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Diese
Anmeldung ist eine continuation-in Part von Ehrenfeld et al.,
U.S. Seriennummer 08/334,788 ,
die am 4. November 1994 unter dem Titel „Medium For Detecting Target
Microbe in a Sample" eingereicht
wurde.
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Erfindungsgebiet:
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Diese
Erfindung betrifft das Gebiet der Chemie, Biologie und Mikrobiologie
und betrifft ein neues Mittel zum Nachweis der Gegenwart von Zielmikroben
in einer Probe eines möglicherweise
kontaminierten Materials.
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Hintergrund:
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Mikroorganismen
sind in biologischen Proben und in Umweltmedien, die für ihr Wachstum
geeignet sind, ubiquitär
vorhanden. Jedoch sind einige schädlich für höhere Organismen und Mittel
zum Nachweis ihres Vorhandenseins sind wichtig, um die öffentliche
Gesundheit zu schützen.
Viele Mittel zum Nachweisen verschiedener Arten von Mikroorganismen
sind verfügbar,
welche zahlreiche Vorteile bezogen auf die Geschwindigkeit und Spezifität bieten.
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Alle
Mikroorganismen haben bestimmte Anforderungen an das Wachstum und
die Reproduktion. Im Allgemeinen benötigen Mikroorganismen das Vorhandensein
der folgenden Dinge für
das Wachstum: eine Energiequelle, wie beispielsweise Licht oder
Kohlenstoffverbindungen; und eine Quelle für Ausgangsmaterialien, einschließlich Kohlenstoff,
Stickstoff, Schwefel und Phosphor, wie auch Spurenelmengen anderer
Mineralien. Des Weiteren müssen
Mikroorganismen in einer geeigneten Umgebung vorhanden sein, wobei
eine angemessene Temperatur, pH-Wert, Salinität und Sauerstoffkonzentration
bewahrt wird.
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Ein
gewöhnliches
Verfahren, das verwendet wird, um das Vorhandensein von Mikroorganismen
nachzuweisen, schließt
das Zugeben einer Probe zu einem Kulturmedium ein, welches alle
notwendigen Elemente enthält,
um das Wachstum zu unterstützen.
Die Probe kann natürlich
oder vorbehandelt sein, beispielsweise durch Membranfiltration,
bevor sie zum Kulturmedium zugegeben wird. Das Medium kann Chemikalien,
wie beispielsweise antimikrobielle Mittel oder Antibiotika enthalten
oder nicht, welche das Wachstum von Mikroor ganismen unterdrücken, die
nicht die Zielmikroorganismen sind. Für gewöhnlich werden diese Kulturmedien sterilisiert,
um sicher zu stellen, dass es keine Störungen durch kontaminierende
Mikroben gibt, und eine eher lange Inkubationszeit von 24 bis 48
Stunden wird für
gewöhnlich
benötigt,
um die Mikroben in nachweisbaren Konzentrationen wachsen zu lassen.
Zusätzlich
müssen,
sobald das Wachstum in diesen Verfahren nachgewiesen wird, die Ziel-Mikroorganismen
unter Verwendung von einem oder mehreren Tests identifiziert werden, die
für eine
Vielzahl physikalischer oder biochemischer Eigenschaften, die für die Zielmikroben
einzigartig sind, spezifisch sind. Diese Verfahren sind daher arbeitsintensiv
und zeitaufwändig.
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Es
sind Anstrengungen unternommen worden, um das Nachweisverfahren
zu vereinfachen und zu beschleunigen. Unter diesen Anstrengungen
waren Versuche, die spezifischen metabolischen Nebenprodukte individueller
Mikroorganismen zu messen. Diese Verfahren schließen ein:
elektrische Impedanztests, ATP-Test, auf Antikörpern basierende Tests und
Tests auf mit Kohlenstoff-14 markiertem Substrat. Indikatoren des
mikrobiellen Wachstums sind ebenfalls verwendet worden, um das Wachstum
von Zielmikroben zu überwachen,
welche die Farbe nur ändern,
wenn Wachstum der Zielmikroben nachgewiesen wird. Die Indikatoren reagieren
normalerweise chemisch mit einem metabolischen Nebenprodukt, das
durch die Zielmikroben hergestellt wird, was zu einer Farbänderung
in dem Medium führt.
Beispiele für
Chemikalien, die die Farbe in Gegenwart von pH-Änderungen, die mit Wachstum
assoziiert sind, ändern,
schließen
Phenolrot, Bromcresolblau und Neutralrot ein. Beispielsweise siehe
Golber,
U.S. Patent Nr. 3,206,317 ,
welcher Phenolrot verwendet, eine Chemikalie, die die Farbe in Gegenwart
von sauren Abfallprodukten ändert,
welche von der Zielmikrobe hergestellt werden. Berger et al.,
U.S. Patent Nr. 3,496,066 ,
beschreibt die Verwendung von Verbindungen, die Bakterien in Farbstoffe
umwandeln, z. B. Tropinone und Dioxane, Bochner,
U.S. Patent Nr. 4,129,483 , beschreibt
die Verwendung einer nicht biologisch abbaubaren Substanz (Tetrazolium),
welche chemisch reduziert wird, um eine Farbänderung hervorzurufen. In all
diesen Beispielen ist der Indikator eine Verbindung, die nicht als
Quelle eines benötigten
Nährstoffs
dient.
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Edberg,
U.S. Patent Nr. 4,925,789 ,
beschreibt die Verwendung eines Nährstoffindikators, der nicht
nur als Nährstoffquelle
dient, sondern auch die Farbe ändert,
wenn er metabolisiert wird. Das Patent stellt ein Medium bereit,
das einen Nährstoffindikator
enthält,
welcher, wenn er durch ein Zielbakterium metabolisiert wird, einen
Rest freisetzt, der dem Medium eine Farbe oder eine andersartige
nachweisbare Änderung
verleiht. Das Verfahren profitiert von einer Enzymspezifität, die für eine bestimmte
Spezies oder Gruppen von Bakterien einzigartig ist. Es legt die
Verwendung von Antibiotika, um das Wachstum der Mikroorganismen
zu selektieren, nahe, welche ins Ziel genommen werden, und stellt
spezifische Beispiele für
auf Flüssigkeiten
basierende Tests bereit. Andere kürzlich verwendete Verfahren,
wie beispielsweise Kilian et al., Acta. Path. Microbiol. Scand.
Sect. B § 7,
271–276
(1979) und Damare et al., J. Food Science 50: 1736 (1985) berichten über die Verwendung
von auf Agar basierenden Medien ohne Antibiotika.
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Insbesondere
war aus
| D1 | WO 94/20638 A ,
Berg, D. James, |
| D2 | EP A 0574 977 ,Berg,
James D. |
| D3 | WO 91/18111A ,
The Regents of the Uni. California |
| D4 | WO 89/01940 a ,
Biogen Inc. |
| D5 | EP A 0058 428 ,
Eisai Co., Ltd. |
| D6 | US A 5 354 663 ,
Charm Stanley E. et al. |
| D7 | US A 4,315,907 ,
Fridlenderet al. |
| D8 | US A 4,088,746 ,
BlakemoreJudith I. et al. |
bekannt, ein Wasserbad zu nutzen, um Proben und
Medien in ein thermisches Gleichgewicht zu bringen.
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WO 94/20638 betrifft insbesondere
ein schnelles Nachweissystem für
Coliforme,
EP 574 977 betrifft ein
direktes Verfahren zum Nachweisen sehr geringer Konzentrationen
einer coliformen Kontaminierung,
WO 91/18111A betrifft eine neue verbesserte
Methode zur Bestimung von E. coli in Wasser,
WO 89/10940 offenbart DNA-Sequenzen,
rekombinante DNA-Moleküle
und Verfahren zur Herstellung von löslichen T4-Proteinen,
EP 0 058 428 offfenbart
ein Verfahren zur Messung von Substanzen mittels Enzym-Immunassay in Testgefäßen zur
Durchführung
dieses Verfahrens,
US 5,354,663 schlägt einen
Testkit und ein Verfahren zum Nachweis von antimikrobiellen Medikamenten
in niedrigen Konzentrationen in einer Probe und einem Testgefäß vor,
US 4,315,907 betrifft kombinierte,
heterogene spezifische Bindungstests und
US 4,088,746 stellt ein Verfahren
für einen
Radio-Immunassay
für Schilddrüsen-stimulierendes
Hormon bereit, welches eine schnelle und günstige Version eines Doppel-Antikörper-Verfahrens
benutzt.
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Zusammenfassung der Erfindung:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren mit einem Medium, das
den Nachweis des Vorliegens oder der Abwesenheit einer Zielmikrobe
in einer Umwelt- oder biologischen Flüssigprobe ermöglicht,
welche in nur 18 bis 24 Stunden durchgeführt werden kann. Beispielsweise
können
Escherichia coli und andere Coliforme innerhalb von ungefähr 18 Stunden
nach dem Beginn der Inkubationsdauer mit großer Spezifizität nachgewiesen
werden. Daher ist das vorliegende Medium von den Medien des Stands
der Technik verschieden, bei denen ungefähr 24 Stunden benötigt werden,
um für
E. coli ein Testergebnis zu gewinnen. Ein derartiges Medium kann
unter Verwendung verschiedener Mengen von sowohl Nährstoffen
als auch Wachstumsindikatoren hergestellt werden. Insbesondere stellt
die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder der
Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer Umwelt- oder biologischen
Flüssigprobe
bereit, das den Schritt des thermischen Äquilibrierens dieser Flüssigprobe
mit einem Zielmikroben-spezifischen Nachweismedium mit einem Nährstoffindikator
bei einer Inkubationstemperatur in einem Wasserbad vor dem Platzieren
dieser Flüssigprobe
in einen Trockeninkubator umfasst, wobei der Nährstoffindikator dazu dient,
eine nachweisbare Eigenschaft der Probe zu verändern, wenn diese Zielmikrobe
in dieser Probe vorhanden ist, und die Überwachung der Probe, um zu
bestimmen, ob die nachweisebare Eigenschaft verändert ist.
