JPS6314699A - 微生物検出用特異的培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は水、食品等のような試料中の微生物の検出に関
する。さらに特に、本発明は目標微生物だ１ノが有意に
代謝でき、そして代謝されると、試料の特性を変える分
子を放出する栄養源を含有する、殺菌が不必要の試験用
培地を用いる目標微生物の検出に関する。従って、本発
明による培地は目標微生物以外の微生物の生育をまた支
持する一般培地とは異なり、目標微生物だけの生育を支
持するという点で１特異的培地」である。 人間、動物または環境起原のいづれかの検査試料中の微
生物病原体を検出するために、次の一般的方法が常用さ
れている。試料中の目標（およびその仙の）微生物をこ
の試料とともに、これらの微生物の生育に必似な全−Ｃ
の栄養源を提供する培養培地中に接種りる。検査試料は
未処理の天然試料であってもにり、あるいは、たとえば
膜濾過により予備処理された試料でしよい。培養培地は
栄養源および代謝拮り’Ｌ物ｖＪＪ刀こは抗生物質のよ
うな目標微生物以外の微ノ１物に対し／　Ｔ選択的に活
性であるその他の選択１７１化学物費を含有する。この
にうな培養培地４選１１ｔ！ｌ’ｌ化学物質を含有して
いる

【ノれども、目標機／ｉ物、ｌｊ　ｊ、’、’び関
連微生物の両方の生育を支持し、従゛）（Ｈ標微１１物
に対して部分的にだけ特異性であることから１一般培地
」である。 水溶液または水ゲルて゛あることができるこの培養培地
は存イ１１）ることがあり、従って分析を干渉しうるい
づれかの２’ｉ染ｖ１微生物を排除するために殺菌され
る。培養培地はＶＪ循後の汚染を避番プるために凍結乾
燥させ、包装μねばならない。 一種または二種以」−のｊ８養培地に検査試料を接種し
た後に、接種しｌこ培地は制御された大気条件下に少な
くとも１６へ・Ｉ　Ｂ　Ｉ＋￥間、あるいはそれ以上の
間インキュベ−１ｍｌする。インキュベーション後に、
培養培地を目標微生物の生育適合性について検査する。 このような生育が見られたならば、その試料をざらに分
析する。これは目標微生物の存在がその伯の微生物との
混合状態でなく、純粋な状態で単離することによってだ
け確認できるからである。後続の培養培地上に単離した
後に、目標微生物は種々の物理的および化学的特徴につ
いての試験により同定される。明確な目標微生物増殖物
が単離されない場合には、誤った陰性の試験結束になる
ことがある。 この最も慣用の分析方法は時間が掛り、また無菌性が保
持されるＪ：うに注意深〈実施しなければならない。 試験方法を簡単で、迅速にするためのかなりの研究が行
なわれている１分野に水の微生物についての試験方法が
あり、このような研究には数例がある。 Ｈａｎｊａは飲料水の糞便汚染を反応ブロスからの硫化
水素の直接的分析により検出する野外試験法を開発した
。この試験はサルモネラ菌の単離に役立つがエスケリッ
ヂＶ　］す（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ。 以下Ｅ、ｃｏｌｉで示す）を選択しないために、まだ広
く普及していない。Ｓｕ＋ｉｔｈは［、ｃｏｌｉ用の迅
速な単一管確認試験を開発しｌこ。彼は乳糖の間を半減
し、そして１０％トリブＩ・ファンを加えることにより
ラウリル　トリプト−スを鰹節した。ｌ？ｅａｓｏｎｅ
ｒは膜濾過法にもとづく迅速７１１．ｓ間糞便大腸菌（
Ｉｅｃａｌ　ｃｏｌｉｆｏｒｓ）試験方Ｖ、を開発した
。この方法では、試ＩＩ　１００　ｍ（！を膜に通して
濾過し、ｍ−７と称され（いるｌｆｒ、地１に、１メさ
゛、４４．５℃で７時間インキュベート・−りる。央使
大腸菌は黄色であり、これは乳糖醗酵を示しＣいる。こ
の技法は迅速であるが、野ＩＡ、　ｆ’ｉ業用に■史（
キず、ＭＰＮ（１ｏｓｔ　ｐｒＯｂａｌｌｌｌ！　ｎ１
１１１１１０１’＝＝　ｋｌ＾確率数）としての特異性
を同様に欠いＣいる。 数人の研究者は１水道の分析り段として細菌副産物の検
出を試みている。、１　（１ｒ　（１０ｎ　Ｓ　（！　
ｎは細菌ｆ’毒素の検出にリムルス（ｌ　ｉｍｕｌｕｓ
　）溶解物を利用している。細菌の存（＋は、１、ｌこ
Ｘ１１気的インピーダンス測定により評価され（いる１
、シかしながら、これらの試験の中で、当分野において
受は入れられた方法はない。これはこれらの試験法がコ
ロニイ内で生存すると見做され、胃腸的病原菌の存在を
予期させる見張り細菌（Ｓｅｎｔｉｎａｌ　ｂａｃｔｅ
ｒｉａ）として使用できる微生物を特異的に分析しない
方法であるからである。 微生物が生育した後にだけ色が変わる微生物増殖物の指
示体がある。しかしながら、これらは微生物用の餌とし
ては役立たない。これらは目標微生物により産生される
代謝副産物との化学的反応ににり単独で作用を現わす。 これらは目標微生物に対していづれの刺激作用も示さな
