DE60114459T2

DE60114459T2 - Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von mikroorganismen in einer probe

Info

Publication number: DE60114459T2
Application number: DE60114459T
Authority: DE
Inventors: David Townsend
Original assignee: BioControl Systems Inc
Current assignee: BioControl Systems Inc
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2001-08-27
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-08-28
Also published as: AU2001286822B2; DE60114459D1; BR0113540A; WO2002018625A2; EP1352083B2; CA2419254A1; JP2004507252A; NZ524033A; DE60114459T3; EP1352083A2; JP5189722B2; CA2419254C; WO2002018625A3; BRPI0113540B1; EP1352083B1; MXPA03001538A; AU8682201A; ATE307896T1; BRPI0113540B8

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis von Zielmikroorganismen in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen, die einen bedingt nachweisbaren Marker und ein Enzymsubstrat, das den Nachweis des Mikroorganismus erlaubt, umfassen, sowie Verfahren zu deren Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entwicklung eines diagnostischen Tests für den Nachweis einer spezifischen Art von Mikroorganismus in einer Testprobe ist aufgrund verschiedener Faktoren ein sehr langsamer und schwieriger Prozess. Um einen diagnostischen Test für einen spezifischen Mikroorganismus zu entwickeln, muss man zuerst einen Weg finden, es auf eine Art nachzuweisen, die hochempfindlich ist und einfach zu erkennen. Im allgemeinen wird dies durch ein Wachstumsmedium erreicht, das ein Nachweismolekül enthält, das mit dem Zielmikroorganismus biochemisch interagiert, um ein messbares Signal zu erzeugen. Die beste Art von Signalen sind solche, die zu einer Farbänderung des Wachstumsmediums führen. Zweitens sollte das Signal nicht mit der Matrix der Testprobe interagieren, was zu einer falsch positiven Reaktion führen würde. Dies ist insbesondere problematisch, wenn die Testprobe aus einem lebenden oder ehemals lebenden Wesen, wie zum Beispiel einem Nahrungsmittelerzeugnis stammt, da solche Wesen viele derselben biochemischen Prozesse wie der Zielmikroorganismus besitzen. Schließlich können die meisten Testmittel, zum Beispiel ein rohes Nahrungsmittelerzeugnis, durch buchstäblich Milliarden von Mikroorganismen verschiedener Art pro Gramm Nahrungsmittel verunreinigt sein. Daher sollte ein verwendbarer diagnostischer Test eine hohe Selektivität für den Zielmikroorganismus besitzen. Das wird im allgemeinen entweder durch Zugeben eines „Cocktails" von antimikrobiellen Agenzien zu dem Wachstumsmedium, um das Wachstum und den Nachweis von Nicht-Zielmikroorganismen zu unterdrücken, oder durch die Auswahl eines Nachweismoleküls, das von der überwiegenden Mehrheit von Nichtziel-Mikroorganismen nicht erkannt wird, erreicht.
Mikrobielle Wachstumsindikatoren reagieren normalerweise chemisch mit einem, von den Zielmikroben erzeugten Stoffwechselnebenprodukt, was zu einer Farbänderung des Mediums führt. Beispiele von Chemikalien, die ihre Farbe in Gegenwart von pH-Änderungen, die mit mikrobiellem Wachstum verbunden sind, ändern, schließen Anilinblau, Phenolrot, Bromkresolblau und Neutralrot ein. Zum Beispiel verwendet Gibson, U.S. Patent Nr. 4,140,580, Anilinblau, eine Chemikalie, die in Gegenwart von sauren metabolischen Abfallprodukten, die von Hefen produziert werden, ihre Farbe ändert.
In einer Reihe von mikrobiellen diagnostischen Anwendungen wurde enzymatische Katalyse zum Hydrolisieren von chromogenen oder fluorogenen Substraten verwendet, um ein nachweisbares Signal zu ergeben.
Ein Beispiel dieses Nachweisverfahrens verwendet das Testen auf die Gegenwart von verschiedenen Enzymen des Zielmikroorganismus. Zum Beispiel beschreiben Townsend und Chen in der US-Anmeldung Nr. 08/484,593, eingereicht am 07. Juni 1995, ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Nachweis bakterieller Verunreinigung in Nahrungsmittelerzeugnissen. Dieses Wachstumsmedium weist bakterielle Verunreinigungen in einer Probe durch den Nachweis von bakteriellen Enzymen (zum Beispiel Phosphatase, β-Glukosidase und L-Alanin-Aminopeptidase) aus verschiedenen mikrobiellen Arten nach. Die freigesetzten fluoreszierenden Gruppen zeigen nachweisbare Signale mit einer identischen Emissionswellenlänge. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil, verschiedene bakterielle Enzymaktivitäten aus verschiedenen Mikroben zu kombinieren, um ein breiteres Enzymaktivitätsspektrum zu erzeugen; das verbreiterte Spektrum ermöglicht den Nachweis der Gesamtbakterien in einer Testprobe.
Koumura et al. beschreiben im US-Patent 4,591,554 die Verwendung von 4-Methylumbelliferyl-Derivaten in einer fluorogenen Analyse, um basierend auf der Menge der freigesetzten Umbelliferon-Derivate die Anzahl von Mikroorganismen nachzuweisen und zu bestimmen. Gemäß dem Verfahren können Mikroorganismen bei mehr als 10.000 cfu/ml durch das in Kontakt bringen einer Probenlösung mit den Umbelliferon-Derivaten und dem Messen der Menge an freigesetzten fluoreszierenden Umbelliferon-Derivaten bestimmt werden. In dem Koumura-Patent ist die Zelllyse erforderlich, um die Menge an freigesetzten Enzymen zu erhöhen. In anderen Fällen sind zum Schluss der Inkubation die Anpassung des pH der Mischung und die Zentrifugation der Mischung, um unlösliche Zellen zu entfernen, erforderlich.
Edberg et al. beschreiben im US-Patent 4,925,739 die Verwendung von Enzymsubstraten als Nährstoffindikatoren, die einen Nährstoffrest enthalten, der kovalent an eine nicht-metabolisierte nachweisbare Gruppe gebunden ist, die von den Zielmikroorganismen spezifisch hydrolysiert werden.
In dem Edberg-Patent werden die Nährstoffindikatoren spezifisch ausgewählt, um nur von dem Zielmikroorganismus aufgrund ihrer Anwesenheit als primäre Nährstoffquelle in dem Wachstumsmedium hydrolysiert zu werden. Nicht-Zielmikroorganismen werden in diesem System nicht nachgewiesen und werden durch die Zugabe von antimikrobiellen Mitteln unterdrückt.
Obwohl die zuvor erwähnten Strategien nützlich sind, sind sie nicht besonders für alle Nachweisarten geeignet, insbesondere, wenn aufgrund einer verbesserten Empfindlichkeit antimikrobielle Mittel vermieden werden sollen. Zum Beispiel sind die meisten antimikrobiellen Mittel so ausgelegt, dass sie gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen wirksam sind. Daher kann die Verwendung dieser Mittel in einem diagnostischen Test oft das Wachstum und den Nachweis des Zielmikroorganismus negativ beeinflussen, was zu einer verringerten Empfindlichkeit des Testes führt. Des Weiteren sind nur sehr wenige Cocktails antimikrobieller Wirkstoffe beim Unterdrücken des Wachstums aller Nicht-Ziel-Organismen wirksam, was zu einer erniedrigten Spezifität des Testes führt. Zudem sind, obwohl die Verwendung eines hoch selektiven Nachweismoleküls diese Hindernisse überwinden könnte, solche Nachweismoleküle selten.
