und 8) das Vorhandensein von Indol an. Die Indolbildung zeigt das Vorhandensein von Indol-positiven coliformen Bakterien an. In Wasser sind die meisten Indol-positiven coliformen Bakterien E. coli.
Zum Vergleich sind in Fig. 2 (Anordnung 1 und Anordnung 3, Seiten 14 und 15) die Proben in den Röhrchen 9-14 nicht E. coli coliforme Bakterien. Speziell sind in den Röhrchen 9 und 6 Enterobacter cloacae, in den Röhrchen 11 und 12 Citrobacter freundii und in den Röhrchen 3 und 14 Klebsiella pneumoniae vorhanden. In den Röhrchen 15 und 16 sind nicht-coliforme Salmonellen vorhanden. Alle diese Bakterien sind Indol-negativ, und wenn sie dem gleichen Testverfahren wie für Fig. 1 beschrieben unterworfen wurden, trat die gelbe Farbe in den Röhrchen 9, 11 und 13 auf, ähnlich der gelben Farbe in den Röhrchen 1, 3, 5 und 7. Wenn das Kovacs-Reagens zu den Röhrchen 10, 12 und 14 zugegeben wurde, trat keine Farbänderung auf Die gelbe Farbe in der organischen Phase zeigte die Abwesenheit einer Indolbildung an, was anzeigt, daß keine Indolpositiven Bakterien vorhanden sind und daß alle in den Röhrchen 9-14 vorhandenen Bakterien Indol-negativ waren, d.h. coliform aber keine E. coli. Als Kontrolle zur Untersuchung der Genauigkeit von sowohl COLITAG- als auch ECOTAG-Tests, wurden nicht-coliforme Bakterien Salmonella unter Anwendung des gleichen Verfahrens untersucht. Die Flüssigkeit in den Röhrchen 15 und 16 ist farblos und zeigt weder die gelbe Farbe für coliforme Bakterien, noch die rot-purpurfarbene Färbung für E. coli.
Die kolorimetrischen Ergebnisse, die bei beiden Tests COLITAG und ECOTAG unter Verwendung des TAG-Mediums, enthaltend Tryptophan und ONPG, erhalten werden, können wie folgt zusammengefaßt werden:
Keine Farbe sowohl in der wäßrigen als auch in der organischen Phase zeigt die Abwesen heit sowohl von E. coli als auch von coliformen Bakterien an.
Gelbe Färbung in der wäßrigen Phase zeigt das Vorhandensein von coliformen Bakterien an, die E. coli umfassen können oder nicht.
Gelbe Färbung in der organischen Phase nach Umsetzung mit Kovacs-Reagens, zeigt die Abwesenheit von E. coli an.
Rot-purpurne Färbung in der organischen Phase nach der Reaktion mit dem Kovacs- Reagens, zeigt das Vorhandensein von E. coli an.
Wenn in dem Medium X-GAL anstelle von ONPG verwendet wird, tritt anstatt der gelben Färbung eine blaue Färbung auf, die das Vorhandensein von coliformen Bakterien anzeigt.
Bei der Variation des Mediums, bei der MU-GAL anstelle von ONPG enthalten ist, fluoreszieren die Proben, enthaltend coliforme Bakterien, unter UV-Licht.
Bei der Variation des Mediums, enthaltend HQDG und Eisen(III)chlorid, wird das Vorhandensein von coliformen Bakterien durch ein schwarzes Pigment angezeigt.
In dem Medium, bei dem X-GAL anstelle von ONPG und SOPC anstelle von Tryptophan verwendet wird, zeigt eine grüne Färbung das Vorhandensein von E. coli an. SOPC ergibt eine gelbe Färbung und X-GAL führt zu einer blauen Färbung. Kombiniert ergeben sie eine grüne Färbung, die das Vorhandensein von E. coli anzeigt.
Der ECOTAG-Test kann ferner angewandt werden zur zahlenmäßigen Bestimmung der vorhandenen E. coli. Typischerweise wird eine Reihenverdünnung in Salzlösung oder in 0,1 % Pepton der wäßrigen Probe hergestellt, wie in Beispiel 5 beschrieben, und der ECOTAG-Test durchgeführt. Das Auftreten der gelben Färbung wird bei allen Verdünnungen beobachtet. Die Ergebnisse werden berechnet unter Anwendung der Tabelle für die wahrscheinlichsten Zahlen (Most Probable Numbers table) nach bekannten und anerkannten Verfahren.

Materialien

Ehrlichs-Reagens, p-Dimethylaminobenzaldehyd in angesäuertem n-Butylalkohol (Sigma); Kovacs-Reagens, p-Dimethylaminobenzaldehyd in angesäuertem Isoamylalkohol (Sigma); Tryptophan (Sigma); Tryptose (Difco), o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Sigma); Natriumlaurylsulfat (Sigma); Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (Sigma); Hefeextrakt (Difco); L-Glutamat (oder Sigma Cal Biochem).

Beispiel 1

Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von gesamten coliformen Bakterien und E. coli in Wasserproben

Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur schnellen visuellen Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandensein von E. coli und/oder coliformen Bakterien in Wasserproben nach dem "COLITAG"-Test. Bei dem Verfahren werden deutliche Eigenschaften angewandt, die spezifisch sind für coliforme Bakterien und E. coli, nämlich die Fähigkeit nur Lactose zu verwerten (coliforme Bakterien) und sowohl eine Lactoseverwertung als auch die Bildung von Indol (E. coli).
Das Prinzip dieser Methode besteht darin, daß die Lactose, die normalerweise die Bildung von Indol hemmt, ersetzt wird durch ein anderes Substrat, das auf die gleiche Weise wie Lactose durch das Enzym β-Galactosidase metabolisiert oder verwertet wird. Das Substitut für Lactose hemmt die Bildung von Indol aus Tryptophan nicht. Folglich enthält die Probe, wenn sich die gelbe Färbung entwickelt, coliforme Bakterien und kann E. coli enthalten oder nicht. Wenn keine gelbe Farbe auftritt, sind keine coliformen Bakterien und keine E. coli vorhanden. Wenn sich die gelbe Farbe entwickelt und auch die purpurne Farbe nach Zusatz von Kovacs-Reagens auftritt, sind E. coli vorhanden.
Für diese Methode wurde ein spezifisches Tryptophanlgalactosidase-(TAG)-Medium, enthaltend minimale Mengen an Tryptophan und dem Lactosesubstitut ONPG, hergestellt und verwendet. Das Medium enthält gegebenenfalls Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), einen Induktor für die Lactosebildung, und wird in destilliertem Wasser hergestellt.