い。ｐＨが変化すると色が変わる化学物質が細菌増殖物
の存在または不存在を示すために使用されている。常用
されているｐＨ指示薬はフェノール　レッド、ブロモク
レゾール　ブルーおよびニュートラル　レッドを包含す
る。これらの指示薬を使用するためには、微生物を生育
させる培地を完全なものにしなければならない。すなわ
ち、炭素源、アミノ酸源、塩類、ビタミン類脂肪酸、エ
ネルギー源が必要である。指示薬は補助的月利゛Ｃある
。微生物学の用Ｍ１において、培地は　般に多大の微生
物のためのものである。すなｉ’）’、＋これ＋３１．
１添加された指示薬とともに、多大の微／１物のノ１白
を支持Ｍる。 ｐＨ指示薬以外の指示薬を用いる細菌生育の検出方法が
提案されている。これらの方法では、電気的インピーダ
ンス、電導１狂、八Ｔ１〕（アデノシントリホスフ１ｍ
ｌ１〜）のが、濁頂（光学１１１度）のような標示対象
が一般１８地に、１０Ｊる被測定化学物質の添加下に微
ノ１物の増＋Ｙ　ｌ、’：　、１、り検出される。たと
えば、Ｇｏｌｂｅｒ　（米Ｌｋｌ　１ｊｌ　＋？’ｌ第
：（，２０６，３１７号）はタンパク負、Ｍ　ＩｓＩ　
：ｌ−１ス、ｌ゛キス１〜ロース塩化ナトリウムお、Ｊ
、びでの他の栄養源を含有する培地で１〜リフエニル　
ｊ　ｌ二ノゾリウム　クロリドを使用している。彼はこ
の’Ｉ！Ｉ　ｊｉ’ｌにおいて、ｐＨ指示薬であるフ」
−ノール　レットを含む一般培地をまた開示している。 １目？λ黴１１物（一種ま）こは二種以上）を含有り−
るど者えｒ”＋　’ｉｉる試料をこの培地に接種Ｊる。 この培地は１１標ｍ’ｌ物ばかりでむく、また同様のそ
の他の徴！１物の１台、代謝およびＪｔ′ｌ殖に必要な
全成分を含有する。微生物が増殖した後に、これらの微
生物は培地中の一種または二種以上の成分を代謝する。 その老廃物およびその他の生成物が指示薬との反応によ
り測定できる。たとえば、微生物からの老廃物の一種に
イオン性水素があり、これは酸性状態を作り出し、フェ
ノール　レッドを赤色から黄色に変える。別の老廃物に
は還元剤がある。これらはテトラゾリウム　クロリドと
反応して、この染料を無色から青紫色に変える。 Ｂｅｒｇｅｒ等（米国特許第３．４９６．０６６号）は
細菌が先駆体化合物から染料に変換する新規な一連の化
合物を開示している。彼等は異なる細菌が異なる先駆体
化合物を異なる色の染料に変換できることを開示してい
る。各場合に、先駆体化合物は細菌の餌としては役立た
ない。微生物が一般培地で代謝し、生育し、そして増殖
すると、先駆体化合物は染料に変換される。 ａｏｃｈｎｅｒ　　（米国特許第４．１２９，４８３号
）は酸化−還元指示薬の変化による微生物の同定または
試験方法を開示している。微生物がこの酸化一還元指示
薬ぐある）Ｉ・ノゾリウム化合物に光化作用する。本発
明の２２　ｆ’ｌは指小桑として作用する指示薬それ自
体をｌｔ　ＩＩしＪることなく、微生物の生育を支持す
−る栄養源を培地中に含有することにある。Ｂｏｃｈｎ
ｅｒは彼の発明において非生体内分解性であり、還元さ
れた後に色を変えることにより関与する化合物を指示薬
どして必要としている。 本発明では、［１標微生物にどって好ましいまたは主要
栄養源であるが、試料申に目標微生物とともに存在する
ことがあるいづれかのその他の生きている微生物が実質
的に代謝できない指示物質を使用することにより試料中
の目標微生物を検出する。従って１本発明は従来技術で
使用されていた積極的反応剤ではなく、むしろ目標微生
物の活性選択体（ａｃｔｉｖｅ　５ｅｌｅｃｔｏｒ　）
を使用する。このような指示物質は当該栄養源が［］標
微生物により代謝されると、試料のｖ１性を変化させる
。この特性は色（可視光線、紫外線、１；Ｉこは赤外線
）、電轡度、電気的インピーダンス等であることができ
る。本発明の好ましい態様は代謝されると、検査試料を
一１／Ｉ　　− 含有する水溶液の可視色または蛍光色を変える栄養Ｂ５
）−指示物質を使用する目標微生物の検出を包含する。 この栄養源−指示物質は好適または主要栄養源としての
役目を果（ことにより目標微生物の生育に実際的に関与
する。目標微生物はこれらが、そして実質的にこれらだ
けがその主要栄養源として指示物質を使用できるので、
生育し、代謝し、そして増殖できる。指示物質は塩、炭
素、窒素、イオウ、アミノ酸、脂肪酸、ペプチドまたは
その他の微生物用主要栄養源に結合しに色原体を含有す
る。目標微生物以外の微生物は生育、代謝または増殖が
妨害されるので、この培地は非常に特異性であって、本
発明では使用前の殺菌は不要である。 目標微生物とその他の微生物との間の培地中の利用可能
ｔＫ栄養源に対づ−る競合は本発明では耕除される。本
発明による培地は試験する試料に添加する粉末形で￥Ｊ
造でき、包装できる。前記したように、殺菌は不必要で
ある。本発明による培地は水に溶解でき、試料はこの溶