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Andere
Merkmale der Medien schließen
die Verwendung von Natriumpyruvat ein, um bei der Erholung metabolisch
verletzter Bakterien zu helfen, die Verwendung von weniger Natriumchlorid
und das Bereitstellen anderer Metabolite in geeigneten Mengen.
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Das
Medium enthält
eine wirksame Menge an Vitaminen, Aminosäuren, Spurenelementen und Salzen,
die so funktionieren, dass sie die Lebensfähigkeit und Reproduktion der
Zielmikrobe in Gegenwart eines Nährstoffindikators
unterstützen.
Medien, die sich in dieser Erfindung als optimal herausgestellt
haben, um alle Coliformen und E. coli in einer Probe nachzuweisen,
schließen
eine Quelle für
Ammoniumionen ein (z. B. in einer endgültigen Probenkonzentration
von ungefähr
4,5 bis 5,5 g/l Ammoniumsulfat), einen Puffer (z. B. ungefähr 6,0 bis
6,5 g/l HEPES freie Säure,
und 4,7 bis 5,8 g/l HEPES Natriumsalz), ungefähr 0,13 bis 0,16 g/l D-Gluconsäure, eine
Sulfitquelle (z. B. ungefähr
0,036 bis 0,044 g/l Natriumsulfit), ein Antipilzmittel (z. B. ungefähr 0,0009
bis 0,0011 g/l Amphotericin B), eine Quelle für Magnesiumionen (z. B. ungefähr 0,09
bis 0,11 g/l Magnesiumsulfat), einen Nährstoffindikator (z. B. ungefähr 0,450
bis 0,550 g/l ortho-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid
(ONPG) und ungefähr
0,067 bis 0,085 g/l 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid (MUG)), eine Quelle für Zinkionen
(z. B. ungefähr
0,00045 bis 0,00055 g/l Zinksulfat), und eine Quelle für Manganionen
(z. B. ungefähr
0,00045 bis 0,00055 g/l Mangansulfat).
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Zusätzlich werden
die folgenden Bestandteile in den folgenden minimalen Mengen bereitgestellt.
Die maximalen oder optimalen Mengen jedes Inhaltsstoffs können vielfach
größer (z.
B. 3- bis 10- oder sogar 20-fach) sein als die unten angegebenen.
Genauer gesagt, hat ein derartiges Medium einen Gesamtstickstoffgehalt
von mindestens ungefähr
1,1 bis 1,7 g/l. Aminosäuren,
die für
das Wachstum der Zielmikrobe benötigt werden,
werden bereitgestellt. Nicht alle Aminosäuren müssen bereitgestellt werden,
und die relativen Mengen jeder davon können variieren. Fachleute auf
dem Gebiet erkennen, dass natürliche
Quellen für
derartige Aminosäuren
statt reiner Quellen verwendet werden können. Aminosäuren können durch
eine Vielzahl an Quellen bereitgestellt werden. Normalerweise müssen nur
wesentliche Aminosäuren,
die nicht endogen durch die Zielmikroben synthetisiert werden können, bereitgestellt
werden. Diese können
durch natürliche
Quellen bereitgestellt werden (z. B. durch Extrakte gesamter Organismen),
als Gemische oder in gereinigter Form. Die natürlichen Gemische können variierende
Mengen derartiger Aminosäuren
und Vitamine (siehe unten) enthalten. Genaue Mengen derartiger Aminosäuren und
Amine sind unten angegeben. Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass
viele verschiedene Kombinationen aus Aminosäuren und Vitaminen in Medien
dieser Erfindung verwendet werden können. Die Listen, die unten
angegeben werden, stellen nur beispielhaft ein derartiges Beispiel
dar. Aminosäuregehalte
schließen
mindestens die folgenden in Mengen in mindestens ungefähr den angegebenen
Mengen dar: Alanin (0,025 g/l), Arginin (0,03 g/l), Asparginsäure (0,056
g/l), Glutaminsäure
(0,1 g/l), Glycin (0,015 g/l), Prolin (0,09 g/l), Cystin (0,002
g/l), Histidin (0,006 g/l), Isoleucin (0,01 g/l), Leucin (0,03 g/l),
Lysin (0,03 g/l), Methionin (0,01 g/l), Phenylalanin (0,018 g/l),
Serin (0,029 g/l), Threonin (0,018 g/l), Tryptophan (0,003 g/l),
Tyrosin (0,0064 g/l) und Valin (0,023 g/l).
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Andere
anorganische Verbindungen sind eingeschlossen, um dem Wachstum der
Zielmikrobe zu helfen. Diese schließen die folgenden ein (insofern
als sie nicht bereits in den oben genannten Quellen der zahlreichen
chemischen Stoffe bereitgestellt werden): Eisen (z. B. mindestens
ungefähr
0,00165 μg/l),
Calcium (z. B. mindestens ungefähr
0,0003 g/l), Phosphat (z. B. mindestens ungefähr 0,1 g/l), Kalium (z. B.
mindestens ungefähr
0,007 g/l, vorzugsweise ungefähr
0,05 g/l), Natrium (z. B. mindestens ungefähr 0,03 g/l) und Spurenmengen
an Kobalt, Kupfer, Blei, Magnesium, Mangan, Chlor, Zinn und Zink.
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Vitamine,
die von der Zielmikrobe für
das Wachstum benötigt
werden, werden ebenfalls bereitgestellt. Diese können in reiner Form oder als
Teil eines eher komplexen Mediums bereitgestellt werden. Solche
Vitamine können
in mindestens den folgenden Mengen vorhanden sein: Biotin ((0,00005
g/l), Cyanocobalamin (Spur), Cholin (0,05 g/l), Inositol (0,060
g/l), Nicotinsäure
(0,014 g/l), Niacin (0,00385 g/l), PABA (0,02 g/l), Folsäure (0,000075
g/l), Pantothensäure
(0,01095 g/l), Pyridoxin (0,0015 g/l), Riboflavin (0,0028 g/l),
Thiamin (0,0037 g/l) und Thymidin (0,010 g/l).
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Fachleute
auf dem Gebiet erkennen, dass organischer Kohlenstoff, Stickstoff,
Spurenelemente, Vitamine und Aminosäuren in vielen Formen bereitgestellt
werden können.
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, eine Menge an Vitaminen und Aminosäuren zu
haben, die mindestens so groß ist,
wie die genauen Mengen, die oben angegeben sind, aber Fachleute
auf dem Gebiet erkennen, dass die tatsächliche Konzentration jedes Inhaltsstoffs
variiert werden kann, so dass eine Reduzierung der Menge eines Inhaltsstoffs
durch einen Anstieg der Menge eines anderen kompensiert werden kann.
Dies ist besonders relevant, wenn die Wachstumsanforderungen einer
bestimmten Zielmikrobe bekannt sind. Einige Inhaltsstoffe können in
reduzierten Mengen bereitgestellt werden oder weggelassen werden,
wenn sie endogen durch die Zielmikroorganismen synthetisiert werden
können.
Am bevorzugtesten ist die Gesamtmenge solcher Inhaltsstoffe in einem
großen Überschuss der
Gesamtmenge vorhanden, die in dem oben erwähnten Beispiel bereitgestellt
wird. Mengen in der Größenordnung
von fünf
bis zehn Mal derer, die oben beschrieben worden sind, sind besonders
wirksam beim Ermöglichen
des Nachweises von Mikroorganismen innerhalb eines kurzen Zeitraums
(18 Stunden), wobei die Nachweis-Spezifizität bewahrt wird.
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Andere
Inhaltsstoffe eines derartigen Mediums schließen Antibiotika ein, die gegen
Gram-positive nicht anvisierte Mikroben wirksam sind, Antibiotika,
die gegen Gram-negative nicht anvisierte Mikroben wirksam sind,
Induktoren für
Enzyme, die den Metabolismus des Nährstoffindikators katalysieren,
DNA-Vorläufermoleküle, Aminosäure-Vorläufermoleküle und ergänzende Quellen
für Kalium
und Phosphor.
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Der
Nährstoffindikator
ist in dem Medium in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um das
Wachstum der Zielmikrobe zu unterstüzen, bis ein nachweisbares
charakteristisches Signal in dem Medium während des Wachstums hergestellt
wird. Zusammen ermöglichen
das Vitamin, die Aminosäure,
das Spurenelement, das Salz und die Nährstoffindikator-Inhaltsstoffe
das ausreichende Wachstum der Zielmikrobe, so dass eine nachweisbare Änderung
in der Probe in weniger als ungefähr 24 Stunden beobachtet werden
kann. Der Nährstoffindikator ändert eine
nachweisbare Eigenschaft der Probe nur dann, wenn sie durch die
Zielmikrobe metabolisiert wird. Daher kann sie verwendet werden,
um die Gegenwart oder die Abwesenheit einer Mikrobe in der Probe
zu bestätigen.
Der Nährstoffindikator
muss nur durch die Zielmikrobe in dem Medium metabolisiert werden.