Herstellung von normalem TAG-Medium (1)

1 g Tryptophan und Mineralsalze, Dinatriumphosphat, Magnesiumsulfat und Kaliumdiphosphat wurden in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde 15 min bei 121ºC sterilisiert. ONPG wurde in destilliertem Wasser in einer Menge von 5 g/l gelöst, durch Filtration bei Raumtemperatur sterilisiert und auf das 10-fache mit der Tryptophan/Salz-Lösung verdünnt Die erhaltene Ausgangslösung wurde im Kühlschrank bei 2-8ºC bis zur Verwendung gelagert.

Herstellung von verbesserter TAG-Mediumbasis (2)

1 g Tryptophan, Kaliumdiphosphat, 3 g Dinatriumphosphat, 0,1 g Natriumlaurylsulfat, 2,9 g Natriumchlorid und 1,0 g Tryptose wurden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und 15 min bei 121 ºC sterilisiert. Dann wurden 0,5 g ONPG und 0,1 g IPTG als durch Filtration sterilisierte Lösung zugegeben. Bis zur Verwendung wurde das Medium im Kühlschrank aufbewahrt.

Herstellung von konzentrierter TAG-Mediumbasis (3)

Alle Bestandteile des obigen Mediums wurden im 3-Fachen der üblichen Konzentration zubereitet. Zum Beispiel wurden 3 g Tryptophan, 1,5 g ONPG und 0,3 g IPTG verwendet. Die Bestandteile wurden vermischt, durch Filtration sterilisiert und wie oben aufbewahrt.

Verfahren zur Bestimmung von E. coli

Die Fig. 1 und 2 erläutern dieses Beispiel. Vorsterilisierte 20 ml Fläschchen, enthaltend 3 ml konzentriertes TAG-Medium, wurden mit 1000 Bakterienzellen in 0,010 ml 0,85 %-iger zu untersuchender salzhaltiger Probe beimpft.
Proben 1-8 waren E. coli:
1 und 2 waren ATCC 25922
3 und 4 waren ECOR 4
5 und 6 waren ECOR 5
7 und 8 waren ECOR 6
Proben 9-14 waren Nicht-E. coli coliforme Bakterien:
9 und 10 waren Enterobacter cloacae
11 und 12 waren Citrobacter lreundii
13 und 14 waren Klebsiella pneumoniae
Proben 15 und 16 waren nicht-coliforme Bakterien:
15 und 16 waren Salmonella.
Die Fläschchen wurden verschlossen und leicht geschüttelt, so daß die Proben und das Medium entsprechend vermischt wurden. Die Fläschchen wurden zu einer 4-stündigen Inkubation in ein Wasserbad von 35ºC gestellt und anschließend 20 h bei 44,5ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben visuell untersucht. Ergebnisse:
Kontrollproben 15 und 10 blieben farblos, es waren keine coliformen Bakterien und E. coli vorhanden. Wenn die wäßrige Phase der Proben 1-8 leuchtend-gelb war, was das Vorhandensein von β-Galactosidase anzeigt, schienen E. coli vorhanden zu sein und in großer Zahl gewachsen zu sein. Die waßrige Phase der coliformen Proben 9-14 war ebenfalls leuchtend-gelb, was das Vorhandensein und anschließende Wachstum von coliformen Bakterien anzeigt.
Die an jedem anderen Röhrchen durchgeführte Untersuchung auf Indol (d.h. Röhrchen 2, 4, 6 und 8) mit einigen Tropfen Kovacs-Reagens zeigte, daß die Proben 2, 4, 6 und 8 E. coli enthielten. Die purpurne Färbung zeigt das Vorhandensein von Indol an (Fig. 1).
Die wäßrige Phase der Proben 9-14 ist gelb (Fig. 2), was das Vorhandensein von β-Galactosidaseaktivität anzeigt. Wenn das Kovacs-Reagens zu den Röhrchen 10, 12, 14 und 16 zugegeben wurde, trat keine purpurne Färbung auf Das zeigt, daß diese Bakterien nicht E. coli waren, da keine Indolbildung eingetreten war.
Die Röhrchen 15 und 16 waren nicht-coliforme Bakterien, die keine gelbe oder purpurne Färbung zeigten, und somit weder coliforme Bakterien, noch E. coli enthielten.
Das ist ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von coliformen Bakterien und E. coli. Die gelbe Färbung und der Indoltest zeigen, daß sowohl die Lactoseverwertung als auch die Indolbildung, die für E. coli typisch sind, bei den Proben 1-8 auftraten. Die gelbe Färbung und negative Indoltests bei den Proben 9-14, zeigten das Vorhandensein von coliformen Bakterien, außer E. coli, an.

Beispiel 2

"ECOTAG"-Schnelltest - Analysenanordnung (Kit) zur Bestimmung von coliformen Bakterien und E. coli in Wasserproben

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von E. coli in Wasser wird allgemein als Verunreinigung durch Abwasser angesehen.
E. coli ist eine Spezies der Familie Enterobacteriaceae. E. coli besitzt zwei Charakteristika: Lactoseverwertung und Indolbildung, die es von anderen Enterobacteriaceae und anderen coliformen Bakterien unterscheidet.
Beim Nachweis von E. coli verwertet der ECOTAG-Schnelltest diese beiden Charakteristika und bestimmt das Vorhandensein von β-Galactosid, einem Enzym das bei der Lactoseverwertung beteiligt ist, und das Vorhandensein von Tryptophanase, einem Enzym das an der Indolbildung beteiligt ist. Beim Nachweis des Vorhandensein von E. coli, werden Wasserproben mit dem ECOTAG-Schnelltestmedium, enthaltend Tryptophan und o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid (ONPG), 4 h bei 35ºC und anschließend 20 h bei 44,5ºC, oder bis zur Entwicklung einer gelben Färbung, inkubiert.Das Auftreten der gelben Färbung zeigt die Lactoseverwertung an. Die Indolbildung wird mit Kovacs-Reagens als rot-purpurne Färbung bestimmt. Das Vorhandensein der gelben Färbung in der Wasserphase zeigt die Lactoseverwertung an, und das Vorhandensein der rot-purpurnen Färbung zeigt die Indolbildung an, und beides zeigt das Vorhandensein von E. coli in der untersuchten Wasserprobe an.

Produktbeschreibung, Lagerung

ECOTAG-Schnelltest, bestehend aus:
3 sterilen Glasfläschchen mit einer Linie bei 100 ml mit Stopfen und einem Volumen von 200 ml, enthaltend jeweils 50 ml konzentriertes gefriergetrocknetes TAG-Medium. Konzentriertes TAG-Basismedium enthält 3 g Tryptophan, 1,5 g ONPG, 0,3 g Isopropyl- β-D-thiogalactopyranosid (ITPG), 9 g Natriumchlorid, 0,3 g Magnesiumsulfat, 1,5 g Kaliumdiphosphat, 9 g Dinatriumphosphat und 0,9 g Natriumlaurylsulfat, gelöst in destilliertem Wasser, und sterilisiert.