Obgleich es nützlich sein kann, eine beliebige Anzahl von spezifischen Mikroorganismen nachweisen zu können, ist das prototypische Beispiel, das nur für Diskussionszwecke dargelegt wird, die Bakterienart Campylobacter. Campylobacter Arten sind Gram-negative, Oxidase-positive, gekrümmte oder gewundene stäbchenförmige Bakterien. Campylobacter sind eine der Hauptursachen von Nahrungsmittelvergiftung, vor allem von Geflügelprodukten, und ihre Häufigkeit bei Ausbrüchen von gastrointestinalen Erkrankungen scheint zuzunehmen. Das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten unternimmt Anstrengungen, um den Grad von Campylobacter-Verunreinigungen in Geflügelprodukten durch die Entwicklung von Verfahren für den Nachweis und die Quantifizierung von Campylobacter in Geflügelwaschwasserproben zu reduzieren. In dem gegenwärtig am weitesten verbreitet verwendeten Verfahren (Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten ARS, Forschungseinheit für die mikrobiologische Sicherheit von Geflügel, Verfahren für die Auszählung von Campylobacter-Arten in Geflügelspülungen, 15. März 2000; siehe ebenfalls Stern et al. J. Food Prot. 55:663–666, 1992 und Stern et al., J. Food Prot. 55:514–517, 1992) werden 400 ml Phosphat-gepuffertes Wasser (BPW) in einen festen Kunststoffbeutel, der einen rohen Hähnchenkadaver enthält zugegeben. Der Beutel wird verdreht und die Inhalte für 2 Minuten geschüttelt, um sämtliche Campylobacter von der Oberfläche des Hähnchens in das BPW freizusetzen. Nach dem Spülen werden mindestens 40 ml des Spülwassers in einen sterilen Behälter überführt und auf Eis gehalten, bis sie auf die Anwesenheit von Campylobacter getestet werden können. Um Campylobacter zu quantifizieren, werden 0,25 ml Aliquots des Spülwassers auf vier Platten mit Agarbasiertem Medium (entweder Campy-Line Agar oder Campy CEFEX Agar, das Rezept ist vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten ARS, Forschungseinheit für die mikrobielle Sicherheit von Geflügel erhältlich; auch erhältlich von Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) ausgestrichen. Als nächstes werden 0,2 ml Aliqouts Spülwasser auf zwei zusätzliche Mediumplatten ausgestrichen. Diese sechs Platten werden dann in einem 42°C mikroaerophilen Inkubator platziert und für 48 Stunden inkubiert. Resultierende Kolonien, die typischen Campylobacter Arten entsprechen, werden mikroskopisch untersucht, um die Zellform und das Vorhandensein von Zellbeweglichkeit sichtbar zu machen. Typische kommaförmige Zellen werden schließlich einem Slide Agglutinationstest unterzogen, um die Anwesenheit von Campylobacter zu bestätigen.
Dieses Verfahren, obwohl weithin akzeptiert, hat eine Reihe von Nachteilen, wobei der wichtigste ist, dass das Verfahren eine große Anzahl von komplizierten Schritten erfordert, um zu bestätigen, dass die Organismen die auf den Platten wachsen, tatsächlich Campylobacter sind. Wie mit den meisten Nachweisassays für Mikroorganismen, ist die Durchführung dieser Schritte sehr teuer, erfordert die Fähigkeiten eines hoch qualifizierten Mikrobiologen und beschränkt die Anzahl von Tests, die in einer normalen Laborschicht durchgeführt werden können, wesentlich. Daher werden von den Technikern, die die Tests durchführen, Abkürzungen genommen, um ihre Arbeit pünktlich abzuschließen, was zu stark verfälschten Daten führen und so die Qualität des erzeugten Nahrungsmittels beeinflussen kann. Deswegen besteht ein Bedarf für verbesserte Tests für den Nachweis von Campylobacter. Wenn der Bestätigungsschritt vereinfacht werden könnte und die Tests in einer kürzeren, kostensparenderen Weise erhalten werden könnten, würde den Herstellern ermöglicht, Produkte mit genaueren Informationen hinsichtlich der wahren Campylobacter Konzentration herauszugeben. Offensichtlicherweise würde das eine wesentliche Arbeits- und Kostenersparnis für die Hersteller bedeuten und würde ebenfalls dem Verbraucher zugute kommen, da sicherere Nahrungsmittel bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung löst die zuvor erwähnten Schwierigkeiten im Stand der Technik, während sie andere ähnliche Vorteile bereitstellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmikroorganismus in einer Probe bereitgestellt, die einen bedingt nachweisbaren Marker, wobei der Marker in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu liefern, wenn er mit einem lebensfähigen Organismus in Kontakt gebracht wird, und ein Substrat für ein Enzym, das dem Zielmikroorganismus im wesentlichen fehlt, umfasst. In einer Ausführungsform ist der Zielmikroorganismus ein Bakterium, eine Hefe, ein Schimmelpilz, ein Pilz, ein Einzeller oder ein Virus. In bestimmten Ausführungsformen ist das Bakterium Salmonella, Listeria, E. coli OH157, Campylobacter, Staphylococcus aerus, Cryptosporidium oder Giardia.
In den verschiedenen Ausführungsformen ist der bedingt nachweisbare Marker durch eine Farbänderung nachweisbar. In verwandten Ausführungsformen wird die Farbänderung durch die biochemische Reduktion von Tetrazoliumrot erzeugt. In weiteren zusätzlichen Ausführungsformen umfasst das Substrat eine Signalgruppe, die mit dem Substrat verbunden ist, wobei die Signalgruppe in der Lage ist ein nachweisbares Signal zu liefern, wenn sie von im wesentlichen allen Nicht-Zielmikroorganismen gespalten wird.
In noch weiteren zusätzlichen Ausführungsformen ist das Enzym eine Aminopeptidase, wie zum Beispiel eine L-Alanin-Aminopeptidase. In verwandten Ausführungsformen ist das Substrat L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin, L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure, L-Alanin-7-Amido- 4-Trifluor-Methylcumarin Trifluoressigsäure, L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phenylalanyl-7-Amido-4-Methylcumarin oder L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure.
In anderen Ausführungsformen schließen die Nicht-Zielmikroorganismen im wesentlichen alle Nicht-Campylobacter-Arten ein. In noch zusätzlichen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ferner ein wachstumsförderndes Medium für den Zielmikroorganismus. In einer weiteren Ausführungsform enthält das wachstumsfördernde Medium alle notwendigen Nährstoffe und Wachstumsbedingungen, um das Wachstum des Zielmikroorganismus zu unterstützen. In noch weiteren Ausführungsformen enthält das wachstumsfördernde Medium Antibiotika, um das Wachstum von Nicht-Zielmikroorganismen zu unterdrücken.