Wenn andere Mikroben in der Probe vorhanden sind, die den Nährstoffindikator
metabolisieren können, dann
muss ihr Wachstum durch die Verwendung spezifischer Antibiotika
unterdrückt
werden. Zusätzlich
kann das Medium, obwohl es bevorzugt ist, dass der Nährstoffindikator
die einzige Quelle des spezifischen Typs an Nährstoff für die Zielmikrobe ist, andere
derartige Quellen enthalten, aber in Mengen, die nicht die Spezifizität des Mediums
reduzieren. Beispielsweise kann der Nährstoffindikator die einzige
Kohlenstoffquelle der Zielmikrobe sein. Alternativ dazu können andere
Kohlenstoffquellen vorhanden sein (z. B. Aminosäuren), welche von der Zielmikrobe
vorzugsweise nicht verwendet werden. Falls gewünscht, kann eine kleinere Menge
einer anderen Kohlenstoffquelle vorhanden sein, die durch die Zielmikrobe
vorzugsweise verwendet wird, aber die Menge, die bereitgestellt
wird, ist derart, dass sie nicht die Spezifizität des Mediums gegenüber einem
ohne eine derartige Kohlenstoffquelle reduziert.
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Der
Begriff „Zielmikrobe" bedeutet eine oder
mehrere Mikroben, deren Gegenwart oder Abwesenheit zu bestimmen
ist. Der Begriff kann sich auf eine einzelne Mikrobe beziehen (z.
B. Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Mycobacterium fortuitum und Klebsiella pneumonia), einen Genus an
Mikroben, eine Anzahl verwandter von Mikroben-Spezies (z. B. Coliforme),
oder noch eine größere Gruppe
an Mikroben, die eine gemeinsame Eigenschaft haben (z. B. alle Gram-negativen
Bakterien). Die Erfindung zieht den Entwurf des Mediums und des
Verfahrens in Erwägung,
um einzigartige Enzym-Spezifizitäten
oder andere Eigenschaften, die für
verschiedene Gruppen, Familien oder Arten von Mikroben spezifisch
sind, auszunutzen. Daher kann der Nährstoffindikator in Abhängigkeit
davon, welche Mikrobe als Ziel ausgewählt ist, variieren. Jedoch
wird nicht beabsichtigt, dass der Begriff „Zielmikrobe" alle Mikroben einschließt.
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Der
Begriff „18
Stunden" meint die
Zeitspanne, die für
ungefähr
95% der Flüssigproben
benötigt
wird, die nur ungefähr
ein bis zehn Coliforme pro 100 ml enthalten, um eine nachweisbare Änderung
der Eigenschaft zu zeigen. Die Temperatur, Menge und Art des Enzym-Induktors,
der vorhanden ist, die Menge der Nährstoffe, die im Medium bereitgestellt
werden, und die re lative Gesundheit der Bakterien betreffen alle
den Nachweisdauer. Die Menge an Nährstoffen, wie beispielsweise
Aminosäuren,
Vitaminen und Spurenelementen, die bereitgestellt wird, kann die
Wachstumsrate der Zielmikrobe beeinflussen, und daher die Nachweisdauer.
Die thermische Äquilibrierung
der Probe auf eine Inkubationstemperatur von ungefähr 35°C nach der
Zugabe des Mediums kann die Zeit, die zum Nachweis benötigt wird,
verkürzen.
Die Menge des Enzyminduktors kann ebenfalls die Nachweisdauer verkürzen. Die
Enzyminduktoren, die im Medium gefunden werden, sind Mittel, die
so wirken, dass sie die Aktivität
oder Expression des Enzyms induzieren, welches den Nährstoffindikator metabolisiert.
Solche Induktoren schließen
Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG),
welcher β-D-Galactosidase-Aktivität induziert,
und Ethyl-β-D-thioglucosid,
welcher β-Glucosidase-Aktivität induziert.
Die relative Gesundheit der Mikrobe betrifft ebenfalls den Zeitraum,
der für
den Nachweis benötigt
wird. Die Zugabe von Mitteln, wie Pyruvat, welches bei der Gewinnung
verletzter Organismen helfen kann, kann daher den Nachweis beschleunigen.
Wenn große
Mengen an Zielmikroben in der Probe vorhanden sind (d. h. mehr als
10 Mikroben/100 ml Probe), ist ebenfalls ein schnellerer Nachweis
möglich.
In dieser Erfindung ermöglicht
das bereitgestellte Medium den Nachweis geringer Mengen an Zielmikroben
(d. h. weniger als 10/100 ml) in dem 18 bis 24 Stunden-Zeitraum,
mindestens 95% des Zeitraums. Standardverfahren können verwendet
werden, um eine derartige Fähigkeit
zu bestimmen.
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Der
Begriff „Medium" meint ein festes,
pulveriges oder flüssiges
Gemisch, welches alle oder im Wesentlichen alle notwendigen Nährstoffe
enthält,
um das Wachstum und die Reproduktion von Zielmikroben zu unterstützen. Diese
Erfindung schließt
sowohl Medien ein, die sterilisiert sind (d. h. in denen nach Inkubation des
Mediums alleine oder mit einem sterilen Verdünnungsmittel kein Wachstum
stattfindet), wie auch Medien, die nicht steril sind.
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Der
Begriff „verflüssigt" meint im Wesentlichen
in flüssiger
Form, obwohl es ebenfalls pulverisierte oder homogenisierte Proben
fester Substanzen einschließen
soll, die mindestens einen 10%igen Flüssigkeitsgehalt haben. Diese
Formulierung soll ein geliertes Medium ausschließen, welches beispielsweise
mit Agar gebildet wird.
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Die
Begriffe „Umwelt" und „biologisch" bedeuten, dass sie
von einer Substanz stammen oder kommen, die in der Lage ist, eine
oder mehrer Lebensformen zu unterstützen, einschließlich Algen,
Pilzen und Bakterien. Bei spiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf
Freizeitgewässer,
Meerwasser, Trinkwasser, Abwasserabläufe und Nahrungsmittelsubstanzen.
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Der
Begriff „Inokulierung" bedeutet, dass zum
oder nahe dem Zeitpunkt die verflüssigte Umwelt- oder biologische
Probe mit dem Medium dieser Erfindung gemischt wird. Es soll den
Zeitpunkt beschreiben, bei dem zwei Substanzen im Wesentlichen miteinander
vermischt werden.
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Der
Begriff „wirksame
Menge" ist eine
Menge innerhalb eines Bereichs, welche das Wachstum und die Reproduktion
eines Zielorganismus ermöglicht
oder fördert,
die innerhalb einer spezifischen Zeit stattfinden. Das bedeutet,
dass eine Menge, die Mikroben ermöglicht, sich an das Medium
anzupassen, die notwendigen Bestandteile für die Reproduktion zu synthetisieren
und sich anschließend
zu reproduzieren, gemeint ist. Das soll nicht genau gemeint sein
und kann in Abhängigkeit
von Faktoren, wie beispielsweise der Probengröße und der Konzentration der
Zielmikroben variieren. Im Allgemeinen gibt der Begriff die Menge
an, die benötigt
wird, um weniger als 100 Zielmikroben pro 1 ml Probe nachzuweisen,
mehr bevorzugt weniger als 100 Mikroben pro 100 ml Probe oder sogar
1 Mikrobe pro 100 ml Probe.
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Die
Begriffe „Vitamine", „Aminosäuren", „Spurenelemente" und „Salze" sollen alle Moleküle, Verbindungen
und Substanzen einschließen,
die durch Fachleute auf dem Gebiet in die jeweilige Kategorie eingeordnet
werden, ob sie organisch oder anorganisch sind, und die Kategorien
sollen keine Substanz ausschließen,
welche notwendig oder förderlich
für die
Aufrechterhaltung des Lebens sind.
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Der
Begriff „Antibiotika" bedeutet ein Molekül oder Peptid,
welches das Wachstum und die Reproduktion einer oder mehrerer Spezies
oder Gruppen von Nicht-Zielmikroorganismen verhindert oder inhibiert.
Beispiele sind im Fachgebiet gut bekannt, jedoch soll dieser Begriff
alle Detergentien ausschließen,
welche spezifisch oder unspezifisch bakterielles Wachstum inhibieren
oder verhindern. Beispiele spezifischer Antibiotika, die in der
Erfindung nützlich
sein können,
schließen
Colistin, Nalidixinsäure
und Ansiomycin ein.
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Der
Begriff „Nährstoffindikator" bedeutet ein Molekül oder eine
Substanz, die einen Rest enthält,
welcher eine Quelle für
einen wesentlichen Nährstoff
der Zielmikrobe ist, und ein Rest, welcher eine charakteristische Änderung
im Medium oder der Probe verursacht oder hervorruft. Ein Nährstoffindikator
schließt
Nährstoffquellen
ein, an die Chromogene angehängt
sind oder diese konjugiert haben. Nährstoffquellen können essentielle
Vitamine, Mineralstoffe (z. B. Phosphat), Spurenelemente, Aminosäuren, oder Kohlenhydrat-Energiequellen
(z. B. Lactose) bereitstellen. Die Nährstoffanforderungen eines
Mikroorganismus steigen, wenn der Mikroorganismus aus der Phase,
in der Nährstoffe
für die
Reproduktion angehäuft
werden (Lag-Phase) in die Phase voranschreitet, während der
die Reproduktion tatsächlich
mit einer relativ schnellen Rate stattfindet (Log-Phase). Konsequenterweise
werden die Nährstoffindikatoren
optimalerweise während
ihrer Wachstumsphasen metabolisiert, welche eine nachweisbare und
charakteristische Änderung
in der Probe hervorruft. Vorzugsweise schließt der Nährstoffindikator einen Nährstoffrest
und ein Chromogen ein. Chromogene schließen irgendwelche Reste ein,
die eine Farbänderung
hervorrufen, welche im sichtbaren Bereich oder unter Fluoreszenz
beobachtbar ist, wenn diese mit einer geeigneten Energiequelle angeregt
wird. Beispiele schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf, Orthonitrophenyl, Phenolphthalein und 4-Methylumbelliferonreste.