Fläschchen mit Kovacs-Reagens mit Tropfern

Lagerung des ECOTAG-Schnelltests im Kühlschrank bei 2-8ºC bis zur Verwendung. Die Glasfläschchen sollen nicht vor der Verwendung geöffhet werden.

Proben

Zu untersuchende unverdünnte Wasserproben.

Testverfahren

Prinzip: Tryptophan in dem Medium liefert eine Stickstoffquelle für E. coli und wird durch E. coli-Tryptophanase zur Bildung von freiem Indol, Pyruvat und Ammoniak in äquimolaren Mengen metabolisiert. ONPG, das Lactose ersetzt, wird durch β-Galactosidase metabolisiert. Bei 35ºC wachsen E. coli und verwerten ONPG und bilden Indol, bei 44,5ºC werden alle anderen Indol-positiven Nicht-E. coli-Bakterien eliminiert. β-Galactosid färbt das Medium gelb. Da Tryptophan als einzige Stickstoffquelle verwertet wird, bilden keine anderen Bakterien, als coliforme Bakterien und E. coli, die gelbe Färbung unter diesen Bedingungen. Bei Zusatz von Kovacs- Reagens färbt sich die Lösung purpurrot, wenn E. coli vorhanden ist.

Anordnung

Die Fläschchen mit dem Medium werden aus dem Kühlschrank genommen, geöffnet und die Wasserprobe bis zu der 100 ml Markierung in dem Fläschchen eingefüllt. Die Fläschchen werden mit dem Stopfen verschlossen, leicht geschüttelt, so daß das Medium und Wasser vermischt werden. Sie werden 4 h bei 35ºC und weitere 20 h bei 44,5ºC inkubiert, bis sich eine leuchtendgelbe Farbe entwickelt, oder 24 h, was jeweils kürzer ist. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet. Es werden 2-3 Tropfen Kovacs-Reagens zugegeben, vermischt und 1 h stehengelassen und anschließend beobachtet. Die purpurrote Färbung, die sich sofort entwickeln knnn, wird notiert.

Bewertung der Ergebnisse.

Eine leuchtend-gelbe Färbung der Lösung zeigt das Vorhandensein von coliformen Bakterien an. Die rotpurpurne Färbung zeigt das Vorhandensein von E. coli an. Keine Farbänderung zeigt die Abwesenheit von E. coli und coliformen Bakterien an.

Beispiel 3

Verfahren zur Bestimmung von gesamten coliformen Bakterien und E. coli "COLITAG"

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung von gesamten coliformen Bakterien und E. coli in verdünnten Wasserproben durch Verwertung von Tryptophan als einer Stickstoffquelle, einer anderen stickstoffhaltigen Verbindung als zweite Stickstoffquelle und Wachstumsbeschleuniger für E. coli und Lactosesubstitut zur Bestimmung von β-Galactosidase. Unter diesen Bedingungen wachsen die meisten Enterobacteriaceae, alle coliformen Bakterien ergeben eine gelbe Färbung und E. coli, das sich durch die Indolbildung unterscheidet, ergibt eine rotpurpurne Färbung entweder mit Kovacs- oder mit Ehrlich-Reagens.

Herstellung von normaler TAG-Mediumbasis (4)

1 g Tryptophan, 0,5 g ONPG, 1 g Tryptose, 0,1 g Natriumiaurylsulfat, 0,1 g Isopropyl-β- D-thiogalactopyranosid und Natriumchlorid auf 50 mmol, 0,1 g MGSO&sub4;, 0,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 3 g Na&sub2;HPO&sub4; werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und 15 min bei 121 ºC sterilisiert. Das ONPG und IPTG werden als durch Filtration sterilisierte Lösung zugegeben.

Herstellung von konzentrierter TAG-Mediumbasis (5)

Dieses Medium ist wie das normale Medium, mit der Ausnahme, daß alle Bestandteile 3- fach so konzentriert sind. Für die Anwendung in dem Vorhandensein/Nichtvorhandensein-Test, wird dieses Medium in 50 ml Anteilen in sterilen Flaschen hergestellt. Dann werden 100 ml Wasserprobe zugegeben, die sterilen Kappen wieder aufgesetzt und die Flaschen 4 h bei 35ºC und anschließend 20 h bei 44,5ºC ihkubiert.

Verfahren zur Bestimmung von gesamten coliformen Bakterien und E. coli

Das Verfahren ist in den Fig. 1 und 2 angegeben.
16 sterile 30 ml Glasfläschchen wurden hergestellt und mit 1-16 markiert. Diese vorsterilisierten Fläschchen, enthaltend 30 ml gefliergetrocknete konzentrierte TAG-Mediumbasis (5), wurden mit 1000 Bakterienzellen in 0,010 ml 0,85 %-iger salzhaltiger zu untersuchender Probe beimpft.
Proben 1-8 waren E. coli: -
1 und 2 waren ATCC 25922
3 und 4 waren ECOR 4
5 und 6 waren ECOR 5
7 und 8 waren ECOR 6
Proben 9-14 waren Nicht-E. coli coliforme Baktenen:
9 und 10 waren Enterobacter cloacae
11 und 12 waren Citrobacter freundii
13 und 14 waren Klebsiella pneumoniae
Proben 15 und 16 waren nicht-coliforme Bakterien:
15 und 16 waren Salmonella.
Die Flaschen wurden verschlossen und leicht geschüttelt, so daß die Proben und das Medium entsprechend vermischt wurden. Die Flaschen wurden 4 h im Wasserbad von 35ºC und anschließend 20 h bei 44,5ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben am nächsten Morgen visuell untersucht.

Ergebnisse:

Die Kontrollproben 15-16 blieben farblos, was anzeigt, daß weder coliformen Bakterien noch E. coli vorhanden waren. Nur coliforme Proben 9-14 waren leuchtend-gelb, was anzeigt, daß verschiedene coliforme Bakterien vorhanden waren, und zu diesem Zeitpunkt war es jedoch nicht klar, ob E. coli in den Proben 9-14 vorhanden waren. Die Proben 1-8, enthaltend nur E. coli, waren ebenfalls leuchtend-gelb, was nahelegt, daß entweder coliforme Bakterien und/oder E. coli vorhanden waren. Zu diesem Zeitpunkt war es wieder nicht klar, ob nur coliforme Bakterien, nur E. coli oder beide in den Proben 1-8 vorhanden waren.
Die Proben 1-14 wurden dann auf das Vorhandensein von freiem Indol untersucht. Es wurde eine Anordnung von 14 kleinen sterilen Petri-Schalen hergestellt und 1 ml Lösung aus den Fläschchen 1-14 in diese Schalen überführt. Mit Kovacs-Reagens gesättigtes Filterpapier wurde auf die Petri-Schalen gelegt. Nach 4 h wurde das Filterpapier auf eine rote Färbung oder Flecken untersucht.