In einem anderen Aspekt wird ein Medium für den Nachweis von lebensfähigen Mikroorganismen in einer Probe bereitgestellt, das ein Substrat für eine Aminopeptidase, einen bedingt nachweisbaren Marker, wobei dieser Marker in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu liefern, wenn er in Kontakt mit einem lebensfähigen Mikroorganismus gebracht wird, eine Signalgruppe, die mit dem Substrat verbunden ist, wobei diese Gruppe ein nachweisbares Signal liefert, wenn es von der Aminopeptidase von einem Mikroorganismus abgespalten wird, und ein wachstumsunterstützendes Medium für Ziel- oder Nicht-Zielmikroorganismen, umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen des Mediums ist die Aminopeptidase L-Alanin Aminopeptidase. In weiteren Ausführungsformen kann die Signalgruppe Ortho-Nitrophenyl, 4-Methylumbelliferon, Para-Nitroanillid, 4-Methoxy-beta-naphtylamid oder 7-Amido-4-Methylcumarin sein. Zusätzlich stellen bestimmte Ausführungsformen ein Enzymsubstrat bereit, das ausgewählt wird aus N-o-Acetyl-lysin-7-Amido-4-Methylcumarin Acetat; N-Acetyl-L-Phenylalanyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin; β-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; D-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Alanin-7-Amido-4-Trifluor-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Alanlyl-L-Alanyl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; D-Alanyl-L-Leucyl-L-Lysin-7-Amido-4-Methylcumarin Salz; L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Arginyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Trihydrochlorid; L-Asparagin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Asparaginsäure-b-(7-Amino-4-Methylcumarin); N-Alpha-Benzoyl-DL-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-Alpha-Benzoyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-Benzoyl-L-Phenylalanyl-L-Valyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin; S-Benzyl-L-Cystein-7-Amido-4-Methylcumarin; N-BOC-L-Phenylalanyl-L-Seryl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Acetat; N-BOC-L-Vanyl-Glycyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; N-BOC-L-Vanyl-L-Leucyl-L-Lysin-7-Amido-4-Methylcumarin Salz; N-Alpha-CBZ-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; N-CBZ-Glycylglycyl-L-Leucin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-CBZ-Glycyl-L-Prolin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-CBZ-Glycyl-L-Prolyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-beta-CBZ-L-Lysin-7-Amido-4-Methylcumarin; N-CBZ-L-Phenylalanyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; N-CBZ-L-Prolyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Citrullin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Citrullin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid Trifluoressigsäure; D-Glutaminsäure-Gamma-(7-Amido-4- Methylcumarin); L-Glutaminsäure-alpha-(7-Amido-4-Methylcumarin); L-Glutamin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; Glutaryl-Glycyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; Glutaryl-glycylglycyl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin; Glutaryl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin; Glycin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; Glycyl-L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; Glycyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Salz; Glycylglycin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; Glycyl-L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin; Glycyl-L-Prolin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Histidin-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Isoleucin-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Isoleucin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Leucin-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Leucin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Leucyl-1-Valvyl-1-Tyrosin-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Lysin-7-Amido-4-Methylcumarin Acetat; L-Methionin-7-Amido-4-Methylcumarin Acetat; L-Ornithin-7-Amido-4-Methylcumarin Carbonat; L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methylcumarin Trifluoressigsäure; L-Prolin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Prolyl-L-Phenylalanyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylcumarin Salz; L-Pyroglutaminsäure-7-Amido-4-Methylcumarin; L-Serin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrochlorid; L-Seryl-L-Tyrosin-7-Amido-4-Methylcumarin Hydrat; oder L-Tyrosin-7-Amido-4-Methylcumarin.
In den verschiedenen Ausführungsformen ist die Bindung zwischen der Signalgruppe und dem Substrat eine Peptidbindung. Ferner ist in einer zusätzlichen Ausführungsform die Signalgruppe eine fluoreszierende Gruppe, wobei die fluoreszierende Gruppe in der Lage ist, ein Fluoreszenzsignal oder eine chromogene Gruppe bereitzustellen, wobei die chromogene Gruppe in der Lage ist, ein Signal im sichtbaren, ultravioletten oder infraroten Spektrum bereitzustellen.
In noch einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis eines lebensfähigen Zielmikroorganismus in einer Probe bereitgestellt, das umfasst ein Mediums, das die zuvor erwähnte Zusammensetzung enthält, bereitzustellen, Beimpfen des Mediums mit der auf die Anwesenheit des Zielmikroorganismus zu testenden Probe, Inkubieren des beimpften Mediums unter Bedingungen, die für das Wachstum des Zielmikroorganismus geeignet sind, wobei es für ein Enzym von im wesentlichen allen Nicht-Zielmikroorganismen möglich ist, auf das Enzymsubstrat einzuwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, und Vergleichen des Unterschieds zwischen dem Signal, das durch den bedingt nachweisbaren Marker und das Enzymsubstrat erzeugt wird, wobei die Abwesenheit oder die Verringerung des nachweisbaren Signals die Anwesenheit des Zielmikroorganismus in der Probe anzeigt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung ersichtlich. Zusätzlich werden unten verschiedene Referenzen dargelegt, die in mehr Detail bestimmte Verfahren oder Zusammensetzungen beschreiben (zum Beispiel Farbstoffe, Substrate, Enzyme, Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Viren, Plasmide, etc.).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der die korrelative Beziehung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zur Standard Campy-Cefex Agarzählung von Campylobacter darstellt. Der Vergleich wurde mit 162 Geflügelwaschproben durchgeführt, die dem erfindungsgemäßen Assay unterzogen, und mit den Ergebnissen, die unter Verwendung des von der Industrie und dem USDA akzeptierten, Campy-Cefex Agartests für dieselben Proben erzielt wurden, verglichen wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vor dem Darlegen der Erfindung mag es für das Verständnis hilfreich sein, die Definitionen von bestimmten Begriffen, die nachstehend verwendet werden, darzulegen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „bedingt nachweisbarer Marker" auf ein Molekül, das eine messbare Veränderung durchmacht (wie zum Beispiel eine Farbänderung), wenn es mit einem lebensfähigen Mikroorganismus in einer Probe reagiert. Daher bezieht sich die Bedingtheit in „bedingt nachweisbar" auf die Bedingung der Lebensfähigkeit. Solche Moleküle werden im Stand der Technik gewöhnlich als vitale Farbstoffe bezeichnet, um einen Farbstoff oder Marker zu kennzeichnen, auf den im wesentlichen nur lebensfähigen Zellen einwirken, wie zum Beispiel Redox-Farbstoffe (Resazurin, XTT, MTT etc.). Eine Liste von solchen Farbstoffen ist im Stand der Technik erhältlich (siehe zum Beispiel Sigma Chemikalienkatalog 2000–2001, Seite 1836, 2000, St. Louis, MO oder Molecular Probes Katalog 2000–2001, Eugene, OR). In einer Ausführungsform wird die biochemische Aktivität eines Farbstoffes verwendet, um die Konzentration eines Mikroorganismus in einer Probe nachzuweisen oder zu messen. In einer anderen Ausführungsform ist der spezifische Farbstoff Tetrazoliumrot. Wie hierin offenbart, wurde für diesen Farbstoff gezeigt, dass er durch Campylobacter-Arten reduziert wird und es ist dem Durchschnittsfachmann gut bekannt, dass er von den meisten Mikroorganismen reduziert wird. Ein Vitalfarbstoff kann jeder Farbstoff sein, der verwendet werden kann, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Enzymsubstrat" auf ein Molekül, auf das ein Enzym einwirkt. Die enzymatische Reaktion schließt gewöhnlich das Hydrolisieren einer oder mehrerer kovalenter Bindungen ein. In einem Aspekt umfasst das Substrat Nährstoff- und nachweisbare Gruppen, die verbunden sind. Durch die Hydrolisierung durch ein mikrobielles Enzym setzt das Substrat eine separate nachweisbare Gruppe in das Medium frei. In einem anderen Aspekt wird das enzymatische Produkt einer natürlichen Substanz durch Verwendung einer separaten nachweisbaren Gruppe nachgewiesen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Enzymsubstrat aus der Gruppe von Substraten, die in Tabelle III aufgelistet sind, ausgewählt. Es ist nicht beabsichtigt, dass diese Liste irgendein Enzymsubstrat, das noch nicht entdeckt worden ist, oder Substrate die später identifiziert werden und durch den Durchschnittsfachmann in dieser Liste eingeschlossen werden können, ausschließt. In bestimmten Ausführungsformen ist das Enzymsubstrat L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Medium" auf eine Umgebung, typischerweise flüssig oder fest, in welchem Mikroorganismen wachsen und sich vermehren können. Es ist eine Umgebung, die vom Durchschnittsfachmann hergestellt wird, um nachweisbares Wachstum des Zielmikroorganismus zu ermöglichen. Die Zusammensetzung des Mediums kann abhängig von der Natur des Zielmikroorganismus variieren, wird aber im allgemeinen wirksame Konzentrationen von Bestandteilen enthalten, die einschließen, aber nicht begrenzt sind auf: Aminosäuren, Vitamine, Kohlenhydrate, eine Stickstoffquelle, Lipide, Fettsäuren, Mineralien, Spurenelemente und antimikrobielle Mittel.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Nährstoffgruppe" auf ein Molekül oder eine Substanz, die ein Nährstoff oder eine metabolische Quelle für mindestens die Nicht-Zielmikroorganismen ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Aminosäuren (zum Beispiel Alanin, Leucin, Arginin, Valin, etc...), Kohlenstoff quellen (zum Beispiel D-Glukose, D-Fruktose, D-Laktose, etc...) und Mineralien (zum Beispiel Sulfat, Phosphat, Kalzium, etc...). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nährstoffgruppe des Enzymsubstrats eine Aminosäure.