Während der
Nährstoffindikator
die einzige Quelle eines wesentlichen Nährstoffs bereitstellen kann,
können
auch andere Quellen derartiger Nährstoffe
bereitgestellt werden, sofern die adäquate Selektivität und Sensitivität des Mediums
bewahrt wird.
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Der
Begriff „nachweisbares
charakteristisches Signal" schließt jede Änderung
in einer Probe ein, die durch einen oder mehrere der menschlichen
Sinne nachgewiesen werden kann. Der Begriff schließt beispielsweise
eine Farbänderung
in sichtbaren oder nicht sichtbaren Wellenlängenbereichen ein, eine Änderung
des Zustands, wie beispielsweise zwischen fest, flüssig und
gasförmig,
eine Emission von Gas oder eine Geruchsveränderung.
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Das
Medium schließt
ausreichend Natriumpyruvat ein, um beim Wachstum metabolisch verletzter
Zellen zu helfen. Der Begriff „metabolisch
verletzt" schließt Umstände ein,
bei denen der zelluläre
Metabolismus durch ein externes Trauma vom optimalen oder homöostatischen
Zustand verändert
wurde. Beispiele einer „metabolischen
Verletzung" schließen Vorgänge ein,
wie beispielsweise die Exposition der Zelle gegenüber zu übermäßiger Wärme, Kälte, Chlor
oder Trockenbedingungen.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform ändert der
Nährstoffindikator
die Farbe des mikrobenspezifischen Mediums. Die Farbänderung
kann im sichtbaren Wellenlängenbereich
auftreten, oder sie kann Fluoreszenz sein, welche in einem sichtbaren
Wellenlängenbereich
nach Exposition gegenüber
einer externen UV-Quelle auftritt. Die Farbe stammt im Allgemeinen
aus der enzymatischen Freisetzung eines chromogenen Restes vom Nährstoffindikator.
Dieser Rest ist gefärbt,
wenn er an den Nährstoffanteil
des Nährstoffindikators konjugiert
ist, und ist farblos, wenn er in nicht konjugierter Form vorliegt
(d. h. wenn er nicht länger
konjugiert ist an den Nährstoffrest
oder daran gebunden ist). Beispiele chromogener Reste, die an einen
Nährstoffrest konjugiert
werden können,
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf, Orthonitrophenylreste, die eine gelbe Farbe hervorrufen, wenn
sie vom Nährstoffindikator
freigesetzt werden, Phenolphthaleinreste, die eine rote Farbe hervorrufen,
wenn sie von dem Nährstoffindikator
freigesetzt werden, 4-Methylumbelliferonreste, welche fluoreszieren,
wenn sie bei ungefähr
366 nm angeregt werden, wenn sie vom Nährstoffindikator freigesetzt werden,
und Brom-Chlor-Indol-Reste, welche blau werden, wenn sie vom Nährstoffindikator
freigesetzt werden.
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Der
Begriff „mikrobenspezifisches
Medium" bedeutet
ein Medium, das im Wesentlichen nur das Wachstum der Zielmikrobe
ermöglicht.
Dies schließt
Medien ein, die ein oder mehrer Antibiotika enthalten, die spezifisch
für die
Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen sind, die nicht die
Zielmikrobe sind, und schließt
Medien ein, die alternativ oder zusätzlich einen oder mehrere Nährstoffindikatoren
enthalten, welche vorzugsweise nicht in wesentlichem Ausmaß durch
Mikroorganismen, abgesehen von der Zielmikrobe, metabolisiert werden.
Der Begriff „wesentlich", in diesem Zusammenhang
verwendet, bedeutet, dass das Medium immer noch das spezifische
(d. h. mindestens 95% oder sogar 98% genau) und sensitive (d. h.
mindestens 95% oder sogar 98% Nachweisniveaus) des Nachweises der
Zielmikrobe ermöglichen,
wenn mit Standardverfahren gemessen wird.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Mikrobe ein coliformes Bakterium, oder noch spezifischer
ist die Zielmikrobe Escherichia coli. Andere bevorzugte Ausführungsformen
schließen
die Wahl des Nährstoffindikators
ein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Nährstoffindikator β-D-Glucuronidasesubstrat,
Beispiele hierfür
schließen
Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid, β-Naphthalamid-β-D-Glucuronid, α-Naphthol-β-D-Glucuronid
und 4-Methylumelliferyl-β-D-Glucuronid
ein. Alternativ dazu ist der Nährstoffindikator
ein β-D-Galactosidase-Substrat,
wobei Beispiele hierfür
Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid
und 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactopyranosid
einschließen.
Der Nährstoffindikator
kann ein β-D-Glucosidase-Substrat sein, wobei
Beispiele hierfür
Orthonitrophenyl-β-D-Glucose
einschließen.
In noch einer weiteren Ausführungsform
kann der Nährstoffindikator
ein L-Pyronidonylaminopeptidase-Substrat sein, wie beispielsweise
Orthonitrophenyl-β-L-pyronidonyl, β-Naphthalamid-β-L-pyronidonyl, α-Naphtholβ-L-pyronidonyl
und Methylumbelliferyl-β-L-pyronidonyl
oder der Nährstoffindikator
kann ein L-Alaninaminopeptidase-Substrat sein, wie beispielsweise L-Alanin-β-L-orthonitrophenyl, β-Naphthalamid-β-L-alanin, α-Naphthol-β-L-alanin und 4-Methylumbelliferyl-β-L-alanin.
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Der
Begriff „Coliform" kennzeichnet irgendeine
Gruppe nicht-sporenbildender Gram-negativer, oxidase-negativer,
stäbchenförmiger Bakterien,
die β-Galactosidase-Aktivität aufweisen
und normalerweise den Gastrointestinaltrakt von Menschen besiedeln.
Die Gruppe schließt
Klebsiella pneumonia und Escherichia coli ein, deren Vorhandensein
in Wasser von Fachleuten als vermutlicher Beweis einer fäkalen Kontamination
verstanden wird, so wie Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii
und Serratia plymuthica.
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Das
Medium enthält
vorzugsweise ebenfalls ein oder mehrere Antibiotika, die Mikroben,
die nicht die Zielmikroben sind, daran hindern, den Nährstoffindikator
zu metabolisieren. Das bedeutet, dass das Medium Antibiotika enthält, die
spezifische Inhibitoren des Wachstums von Mikroben sind, welche
nicht die Zielmikrobe sind, und wirksam das Wachstum von mindestens
einigen dieser Mikroben verhindern. Am meisten bevorzugt wirken
diese Antibiotika gegen ein oder mehr Gram-positive und Gram-negative
nicht-coliforme Bakterien. Beispiele dieser Anti-Mikrobizide, welche
gegen andere Bakterien und Hefen nützlich sind, schließen Colistin,
Nalidixidinsäure,
Ansiomycin und Amphotericin-B ein.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder
Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer Umwelt- oder biologischen
Flüssigkeitsprobe,
vorzugsweise, einschließlich
des Schritts des Aufwärmens
der Probe auf Inkubationstemperatur in einem Flüssigkeitsinkubator nach der
Zugabe des mikroben-spezifischen Mediums. Am bevorzugtesten ist
die Inkubationstemperatur ungefähr
35°C. Der
Begriff „Flüssigkeitsinkubator" kennzeichnet eine
Flüssigkeit,
die auf eine spezifische Temperatur oder einen Temperaturbereich
aufgewärmt
wurde. Diese kann beispielsweise jede Art von Wasserbad einschließen. Ein
derartiger Inkubator ist gegenüber
zuvor verwendeten Luftinkubatoren vorteilhaft, da das Medium schneller
in einem Flüssiginkubator
als in einem Luftinkubator die optimale Inkubationstemperatur erreichen
kann.
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Ebenfalls
beschrieben ist ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder
Abwesenheit einer Zielmikrobe in einer Umwelt- oder biologischen
Flüssigkeitsprobe
innerhalb von 24 Stunden. Escherichia coli und andere Coliforme
können
unter Verwendung dieses Verfahrens innerhalb von nur ungefähr 18 Stunden
nachgewiesen werden. Dieses Verfahren umfasst zuerst das Mischen
der Probe mit dem erfindungsgemäßen Medium,
das Aufwärmen
der Probe und der Mediummischung auf eine Inkubationstemperatur,
vorzugsweise 35°C,
für unge fähr 20 Minuten.
Die Probe wird dann in einen Luftinkubator überführt, vorzugsweise bei 35°C für ungefähr 18 Stunden.
Das Medium schließt
eine wirksame Menge an Vitaminen, Aminosäuren, Elementen und Salzen
ein, so dass coliforme Mikroben wachsen und sich reproduzieren.
Das Medium schließt
auch eine wirksame Menge eines Nährstoffindikators
ein, um das Wachstum der coliformen Bakterien zu unterstützen, und
welcher ein nachweisbares charakteristisches Signal erzeugt, wenn
er durch die Zielmikrobe metabolisiert wird. Als nächstes wird
die Probe überwacht,
um festzustellen, ob die nachweisbare Eigenschaft sich verändert hat.
Vorzugsweise enthält
das Medium ebenfalls ein oder mehrere Antibiotika in einer ausreichenden
Menge, um das Wachstum nicht coliformer Organismen, welche möglicherweise
in der Testprobe vorhanden sind, zu inhibieren oder zu verhindern.
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In
anderen Ausführungsformen
verwendet die Erfindung den Apparat, der von Naqui et al. in U.S.S.N. 08/201,110
(
US 5,518,892 ) beschrieben
wurde. Der Quantifizierungsschritt umfasst das Bereitstellen iner
Umwelt- oder biologischen Probe in Flüssigform. Die Probe wird in
einen Probenaufnahmebehälter,
der von Naqui et al. beschrieben wurde, gegeben oder dispergiert,
und mit einem Medium gemischt, um das Wachstum der Zielbakterien
zu ermöglichen
und zu fördern.