Ergebnisse

Die über die Petri-Schalen 9-14 gelegten Filterpapiere waren nicht verfärbt und blieben weiß, was die Abwesenheit von E. coli anzeigt. Die Filterpapiere 1-8 hatten purpurrot gefärbte Flecken, was das Vorhandensein von E. coli-Kolonien anzeigt.

Beispiel 4

"COLITAG"-Schnelltest auf E. coli - Analysenanordnung (Kit) zur Bestimmung von gesamten coliformen Bakterien und E. coli in Wasserproben

Zusammenfassung

Coliforme Bakterien sind eine Gruppe von Enterobacteriaceae, enthaltend sowohl infektiöse fäkale E. coli-Bakterien als auch andere nicht-infektiöse und Umweltbakterien. Nur das Vorhandensein von E. coli in Wasser wird allgemein als Zeichen für eine Verunreinigung durch Abwässer angesehen.
E. coli ist eine Spezies der Familie Enterobacteriaceae. E. coli besitzt zwei Charakteristika: Lactoseverwertung und Indolbildung, die sie von anderen Enterobacteriaceae und anderen coliformen Bakterien unterscheiden.
Beim Nachweis von gesamten coliformen Bakterien und E. coli, verwertet der COLITAG- Schnelltest diese beiden Charakteristika und bestimmt das Vorhandensein von β-Galactosidase, einem Enzym das bei der Lactoseverwertung beteiligt ist, die bei coliformen Bakterien einschließlich E. coli auftritt, und Tryptophanase, einem Enzym das bei der Indolbildung beteiligt ist, das nur in fäkalen E. coli auftritt. Die Zusammensetzung des Mediums eliminiert eine katabole Repression durch ein Lactosesubstitut und fördert das Wachstum von E. coli. Beim Nachweis von gesamten coliformen Bakterien wird eine gelbe Färbung beobachtet, die von β-Galactosidase stammt, die das ONPG-Lactosesubstitut metabolisiert. Bei diesem Test werden Wasserproben mit COLITAG-Schnelltestmedium, enthaltend Tryptophan und o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid (ONPG), Tryptose, Natriumlaurylsulfat, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid und Natriumchlorid, 4 h bei 35ºC und 20 h bei 44,5ºC, oder bis sich eine gelbe Färbung entwickelt, inkubiert. Das Auftreten der gelben Färbung zeigt eine Lactoseverwertung des Lactosesurrogats ONPG durch β- Galactosidase an. Das Auftreten der gelben Färbung zeigt das Vorhandensein von gesamten coliformen Bakterien an, einschließlich E. coli. Proben, die eine gelbe Färbung zeigen, werden anschließend dem Indoltest unterworfen, wobei ein kleiner Anteil einer gelb gefärbten Probe aus Stufe 1 mit Kovacs-Reagens umgesetzt wird. Nur solche Proben, die eine purpurrote Färbung ergeben, enthalten E. coli. Die Indolbildung, die sich durch die purpurrote Färbung anzeigt, zeigt somit das Vorhandensein von E. coli in der untersuchten Wasserprobe an. Produktbeschreibung, Lagerung
COLITAG-Schnelltest, bestehend aus:
Stufe 1: 2 sterilen Glasfläschchen mit einem Volumen von 20 ml mit Stopfen, enthaltend jeweils 3 konzentriertes gefriergetrocknetes TAG-Medium.
Konzentriertes TAG-Basismedium enthält 3 g-Tryptophan, 1,5:g ONPG, 0,3 g Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid (ITPG), 9 g Tryptose, und 0,3 g Natriumlaurylsulfat, 0,3 g Magnesiumsulfat, 1,5 g Kaliumdiphosphat, 9 g Dinatriumphosphat und 9 g Natriumchlorid, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser, und ist sterilisiert.
Der COLITAG-Schnelltest wird im Kühlschrank bei 2-8ºC bis zur Verwendung gelagert.
Die Glasfläschchen sollen nicht vor der Verwendung geöffhet werden.
Stufe 2: Tüpfelplatte (oder Mikrotiterplatte) und Tropfflasche, enthaltend Kovacs- Reagens.

Proben

Zu untersuchende unverdünnte Wasserproben.

Testverfahren

Prinzip der Stufe 1: ONPG, das die Lactose ersetzt, wird mit β-Galactosidase metabolisiert. Bei 35ºC wachsen E. coli und verwerten ONPG und bilden Indol; bei 44,5ºC werden alle anderen Indol-bildenden Nicht-E. coli-Bakterien abgetötet β-Galactosid färbt das Medium gelb. In dem gelb gefärbten Medium sind sowohl coliforme Bakterien als auch E. coli vorhanden. Bei Proben, die keine gelbe Färbung zeigen, sind weder coliforme Bakterien noch E. coli vorhanden.
Prinzip der Stufe 2: Tryptophan in dem Medium liefert eine Stickstoffquelle für E. coli und wird durch E. coli-Tryptophanase zur Bildung von freiem Indol, Pyruvat und Ammoniak in äquimolaren Mengen metabolisiert. Da das Tryptophan als einzige Stickstoffquelle verwertet wird, bilden keine anderen Bakterien als E. coli die purpurrote Färbung, wenn das Kovacs- Reagens zugesetzt wird.

Anordnung

Die Fläschchen mit dem gefriergetrockneten Medium werden aus dem Kühlschrank entnommen, geöffiiet und die Wasserprobe bis zu der 100 ml Markierung in das Fläschchen eingefüllt. Die Fläschchen werden mit dem Stopfen verschlossen, leicht geschüttelt, so daß das Medium und das Wasser vermischt werden. Sie werden bei 35ºC und anschließend 20 h, oder bis sich eine leuchtend-gelbe Färbung entwickelt, bei 44,5ºC inkubiert.
Die Fläschchen, die nicht gefärbt sind, werden von denjenigen mit einer gelben Färbung getrennt.
Mit einer Pasteur-Pipette wird etwa 1 ml, der aus einer gelben Probe entnommen worden ist, in jede Vertiefüng der Tüpfelplatte oder Mikrotiterplatte eingebracht. Es wird ein Tropfen Kovacs-Reagens zugegeben und die Bildung einer purpurroten Färbung innerhalb von 10 s beobachtet und aufgezeichnet.