液に添加できる。あるいは、試料が水１ｍｌＩＣある場
合に番、１、培地を試料に直接添加でさる３、試ｒｔ中
のイの他の微生物の中でこの培地中の栄養源を実顕的に
代謝できるものは存在しないので、ＩＩ椋ｒｌｔ／ｌ物
の生育を確実にするための最低イン１１ベ一ジ１ン時間
も不必要である。 特定の色の発現が１ｍｌ１椋微／Ｉ物の存在を指示する
。 これは処理を開始しｌ、二４訃のいづれかの時点で生起
しうる。目標微生物の粕製す不必要である。目標微生物
が存在するか否かを決定するために試料を化学的に分析
Ｊる必要−ｂ２’（い１゜微生物の命名は分類学的に行
なわれる。成る全般的特徴から出発して、樹木様判定図
をたどっていく。さらにこの樹木様判定図を下がってい
くと、ざらに特貸的な１Ｓ＋　ｌ’ｌが・′」の微生物
をあるレベルに位置づけることに＜ｒる。各レベルは界
、族、科等のようｈイれ自ｑの名前を１１する。属およ
び種はこの樹木様判定図の最後の２つのレベルである。 微生物の名前は、の属おＪ、ひ種によつ−Ｃ知られてい
る。 −’１６　− 人間と同様に、微生物も科学の世界におけるそれらの位
置について２つの名前を有する。すなわち局名と種名で
ある。属は共通の特徴を分は合っている微生物の群を表
わす。人間の家族の名前と類似している。種はそれ以上
分類できない分類区分である。これは人の名と同様であ
る。しかしながら、人間の名前と同様に、同−属および
種名を右する微生物（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）も全部が同一であることはない。局名は
種名の前にくる（姓を初めに書くのと同様である）。 本明細書で使用するかぎりにおいて、「目標微生物」の
用語は単一の微生物、関連種の微生物または共通の分類
学的特徴を有する大きい範囲の属の微生物を表わす。本
発明における指示物質は［１］標微生物」に対して特異
的である必要があるだ（プである。たとえば、指示物質
はＥｓｃｈｅｒｉａ旧ａｃｏｌｉ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）の
ような単一の微生物の検出に、あるいはにＩｅｂｓｉｅ
ｌ　１ａ−Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ−３ｅｒｒａｔｉ
ａのＪ：うな密に関連する種の微生物の検出に、あるい
はグラム陰性細菌のような広範な属の微生物のいづれか
一種の検出に利用（さる１、栄養８９−指示物質に使用
される色原体１；Ｉ：　ｉ’＋ｌ　ｉｌＪ光線範囲、紫
外線範囲または赤外線範囲（゛「Δを１１じることかて
゛さるものであ−る。前記ｈ’　”ｒ明白／Ｉ′ｊ、）
に、栄養源−指示物質は好ましく【ま末代ｌ（状ｒｌ！
　Ｃ無色であり、好ましくは微生物に１１．１）代−９
１、＼Ｉ’Ｌ　／、二接に、発色基を放出づる。この色
１．１川祝、蛍）Ｉ’、　；ｌ、たは機械により読み取
り可能な色Ｃある（′ｌどが（・きる。６Ｆ＋記したＪ
、うに、本発明を使１１しするど、１１“１地中の微生
物量で餌または栄養源にχ・１しくの競合【、１はと／
υど僅かであるか、または全く兄Ｉ）れｔｌい。これは
培地中の唯一の栄養源が１１標微生物にＪ、り独占的に
いづれか有意の程庶に代謝されうるからである。従って
、従来技術の方法Ｃ１１じる有意の数の誤った陰性の試
験結果が本発明によりＩＪ＋除される。使用される栄養
源は目標微生物がその他の栄養源よりも一般に好むもの
であり１，１、！ごイの他の微（ｌ物が僅かに好むか、
または全＜　Ｉ（；ｌ：　＜’ｃいムのである。従って
検査試料中のｒ＋　＋？！微／Ｉ物が／ｆイ１する場合
にだＩプ、試料にお（］る色またはその他の特性変化を
生じさＶるに充分な栄ｉ！ｆ源の代謝が生じる。 本発明における栄養源−指示物質は目標微生物に対して
だけ実質的に特巽性であって、好ましくは目標微生物用
の培地における好適または主要栄養源であるので、目標
微生物はこの栄養源−指示物質を摂取して、色変化の速
痕が高められる。 従って、本発明の目的は試料の検出できる特性の代謝的
変化により検査試料中の微生物を検出する方法を提供す
ることにある。 本発明のもう一つの目的は試料の色が目標微生物の代謝
により変えられる、前記特徴を有する方法を提供するこ
とにある。 本発明のざらにもう一つの目的は色変化が試料に添加さ
れた栄養源の代謝により与えられ、この栄養源がその代
謝後にだけ検出できる色原体分子を含むものである、前
記特徴を有する方法を提供することにある。 本発明のさらにもう一つの目的は色原体分子を有Ｊる栄
養源が目標微生物によってだけ有意に代謝されうるちの
である、前記特徴を有する方法を提供することにある。 本発明のこれらのおよびイの他の目的は本発明の数種の
好適態様を説明りる以下の訂細な記載からさらに容易に