Das Gemisch wird inkubiert und die Menge und Qualität der Farbänderung
wird nachgewiesen. Die Menge und Qualität, die gewonnen wird, wird
mit einer Reihe an Proben verglichen, bei denen die Konzentration
an Bakterien bekannt war.
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Ein
optimiertes Medium zur Bestimmung des Vorhandenseins von Zielmikroben
wird beschrieben. Mikroben, z. B. Bakterien, wachsen in diesem Medium,
infolge der erhöhten
Menge an Vitamin und darin bereitgestellten Aminosäuren, viel
schneller als in den gegenwärtig
verfügbaren.
Daher sind die Testergebnisse schneller verfügbar. Schnelle Ergebnisse sparen
sowohl Geld als auch Zeit im Labor. Die Geschwindigkeit verringert
auch die Bedrohung für
die öffentliche
Gesundheit, was frühe
Warnungen und Umkehrmaßnahmen
ermöglicht,
um mit dem Vorhandensein einiger Mikroorganismen umzugehen, die
beispielsweise an solchen Stellen gefunden werden, wie Trinkwasserreservoirs
und Freizeitgewässern.
Des Weiteren benötigt
das erfindungsgemäße Verfahren
im Allgemeinen keine bestätigenden
Tests, da Mikroorganismen-spezifische Nährstoffindikatoren verwendet
werden können.
Zusätzlich
benötigt
die Erfindung nicht die Verwendung eines sterilen Mediums.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
hierfür
und aus den Ansprüchen
klar.
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Kurzbeschreibung
der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen: In der folgenden
Beschreibung wird auf zahlreiche Methoden Bezug genommen, die Fachleuten
auf dem chemischen, biologischen und mikrobiologischen Gebiet bekannt
sind. Die Zusammensetzungen, Verfahren und Produkte dieser Erfindung sind
auf biologische und Umwelt-Proben anwendbar, und sind auf dem chemischen,
biologischen und mikrobiologischen Gebiet zum Nachweis von Mikroorganismen
nützlich.
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Nachweisen
von Mikroorganismen auf Grundlage der Enzymspezifizität:
Spezifische
Mikroorganismen erhalten ihre Nährstoffe
aus einer großen
Anzahl an Quellen. Jedoch kann die Fähigkeit, bestimmte Quellen
zu metabolisieren, für
einen bestimmten Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen
einzigartig sein. Familien, Gruppen oder Arten von Mikroorganismen
können
eine Enzymspezifität
für bestimmte
Nährstoffe
teilen, welche anderen Mikroorganismen fehlt. Indem von den metabolischen
Eigenschaften spezifischer Mikroorganismen profitiert wird, ist
es möglich,
auf die Gegenwart dieser Enzymsysteme zu testen, und daher auf die
Mikroorganismen, die diese Enzymsysteme selbst herstellen. Siehe Edberg,
supra. Viele Enzyme sind identifiziert worden, welche für eine bestimmte
Gruppe von Mikroorganismen spezifisch sind, und andere werden wahrscheinlich
in der Zukunft identifiziert werden.
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Gram-negative Bakterien:
-
Gram-negative
Bakterien enthalten ein Endotoxin als Teil ihrer äußeren Zellmembran.
Sie können
Umwelt- oder biologische Proben, wie auch Pharmazeutika und andere
medizinische Präparate
kontaminieren. Daher ist es wichtig, wirksame Screeningverfahren
zu besitzen, die zur Verfügung
stehen, um zu bestimmen, ob Gram-negative Bakterien vorhanden sind.
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Einige
Gram-negative Bakterien als Gruppe haben eine L-Alaninaminpeptidase-Enzymaktivität. Nährstoffindikatoren,
wie beispielsweise L-Alanin-β-orthonitrophenyl, β-Naphthalamid-β-L-alanin, α-Naphthol-β-L-alanin
und 4-Methylumbelliferyl-β-L-alanin
können
in dem Medium als Nährstoffindikatoren
verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Gram-negativen
zu testen. Antibiotika, die für
das Eliminieren aller Gram-positiven Bakterien aus dem Medium nützlich sind,
sind im Fachgebiet ebenfalls gut bekannt. Daher ist es möglich, die
Gegenwart von irgendwelchen Gram-negativen Bakterien unter Verwendung
von Nährstoffindikatoren
mit L-Alaninaminopeptidase- Aktivität in einem
Medium nachzuweisen, welches ein Antibiotikum enthält, das
Gram-positive Bakterien eliminiert.
-
Enterococcus:
-
Das
Enzym β-D-Glucosidase
wird in der Gruppe der Enterococcen der Bakterien gefunden. Das
Enzym kann die Hydrolyse eines geeigneten Nährstoffindikators katalysieren,
welcher chromogene oder fluorogene Reste an ein β-Glucosid gebunden enthält. Diese
Eigenschaft kann verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit
von Enterococcen in einer Probe anzuzeigen. Nährstoffindikatoren, wie beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucopyranosid
können
verwendet werden, um die Gegenwart von Enterococcen anzuzeigen.
Das Wachstum anderer Mikroorganismen, die β-D-Glucosidase-Aktivität exprimieren,
kann durch das Bereitstellen eines Mediums inhibiert werden, welches
Antibiotika enthält,
die das Wachstum der Nicht-Zielmikroorganismen unterstützt, aber
das Wachstum von Enterococcen nicht wesentlich inhibiert. Amikacinsulfat,
Bacitracin und Amphotericin B sind Beispiele für derartige Antibiotika. Zusätzlich kann
das Wachstum anderer Organismen durch das Bereitstellen einer Wachstumsumgebung
inhibiert werden, welche einen hohen pH-Wert von ungefähr 9,6 hat,
oder eine erhöhte
Temperatur von ungefähr
45°C. Enterococcen
können bei
diesem hohen pH-Wert und der erhöhten
Temperatur wachsen, was einen spezifischen Nachweis von Enterococcen
unter diesen Bedingungen ermöglicht.
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Staphylococcus aureus:
-
Diese
Spezies ist in der Lage, Orthonitrophenylphosphat zu metabolisieren.
Daher wächst
Staphylococcus aureus, wenn das Wachstumsmedium diesen Nährstoffindikator
als einzige Phosphatquelle enthält, während Mikroorganismen,
die nicht in der Lage sind, Orthonitrophenylphosphat zu metabolisieren,
es nicht können.
Eine Farbänderung
wird durch Freisetzung des Orthonitrophenylrestes erzeugt.
-
Mycobacterium fortuitum:
-
Diese
Art benötigt
SO4 als Schwefelquelle und kann Phenolphthaleinsulfat
metabolisieren. Auf diese Weise wächst diese Art in einem Selektionsmedium,
dessen einzige Schwefelquelle Phenolphthaleinsulfat ist, und erzeugt
eine charakteristische Farbänderung
durch Freisetzung des Farbrestes.
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Nachweis von Escherichia coli:
-
Das
Enzym β-D-Glucuronidase
ist in E. coli vorhanden. Nährstoffindikatoren,
wie beispielsweise Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid, β-Naphthalamid-β-D-glucuronid, α-Naphthol-β-D-Glucuronid
oder Mehtylumbelliferyl-β-D-Glucuronid
sind Beispiele für
Nährstoffindikatoren,
die in einem Medium zum Nachweis von E. coli verwendet werden können. Die
Antibiotika Vancomycin und Ansiomycin können hinzugegeben werden, um
E. coli aus Gram-positiven Bakterien und Hefen in Mengen von ungefähr 0,0001%
bis 0,01% w/w zu selektieren.
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Edberg,
U.S. Patent Nr. 4,925,789 ,
beschreibt ein auf einer Flüssigkeit
basierendes bakterielles Wachstumsmedium, welches einen spezifischen
Nachweis von E. coli in einer Probe nach ungefähr 24 Stunden Inkubation erlaubt.
Es hat eine beschriebene Spezifizität, das die Gegenwart von einer
CFU (Kolonien-bildenden Einheit) in 100 ml Volumen nachzuweisen.
Jedoch ist im Gegensatz zu den spezifischen Beispielen in Edberg
der Nachweis der gesamten Coliformen einschließlich solcher Bakterien wie
E. coli, welche in ungefähr 18
Stunden erzielt werden kann, wenn andere Medien oder Methoden, die
in dieser Erfindung beschrieben sind, verwendet werden und überraschenderweise
eine Spezifizität,
um eine CFU pro 100 ml Volumen nachzuweisen, immer noch zu erreichen.
Genauer gesagt, beschreibt diese Erfindung Medien, die die Anzahl
an Vitaminen und Aminosäuren,
die vorhanden sind, erhöhen,
um das Zellwachstum zu erleichtern. Beispielsweise werden kürzere Nachweisdauern
erreicht, wenn die Menge an Vitaminen und Aminosäuren über die in dem Medium, das
von Edberg beschrieben wurde, erhöht wird. Ein Medium, das die
folgenden Verbindungen einschließt, ist besonders nützlich zum
Nachweis von Escherichia coli, was aufgrund der schnelleren Wachstumsrate
und der genaueren Spezifizität
einen Nachweis innerhalb von 24 Stunden ermöglicht. Das Bereitstellen der
Mengen des Bestandteils I in Konzentrationen von 5 bis 10 Mal derer,
die angegeben sind, ermöglicht
den Nachweis von Escherichia coli innerhalb von 18 Stunden.