Bewertung der Ergebnisse

Stufe 1:
Eine leuchtend-gelbe Färbung der Proben zeigt das Vorhandensein von coliformen Bakterien an, die E. coli umfassen oder nicht umfassen können. Keine Veränderung der Probe zeigt die Abwesenheit von coliformen Bakterien und E. coli an.
Stufe 2:
Eine rotpurpurne Färbung der Probe in der Tüpfelplatte oder Mikrotiterplatte, zeigt das Vorhandensein von freiem Indol und somit das Vorhandensein von E. coli an. Das Nichtauftreten einer rotpurpurnen Färbung zeigt die Abwesenheit von E. coli, aber das Vorhandensein von coliformen Bakterien an.

Beispiel 5

Verdünnungsassay in mehreren Röhrchen

Dieses Beispiel erläutert ein zahlenmäßiges Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Anzahl an E. coli, die in der Wasserprobe vorhanden sind.
Das Verfahren beruht auf der Methode der aufeinanderfolgenden Verdünnung, wie sie allgemein bei mikrobiologischen Untersuchungen angewandt wird. Wasserproben werden um mehrere Größenordnungen verdünnt, um die wahrscheinlichste Anzahl an E. coli zu bestimmen.
Dieses Beispiel erläutert die Methode der schnellen visuellen Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit sowie der zahlenmäßigen Bestimmung von E. coli in Wasserproben. Bei dem Verfahren werden zwei deutliche Charakteristika, die spezifisch für E. coli sind, ausgenutzt, nämlich die Verwertung von Lactose und die Bildung von Indol.
Das Prinzip dieser Methode besteht darin, daß die Lactose, die normalerweise die Bildung von Indol hemmt, ersetzt wird durch ein Substrat, das durch das gleiche Enzym wie Lactose, nämlich β-Galactosidase, metabolisiert oder verwertet wird. Auf diese Weise und aufgrund der spezifisch ausgewogenen Komponenten des Mediums, die die katabolische Repression ausschalten, hemmt das Substitut für Lactose nicht die Bildung von Indol aus Tryptophan.
Für diese Methode wird ein spezifisches Tryptophanlgalactosidase-(TAG)-Medium (5), wie in Beispiel 3 beschrieben, enthaltend minimale Mengen Tryptophan und das Lactosesubstitut ONPG, hergestellt und verwendet. Das Medium enthält gegebenenfalls Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), einen Induktor für die Lactoseenzymbildung, und Trypiose als sekundären stickstoffhaltigen Wachstumsbeschleuniger zur Bildung einer Verbindung, und wird vorzugsweise als geeignete Mineralsalzlösung hergestellt. Das Medium wird mit normalen und verdünnten Proben umgesetzt. Aus dem Grad der Verdünnung kann die wahrscheinlichste Anzahl an E. coli bestimmt werden.

Vefahren zur Bestimmung von E. coli

Für jede Probe wurde ein Set von 3 x 5 sterilen Röhrchen vorbereitet und als 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C und 5A, SB, 5C markiert und eine andere Beschreibung der Proben, wie I, II etc. Jedes Röhrchen enthielt 10 ml Salzlösung.
Es waren 3 Proben für jede Gruppe vorhanden:
I Kontrollen, enthaltend Salmonellen
II E. coli ATCC 25922, ECOR 4, ECOR 5 und ECOR 6
III Coliforme Bakterien ohne E. coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae.
In jedes der Röhrchen I 1A - I 5A, II 1a - II 5A, III 1A - III 5A usw. wurden 10 ml des TAG-Mediums (6) bis zu dem Strich in dem Röhrchen zugegeben. Dann wurde 1 ml der zu untersuchenden Probe in die Röhrchen 1A, 1B und 1C gegeben, um eine 1/10-Verdünnung herzustellen, und vermischt. 1 ml der Lösung aus Röhrchen 1A wurde entnommen und in das Röhrchen 2A gegeben, um eine 1/100-Verdünnung zu erhalten, und vermischt. 1 ml der Lösung aus Röhrchen 2A wurde entnommen und in das Röhrchen 3A gegeben, um eine 1/1000-Verdünnung zu erhalten, und vermischt. 1 ml der Lösung 3A wurde entnommen und in das Röhrchen 4A gegeben, um eine 1/10000-Verdünnung zu erhalten, und vermischt. 1 ml der Lösung aus Röhrchen 4A wurde in das Röhrchen 5A gegeben, um eine 1/100000-Verdünnung zu erhalten. Die Röhrchen 1B-5B und 1C-5C wurden auf ännliche Weise hergestellt.
Coliforme Proben III und E. coli-Proben II wurden ähnlich verdünnt.
Wahlweise können Reihenverdünnungen in Salzlösung oder 0,1 % Pepton hergestellt und dann 0,1 bzw. 1,0 ml jeder Verdünnung in jedes der drei Kulturröhrchen gegeben werden.
Die Röhrchen wurden verschlossen oder abgedeckt und leicht geschüttelt, so daß Wasser mit dem Medium gut vermischt wurde. Die Röhrchen wurden 4 h bei 35ºC und anschließend 20 h bei 44,5ºC inkubiert. Nach der Irikubation wurden die Proben visuell untersucht.

Ergebnisse

Kontrollproben der Gruppe 1 blieben farblos und es waren keine coliformen Bakterien oder E. coli vorhanden. E. coli-Proben der Gruppe II waren leuchtend-gelb und wurden nach Zugabe von Kovacs-Reagens rotpurpurfarben. E. coli waren in großen Mengen in den Röhrchen II 1A, B, C - 3A, B, C vorhanden. Coliforme Proben der Gruppe III waren blaßgelb, was das Vorhandensein von coliformen Bakterien nahelegt. Es war eine gering sichtbare Purpurfärbung in den Proben II 4, A, B, C - 5, A, B, C vorhanden.
Das ist ein COLITAG- und E. coli-Mehrfachverdünnungsverfahren. Die purpurne Färbung zeigt an, daß sowohl eine Lactoseverwertung als auch Indolbildung, die für E. coli charakteristisch sind, auftritt, und so wird das Vorhandensein von E coli bestimmt. Die Anzahl an positiven Röhrchen bei jeder Verdünnung, interpretiert mit Hilfe einer Tabelle der wahrscheinlichsten Zahl (MPN), gibt einen Wert für die Konzentrationen an coliformen Bakterien und E. coli in den Ausgangsproben an.