明白になるだろう。 ダラム陰性微牛物の属および種の微生物（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉ）　、グフム陽性微生物ノ属オよ
び種の微生物（ｓ＋ｒｃｐ＋ｏｔ：ｏｃｃｕｓ　ｆａｅ
ｃａｌｉｓ）　、およびかなりの数の微ｌｌ物（ダラム
陰性微牛物）を含む広い群より４１６分類学的ト分を検
出するために本発明を用いる土つの例を以下に詳細に説
明する。検査試料をこれらの五種のいづれかについて検
査する場合に、ぞれそ“れσ月１標微生物を標記する。 ＥＳＣｌｌｅｒｌＣｈｆａ　ｃｏｌｉ 栄養源はＭ累１ｔ　　タルク１１ニダーゼの基質である
。ｔ、ｃｏ＋＋の存在ど色変化により検出しようとする
場合には、栄養源−指示物質はＡルトニト０フェニル−
８−１）−グルタ１１ｍｌド（黄色）、Ｂ−ナツタルア
ミド〜１３−１）−グルクロニド（紫色）、アルファー
ナフＩ〜−ルー１ｌ−Ｄ−グルクロニド＝　２０− （赤色）、またはメチル　ウンビリフエリルーＢ−Ｄ−
グルクロニド（蛍光色）等であることができる。 これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用する
。培地の残りの成分は各成分がＥ、ｃｏｌｉに必要な成
分を提供するように作成する。 先ず、培地からダラム陰性微生物に族する広い分類範囲
以外の微生物との競合を防止するために、抗生物質、パ
ン＝１マイシンおよびアンジオマイシンを５重量％の吊
で加える。これらの抗生物質は１〜１０重楢％の範囲で
存在できる。 次いで、ダラム陰性細菌からｔ、ｃｏｔｉを選択するた
めに、次の成分を使用する： アミノ酸　　ヒスチジン　　　　　　　　０．０６９７
　　　　０．０２〜０．１メヂオニン　　　　　　　　
０．１１１６０　　　　０．０２〜０，４トリプトツノ
ｌン　　　　　　　０．２３２５　　　　０．０２〜０
．５ビタミン　　ビオーヂン　　　　　　　　　０．０
００２３２　　　０．０００１〜ｏ、ｏｏｉパントｊ−
ンＭ珈　　　　　　　０．００９３　　　　０．００１
〜０．０１葉　　酸　　　　　　　　　　０．０００２
３２　　　０．０００１〜０．０２イノシ１〜−ル　　
　　　　　０．０１１１Ｇ　　　　　０．０１〜０．０
２ｐ−アミノ安Ｉ；ｔｈＭｏ、ｏ４６ｏ、ｏ１〜０，１
ピリド４−シンＪ＆ｌ酸塩　　　　　０．０！１３　　
　　０．０５〜０．３リボフラビン　　　　　　　０．
０３７　　　　０．０１〜０．０６ヂアミン　　　　　
　　　　０．０３７　　　　０．０１〜０．０６元　素
　　　塩化第二鉄　　　　　　　　（１，０４６０，０
２〜０．１硫酸銅　　　　１１．０１１１８６０　０．
００１〜０．００２硫酸マンガン　　　　　　　０．０
０３７　　　　０．００２〜０．００７塩化カリウノ、
０．１）０００００９　　０．００００１〜ｏ、ｏｏｉ
ヨー化カリウｌｈ　　　　　　　　Ｏ，（１００００４
６０，０００００１〜０．００００１硫Ｍ）ノコ、ン　
　　　　　　　　　　　（１，０４Ｇ　　　　　　　Ｏ
，０１〜０．０８塩化マグネシウム　　　　　０．０１
ミ＋　　　　　ｏ、ｏｉ〜０．０５栄養源−指示物質　
　　　　　　　　　　０．３４５　　　　０．２〜２５
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓは尿道管系感
染に見られる微生物である。この微生物はプールの水で
分析される主要微生物でもある。 栄養源−指示物質は酵素Ｌ−ピロニドニル　アミノペプ
ヂダーゼの基質である。Ｓ、ｆａｅｃａｌｉｓの存在を
色変化により検出しようとする場合には、栄養源−指示
物質分子はオルトニトロフ■ニルーＢ−Ｌ−ピロニドニ
ル（黄色）、Ｂ−ナフタルアミドーＢ−Ｌ−ピロニドニ
ル（紫色）、アルファーナフト−ル−Ｂ−１ｍｌピロニ
ドニル（赤色）、およびメチルウンビリフ１ニル＝Ｂ−
１ｍｌ−ピロニドニル（蛍光）である。 これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用する
。培地中の残りの成分は各成分がＳ、ｆａｅｃａｌｉｓ
に要求される成分を提供するようにする。 先ず、グラム陽性細菌に族する広い区分以外の微生物と
の競合を防止するために、抗生物質コリスチン、ナラデ
ィキシン酸およびアンシオマイシンを加える。 次いで、グラム陽１り細菌か’：）　Ｓ、　ｆａｅｃａ
ｌ　ｉｓを選択するために、ｌ、ｃｏｌｉの場合につい
て特定されている同一成分混合物を前記栄酋鯨−指示物
質および抗生物質ととｂに使用４る。栄養源−指示物質
は０．３４５小Ｗ％の淵１αぐ０イ１させる：その使用
可能範囲は約０．２−・約２．０重量％である。抗生物
質は５小量％の１１＃爪で介在させ、その使用可能範囲
は約１〜約１０重量％Ｃある。 ダラム陰性細菌 細菌には２つの広いｌ！Ｙ、゛りなわちグラム陽性群と
ダラム陰性ＪＡＹとがある。ダラム陰性細菌は、これら