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Während spezifische
Aminosäuren
und Vitamine, wie auch einige Elemente, angegeben sind, erkennen
Fachleute auf dem Gebiet, wie oben beschrieben wurde, dass die relativen
Mengen jedes Bestandteils ohne Spezifizitätsverlust signifikant variieren
können. Tabelle 1 Bestandteil I
| Inhaltsstoff | Quelle | Menge |
| Stickstoff | | 1,10 | bis
1,70 | g/l |
| Aminosäuren | Alanin | 0,025 | bis
0,08 | g/l |
| | Arginin | 0,030 | bis
0,08 | g/l |
| | Asparaginsäure | 0,056 | bis
0,085 | g/l |
| | Cystin | 0,002 | bis
0,005 | g/l |
| | Glutaminsäure | 0,102 | bis
0,207 | g/l |
| | Glycin | 0,015 | bis
0,15 | g/l |
| | Histidin | 0,005 | bis
0,020 | g/l |
| | Isoleucin | 0,0145 | bis
0,046 | g/l |
| | Leucin | 0,030 | bis
0,079 | g/l |
| | Lysin | 0,034 | bis
0,068 | g/l |
| | Methionin | 0,011 | bis
0,023 | g/l |
| | Phenylalanin | 0,018 | bis
0,037 | g/l |
| | Prolin | 0,088 | bis
0,093 | g/l |
| | Serin | 0,028 | bis
0,044 | g/l |
| | Threonin | 0,018 | bis
0,032 | g/l |
| | Tryptophan | 0,0036 | bis
0,005 | g/l |
| | Tyrosin | 0,0064 | bis
0,018 | g/l |
| | Valin | 0,023 | bis
0,056 | g/l |
| Elemente | Kobalt | | in
Spuren | |
| | Kupfer | | in
Spuren | |
| | Eisen | 0,00165 | bis
0,00165 | mg/l |
| | Blei | | in
Spuren | |
| Vitamine | Biotin | 0,00005 | bis
0,00016 | mg/l |
| | Cholin | 0,050 | bis
0,10 | mg/l |
| | Cyanocobalamin | | in
Spuren | |
| | Folsäure | 0,000075 | bis
0,0014 | mg/l |
| | Inositol | 0,060 | bis
0,12 | mg/l |
| | Niacin | 0,00385 | bis
0,0070 | mg/l |
| | Nicotinsäure | 0,014 | bis
0,03 | mg/l |
| | PABA | 0,020 | bis
0,038 | mg/l |
| | Pantothensäure | 0,01 | bis
0,013 | mg/l |
| | Pyridoxin | 0,0015 | bis
0,0021 | mg/l |
| | Riboflavin | 0,0028 | bis
0,0058 | mg/l |
| | Thiamin | 0,0037 | bis
0,026 | mg/l |
| | Thymidin | 0,010 | bis
0,02 | mg/l |
| Enzym | Induktoren | 0,015 | | g/l |
| Bestandteil
II | Konzentration
(g/l)* |
| Ammoniumsulfat
(wasserfrei) | 5,000 |
| HEPES
(freie Säure) | 6,864 |
| HEPES
(Na+-Salz) | 5,292 |
| D-Gluconsäure (Hämicalciumsalz) | 0,145 |
| Natriumsulfit
(wasserfrei) | 0,040 |
| Amphotericin
B (gelöst) | 0,0010A |
| Magnesiumsulfat
(wasserfrei) | 0,100 |
| ONPG | 0,500 |
| Methylumbilliferyl-β-D-Glucuronid | 0,075 |
| Zinksulfat
(Heptahydrat) | 0,0005 |
| Mangansulfat | 0,0005 |
| Pyruvatsäure (Na+-Salz) | 0,005 |
| Natriumchlorid | 0,100 |
| DNA-Vorläufer | 0,005 |
| Antibiotika
gegen Gram-positive | 0,005 |
| Antibiotika
gegen Gram-negative | |
| (nicht-coliform) | 0,01 |
| Aminosäure-Vorläufer | 0,001 |
| Phosphatquellen | 0,1 |
- *Spurenmengen an Elementen sind optional,
und schließen
Mengen von weniger als 0,001 g/l ein. Spurenmengen von Vitaminen
sind ebenfalls optional und schließen Mengen von weniger als
0,5 μg/g
ein.
- A Endkonzentration von Amphotericin
B nach Inbetrachtziehen der Konzentration der Lösung.
-
In
einem spezifischeren Beispiel eines Mediums dieser Erfindung wird
Bestandteil I in zehnfach höheren
Mengen bereitgestellt als in Tabelle 1 (+/– 10%) bezüglich Bestandteil II angegeben.
Dieses wird hier als Medium 2 bezeichnet.
-
Gesamte coliforme Bakterien:
-
Ein
Enzym basiertes Nährstoffindikator-Detektionssystem
hat die Spezifizität,
ein coliformes Bakterium in einem Volumen von 100 ml in 18 Stunden
nachzuweisen. Die gesamten Coliformen können durch Überwachung des Mediums hinsichtlich
des Auftretens einer intensiven gelben Färbung im Testmedium nach 18 Stunden
beobachtet werden, wenn Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG) in
dem Medium als primäre
Kohlenstoffquelle verwendet wird. Das Enzym β-D-Galactosidase wird in allen
coliformen Bakterien gefunden und wirkt so, dass es die Hydrolyse
von Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid katalysiert.
Diese Reaktion ist sowohl nicht reversibel als auch extrem sensitiv
bezüglich
des Vorhandenseins von coliformen Bakterien. Wenn E. coli unter
den gesamten Coliformen vorhanden ist, wird das Medium Fluoreszenz-Blau,
wenn eine ultraviolette Lampe im Bereich von 366 nm in der Nähe der Testprobe
platziert wird. Diese Fluoreszenz beruht auf der Hydrolyse von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid
(MUG), um die fluoreszierende Verbindung von 4-Methylumbelliferon
(MU) herzustellen, und die Reaktion wird durch das Enzym β-D-Glucuronidase
katalysiert, welche in über
97% der E. coli-Stämme
gefunden wird.
-
Der
Nachweis kann mit höchster
Geschwindigkeit und zu geringsten Kosten erzielt werden, wenn das Medium
optimiert wurde, um die schnellste Rate bakteriellen Wachstums und
der Enzymaktivität
zu erzeugen. Zusätzlich
kann Natriumpyruvat zu dem Medium hinzugegeben werden, um bei der
Erholung und dem Wachstum von metabolisch verletzten Bakterien zu
helfen. Eine Menge von ungefähr
0,0005% des Gewichts ist normalerweise ausreichend. Gleichermaßen senkt
das thermische Äquilibrieren
der Probe und der Medienmischung auf ungefähr 35°C durch Platzieren der Probe
in ein Wasserbad bei ungefähr
35°C für 20 Minuten
vor dem Platzieren in einem Trockeninkubator signifikant die für den Nachweis
benötigte
Zeit.
-
Analyse von Wasser auf Coliforme:
-
Es
ist wichtig, das Vorhandensein von coliformen Bakterien in Trinkwasser
und in Freizeitgewässern nachzuweisen.
Wenn antibakterielle Mittel in dem Wasser vorhanden sind, kann es
nützlich
sein, neutralisierende Mittel zuzugeben, wie beispielsweise Natriumthiosulfat
oder Natrium-EDTA. Sonst kann das Vorhandensein von Coliformen durch
Herstellen der Probe gemäß Standardtechniken
nachgewiesen werden. Eine 100 ml Wasserprobe wird gesammelt, das
Wachstumsmedium wird zu der Probe zugegeben, die Probe wird bei
einer Temperatur, die dem bakteriellen Wachstum förderlich
ist, inkubiert (welches normalerweise bei 35°C auftritt), und das Vorhandensein
von Coliformen wird durch eine Änderung
der Farbe der Probe nach ungefähr 18
Stunden angezeigt. Ein positives Ergebnis kann zu jedem Zeitpunkt
bis 22 Stunden nach Mischung der Probe und des Mediums auftreten.
Es kann viel schneller in Gegenwart einer relativ hohen Konzentration
an Coliformen auftreten. Das Vorhandensein einer Coliformen in einem
100 ml Volumen kann unter Verwendung des Mediums und des Verfahrens,
das in dieser Erfindung beschrieben ist, bestimmt werden.
-
Chromogene Reste:
-
Zahlreiche
Substrate, die einen chromogenen Rest einschließen, sind nachweislich in der
Lage, eine charakteristische Farbänderung in Proben zu zeigen,
die Zielmikroorganismen enthalten, welche eine spezifische Enzymaktivität aufweisen.
Beispielsweise erzeugt in Gegenwart von β-D-Glucuronidase Orthonitrophenyl-β-D-Glucuronid
eine Farbänderung
zu gelb, 4-Methylumbelliferylglucuronid erzeugt eine Fluoreszenz
nach Anregung bei 366 nm, und Bromchlorindol-β-D-Glucuronid erzeugt eine Farbänderung
nach blau, wenn E. coli vorhanden ist. In Gegenwart von β-D-Galactosidase
erzeugt Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid
eine Farbänderung
nach gelb, und 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactopyranosid erzeugt
eine Fluoreszenz nach Anregung bei 360 nm.
-
Einige
Kombinationen haben sich als wirksam zum Nachweis des Vorhandenseins
von E. coli wie auch gesamter coliformer Bakterien herausgestellt.
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid
kann zusammen mit Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid verwendet werden. Wenn
irgendwelche Coliformen vorhanden sind, verändert die Lösung ihre Farbe im sichtbaren
Wellenlängenbereich
in gelb. Wenn sowohl E. coli als auch andere Coliforme vorhanden
sind, ändert
sich die Probenlösung
in ihrer Farbe nach gelb und fluoresziert nach Anregung bei 366
nm.