Beispiel 6

ECOTAG-Test - eine Analysenanordnung (Kit) zur quantitativen Bestimmung von E. coli in Wasserproben

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von E. coli in Wasser wird allgemein als Zeichen für eine Kontamination durch Abwasser angesehen. Nach den derzeitigen Bestimmungen des EPA beträgt der derzeit zulässige Wert für die Kontarnination von Trinkwasser etwa 5 % gesamte coliforme Bakterien. Wenn das Fäkalbakterium E. coli vorhanden ist, tritt es innerhalb der Gruppe von coliformen Bakterien auf Nicht alle coliformen Bakterien sind jedoch fäkalen Ursprungs, und so ist es erforderlich, etwa die wahrscheinlichste Anzahl an E. coli, die innerhalb der zulässigen 5 % gesamten coliformer Bakterien vorhanden sind, zu bestimmen.
E. coli ist eine Spezies der Familie Enterobacteriaceae und ist eines der coliformen Baktenen. E. coli besitzt zwei Charakteristika: Lactoseverwertung und Indolbildung, die sie von anderen Enterobacteriaceae und anderen coliformen Bakterien unterscheiden.
Bei der Bestimmung der wahrscheinlichsten Anzahl von E. coli, nutzt der ECOTAG-Test diese beiden Charakteristika aus und bestimmt das Vorhandensein einer gelben oder rotpurpurnen Färbung in 10-fach verdünnter Folge von Proben. Bei Nachweis des Vorhandenseins von E. coli werden Wasserproben nacheinander verdünnt und mit ECOTAG-QUANTI-Testmedium, enthaltend als essentielle Bestandteile Tryptophan und o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid (ONPG) und Reaktionsverstärker, 4 h bei 35ºC und 20 h, oder bis sich eine gelbe Färbung entwickelt, bei 44,5ºC, umgesetzt. Das Auftreten der gelben Färbung zeigt das Vorhandensein von coliformen Bakterien und/oder E. coli in der untersuchten Wasserprobe an. Nach Reaktion mit Kovacs- Reagens entwickelt sich die rotpurpurne Färbung in Proben, enthaltend E. coli. Die Anzahl an E. coli hängt von der Verdünnung ab.

Produktbeschreibung, Lagerung

ECOTAG QUANTI-Test, bestehend aus:
Für eine Probe:
15 sterile Röhrchen mit Stopfen, mit einem Strich bei einem Gehalt von 10 ml, enthaltend ursprünglich jeweils 10 ml konzentrierte gefriergetrocknete TAG-Mediumbasis. Sie sind mit x markiert zur Identifizierung der Proben und unterteilt in 1A-5A, 18-58, 1C-5C.
Konzentriertes TAG-Basismedium enthalt 3 g Tryptophan, 1,5 g ONPG, 3 g Isopropyl-β- D-thiogalactopyranosid, 0,3 g Natriumlaurylsulfat, gelöst in Mineralsalzen in der 3-fachen Konzentration gegenüber der üblichen, und sterilisiert.

Tropffläschchen mit Kovacs-Reagens

Lagerung des CHANG QUANTI E.C. -Testes im Kühlschrank bei 2-8ºC bis zur Verwendung. Die Glasröhrchen sollen bis zur Verwendung nicht geöffhet werden.

Proben

Zu untersuchende nicht verdünnte Wasserproben.

Testverfahren

Prinzip: Tryptophan in dem Medium liefert eine Stickstoffquelle für E. coli und wird von E. coli-Tryptophanase unter Bildung von freiem Indol, Pyruvat und Ammoniak in äquimolaren Mengen metabolisiert. ONPG, das Lactose ersetzt, wird durch β-Galactosidase metabolisiert. Bei 35ºC wachsen E. coli und verwerten ONPG und bilden Indol, und bei 44,5 ºC werden alle anderen Indol-bildenden Nicht-E. coli-Bakterien abgetötet Die Wirkung von β-Galactosidase auf ONPG färbt das Medium gelb. Da das Tryptophan als einzige Stickstoffquelle verwendet wird, bilden keine anderen Bakterien als coliforme oder E. coli die gelbe Färbung unter diesen Bedingungen. E. coli färbt sich mit Kovacs-Reagens rotpurpurfarben.

Anordnung

Die Röhrchen mit dem gefriergetrockneten Medium werden aus dem Kühlschrank entnommen, geöffhet und das sterile destillierte Wasser bis zu der 10 ml Markierung in dem Fläschchen zugegeben.
1 ml der zu untersuchenden Wasserprobe wird in die Röhrchen x 1A, x 1B und x 1C eingebracht und vermischt.
1 ml der Probe aus dem Röhrchen x 1A wird entnommen und in das Röhrchen x 2A gegeben und vermischt.
1 ml der Probe aus dem Röhrchen x 2A wird entnommen und in das Röhrchen x 3A gegeben und vermischt.
1 ml der Probe aus dem Röhrchen x 3A wird entnommen und in das Röhrchen x 4A gegeben und vermischt.
1 ml der Probe aus dem Röhrchen x 4A wird entnommen und in das Röhrchen x 5A gegeben und vermischt.
Auf die gleiche Weise werden die Proben x 1B - x 5B und x 1C - x 5C hergestellt.
Es wird 4 h bei 35ºC und dann 20 h bei 44,5ºC inkubiert und das Auftreten oder Nichtauftreten einer gelben Färbung notiert.
Die Fläschchen werden mit den Stopfen verschiossen, leicht geschüttelt, so daß sich das Medium und Wasser vermischen. Sie werden bei 35ºC und bei 44,5ºC inkubiert, bis sich eine leuchtend-gelbe Farbe entwickelt, oder 24 h, was jeweils kürzer ist. Es werden 2-3 Tropfen Kovacs-Reagens zugegeben.

Bewertung der Ergebnisse

Eine leuchtend-gelbe Färbung der Lösung zeigt das Vorhandensein von coliformen Bakterien und/oder E. coli an. Eine rotpurpurfarbene Färbung zeigt das Vorhandensein von E. coli an. Keine Veränderung der Färbung zeigt die Abwesenheit oder eine nicht nachweisbare geringe Menge an E. coli an.
Verdünnung:
Proben x 1 A, B, C= 1/10
Proben x 2 A, B, C= 1/100
Proben x 3 A, B, C= 1/1000
Proben x 4 A, B, C = 1/10000
Proben x 5 A, B, C = 1/100000
Die Proben werden auf kolonienbildende Einheiten untersucht und diese aufgezeichnet und pro Verdünnung angegeben.

Beispiel 7

ECOTAG- und COLITAG-Membranfilterverfahren

Dieses Beispiel erläutert eine andere methodische Variation von ECOTAG- und COLITAG-Tests.

Materialien:

Sterile Membranfilter. Beispiele, die in verschiedenen Veröffentlichungen von Standardmethoden empfohlen werden, umfassen 47 mm 0, 45 µm ebene oder mit Gittern versehene Membranen, wie Gelman GNG. Hydrophobe Gittermembranfilter (HMGF) können ebenfalls verwendet werden.