がその身体の一部分どして毒性物質、いわゆるエンドト
キシンを金石ｉＪることから重要である。 これらの細菌はまＩこ医桑品おｊ：びその他の医療用製
剤の汚染物でありうる。 栄養源−指示物質はＮ’を索１ｍｌアラニン　アミノペ
プチダーＵの３．＜質Ｃある１、ダラム陰性細菌の存在
を色変化にＪ、り検知しＪ、うど４る場合には、栄養源
−指示物質分子はＬ　−アラニン−Ｂ−オルト−２／Ｉ
　　− 二Ｉ−口フェニル（黄色）、ベーター−ナノタルアミド
−Ｂ−Ｌ−アラニン（紫色）、アルファーナフトール−
［３−Ｌ−アラニン（赤色）、およびメチルウンビリフ
■リルーＢ−１ｍｌアラニン（蛍光）であることができ
る。 これらの栄養源−指示物質は必須炭素源として作用する
。培地の残りの成分は各成分がダラム陰性細菌に必要な
成分を提供するようにする。 先ず、ダラム陰性細菌の広いカテゴリイ以外の微生物を
排除するために、抗生物質アンジオマイシン（酵母菌を
排除する）およびバンコマイシン（ダラム陽性菌を排除
する）を５重量％の量で加える。 前記に特定した同一成分混合物を、０．３４５重隋％の
量および約０．２〜約２．０重量％の範囲で存在する前
記栄養源−指示物質とともに使用する。抗生物質は約１
〜約１０重量％の範囲で存在させることができる。 追加例 水中のにＩｅｂｓｉｅｌ　１ａｃ−族の検出には主要栄
養源として主要炭素源を使用でさる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ−族の細菌は糖分子中の炭素が］卜」〕結合により
結合している炭素源を代謝で２１６０．この種の菌の検
出組成物は主要炭素源としく、Ｉ３−１）結合を介して
オルトニド［Ｊノニ１ニル、色１１；Ｉ体分子に結合し
ているグル」−ス分子、おＪ、びＩ＋’α１物質−１リ
スヂンおよびナラトキシン酸を金石づる。Ｋｌｃｂｓｉ
ｃｌｌａ−族が存在する場合には、Ａルｌ−Ｌ　ｌ・１
）■ニルー［〕−〕Ｄ−グルニー１ｍｌが代９吻（イれ
−（Ａル１ヘニト１］フェニル分子ｈ＜放出さ［Ｌる。 （二の分子は放出されると黄色になる。従−）　−（、
＋５ｉ杏試旧の黄色化は目標微生物、すなわらＫｌｃｌ
＋ｓｉ＋５ｌｌａｃ−族の存在を示す。 その他の微生物は、これらが指示物質であるＡルトニト
ロフェニル−１，３−１’）　　グル」−スを代謝でき
ないことから／ｌ白しない１．イの他の微生物が生育お
よび代謝し４（いので、これらの他の微生物との微生物
的弱含４；Ｌ　１１じない。 ５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓは混合水
試料中の別の５ｔａｐｈｖ１０ＣＯＣＣｉの存在にＪ：
り同定でき、これはこの目標微生物が１）０４を代１１
できるからである。 −２ｆ５　　−一 この種の細菌の検出には、試験培地中の代謝性指示物質
として、ホスフェ−１・に結合したオル１ｍｌ二トロフ
ェニルを使用できる。混合物を含有する試料を培地と混
和した後に、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ
ｓだけが培地中のこの栄養源を代謝し、黄色で見られる
色変化を生じる指示分子を放出する。 ダラム陰性細菌および［１菌はコリスチン、ナラトキシ
ン酸およびアンジオマイシンの添加により検査試料から
それぞれ排除される。 窒素およびイオウはそれらの還元形で、アミン基または
アンモニア塩（ＮＨ３）およびスルフどドリル（Ｓ　ｌ
−１）基として原則的に微生物により代謝される。炭素
と同様に、窒素およびイオウは生育に必須である。本発
明は微生物の検出および確認に、窒素またはイオウに結
合した加水分解性基質を使用する合成性試験において、
炭素について記載の同一原理を使用できる。 この例として、Ｈ■ＣＯｂａＣｔＯｒｉｕｗ＋　ｆｏｒ
ｔｕｉｔｕｍの検出がある。この細菌はそのイオウ源と
して、硫酸イオン、ＳＯ４を要求づ゛る。栄養源−指示
物質のフェノールツタ１ツイン−スルフェートは通常無
色である。イＡつ源を除い（、／１育に必要な全成分を
含有する培地１．Ｌｌ；　ｌ／％　’Ｃ１ＨｖＣＯｂａ
ＣｔＯｒｉｕｍ属のＨｙｃｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ　ｆｒ
ｌｕｉｌｕｍだ（Ｊがスルフエートを利用できる。従つ
Ｃ１この秤の細菌だりが生育し、代謝する。イの〆ｔ　
ｌ＋　ｌま放出＜！　’ｌ′した色原体分子〕］二ノー
ルフタレインｉＪ、１、す／１じる赤色により照明され
る。 栄養源−指示物ｖ１に変換【・さる栄養源を使用するも
う一つの例には化合物１ｍｌリグリセライドーオルトニ
トｏ　７　、、、ｒ−ルがある＋＋　ｌｌｌ５ＯｂａＣ
ｔｅｌ”１ＵＩＩｌ属はその生育おｊ、び代−１に１へ
リグリレライドを利用する医療上で重要な幅−・のグシ
ム陰性嫌気性細菌である。ｒＵｓＯｂａｃｔｏｒｉｌｌ