Wie hierin verwendet bezieht sich „nachweisbare Gruppe" auf ein Molekül oder eine Substanz, die an eine Nährstoffgruppe gebunden werden kann oder als einzelne Einheit vorliegt. Die nachweisbare Gruppe verursacht oder erzeugt kein nachweisbares Signal, wenn sie mit einer Nährstoffgruppe verbunden ist (zum Beispiel kovalent daran gebunden). Wenn jedoch ein Enzym eines Mikroorganismus das Substrat hydrolysiert, wird eine nachweisbare Gruppe freigesetzt und verursacht ein nachweisbares Signal oder ist in der Lage, ein solches zu erzeugen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die nachweisbare Gruppe ein Chromogen, das vorzugsweise eine Farbänderung in dem sichtbaren Wellenlängenbereich erzeugt (alternativ im ultravioletten oder infraroten Spektrum), oder ein Fluorogen, das Fluoreszenz emittiert, wenn es durch eine externe Energiequelle entsprechend angeregt wird. Beispiele von nachweisbaren Gruppen schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf: Ortho-Nitrophenyl, 4-Methylumbelliferon, Para-Nitroanillid, 4-Methoxy-β-Naphtylamid und 7-Amido-4-Methylcumarin.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „nachweisbares Signal" auf eine charakteristische Veränderung in einem Medium oder einer Probe, die durch physikalische, chemische oder biologische Mittel, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, zu beobachten oder messbar ist. Solch ein nachweisbares Signal kann über visuelle, taktile oder olfaktorische Mittel bestimmt werden. Zum Beispiel wird eine Veränderung in der Emission oder Absorption von sichtbarem oder unsichtbarem Licht oder Radiowellen bei einer bestimmten Wellenlänge, die elektrische Leitfähigkeit, die Emission eines Gases oder ein Geruch bestimmt. Ein nachweisbares Signal kann ebenfalls eine Änderung in dem physikalischen Zustand sein, wie zum Beispiel zwischen einem Feststoff, einer Flüssigkeit und einem Gas. Typischerweise wird ein nachweisbares Signal visuell gemessen. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen nachweisbare Signale eine Änderung in der Farbe oder Fluoreszenzemission des Mediums.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Probe" auf einen Bestandteil, der einem Nahrungsmittelerzeugnis, einer menschlichen oder tierischen Testprobe, einem pharmazeutischen oder kosmetischen Artikel, dem Boden, dem Wasser, der Luft oder einer anderen Umweltquelle, oder jeder anderen Quelle, in der der Zielorganismus nachgewiesen werden soll, entnommen wird. Eine Testprobe kann aus einer Quelle unter Verwendung von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, entnommen werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Testprobe eine Geflügelspülwasserprobe.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Zielmikroorganismus" auf jeden lebensfähigen einzelligen Mikroorganismus, dessen Nachweis erforderlich ist, um die Qualität, Sicherheit oder andere Spezifikation einer bestimmten Testprobe zu bestimmen. Diese Zielmikroorganismen schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Pilze, Parasiten und Viren. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zielmikroorganismen Campylobacter-Arten.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein „Nicht-Zielmikroorganismus" auf im wesentlichen alle lebensfähigen einzelligen Mikroorganismen, die zu Wachstum und Nachweis in dem Medium in der Lage sind, und die nicht der Zielmikroorganismus sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „wirksame Konzentration von Bestandteilen" auf eine Menge von Nährstoffen oder antimikrobiellen Mitteln innerhalb eines Bereiches, der das Wachstum und die Vermehrung des Zielmikroorganismus erlaubt oder fördert. Das heißt eine Menge, die dem Zielmikroorganismus erlaubt sich an das Medium anzupassen, seinen Stoffwechsel fortzusetzen oder die notwendigen Bestandteile für die Vermehrung zu synthetisieren und sich schließlich zu vermehren.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Aminosäuren", „Vitamine", „Kohlenhydrate", „eine Stickstoffquelle", „Lipide", „Fettsäuren", „Mineralien", „Spurenelemente" und „antimikrobielle Mittel" auf alle Moleküle, Verbindungen und Substanzen, entweder organisch oder anorganisch, die durch den Durchschnittsfachmann in jede Kategorie eingeteilt werden. Es ist beabsichtigt, dass die Kombination dieser Kategorien jede Substanz einschließt, die nötig oder zuträglich sein kann, um den Zielmikroorganismus am Leben zu erhalten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „vermutlicher Nachweis des Zielmikroorganismus" auf die Tatsache, dass das Medium den sensitiven (d.h. mindestens 50%) Nachweis des Zielmikroorganismus, gemessen relativ zu einem allgemein akzeptierten Standardkulturverfahren, erlaubt.
Wie hierin verwendet, sich der Ausdruck „im wesentlichen" auf mindestens 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100 des bestimmten Mikroorganismus, der in der Lage ist, in dem Medium zu wachsen und sich zu vermehren.
Der Ausdruck „wirksame Menge von Nährstoffen" ist eine Menge von Nährstoffen in einem Bereich, der das Wachstum und die Vermehrung eines Zielmikroorganismus erlaubt oder fördert. Das heißt eine Menge, die es den Zielmikroben oder anderen Organismen erlaubt sich dem Medium anzupassen, ihren Stoffwechsel fortzusetzen oder die notwendigen Bestandteile für die Vermehrung zu synthetisieren, und sich schließlich zu vermehren.
Der Ausdruck „Medium" bezeichnet eine feste, pulverförmige oder flüssige Mischung, die alle oder im wesentlichen alle der Nährstoffe enthält, die erforderlich sind, um einer Mikrobe zu erlauben zu wachsen und sich zu vermehren. Diese Erfindung schließt sowohl Medien ein, die sterilisiert werden, als auch Medien, die nicht steril sind.
Der Ausdruck „Zielmikroorganismus" bezieht sich auf einen Mikroorganismus, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nachgewiesen werden soll.
Der Ausdruck „Aminopeptidase" bezieht sich auf ein Enzym, dessen enzymatische Aktivität in der Lage ist eine Peptidbindung eines Enzymsubstrats oder einer Vielzahl von Enzymsubstraten zu hydrolysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die enzymatische Aktivität von einer oder mehreren Aminopeptidasen verwendet, um die Konzentration von Hefen und Schimmelpilzen einer Probe nachzuweisen oder zu messen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Aminopeptidaseenzym Alanin Aminopeptidase.
Der Ausdruck „verflüssigt" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Materiezustand von im wesentlichen flüssiger Form, obwohl ebenfalls beabsichtigt ist pulverisierte oder homogenisierte Proben von festen Substanzen, die mindestens 10% Flüssigkeitsgehalt besitzen, einzuschließen. Verflüssigtes Medium ist gegenüber einem gelierten Medium, wie zum Beispiel einem Agar-basierten Medium, zu unterscheiden.
„Bakterien" wie hierin verwendet, meint den Begriff, wie er im Stand der Technik verwendet wird, einschließlich alle bakteriellen Formen (siehe Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Lippincott Williams, and Wilkins, 1989).
Der Ausdruck „Hefe" wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen typischerweise einzelligen Pilz, der sich asexuell fortpflanzt. Hefe schließt eine oder mehrere Arten der folgenden Organismen die in einer Testprobe existieren oder kollektiv koexistieren ein. Zum Beispiel schließen Hefen die in Tabelle 1 aufgelisteten und in Tibor Deak und Larry Beuchat, Handbook of Food Spoilage Yeasts, pp. 3-11, 124-25 (1996) und James, M. Jay, Modern Food Microbiology, 4th Ed., pp. 26–35 (1992), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschriebenen, ein. Der Ausdruck „Hefen" bezieht sich ebenfalls auf das Aufgebot von Hefen, die zum Beispiel in einer Testprobe gefunden werden. Der Ausdruck ist nicht darauf beschränkt irgendeine gegebene Anzahl dieser Arten zu bezeichnen und ist ebenfalls nicht gemeint Arten, die noch entdeckt werden müssen, aber später identifiziert und durch den Durchschnittsfachmann in diese Definition eingeschlossen werden könnten, auszuschließen.