Filtervorrichtung:

Ein geeigneter sterilisierbarer oder vorsterilisierter wegwerfbarer Filtertrichter und Kolben sowie eine manuelle oder elektrische Vorrichtung, um eine Wasserprobe durch das Membranfilter zu ziehen.

Medium:

Flüssiges Medium vom COLITAG- oder ECOTAG-Typ, das am Durchfließen verhindert wird durch Einbau in ein Gel (typischerweise ein 1,5 %-iges Agargel), oder durch Sättigung eines sterilen Filterpapierkissens (typischerweise 2 ml Medium auf einem Kissen mit einem Durchmesser von 55 mm). Das Medium ist vorsterilisiert und in einem geeigneten sterilen Behälter, wie einer Petri-Schale, enthalten.

Typische Anwendung:

Eine 100 ml Wasserprobe wird vorsichtig durch das Membranfilter unter Anwendung der Filtervorrichtung filtriert. Dann wird das Filter mit sterilen Pipetten entnommen und vorsichtig auf ein Kissen aufgelegt, das mit 2 ml COLITAG-X-GAL-Medium gesättigt ist. COLITAG-X-GAL ist identisch mit dem oben beschriebenen COLITAG-Medium mit der Ausnahme, daß 0,1 g X- GAL anstelle von 0,5 g ONPG pro 1000 ml Medium verwendet wird.
Das Filter, Kissen und Medium im Inneren der schützenden Petri-Schale werden 4 h bei 35ºC und dann 20 h bei 44,5ºC inkubiert. Dann werden die Kolonien untersucht und diejenigen mit einer blauen Färbung notiert. Hier handelt es sich um coliforme Bakterien.
Um zu bestimmen, welche coliformen Kolonien E. coli sind, wird das Membranfilter auf ein Filterpapierkissen, das mit Kovacs-Reagens gesättigt ist, aufgelegt.
Nach 2 min wird eine rötliche Färbung beobachtet, die eine Kolonie von Indol-positiven Bakterien anzeigt. Indol-positive Coliforme sind wahrscheinlich E. coli. Es kann leichter sein, die rötliche Farbe durch leichtes Anheben des Filters und Untersuchung der Unterseite zu erkennen.

Datensammlung:

Die Anzahl von blauen Bakterien ist die Anzahl an Coliformen in koloniebildenden Einheiten (cfu) pro 100 ml. Die Anzahl von blauen Kolonien, die sich bei Kontakt mit Kovacs- (oder Ehrlich's)-Reagens rötlich farben, ist die Anzahl an E. coli in cfu pro 100 ml.

Beispiel 8

Vergleich des COLITAG-Tests mit dem Standardtest auf fäkale coliforme Bakterien

Dieses Beispiel zeigt die Vorteile des erfindungsgemäßen TAG-Mediums im Vergleich mit dem Standardtest auf fäkale coliforme Bakterien unter Verwendung von EC-Medium, der angewandt wird zum Untersuchen von Oberflächen- und Grundwasserproben.

Verfahren:

Untersuchung von Proben unter Anwendung von E. coli-Medium, einschließlich der Beschreibung von Bestandteilen, ist angegeben in Standard Methods, APHA (1985). Die Methode, die angewandt wird zur Untersuchung von COLITAG entspricht dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren. Wasserproben wurden entweder von Oberflächenwasser oder von Grundwasser entnommen. Das Wasser wurde in sterilen 2 1 Flaschen entnommen und sofort ins Labor gebracht. Innerhalb von Minuten nach der Ankunft im Labor wurde es auf die folgende Weise verdünnt.

Probe:

1. 1l Wasserprobe;
2. 10 ml der Probe (1) wurden in das Teströhrchen, enthaltend 10 m doppelt-starkes EC- oder COLITAG-Medium, gegeben;
3. 1 ml der Probe (1) wurde in das Teströhrchen, enthaltend 10 m einfach-starkes EC- oder COLITAG-Medium, gegeben;
4. 0,1 ml der Probe (1) wurde in das Teströhrchen, enthaltend 10 m einfach-starkes EC- oder COLITAG-Medium, gegeben;
5. Probe (1) wurde 10:1 mit Lösung (5) verdünnt und 0,1 ml verdünnte Lösung (5) wurde in Teströhrchen, enthaltend 10 m einfach-starkes EC- oder COLITAG- Medium, gegeben;
6. Lösung (5) wurde 10-fach verdünnt und 0,1 ml in jedes Röhrchen, enthaltend 10 m einfach-starkes EC- oder COLITAG-Medium, gegeben.
Die Testbedingungen auf fäkale coliforme Bakterien waren entsprechend dem Standardverfahren. COLITAG-Röhrchen wurden 4 h bei 35ºC und 20 h bei 44,5ºC inkubiert. Dann wurden die Röhrchen auf ONPG, MUG und Indolreaktionen untersucht. Die Anzahl der positiven Reaktionen in Röhrchen wurde in Verbindung mit der Standardtabelle für die wahrscheinlichste Anzahl (MPN) angewandt, um MPN für positive E. coli-Organismen in der Ursprungsprobe zu erhalten. Tabelle 1 Vergleich von COLITAG mit dem Standardtest auf fäkale coliforme Bakterien an Oberflächen- und Grundwasser
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Bei dem Oberflächenwasser zeigen die Proben 3, 4, 7, 10, 12 und 13 wesentliche Unterschiede zwischen dem EC-Medium, das die gesamten coliformen Bakterien einschließlich E. coli mißt, und COLITAG-Test, der ONPG, MUG und Indol mißt. Mit Ausnahme der Probe 3 waren alle Ergebnisse bei dem COLITAG-Test höher. Darüberhinaus war der COLITAG-Test in der Lage, zwischen MUG-positiven und MUG-negativen Proben zu unterscheiden, wie bei Probe (3) zu ersehen, wenn MUG MPN niedriger war als MPN ONPG und Indol. Der EC-Test führte zu MPN 500, vermutlich weil coliforme Bakterien neben E. coli vorhanden waren. Bei allen anderen Proben fand der COLITAG-Test hohe MPN an E. coli als fäkaler coliformer Test.
In der Grundwasserprobe (9) zeigte wieder der Test auffakale coliforme Bakterien niedrigere MPN als ONPG und Indol bei COLITAG. MUG MPN war wieder deutlich (p< 0,05) niedriger als MPN für ONPG oder Indol. So zeigte es sich, daß MUG-negative E. coli vorhanden waren. MPN für ONPG und Indol sind etwa 5 Mal höher als MPN für fäkale coliforme Bakterien und nahezu 10 Mal höher als MUG MPN.

Beispiel 9

Auswirkung der Temperatur auf den E. coli-Test

Dieses Beispiel zeigt unterschiedliche Ergebnisse und falsch-positive Ergebnisse, die bei 35ºC erhalten wurden und den Wegfall von falsch-positiven Ergebnissen durch Einfilluung der Inkubation bei 44,5ºC.