ｌｌｌを含有りる試料を全生育必須成分およびＩ−リグ
リレライドの主要源としてトリグリセライド−Δルｊ−
二１・【コノエニルを含有する無酸素性培地に接種する
と、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍだけが代謝する。イの
代謝はＡ−ルトニトロフェニル分子の放出により生成さ
れる黄色により示される。 本発明は目標機イ１物だｔノが１要栄養源として使用で
きる栄養源−指示物質を培地中の一般的栄養源の代りに
選択することにより各目標微生物、微生物種または微生
物属に対して作成できる。すなわち、本発明による培地
は特異性であって、一般的培地ではない。 ｒ、ｃｏ＋＋は糖アドニトールを代謝できないのに対し
て、に１ｅｂｓｉａｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　　
（Ｋ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は代謝できる。従って、
アドニトールが培地中の叩−の栄養源である場合には、
Ｅ、ｃｏｌｉは生育、代謝および増殖しないのに対し、
に、　ｐｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅは生育、代謝および増殖
する。培地はに、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが代謝し、生
育する主要栄？！源であるアドニトールとともにに、　
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが要求する全ての生育因子を用意
することによりこの事実にもとづいて作成できる。関連
細菌であるＥ、ｃｏｌｉが同−培地中に存在する場合に
、Ｅ、ＣＯ１＋は代謝せず、また生育しない。従って、
アドニトールに結合している色原体分子１．１［、ｃＯ
ｌｉと混合して試料中に存在するに、　ｐｎｅｕｍｏｎ
　ｉ　ａｅの生育および代謝を検知するための栄養源−
指示物質としての役目を果たす。 　２９一 本発明で使用りる栄養ｄｇじ指示物質は従来、主要栄養
源としで使用され！、：ことのない合成分子である。ア
ドニトールの例と同様に、特定の栄養源−色原体を目標
微生物にＪ、り攻撃させ、着色分子を放出させる。その
伯の微生物はこれを代謝できないので、これらの微生物
は生育しない。 検査試料はビンのＪ：うな容器に入れる。本発明による
培地を試料に加え、よく混合する。試料が固体である場
合には、水稀釈剤を使用できる。目標微生物または−Ｂ
Ｙの微ｌＩ物が存在する場合には、本発明による培地は
色を変える（接種時点からいづれかの時点で）。１８地
の接種後の操作時間または労力は不必要である１、：１
刀ご、終了点が明確な変色であるので、陽１１１の判定
（５二対する測定化の訓練は不必要である、。 基質は糞便大腸菌類（ｒ、ｃｏｌｉ）　、総大腸菌群、
ＫＩｃｂｓ＋ｃ’ｌ　１ａ−Ｅ１１ＬＯｒＯ１１ａＣＬ
ＯＩ゛−３Ｏｌ’ｒａＬ　ｆａ族、および５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｒ；Ｉｆ！ｉ：；１１１３の’Ｒｉ定
の検出について利用できる。 本発明は特に、水の分１１にイＪ用である。水を分−；
３〇　− 析する場合に、必要に応じて、チオ硫酸ナトリウムまた
はＥ　Ｄ　ＴΔナトリウム塩を加えて、水に見い出され
る抗菌剤を中和することができる。 本発明により水をＥ、ｃｏｌｉについて分析する場合に
は、次の方法に従う： １、　水試料を採取する。予め目盛が付けられているピ
ペットを使用して、水試料の１．０ｄ、ｏ、Ｉｉｌおよ
び０．０１ｍｌを３本の試験管にそれぞれ加える。本発
明による前記培地を粉末形で加える（別法として、本発
明による培地を試験管内に粉末形で存在させることもで
きる）。 ２、　試験管を２０℃（７０°［）〜４４℃（１４０下
）でインキュベートする。 ３、　　Ｅ、ｃｏｌｉの存在は試験管の色の変化により
指示される。 ４、　　１００　　Ｅ、ｃｏｌｉ／ｄ以上のＥ、ｃｏｌ
ｉが存在する場合には、ｏ、　ｏｉｌｌｌ！試験管が陽
性を示す；１０　　［、ｃｏｌｉ／Ｉｄ以上が存在する
場合には０．１ｄ試験管が陽性を示ず：多くて１Ｅ、ｃ
ｏｌｉ／＃＋ｅが存在する場合には、１ｍｌ試験管だけ
が陽性を示す。 陽性試験結束は、試料１ｍｌ中に１個の微生物が存在す
る場合に、重ｌｌｊに１ｇ種した試料を用いて接種後の
短時間から２０１１．１間、Ｌぐの間のいづれかの時点
で生起しつる１、試験管にｒめ１］１盛を６１　ＧＪた
ピペットにより水を添加りるという技術的操作が必要な
だ【ノである。 前記と同一のＪｉｍ　Ｊｌｌｌを１’、ｃｏｌｉの存在
または不存在（Ｐ−Ａ）試験についも水の分析に使用し