Tabelle I
Der Ausdruck "Schimmelpilz" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Pilz. Zum Beispiel schließt ein Schimmelpilz einen oder mehrere Arten von Aspergillen oder Penicillin ein. Der Ausdruck ist nicht darauf beschränkt irgendeine gegebene Anzahl dieser Arten zu bezeichnen und ist ebenfalls nicht gemeint Arten, die noch entdeckt werden müssen, aber später identifiziert und durch den Durchschnittsfachmann in diese Definition eingeschlossen werden könnten, auszuschließen. Die Schimmelpilze schließen die in Tabelle II aufgelisteten und in Modern Food Microbiology, 4th Ed., supra, beschriebenen ein.
Tabelle II
In den verschiedenen Ausführungsformen schließen mikrobielle Aminopeptidasen ein, aber sind nicht begrenzt auf Alanin Aminopeptidase. In bestimmten Ausführungsformen werden die Peptidasesubstrate aus der Gruppe von fluorogenen Aminopeptidasesubstraten, die in Tabelle III aufgelistet sind, ausgewählt. Es versteht sich, dass diese Liste andere bekannte enzymatische Substrate, einschließlich chromogene Aminopeptidasesubstrate (zum Beispiel P-Nitroanilin getaggte Arten) und Aminopeptidasesubstrate, die noch entdeckt werden müssen aber vom Durchschnittsfachmann später identifiziert und in dieser Liste eingeschlossen werden, nicht ausschließt.
Tabelle III
In einem Aspekt stellt diese Erfindung ein Medium für den Nachweis eines Zielmikroorganismus in einer Probe bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium: ein Enzymsubstrat (zum Beispiel eine Aminopeptidase); einen bedingt nachweisbaren Marker und ein wachstumsförderndes Medium.
Vor dieser Erfindung verwendeten Mikrobiologen eine von zwei Strategien, um die Spezifität der zu entwickelnden mikrobiellen diagnostischen Tests zu verbessern. Das beliebteste Verfahren ist die Verwendung von antimikrobiellen Mitteln, um das Wachstum und den Nachweis von Nicht-Zielmikroorganismen zu unterdrücken. Das zweite, deutlich weniger beliebte Verfahren ist die Verwendung eines spezifischen, hoch selektiven Indikators für den Zielmikroorganismus selbst. Leider hat diese Strategie eine sehr begrenzte Anwendbarkeit, weil es in der Praxis sehr schwierig ist, für jeden nachzuweisenden Mikroorganismus einen solchen Indikator zu finden. Mit der hierin offenbarten Erfindung wird ein sehr viel breiter anwendbarer Ansatz offengelegt, der einen vermutlichen Indikator für den Zielmikroorganismus und Nicht-Zielmikroorganismen, die in der Lage sind, in dem Medium zu wachsen und nachgewiesen zu werden, verwendet, gefolgt von einem Bestätigungsindikator, der im wesentlichen nur mit den Nicht-Zielmikroorganismen reagiert. Solch eine Strategie hat eine breite Anwendbarkeit. Wie oben erwähnt wird das Bakterium Campylobacter aufgrund des dringenden Bedarfs auf dem Gebiet hierin als prototypisches Beispiel verwendet. Der Durchschnittsfachmann würde jedoch leicht ableiten, dass dieses allgemeine Schema auf alle Mikroorganismen ausgedehnt werden kann.
Es wurde angenommen, dass das Enzym L-Alanin Aminopeptidase in Gram negativen Bakterien ubiquitär ist. Frühere Arbeiten hatten sogar vermuten lassen, dass die Messung der Aktivität dieses Enzyms durch das direkte Einbringen eines entsprechenden Enzymsubstrats in das bakterielle Wachstumsmedium verwendet werden könnte, um spezifisch die Konzentration von Gram negativen Bakterien in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Überraschenderweise exprimieren Campylobacter-Arten diese Enzymaktivität in biochemischen Standard-Assays nicht. Die vorliegende Erfindung umfasst, dass der vermutliche Nachweis eines Zielmikroorganismus (zum Beispiel einer Campylobacter Art) kolorimetrisch in einem geeigneten Medium, das einen bedingt nachweisbaren Marker (zum Beispiel den Farbstoff Tetrazoliumrot) enthält, erreicht werden kann, und ihre Identität durch die Abwesenheit einer enzymatischen Aktivität (zum Beispiel L-Alanin Aminopeptidase), von der bekannt ist, dass sie im wesentlichen in allen Nicht-Zielmikroorganismen vorhanden ist, bestätigt werden kann.
Dementsprechend wird ein Medium für den Nachweis von Zielmikroorganismen offenbart, das spezifisch den Nachweis einer Campylobacter Art in einer Testprobe veranschaulicht. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt das Medium ein wirksames Ergebnis bereit durch die Verwendung eines bedingt nachweisbaren Markers für den vermutlichen Nachweis einer Campylobacter-Art und eines nachweisbares Enzymsubstrat für ein Enzym, das in Campylobacter-Arten nicht exprimiert wird, dessen Abwesenheit die Anwesenheit von Campylobacter-Arten bestätigt. Zusätzlich werden in dem Medium Pufferstoffe, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Spurenelemente, Salze und Wachstumsstimulatoren bereitgestellt, um ausreichendes Wachstum dieser Zielorganismen zu erlauben, so dass die nachweisbaren Signale in der Probe aufgrund der biochemischen Reduktion von Tetrazoliumrot durch Campylobacter und Nicht-Campylobacter-Arten und die Hydrolyse des L-Alanin Aminopeptidasesubstrats durch die Nicht-Campylobacter-Arten wirksamer beobachtet werden kann. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden antimikrobielle Mittel, zum Beispiel Polymixin B, Vancomycin, Cycloheximid, Rifampicin, Amphotericin B (für Hefe und Schimmelpilze), Cephaperazon und ähnliche geeignete, zu dem Medium zugesetzt, um das Wachstum von bestimmten Nicht-Campylobacter-Arten zu unterdrücken.
Bezogen auf das prototypische Beispiel Campylobacter wurde für diese Art gezeigt, dass sie den Farbstoff Tetrazoliumrot biochemisch reduziert, was zu der Erzeugung einer intensiv roten Farbe führt. Campy Line Agar wurde vom USDA als ein Agar-basierter Campylobacter Selektionsagar entwickelt und enthält Tetrazoliumrot, um Campylobacter und Nicht-Campylobacter Kolonien nach einer 48 Stunden Inkubationsperiode rot zu färben. Die Unterdrückung von Nicht-Ziel (d.h. Nicht-Campylobacter)-Bakterien auf diesem Agar wird nur durch die Verwendung von Antibiotika erreicht, die während der Herstellung zu dem Medium zugegeben werden. Siehe z. B. Janet E.L. Corry, International Journal of Food Microbiology 26:43–76, 1995. Das Unterdrücken der Nicht-Zielorganismen ist nicht sehr genau, daher sind noch ergänzende Reaktionen notwendig, um die Anwesenheit von Campylobacter-Arten in dem Medium zu bestätigen. Tatsächlich haben alle bestehenden Verfahren für den Nachweis von Campylobacter, genauso wie viele Nachweisverfahren für Mikroorganismen, das zwingende Erfordernis der Anwesenheit von Antibiotika in dem Wachstumsmedium, um das Wachstum von Nicht-Zielorganismen zu unterdrücken, und komplizierte Ergänzungsreaktionen, um die Identität vermutlicher Campylobacter Kolonien zu bestätigen.
Ein Weg, um die komplizierten Bestätigungsschritte zu vermeiden, besteht darin, einen Weg zu entdecken, durch den Campylobacter-Arten direkt von Nicht-Campylobacter Organismen im Wachstumsmedium unterschieden werden können (zum Beispiel kolorimetrisch). Um das zu tun, müsste man ein Enzymsubstrat, das eine nachweisbare Gruppe enthält, das die Campylobacter-Arten nicht hydrolysieren, aber im wesentlichen alle Nicht-Campylobacter Organismen hydrolysieren können, in das Wachstumsmedium geben. Ein Beispiel ist das Enzymsubstrat L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin, das von dem Enzym L-Alanin Aminopeptidase hydrolysiert wird, und diese Rolle erfüllt.