Verfahren

Es wurden Proben aus Oberflächenwasser wie in Beispiel 8 erhalten. Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabehe 2 angegeben. Drei Methoden, nämiich Lauryltryptose-EC-Medium - Standardmedium für fäkale coliforme Bakterien, COLILERT (MMO-MUG), angegeben in Fed. Reg., 54 (135): 29999 (Juli 1989), und COLITAG wurden zum Vergleich angewandt.
Die Probengewinnung, Verdünnung und Durchführung der Tests sind in Beispiel 8 bzw. in den Beispielen 1-6 beschrieben. Tabelle 2 Vergleich von COLITAG (35ºC) und COLILERT (35ºC)
Probe = Oberflächenwasser. Daten für 5 Röhrchen MPN (#/100 ml)
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, zeigen die Daten in der MUG-Spalte deutlich die Überlegenheit des COLITAG-Tests: ONPG MPN betrug 2400, MUG MPN betrug 1300 und Indol MPN betrug 5000 gegenüber dem COLILERT-Test, wo ONPG MPN nur 1300 und MUG MPN nur 300 betrug.
Damit ist COLITAG wesentlich empfindlicher als COLILERT. Der Unterschied in der Empfindlichkeit von MUG-Tests ist bei dem 95 %-Gehalt signifikant.
Die Schlußfolgerung aus diesem Versuch war, nach einer anderen Temperatur zu suchen, bei der die für Indol erhaltenen falsch-positiven Werte nicht auftraten.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse, die bei Versuchen erhalten wurden, bei denen die Inkubation 4 h bei 35ºC und weitere 20 h bei 44,5ºC durchgeführt wurde. Diese Inkubationsbedingungen lösten das Problem der falsch-positiven Ergebnisse bei 35ºC, wie aus Tabelle 3 hervorgeht, wenn nicht nur E. coli, sondern auch andere Bakterien, wie Ent. agglomerans, Ser. Marcescans, K. oxytoca und andere vorhanden waren, die Indol-positiv sind und Indol-positive Ergebnisse ergaben, was das Vorhandensein von E. coli nahelegte, wenn keine vorhanden waren. Tabelle 3
Die Inkubation bei 44,5ºC löste das Problem von falsch-positiven Indoltests. Bei 44,5ºC finden sich nur E. coli in den Indol-positiven COLITAG-Röhrchen.
Wenn diese gleichen Proben nur 2-4 h bei 35ºC inkubiert wurden, und den Rest der Zeit bei 44,5ºC, zeigte es sich, daß nur E. coli vorhanden waren, wie aus der 44,5ºC COLITAG- Testspalte hervorgeht. Die Identität von E. coli wurde bestätigt durch Isolieren auf EMB- Agarplatten, und das Vorhandensein von ausschließlich E. coli wurde bestätigt mit dem Interotube-2-Test oder mit API-20E. In diesen Isolaten waren keine anderen Indol-positiven Bakterien vorhanden.

Claims

1. Verfahren zum spezifischen Nachweis von koliformen Bakterien und E.coli in einer Wasserprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Zusammenbringen der Probe mit einem Medium, umfassend

(i) ein Laktosesurrogat, das ein β-D-Galaktosidasesubstrat ist,

(ii) Tryptophan oder einen Tryptophanersatz, das/der ein Tryptophanasesubstrat ist,

(iii) ein Protein- oder Peptidhydrolysat in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von E.coli zu beschleunigen,

(b) Inkubieren der Bakterien bei einer Temperatur von 44,5ºC während 2 bis 24 Stunden, anschließend

(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines β-D-Galaktosidasereaktionsproduktes des β-D- Galaktosidasesubstrats,

(d) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Tryptophanasereaktionsproduktes des Tryptophanasesubstrats,

wobei das Vorhandensein des β-D-Galaktosidasereaktionsproduktes das Vorhandenseins eines koliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandenseins des Tryptophanasereaktionsproduktes das Vorhandensein von E.coli in der Probe anzeigt.

2. Verfahren zum spezifischen Nachweis von koliformen Bakterien und E.coli in einer Wasserprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Bildung eines Gemisches eines wäßrigen Probenmediums durch Zusammenbringen der Probe mit einem Medium umfassend

(i) ein Indol-bildendes Tryptophanasesubstrat,

(ii) ein chromogenes oder fluorogenes β-D-Galaktosidasesubstrat,

(iii) ein Protein- oder Peptidhydrolysat in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von E.coli in dem Gemisch zu beschleunigen,

(b) Inkubieren des Gemisches bei einer Temperatur von 44,5ºC während 2 bis 24 Stunden, anschließend

(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer ersten Färbung oder einer ersten Fluoreszenz in dem Gemisch,

(d) Zugabe eines Indolnachweisreagenz zu dem Gemisch und anschließend

(e) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer zweiten Färbung in dem Gemisch, wobei das Vorhandensein der ersten Färbung oder der ersten Fluoreszenz in dem Gemisch das Vorhandensein eines koliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandensein der zweiten Färbung in dem Gemisch das Vorhandensein von E.coli in der Probe anzeigt.

3. Verfahren zum spezifischen Nachweis von koliformen Bakterien und E.coli in einer Wasserprobe, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Bildung eines Gemischs des wäßrigen Probenmediums durch Zusammenbringen der Probe mit einem Medium umfassend

(i) Tryptophan,

(ii) o-Nitrophenyl-β-galaktopyranosid,

(c) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer gelben Färbung in dem Gemisch,

(d) Zugabe von p-Dimethylaminobenzaldehyd in angesäuertem n-Butylalkohol oder angesäuertem Isoamylalkohol zu dem Gemisch und anschließend

(e) Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer rot-purpurnen Färbung in dem Gemisch,

wobei das Vorhandensein der gelben Farbe in dem Gemisch das Vorhandensein eines koliformen Bakteriums in der Probe und das Vorhandensein der rot-purpurnen Färbung in dem Gemisch das Vorhandensein von E.coli in der Probe anzeigt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das β-D-Galaktosidasesubstrat o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Tryptophanasesubstrat Tryptophan ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Indolnachweisreagenz p-Dimethylaminobenzaldehyd in angesäuertem n-Butylalkohol oder angesäuertem Isoamylalkohol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Hydrolysat Tryptose ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Hydrolysat in einer Konzentration von 0,05 bis 30 g/l vorhanden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Medium zusätzlich einen Inhibitor für das Bakterienwachstum enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Detergenz, einem Antibiotikum und einem Gallensäuresalz.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend ferner das Futrieren der Probe durch ein Filter vor der Stufe des Zusammenbringens.