た。 １、　水の試料’Ｉ　００　ｍｆｌ　（！本発明による
前記培地を含有する容器に加える、１ ２、　反応混合物が変色した場合（最＾１８時間）に、
Ｅ、ｃｏｌｉが存ｌＩシ、この試験は陽性である。 ３、　確認試験またｔよイの他の試験は不必要である。 本発明による１ノ払を野外で数種のＢ−グルクロニダー
ゼおよび１３−ガシクトビラノシド基質を用いて実施し
た。［〕−Ａ試験方式の本発明による方法の比較は慣用
の膜濾過技法で行ない、新規用具の認可に係る１ｍｌ１
）へ規約に４７い評価した。試験は二種の目標機ノ１物
、１．、ｃｏｌｉおよび総大腸菌群について行なった。 基本的方式は前記のとおりに行なう：但し特定の目標微
生物を検出するために、加水分解性基質だけは変える。 下記の説明は迅速自動分析組成物方式に関するものであ
る。 自動分析用組成物をＢ−グルクロニダーゼおよびＢ−ガ
ラクトシダーゼに対する数種の基質を用いて作り、野外
で試験する。Ｂ−グルクロニジダーゼ基質はＥ、ｃｏｌ
ｉ用である；Ｂ−ガラクトシダーゼ組成物は総大賜菌群
用である：二種の基質は一緒に、両方の微生物を同時的
に同定できる。このＰ−Ａ試験方式による自動分析用組
成物の比較は膜濾過技法により行なった。 二種の目標微生物、Ｅ、ｃｏｌｉおよび総大賜菌群につ
いての自動分析用組成物を作る。Ｂ−グルクロニダーゼ
（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびＢ−ガラクトシダーゼ（総大腸
菌群）について異なる基質を試験する。 これらの基質は分子の発色（色原体）部分が変えられて
いる。 Ｂ−グルクロニダーゼ用基質 １）　　Ｂ−グ用タ１１ニダーＵ川の下記の基質をそれ
らのＦ、ｃｏｌｉ検出（Ｌ　／Ｊについ−（ｌれぞれ別
々に試験する： オルトニ１ｍｌｒ１〕−［ニル−グルクロニド：これは
加水分解されると邑「Δになる。 メチルウンじリノ」１ｍｌＩンーグルクロニドン：これ
は加水分１１／ｌ’されるど、３６６ｎｗ＋で蛍光を発
する。 プロモークロル−インドール−グルクロニド；これは加
水分解されると、青色になる。 ２）　　Ｂ−ガラクトシダーＵ川の下記の基質をそれら
の総大腸菌群検出能ノ】について、それぞれ別別に試験
する： Ａルトニトロフェニル−ガラクトシド；これは加水分解
されると黄色になる。 メチルウンビリノ１０ンー＝ガラクトシド：これは加水
分解されると、３　Ｂ　６１１１１で蛍光を発する。 ３）　　Ｅ、ｃｏｌｉおよび（，１，たは）総人腸菌群
の存在を同時的に検１１しＪるぞれらの能力について、
下肥−：ｌ／ｌ−− の組合せを試験した＝ メチルウンビリフエロンーグルコシド＋オルトニトロフ
ェニル−ガラクトピラノシド；　Ｅ、ｃｏｌｉ（排泄物
大腸菌類）が存在すると、試験溶液は３６６ｎｎ＋で蛍
光を発する；総大腸菌群が存在すると、黄色になる二両
神の大腸菌が存在すると、溶液は蛍光を発し、黄色にな
る。 Ｅ、ｃｏｌｉ　（糞便大腸菌類）を検出するためのプロ
モークロル−インドール−Ｂ−グル］シト＋総大腸菌群
を検出するためのメチルウンビリフエロンーガラクトビ
ラノシド：　Ｅ、ｃｏｌｉ　（排泄物大腸菌類）が存在
すると、試験溶液は青色になる；総大腸菌群が存在する
と、黄色になる：両方が存在すると、溶液は青色になり
、蛍光を発Ｊ−る。 被験基礎培地 １）下記の基礎組成を使用する： 自動分析用組成物中の色原体性基質 ラウリル乳糖トリプトース　ブロス中の色原体性基質。 結果 １）ラウリル乳糖１ｍｌリブドース　ブロス中でメチル
ウンヒリフ」ロン−グルクロニドを使用することによる
［、ｃｏｌｉの７ｆ在に係る分析：貯水池からのイ１の
未処理水の７５個の検査試料を試験Ｊる。膜濾過技法て
・は、総大腸菌群について１２個が、イして糞便大腸菌
類について１２個が陽性の結果を示しｌこ。Ｉｉ？示物
質物質有するラウリル乳糖トリブＩ・−ス　７１’ｉｌ
スは６個の場合について総大腸菌ｔ！Ｙ＾りＩｊ　Ｊ、
び２１１ＡＩの場合についてＥ、Ｃ０１ｉを検出した。 １１！均同定ＩＩＩ間は１６．５時量であった。混濁お
、Ｊ、σ大腸菌１ス外の細菌により生じたラウリル乳糖
の乳糖醗酵により、終点の決定は困難であつｌこ、　Ｌ
Ｙ　−＞　（、ＩＩｔ礎培地としてのラウリル乳糖の使
用はＡゝ）め、この培地はさらに検関しなかった。 ２）被験自動分析用組成物中でＡルトニＩ〜［１）工二
ルーガラクトシドを使用りることによるＥ、ｃｏｌｉ　
（糞便大腸菌類）の０７１の分析貯水池からの牛の未処
理水の３５個の検査試料を試験した。膜濾過法おＪ、び
自動分析法でそれぞれ１個の陽性結果が得られた。平均
同定時間は１８時量であった。 ３）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　（糞便大腸菌類）用のメチルウ
ンピリフエロンーＢ−グルクロニド基質＋総大腸菌群用
のオルトニトロフェニル−Ｂ−ガラクトピラノシドを同