Mit dieser Erfindung sind die Probleme und Streitfragen, denen bei der Entwicklung von mikrobiellen diagnostischen Tests begegnet wurde, wesentlich reduziert worden. Das wird durch das Einfügen eines Nachweisschemas direkt in das Wachstumsmedium, das vermutlich positive und bestätigt positive Indikatoren für einen Zielmikroorganismus enthält, erreicht. Der vermutliche Indikator reagiert mit dem Zielmikroorganismus und jedem Nicht-Zielmikroorganismus, das zum Wachstum in dem Medium in der Lage ist, was zu dem Erzeugen eines messbaren Signals führt. Der Bestätigungsindikator reagiert im wesentlichen nur mit den Nicht-Zielmikroorganismen, was zu einem anderen nachweisbaren Signal führt. Die Abwesenheit eines Signals dieses Indikators zeigt die Gegenwart des Zielmikroorganismus an. Ein Beispiel eines solchen Nachweisschemas, das in die Praxis umgesetzt worden ist, wird nachfolgend für den Nachweis von Campylobacter-Arten in Geflügelspülwasserproben beschrieben. Jedoch kann diese Erfindung auf jeden Mikroorganismus ausgedehnt werden, bei dem der Zielmikroorganismus im Gegensatz zu Nicht-Zielorganismen, die wahrscheinlich in der Probe vorhanden sind, wesentlich weniger eines bestimmten Enzyms besitzt.
Zum ersten Mal kann die Anwesenheit eines Zielmikroorganismus in einer Probe mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit und Selektivität durch die Kombination von vermutlichen und Bestätigungsschritten direkt in dem Wachstumsmedium ohne das Erfordernis von Überführungsschritten, ergänzenden Tests, eines Cocktail von antimikrobiellen Mitteln oder der Verwendung von Nährstoffindikatoren, nachgewiesen werden. In dieser Erfindung ist der vermutliche Test ein verallgemeinerter Indikator, der durch im wesentlichen alle Mikroorganismen, die in dem Medium zum Wachstum in der Lage sind, biochemisch verändert werden kann, und der Bestätigungstest ist die Abwesenheit einer einzigartigen metabolischen Aktivität in dem Zielmikroorganismus, die in den Nicht- Zielmikroorganismen vorhanden ist. Dieser Ansatz wurde für den Nachweis von Campylobacter-Arten in einer Probe über ihre Fähigkeit, den Farbstoff Tetrazoliumrot reduzieren und ihre Unfähigkeit, das Aminopeptidasesubstrat L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin hydrolysieren zu können, in die Praxis umgesetzt. Wie hierin beschrieben, können diese Chemikalien in ein geeignetes Wachstumsmedium eingebracht werden, dessen Entwicklung dem Durchschnittsfachmann gut bekannt ist.
Die Fähigkeit von Campylobacter-Arten, Tetrazoliumrot biochemisch zu einem rotgefärbtes Molekül zu reduzieren, wurde gut dokumentiert. Bis zu der unerwarteten Entdeckung, dass Campylobacter-Arten die Fähigkeit fehlt, eine L-Alanin Aminopeptidaseaktivität zu exprimieren, war es allerdings nicht möglich zu bestätigen, dass diese, rote Farbe produzierenden Mikroorganismen tatsächlich Campylobacter sind, sofern nicht eine Reihe von komplizierten Bestätigungsschritten durchgeführt wurde. Es war unerwartet, dass Campylobacter-Arten die Fähigkeit diese Enzymaktivität zu exprimieren, fehlen würde, da der Stand der Technik lehrt, dass L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität bei Gram negativen, stäbchenförmigen Bakterien ubiquitär ist und daher angenommen werden würde, dass sie auch in Campylobacter-Arten vorhanden ist. Daher kann eine ähnliche Analyse auf Verlust einer Funktion in anderen mikrobiellen Nachweissystemem durchgeführt werden, wo die Anwendung dieses vermutlichen/Bestätigungs- enzymatischen Nachweises möglich ist.
Daher richten sich verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung auf eine Mediumzusammensetzung für den vermutlichen Nachweis von Campylobacter-Arten durch ihre Fähigkeit mit einem bedingt nachweisbaren Marker zu reagieren; in einer Ausführungsform ist der Marker der Farbstoff Tetrazoliumrot, die Identität dieser Organismen wird durch die Abwesenheit einer Enzymaktivität bestätigt; in einer Ausführungsform ist das Enzym L-Alanin Aminopeptidase. Der vermutliche Nachweis von Campylobacter-Arten wird durch das Auftreten einer roten Farbe in dem Medium erreicht, was durch die Abwesenheit von Fluoreszenz bestätigt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein bedingt nachweisbarer Marker, der in der Lage ist mit Campylobacter-Arten zu reagieren, zusammen mit mindestens einem Enzymsubstrat, das von einem Enzym, das in Campylobacter-Arten nicht gefunden wird, das aber bei Nicht-Campylobacter-Arten, die in der Lage sind, in dem Medium zu wachsen und sich zu vermehren, häufig ist, in einem Wachstumsmedium eingeschlossen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Signale, die von dem bedingt nachweisbaren Marker und dem hydrolysierten Enzymsubstrat erzeugt werden, unterschiedlich. In bestimmten Ausführungsformen ist der bedingt nachweisbare Marker Tetrazoliumrot. In weiteren Ausführungsformen ist das Enzymsubstrat L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Medium eine effektive Menge an biologischen Puffern, Kohlenhydraten, Vitaminen, Aminosäuren, Elementen, Salzen, Wachstumsstimulatoren und Selektionsmitteln, um Lebensfähigkeit und spezifische Anreicherung von Campylobacter-Arten in der Gegenwart von Tetrazoliumrot und L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin zu gewährleisten. Zusätzlich, obwohl das zur Zeit bevorzugte L-Alanin Aminopeptidasesubstrat L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin ist, sollte klar sein, dass dies nicht andere bekannte Chromogene, Fluorogene oder anderweitig nachweisbare Substrate für dieses Enzym und Substrate, die noch entdeckt werden müssen, aber nachher vom Durchschnittsfachmann identifiziert werden, geeignete Alternativen für dieses Substrat zu sein, ausschließt.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, um Campylobacter-Arten in einer Testprobe nachzuweisen. Das Medium wird mit der Testprobe beimpft und unter Bedingungen, die für das Wachstum von Campylobacter-Arten geeignet sind, für einen bestimmten Zeitraum, vorzugsweise zwischen 12 bis 60 Stunden und noch bevorzugter zwischen 18 und 52 Stunden, einschließlich jeder ganzen Zahl im Zahlenbereich zwischen 12 und 60 und 18 bis 52 Stunden, geeignet sind. Die Erzeugung eines Signals durch einen bedingt nachweisbaren Marker, zum Beispiel biochemisch reduziertes Tetrazoliumrot und die Abwesenheit von Fluoreszenz von hydrolysiertem L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin zeigt die Anwesenheit von bestätigten Campylobacter-Arten in der Testprobe an.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium eine Pulverform. Das Pulver wird vorzugsweise mit einem sterilen Verdünnungsmittel verflüssigt, bevor die Testprobe mit dem Medium beimpft wird. Die Inkubation kann mikroaerophil bei 42°C durchgeführt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren ein geliertes Medium. Ein bevorzugtes Medium ist ein Agarmedium, das Tetrazoliumrot (oder eine verwandte Verbindung) und L-Alanin-7-Amino-4-Methylcumarin (oder ein verwandtes Substrat) umfasst.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Quantifizieren der Anzahl von Campylobacter-Arten in einer Testprobe bereit. In diesem Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren, um die Menge von Campylobacter-Arten in einer Probe zu zählen durch in Kontakt bringen der Probe mit dem Testmedium, Einbringen der Probe und der Mediummischung in Behältern, Inkubieren der Probe und der Mediummischung, Beobachten der Quantität und Qualität von nachweisbaren charakteristischen Signalen und Vergleichen der Quantität von nachweisbaren charakteristischen Signalen mit den wahrscheinlichsten Zahlenwerten. Dieser Quantifizierungsprozess umfasst das Vergleichen der Quantität und Qualität der Eigenschaft, die verändert worden ist, vorzugsweise eine Farbänderung und/oder auch eine Fluoreszenzänderung, um statistisch die wahrscheinlichste Anzahl von Campylobacter-Arten in der Testprobe zu bestimmen. Solche statistischen Bestimmungen werden in Einklang mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt. Die Technik der wahrscheinlichsten Anzahl (MPN) basiert auf Wahrscheinlichkeitsstatistiken. Die Ergebnisse jeder Art von MPN-Analyse sind direkt mit der Häufigkeit des Auftretens einer Reihe von positiven Ergebnissen, die am wahrscheinlichsten auftreten, wenn bestimmte Anzahlen von Organismen in einer Testprobe vorhanden sind, direkt in Beziehung zu setzen.