-
Die
Nährstoffindikatoren
können
durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut
bekannt sind. Die Verfahren schließen im Allgemeinen das Verbinden
oder Konjugieren eines Nährstoffrestes
an einen chromogenen Rest ein, wodurch ein Nährstoffindikator hergestellt
wird. Beispiele solcher Verfahren werden von Edberg in
U.S. Patent Nr. 4,925,789 beschrieben.
-
Derzeit verfügbare Nachweisverfahren:
-
Die
zwei allgemein akzeptierten Standard-Verfahren zum Untersuchen auf
das Vorhandensein von Mikroorganismen in Trinkwasser schließen eine
Fermentierung in mehreren Röhrchen
gekoppelt mit dem (MPN-)Test für
die Analyse der wahrscheinlichen Anzahl („most probable number analysis
test") und den Membranfiltrations
(MF)-Test ein. Das Protokoll dieser Verfahren zum Nachweisen coliformer
Bakterien schließt
vorausschauende Tests ein, die mit bestätigenden Tests gekoppelt werden,
welche 48 bis 96 Stunden für
die Durchführung
benötigen.
Die Ergebnisse dieser Tests werden auch durch das Vorhandensein
nicht-coliformer Bakterien kompliziert, welche, wenn sie zu mehr
als 500 Mikroorganismen pro Milliliter vorhanden sind, falsch positive
oder falsch negative Ablesungen verursachen können.
-
Die
Erfindung des COLILERT
®-Tests, welche von Edberg,
U.S. Patent Nr. 4,925,789 beschrieben
ist, stellt eine beachtliche Verbesserung gegenüber den zuvor verfügbaren Verfahren
bereit. Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, Coliforme
in Proben in Konzentrationen bis zu einem Mikroorganismus pro 100
ml Probe nachzuweisen. Sie umfasst eine Kombination aus dem Mutmaßungsschritt
und dem Bestätigungsschritt
der mikrobiellen Identifizierung. Daher ist die Geschwindigkeit
des Nachweises viel schneller, und die Wahrscheinlichkeiten des
Erzielens falsch negativer oder falsch positiver Ableseergebnisse
sind viel geringer, da zahlreiche Selektionsmittel in dem Medium
vorhanden sind, welche das Wachstum von nicht coliformen Bakterien
stark einschränken.
Die Medien der vorliegenden Erfindung fassen jedoch die Verwendung
von mindestens einem zweifachen Anstieg der Konzentration an Aminosäuren, Vitaminen,
Spurenelementen und Salzen gegenüber
zuvor verwendeten Medien ins Auge. Überraschenderweise erzeugt
diese Änderung
des Mediums einen viel schnelleren Nachweis ohne Verlust der Spezifizität.
-
Die
vorliegende Erfindung wurde mit bereits existierenden Verfahren
zum Nachweis von Coliformen und E. coli in Proben verglichen.
-
Nachweisverfahren:
-
Die
Anzahl an Zielmikroben, die in einer Flüssigkeitsprobe vorhanden sind,
kann durch Mischen einer Flüssigkeitsprobe
mit dem oben beschriebenen Medium quantifiziert werden, indem die
Flüssigkeitsprobe
einschließlich
des Mediums in geeignete Container zur Inkubation platziert wird,
durch Inkubieren der Flüssigkeitsprobe
und des Mediengemischs, durch Beobachten der Menge und Qualität eines
nachweisbaren charakteristischen Signals, und Vergleichen der Quantität und Qualität eines
nachweisbaren charakteristischen Signals mit den am meisten wahrscheinlichen
numerischen Werten. Dieses Quantifizierungsverfahren umfasst das
Vergleichen der Quantität
und Qualität
der Eigenschaft, die geändert
worden ist, vorzugsweise eine Farbänderung, mit den am meisten
wahrscheinlichen numerischen Werten, die aus Proben gewonnen wurden, bei
denen die Konzentration und die charakteristischen Änderungen
mit Proben korreliert worden sind, bei denen die bakterielle Konzentration
bekannt ist. Siehe z. B. Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods, 3. Ausg., herausgegeben von Vanderzant und
Splittstoesser, 1992. Die Technik der am meisten wahrscheinlichen
Anzahl erlaubt Schätzungen
bakterieller Konzentration, die unter nachweisbaren Grenzen anderer
Verfahren liegen. Die am meisten wahrscheinliche Anzahl wird aus
Reaktionen abgeschätzt, wobei
die Ergebnisse in einer oder mehreren Verdünnungen der Probe als positiv
oder negativ beschrieben werden. Das Verfahren setzt voraus, dass
nicht alle Proben ein positives Ergebnis bereitstellen, und für gewöhnlich werden
mindestens drei Proben jeder Verdünnung benötigt. Listen der am meisten
wahrscheinlichen Mengen sind verfügbar. Eine derartige Reihe
wird von de Man, European Journal of Applied Microbiology, 1: 67
(1975) bereitgestellt. Abschätzungen
der am meisten wahrscheinlichen Anzahl können unter Verwendung der allgemeinen
Formel durchgeführt
werden, die von Thomas, J. Am. Water Works Assoc., 34: 572 (1942) beschrieben
worden ist und wie folgt lautet: MPN/g = P/(NT)worin
P die Anzahl positiver Röhrchen
ist, N die Gesamtmenge der Probe in allen negativen Röhrchen ist,
und T die Gesamtmenge einer Probe in allen Röhrchen ist. Die Mengen werden
in Gramm ausgedrückt.
-
Naqui
et al. (in der anhängigen
Patentanmeldung U.S.S.N 08/201,110), US 5,518,892 beschreibt ein genaues
Verfahren zur Quantifizierung der Anzahl an Bakterien in einer Flüssigprobe.
Die Erfindung verwendet einen neuen Apparat zum Halten einer Flüssigkeitsprobe.
Der Apparat umfasst ein Gefäß, welches
so entworfen ist, dass es eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann
und anschließend
die Flüssigkeitsprobe
in verschiedene Abteile innerhalb des Gefäßes verteilt, so dass verschiedene
Aliquots von einer oder mehreren Größen getestet werden können. Die
in dieser Anmeldung beschriebene Erfindung ermöglicht ebenfalls die Quantifizierung
der Mikroorganismen, die in der Probe vorhanden sind, durch die
Zugabe eines Mediums, um das Wachstum von Mikroorganismen zu fördern, durch
die Wärmeversiegelung
des Gefäßes der
Erfindung für
ungefähr
fünf Sekunden
bei einer Temperatur von ungefähr
121,1°C
bis 176,7°C
(250°F bis
350°F),
Inkubieren der Probe bei einer geeigneten Temperatur über einen
ausreichenden Zeitraum, um das Wachstum der Mikroorganismen zu ermöglichen,
und Aufzeichnen und Analysieren der Ergebnisse. Der Quantifizierungsschritt schließt das Nachweisen
der Quantität
und Qualität
der Farbänderung
ein, unter Vergleichen der Quantität und Qualität mit Ergebnissen,
die für
eine Reihe von Proben gewonnen wurden, bei denen die Konzentration
der gesamten lebensfähigen
Bakterien bekannt war.
-
Beispiel 1
-
Protokoll zu beschädigten Organismen:
-
Das
folgende Protokoll folgt dem U.S. EPA-Verfahren. Dem Verfahren zum
Einsammeln von Proben beschädigter
Mikroorganismen wurde gefolgt. Es wird als Mittel zur Sicherung
des richtigen Probenziehens und der Behandlung von Proben, die in
Vergleichen der Spezifizität
und Zeit, die für
ein Ergebnis benötigt
wird, für
Medien dieser Erfindung und der Medien des Stands der Technik verwendet
werden, bereitgestellt.
- 1. Abnahme von 2 Litern
frischen primären
Abwasserausflusses aus einer externen Quelle (z. B. einer Abwasserbehandlungseinrichtung).
- 2. Durchlauf des Abwassers durch einen Whatman-40 (150 mm Durchmesser)
Filter.
- 3. Filtrat Raumtemperatur erreichen lassen vor der Chlorbeschädigungsbehandlung.
- 4. Überprüfe den pH-Wert
und die Temperatur des Abwassers, und fülle dann 49,5 ml Aliquots in
21 Polystyrolgefäße, die
kein Natriumthiosulfat enthalten.
- 5. Schüttel
die Proben auf einer Roto-Mix 50800 Plattform (Einstellung 2) bei
Raumtemperatur.
- 6. Aliquotiere NaOCl (Natriumhypochlorid)-Lösung (5 bis 6% in jede Probe
bei einer Endkonzentration von 5 ppm). Sofortiges Überprüfen der
freien Chlorkonzentration in einer Probe.
- 7. Zugeben von 25 μl
einer 10% Lösung
Natriumthiosulfat zur ersten Probe nach 2 Minuten. Zugabe der gleichen
Menge Natriumthiosulfat zu den restlichen Proben in zweiminütigen Intervallen
nach der ersten Zugabe.
- 8. Messung der gesamten und freien Chlorkonzentration zum mittleren
Zeitpunkt der Beschädigung
in mindestens einer Probe, direkt vor der Zugabe von Natriumthiosulfat.
- 9. Bestimmen der Anzahl überlebener
Coliformer in jeder Probe durch Membranfiltration auf mEndo-Platten,
und Bestimmung der ursprünglichen
Konzentration an Coliformen in dem nicht behandelten Abwasser durch
Membranfiltration (Verdünnungen
benötigt)
auf mEndo-Platten.
- 10. Zählen
der Anzahl an Coliformen auf jeder mEndo-Platte (ein Selektionsmedium
für E.
coli) nach 22 bis 24 Stunden Inkubationszeit. Auswählen der
geeigneten Probe, die eine 2 Log 10 bis 4 Log 10 Reduzierung der
gesamten Coliformen-Konzentration erlitten hat, und Herstellen einer
Reihe aus Zweifachverdünnungen
dieser Probe. Die Anzahl an Verdünnungen,
die durchgeführt
werden, hängt
von der Anzahl überlebender
Coliformer ab, die vorhanden sind, und muss mindestens zwei Verdünnungen
ermöglichen,
die keine Coliformen enthalten.
-
Nachweisen des Vorhandenseins oder der
Abwesenheit beschädigter
Organismen:
-
Dieses
Experiment ist darauf ausgerichtet, die relative Leistungsfähigkeit
von Medium 2 und Colilert®-Medium beim Nachweis
des Vorhandenseins beschädigter
Coliformer und E. coli aus chlorinierter primärer Abwasserflüssigkeit
zu vergleichen. Das Verfahren, das befolgt wird, um die zwei Medien
zu vergleichen, schloss zunächst
das Inokulieren jeder verdünnten
chlorierten Abwasserprobe in Testmedium mit 1 ml jeder Verdünnung in
3 Colilert®-Tests
ein und 1 ml jeder Verdünnung
in 3 Medium 2-Tests. Als nächstes
wurden die Medium 2-Tests thermisch für 20 Minuten in einem 35°C +/– 0,5°C Wasserbad äquilibriert
und die anderen Tests wurden in einem 35°C +/– 0,5°C Trockeninkubator platziert.
Nach 20 Minuten wurden die Medium 2-Tests in dem 35°C Trockeninkubator platziert.
Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht und die Ergebnisse wurden
nach 18 Stunden für
Medium 2 und nach 24 Stunden für
Cholilert-Medium aufgezeichnet. Zufällige positive Medium 2-Proben
wurden aus EMB-Agar zur Isolierung und weiteren Identifizierung
unter Verwendung von API 20E ausgestrichen.
-
Ergebnisse:
-
Sieben
Abwässer
aus vier getrennten, geographisch unterschiedlichen Stellen in Georgia,
Maine, Connecticut und Kalifornien wurden in diesen Studien verwendet.
Insgesamt 201 Medium 2 und 201 Colilert
®-Gefäße wurden
mit den behandelten Abwässerverdünnungen
inokuliert. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt:
| | #
der Coliformen | #
der E. coli |
| Test | Zeit | positiven | positiven |
| Medium
2 | 18
Stunden | 91 | 6 |
| Colilert | 24
Stunden | 92 | 5 |
-
Eine
Analyse durch den Chi-Quadrat-Test zeigte, dass diese Werte innerhalb
eines 95% Vertrauens-Intervalls nicht signifikant verschieden waren.
Insgesamt 43 positive Medium 2 Proben wurden unter Verwendung des
API 20E-Kits spezifiziert und alle 43 Proben enthielten coliforme
Bakterien. Diese Daten zeigen, dass Medium 2 nach 18 Stunden Inkubation
eine ähnliche
Anzahl beschädigter
Coliformer und E. coli, wie Colilert®-Medium
nach 24 Stunden Inkubation nachwies. Das Medium dieser Erfindung
ist daher genauso spezifisch wie das Colilert®-Medium
und es ermöglicht
den Nachweis von Mikroorganismen innerhalb von 18 Stunden, während das
Colilert®-Medium
den Nachweis in 24 Stunden ermöglicht.
-
Experiment 2:
-
MPN-Verfahren für verletzte Mikroorganismen
gegenüber
LTB-Verfahren:
-
Dieses
Experiment ist darauf ausgerichtet, die Leistungsfähigkeit
von Medium 2 gegenüber
der Lauryl-Tryptose-Nährflüssigkeit
(LTB)-Methode (EPA Referenz) beim Nachweis des Vorhandenseins beschädigter Coliformer
und E. coli aus chlorierten primären
Abwässern
zu vergleichen. Die Testergebnisse wurden zuerst durch das Inokulieren
jeder verdünnten
Probe in das Testmedium erzielt, indem 100 μl jeder Verdünnung in 10 Medium 2-Röhrchen gegeben
wurden (jeweils 10 ml) und 100 μl
jeder Verdünnung
in 10 LTB-Röhrchen
(Einfach-Konzentration). Als nächstes
wurden die Medium 2-Tests bei 20 Minuten in einem 35°C Wasserbad
thermisch äquilibriert.
Die LTB-Röhrchen
wurden direkt in den 35°C
Trockeninkubator gestellt. Nach 20 Minuten wurden die Medium 2-Tests
in den 35°C
Trockeninkubator gestellt. Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht
und die Ergebnisse wurden nach 18 Stunden für Medium 2 aufgezeichnet. Zufällige positive
Medium 2-Proben wurden auf EMB-Agar zur Isolierung und weiteren
Identifizierung unter Verwendung von API 20E ausgestrichen. Die
LTB-Proben wurden dann auf das Vorhandensein von Gas nach 24 und
48 Stunden Inkubationszeit überprüft. Wenn
Gas vorhanden war, wurden die Proben in 10 ml BGLB (Brilliant Green
Lactose Broth) und 10 ml E. coli und 4-Methylumbelliferonglucuronid-Nährlösung (EC-MUG)
inokuliert. Die BGLB-Röhrchen
wurden bei 35°C
in einem Trockeninkubator für
zwischen 24 und 48 Stunden inkubiert. Die EC-MUG-Röhrchen wurden
in einem 44,5°C
Wasserbad für
24 Stunden inkubiert. Das Vorhandensein von Gas in BGLB-Röhrchen zeigte
das Vorliegen von Coliformen an. Das Vorhandensein von Gas und Fluoreszenz in
den EC-MUG-Röhrchen
zeigte das Vorliegen von E. coli an. Das Experiment ist fertig,
nachdem die Inkubation der BGLB und EC-MUG-Röhrchen
beendet war.
-
Ergebnisse:
-
Zwei
Abwässer
aus zwei primären
Abwasserstellen in Maine und Kalifornien wurden in dieser Studie verwendet.
Insgesamt 240 Medium 2 MPN-Röhrchen
wurden mit 240 LTP-Röhrchen
verglichen. Die Ergebnisse sind wie folgt:
| | #
der Coliformen | #
der E. coli |
| Test | Zeit | positiven | positiven |
| Medium
2 | 18
Stunden | 104 | 33 |
| Colilert | 96
Stunden | 75 | 16 |
-
Eine
Analyse durch den Chi-Quadrat-Test zeigte, dass diese Ergebnisse
innerhalb eines 95% Vertrauens-Intervalls signifikant verschieden
waren.
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Insgesamt
46 positive Medium 2-Proben wurden unter Verwendung des API 20E-Kits identifiziert
und alle 46 Proben enthielten coliforme Bakterien. Daher ist Medium
2 besser als das LTB-Verfahren beim Gewinnen beschädigter Coliformer
und E. coli aus primären
Abwässerflüssigkeiten.
-
Beispiel 3
-
Heterotrophe Interferenz:
-
Dieses
Experiment wurde entworfen, um die Leistungsfähigkeit von Medium 2 und Colilert®-Medium beim
Nachweis nicht beschädigter
Coliformer und E. coli in Gegenwart einer hohen Konzentration heterotropher
Bakterien zu untersuchen. Das folgende Verfahren wurde befolgt.
Zunächst
wurden jeweils 100 ml Medium 2 und Colilert®-Testgefäße mit 1
bis 10 CFU der folgenden Bakterien inokuliert: Escherichia coli
ATCC 25922, Citrobacter freundii ATCC 8090, Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883 und Enterobacter cloacae ATCC 33457. Dieser Schritt wurde
dann mit einem zweiten Probensatz wiederholt.
-
Aeromonas
hydrophilia ATCC 35654, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) oder
Pseudomonas putrefaciens (ein natürliches Isolat) wurden in den
zweiten Satz an Gefäßen in einem
Konzentrationsbereich von 16.000 bis 10.000 CFU/ml inokuliert. Medium
2 und Colilert®-Testgefäße wurden
mit A. hydrophilia, Pseudomonas aeruginosa oder P. putrefaciens
alleine inokuliert, um falsch positive Ergebnisse zu untersuchen.
Die Medium 2-Tests wurden thermisch für 20 Minuten in einem 35°C Wasserbad äquilibriert
und die Colilert®-Tests in einen 35°C Trockeninkubator
gestellt. Nach 20 Minuten wurden die Medium 2-Tests in den 35°C Trockeninkubator gestellt.
Danach wurden Farbe und Fluoreszenz überwacht und die Ergebnisse
nach 18 Stunden für Medium
2 und nach 24 Stunden für
Colilert® aufgezeichnet.
-
Ergebnisse:
-
Die
folgenden Ergebnisse wurden erzielt: Coliforme mit und ohne heterotrophe Bakterien
| | #
der Coliformen | #
der E. coli |
| Test | Zeit | positiven | positiven |
| Medium
2 | 18
Stunden | 33 | 9 |
| Colilert | 24
Stunden | 33 | 6 |
-
Insgesamt
36 Medium 2- und 36 Colilert
®-Tests wurden in dieser
Studie durchgeführt.
Neun aus jedem Satz der 36 Tests enthielten E. coli. Heterotrophe Bakterien allein
| | #
der Coliformen | #
der E. coli |
| Test | Zeit | positiven | positiven |
| Medium
2 | 18
Stunden | 0 | 0 |
| Colilert | 24
Stunden | 0 | 0 |
-
Insgesamt
wurden 24 Medium 2- und 24 Colilert®-Tests
in dieser Studie durchgeführt.
-
Weitere
Ausführungsformen
sind in den folgenden Ansprüchen.