Die Zusammensetzung der Erfindung wird vorzugsweise zu Medium zugegeben, das vorzugsweise verwendet wird, um Assays in Multiwell Mikrotiterplatten durchzuführen. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Erfindung mit der Apparatur verwendet, die von Croteau et al. in US-Patent 5,985,594 oder von Croteau et al. in US-Patent 5,700,655, die beide hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschrieben ist. Assaygeräte, in die eine solche Technologie eingebaut ist, werden unter dem Markennamen SimPlate^® (BioControl Systems, Inc., Bellevue, WA) vermarktet. Der Quantifizierungsschritt schließt vorzugsweise das Bereitstellen einer Umwelt- oder biologischen Probe in ein verflüssigtes Medium der Erfindung, das Einbringen oder Abgeben der Mischung von Probe und Medium in ein von Croteau et al. beschriebenes Gerät, Inkubieren der Probe, Nachweis der Quantität und Qualität der Nachweisgruppencharakteristika und optional das Vergleichen der Quantität des charakteristischen Signals mit den wahrscheinlichsten Zahlenwerten ein. Vorzugsweise wird der Inkubationsschritt bei 42°C für einen Zeitraum von 48 bis 52 Stunden in einem mikroaerophilen Inkubator unter Verwendung des oben beschriebenen Mediums oder einer anderen günstigen Temperatur und Zeit, die für den bestimmten Mikroorganismus geeignet ist, durchgeführt.
Unter Verwendung des Mediums und der Verfahren dieser Erfindung kann die Campylobacter Konzentration in einer Testprobe viel einfacher und schneller bestimmt werden, als durch zur Zeit verfügbare Verfahren.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die Anzahl von Zielmikroben, die in einer flüssigen Probe vorhanden sind, durch Mischen einer flüssigen Probe mit dem oben beschriebenen Medium, Einbringen der flüssigen Probe einschließlich des Mediums in geeignete Inkubationsbehälter, Inkubieren der flüssigen Probe und der Mediummischung, Beobachten der Quantität und Qualität eines charakteristischen Nachweissignals und Vergleichen der Quantität und Qualität eines charakteristischen Nachweissignals mit den wahrscheinlichsten Zahlenwerten quantifiziert werden. Dieser Quantifizierungsprozess beinhaltet den Vergleich der Quantität und Qualität des veränderten Charakteristikums, vorzugsweise einer Farbänderung, mit den wahrscheinlichsten Zahlenwerten, die von Proben erhalten werden, für welche die Konzentration und die charakteristische Änderung mit Proben, für die die bakterielle Konzentration bekannt ist, korreliert worden ist. Siehe z. B. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 3^rd ed., Edited by Vanderzant and Splittstoesser, 1992. Die Technik der wahrscheinlichsten Anzahl erlaubt Abschätzungen von bakteriellen Konzentrationen, die unterhalb der Nachweisgrenzen anderer Verfahren sind. Die wahrscheinlichste Anzahl wird aus Antworten, bei denen die Ergebnisse in einer oder mehreren Verdünnungen der Probe als positiv oder negativ gemeldet werden, geschätzt. Das Verfahren erfordert, dass nicht alle Proben ein positives Ergebnis liefern und gewöhnlich sind von jeder Verdünnung mindestens drei Proben erforderlich. Viele Diagramme der wahrscheinlichsten Anzahl sind verfügbar. Eine solche Serie wird von de Man, Eur. J. Appl. Microbiol. 1:67 (1975), das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist: bereitgestellt. Schätzungen der wahrscheinlichsten Anzahl können unter Verwendung der allgemeinen Formel, die von Thomas, J. Am. Water Works Assoc. 34:572 (1942) wie folgt berichtet wurde: MPN/g = P/(NT),wobei P die Anzahl von positiven Röhrchen, N die Gesamtzahl von Proben in allen negativen Röhrchen und T die Gesamtzahl von Proben in allen Röhrchen ist, gemacht werden. Die Mengen werden in Gramm angegeben.
BEISPIELE
BEISPIEL I
Nachweis von Campylobacter in Geflügelwaschproben
Eine Gesamtzahl von zwanzig Geflügelspülwasserproben wurde in einer kanadischen Geflügelfarm genommen. 1 ml Aliquots jeder Spülwasserprobe wurden zu 9 ml Proben eines Mediums hinzugegeben, das den Farbstoff Tetrazoliumrot und das Aminopeptidasesubstrat L-Alanin-7-Amido-4-Methylcumarin enthielt. Jede 10 ml Mischung wurde auf SimPlate Einheiten, die ebenfalls von BioControl Systems, Inc. verkauft werden, übertragen und in einen 42°C mikroaerophilen (5% O₂ und 10% CO₂) Inkubator eingebracht. 1 ml Aliquots jeder Spülwasserprobe wurden ebenfalls auf 4 Campy Line Agarplatten (0,25 ml pro Platte) ausgestrichen. Diese Platten wurden ebenfalls in einen 42°C mikroaerophilen Inkubator eingebracht. Alle Tests wurden für 48 Stunden inkubiert.
Die SimPlates wurden nach 48 Stunden aus dem Inkubator entfernt und die Anzahl von roten Vertiefungen (vermutlich positiv für Campylobacter) wurde für jede Platte gezählt. Als nächstes wurde ein tragbares (366nm) UV-Licht über jeder roten Vertiefung eingestrahlt, um auf Fluoreszenz zu prüfen. Die Abwesenheit von Fluoreszenz in jeder vermutlich positiven Vertiefung wurde als bestätigt positiv für Campylobacter aufgefasst. Die Anzahl von bestätigten positiven Vertiefungen für jede Platte wurde durch die Verwendung der SimPlate Konversionstabelle, die durch den Hersteller bereitgestellt wurde, in die Anzahl von Organismen pro ml Spülwasserprobe umgewandelt.
Die Campy Line Agarplatten wurden nach 48 Stunden aus dem Inkubator entfernt und die Anzahl von roten Kolonien wurde für jeden Spülwassersatz von Platten bestimmt. Vermutete Campylobacter Kolonien wurden auf AHB-Platten ausgestrichen und über Nacht in einem 42°C mikroaerophilen Inkubator inkubiert. Isolate, die auf den AHB-Platten wuchsen, wurden Immunopräzipitationsreaktionen unterzogen, um die Anwesenheit von Campylobacter-Arten zu bestätigen. Bestätigte Campylobacter Isolate wurden für jeden Plattensatz gezählt und als Anzahl von Koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml Spülwasser ausgedrückt. Die Ergebnisse der Studie sind unten gezeigt:
BEISPIEL II
Korrelation des Campy-Cefex Agar Nachweises von Campylobacter in Geflügelwaschproben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt, außer, dass anstatt von Campy Line Agar Plates, Campy-Cefex Agarplatten verwendet wurden, und es wurden 162 Geflügelwaschungen, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, verglichen. Der Campy-Cefex Agar-Assay wurde wie vom Landwirtschaftsministerum der Vereinigten Staaten ARS, Forschungseinheit für mikrobielle Geflügelsicherheit, Verfahren für das Auszählen von Campylobacter-Arten aus Geflügelspülungen, 15. März 2000, beschrieben durchgeführt und positive Campylobacter Proben durch folgende Agglutinations-Assays bestätigt. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in 1 gezeigt. Wie durch das Bewerten der Figur abgeschätzt werden kann, waren die Daten hoch korrelativ und zeigen die Nützlichkeit des erfinderischen Assays, vergleichbare Ergebnisse in deutlich schnellerer Zeit ohne die arbeitsintensiven Schritte, die in den Standardverfahren erforderlich sind, zu erreichen.
Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich, dass, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hier zu Veranschaulichungszwecken beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können. Dementsprechend ist die Erfindung außer durch die angehängten Ansprüche nicht begrenzt.

Claims

Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmikroorganismus in einer Probe, umfassend einen bedingt nachweisbaren Marker, wobei der Marker in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zur Verfügung zu stellen, wenn er mit einem lebensfähigem Organismus in Kontakt gebracht wird, und ein Substrat für eine Aminopeptidase, die dem Zielmikroorganismus im wesentlichen fehlt, wobei das Substrat eine Signalgruppe umfaßt, die mit dem Substrat verbunden ist, wobei die Signalgruppe in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zur Verfügung zu stellen, wenn durch im wesentlichen alle Nicht-Zielmikroorganismen gespalten.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Zielmikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefe, Schimmelpilzen, Pilzen, Protozoen und Viren.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Zielmikroorganismus Bakterien ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Bakterien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Salmonella, Listeria, E. coli OH157, Campylobacter, Staphylococcus aurum, Cryptosporidium, und Giardia.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Bakterium Campylobacter ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der bedingt nachweisbare Marker durch eine Farbveränderung nachweisbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Farbveränderung durch die biochemische Reduktion von Tetrazoliumrot hergestellt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Aminopeptidase eine L-Alanin-Aminopeptidase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L-Alanin-7-amida-4-methylcumarin, L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin TFA, L-Alanin-7-amido-4-trifluor-methylcumarin TFA, L-Alanin-L-alanyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin und L-Alanyl-L-alanyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin TFA
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Substrat L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Nicht-Zielmikroorganismus im wesentlichen alle Nicht-Campylobacter-Spezies einschließt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein wachstumsförderndes Medium für den Zielmikroorganismus.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das wachstumsfördernde Medium alle erforderlichen Nährstoffe und Wachstumsbedingungen enthält, um das Wachstum des Zielmikroorganismus geeignet zu unterstützen.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das wachstumsfördernde Medium Antibiotika enthält, um das Wachstum von Nicht-Zielmikroorganismen zu unterdrücken.
Medium zum Nachweis von lebensfähigen Organismen in einer Probe, umfassend: a) ein Substrat für eine Aminopeptidase; b) einen bedingt nachweisbaren Marker, wobei der Marker in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zur Verfügung zu stellen, wenn er mit einem lebensfähigen Mikroorganismus in Kontakt gebracht wird; c) eine Signalgruppe, die mit dem Substrat verbunden ist, wobei die Gruppe ein nachweisbares Signal zur Verfügung stellt, wenn durch die Aminopeptidase von einem Mikroorganismus abgespalten; und d) ein wachstumsförderndes Medium für Ziel- oder Nicht-Zielmikroorganismen.
Medium nach Anspruch 15, wobei die Aminopeptidase L-Alanin-Aminopeptidase ist.
Anspruch 15, wobei die Signalguppe Ortho-nitrophenyl, 4-Methylumbelliferon, Para-Nitroanilid, 4-Methoxy-beta-naphtylamid, 7-Amido-4-methylcumarin.
Medium nach Anspruch 15, wobei das Enzymsubstrat: N-o-Acetyl-lysin-7-amido-4-methylcumarinacetat; N-Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin; beta-Alanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; D-Alanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Alanin-7-amido-4-trifluor-methylcumarin TFA; L-Alanyl-L-alanyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin; L-Alanyl-L-alanyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; D-Alanyl-L-leuryl-L-lysine-7-amido-4-methylcumarin Salz; L-Arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Arginyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarintrihydrochlorid; L-Asparagin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Asparginsäure-b-(7-amido-4-methylcumarin); N-alpha-Benzoyl-DL-arginin-7-amido-4-methylcumarin; N-alpha-Benzoyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin; N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin; S-Benzyl-L-cystein-7-amido-4-methylcumarin; N-BOC-PhenylalanyI-L-seryl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinacetat; N-HOC-L-Vanyl-glycyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; N-BOC-L-Vanyl-L-Leucyl-L-Lysin-7-amido-4-methylcumarin-Salz; N-alpha-CBZ-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; N-CBZ-Glycylglycyl-L-leucin-7-amido-4-methylcumarin; N-CBZ-Glycyl-L-prolin-7-amido-4-methylcoumarid; N-CBZ-Glycyl-L-prolyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin; N-beta-CBZ-L-Lysin-7-amido-4-methylcumarin; N-CBZ-L-Phenylalanyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; N-CBZ-L-Prolyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlarid; L-Zitrullin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Zitrullin-7-amido-4-methylcumarinhydmchlorid TFA; D-Glutaminsäure-gamma-(7-amido-4-methylcumarin); L-Glutaminsäure-alpha-(7-amido-4-methylcumarin); L-Glutamin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; Glutaryl-glycyl-L-arginin-1-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; Glutaryl-glycylglycyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcoumarin; Glutaryl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin; Glycin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; Glycyl-L-alanin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; Glycyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin-Salz; Glycylglycin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; Glycyl-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin; Glycyl-L-prolin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Histidin-7-amido-4-methylcumarin; L-Isoleuzin-7-amido-4-methylcumarin; L-Isoleuzin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Leuzin-7-amido-4-methylcumarin; L-Leuzin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Leuzyl-1-valyl-1-tyrosin-7-aroido-4-methylcumarin; L-Lysin-7-amido-4-methylcumarinacetat; L-Methionin-7-amido-4-methylcumarinacetat; L-Ornithin-7-amido-4-methylcumarincarbonat; L-Phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin TFA; L-Prolin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin-Salz; L-Pyroglutaminsäure-7-amido-4-methylcumarin; L-Serin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid; L-Seryl-L-tyrosin-7-amido-4-methylcumarinhydrat; oder L-Tyrosin-7-amido-4-methylcumarin ist.
Medium nach Anspruch 15, wobei die Bindung eine Peptidbindung ist.
Medium nach Anspruch 15, wobei die Signalgruppe eine fluoreszente Gruppe ist und die fluoreszente Gruppe in der Lage ist, ein Fluoreszenzsignal zur Verfügung zu stellen.
Medium nach Anspruch 15, wobei die Signalgruppe eine chromogene Gruppe ist und die chromogene Gruppe in der Lage ist, ein Signal im sichtbaren, ultravioletten oder infraroten Spektrum zur Verfügung zu stellen.
Verfahren zum Nachweis von lebensfähigen Zielmikroorganismen in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt: a) Zur Verfügung stellen eines Mediums, umfassend die Zusammensetzung von Anspruch 1; b) Beimpfen des Mediums mit einer Probe, die auf die Anwesenheit von Zielmikroorganismen hin getestet werden soll; c) Inkubieren des beimpften Mediums unter Bedingungen, die für das Wachstum der Zielmikroorganismen geeignet sind, wobei das Enzymsubstrat in der Lage ist, durch ein Enzym aus im wesentlichen allen Nicht-Zielmikroorganismen beeinflußt zu werden, um ein nachweisbares Signal zu produzieren; und d) Vergleichen des Unterschieds zwischen dem durch den bedingt nachweisbaren Marker erzeugten Signal und dem Enzymsubstrat, wobei das vergleichende Fehlen oder Abnehmen in dem durch das Enzymsubstrat erzeugten Signal die Anwesenheit von Zielmikroorganismen in der Probe anzeigt.