時的に評価した。 貯水池からの生の未処理水の８０個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では糞便大腸菌類について陽性結果はゼ
ロであり、総大腸菌群についての陽性結果は８であった
。自動分析用組成物ではＥ、ｃｏｌｉの検出はゼロであ
り、そして総大腸菌群の検出は８であった。平均検出時
間は１８時量であった。 ４）　　［、ｃｏｌｉ　（糞便大腸菌）用のプロモーク
ロル−インドール−Ｂ−Ｄ−グルクロニド＋総大腸菌群
用のメチルウンビリフエロンーガラクトピラノシドを同
時的に評価した。 貯水池からの生の未処理水の１０個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では総大腸菌群について１個の陽性結果
が得られた。自動分析用組成物では同一試料において総
人腸菌群について１個の陽性結果が得られた。平均同定
時間は２２時量であった。 ５）総大賜菌酊用のオルトニトロフェニル−Ｂ−ガラク
トピラノシド。 配水系からの完全水の５０個の検査試料を試験した。膜
濾過技法（゛は総人腸菌群について２個の陽性結果が得
られｌこ（＜　２　ＣＦ　Ｕ　／　１００　ｄ　）。 自動分析用組成物Ｃは同じ２個について総大腸菌群が検
出された、ψ均検出：１，１間は１７時量であった。 ６）総大膓菌ＡＹ用のメブルウンビリフＵｉ　ＯンーＢ
−ガラクトシド 配水系″からの完全水の２０個の検査試料を試験した。 膜濾過技法１１ｊ　Ｊ：び自動分析組成物の両方で、全
部で一つの同一・の総人腸菌ＢＹについての陽性結果が
得られた。平均１１１１定＋１．’ｒ間は１８時量であ
った。 ７）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　（糞便大腸菌類）用のメチルウ
ンビリフエロン〜１３−グルクＬ１ニド＋総大腸菌群用
のブロモ−２０ルーインドール−Ｂ−ガラクトシドを同
時的に評価した。 貯水湖からの生の未処理水の５０個の検査試料を試験し
た。膜濾過技法では総大腸菌群について１６個のおよび
Ｅ、ＣＯ１＋について２個の陽性結果が得られた。自動
分析用組成物では同一の１６個に加えて２個の追加の陽
性結果が総大腸菌群について得られ、Ｅ、ｃｏｌｉにつ
いては２個の陽性結果が得られた。平均同定時間は１８
時量であった。 本発明に従って有用な栄１ト指示物質は次のとおりにし
て生成できる： オルトニトロフェニル誘導体 ０−＝トｏ７ｘニル４２９をＮａＯＨ１６，８び含有蒸
留水４２０ｄに溶解して反応混合物を生成する。この溶
液に、アセトン６２ＯＩｄ中のテトラアセデル−Ｂ−Ｄ
−ガラクトピラノシル　プロミドを加える。室温で５時
間、反応させた後に、溶媒を蒸発により除去する。この
生成物１ｇを０．４Ｎバリウム　メトキシド含有メタノ
ール５０ｄ中に懸濁する。この反応混合物から生成する
結晶はＯ−ニド０フェニル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドである。 パラニトロフ■ニルスルファターゼ 次の反応を行なう：ジメチルアナリン４フｊｄ！および
二硫化炭素５０　ａｉ！を２１ｉ！合し、４℃に冷却し
、クロルスルホン酸９．２〆を加え、次いでｐ−二トロ
フェノールｉ３．Ｏｇを加え、混合し、次いで一夜にわ
たり放１１１Ｊる。０．４Ｎ水酸化カリウム１００ｄを
加える。明員色結晶が混合物を８０℃で、二硫化炭素を
蒸発さ１！ながら加熱することにより生成する。過剰の
メｆルアナリンを遠心分離により分離する。、ＭＦＪ、
［）−二トＯフェニルをアルコールからＦ＋結晶させる
。 本発明による特巽的培地が粉末形で生成でき、種々の目
標微生物に対し′（特定のそのまま使用できる量で包装
でさることは容易に認識される。生成される培地は所望
ににす、抗生物質を含有できる。 本発明の前記態様において、かなりの変更および修正が
本発明の要旨から逸脱することな〈実施できるので、本
発明は１Ｓ１訂請求の範囲により要求−／ＩＱ　　− される要件以外の何者によっても制限されるものではな
い。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）検査試料中の目標微生物の存在または不存在を決
   定するために検査試料と組合せて使用する特異的培地で
   あつて、目標微生物の生育の支持に必要な必須成分およ
   び目標微生物が代謝でき、そして検査試料中の生きてい
   る微生物に関して目標微生物だけが代謝できる培地中の
   唯一の栄養源である栄養源−指示物質の有効量を含有し
   、この栄養源−指示物質は代謝性分子および試料−変性
   分子を含み、この試料−変性分子は前記栄養源−指示物
   質が目標微生物によつて代謝された場合にだけ放出され
   、これにより試料の感知できる特性が変えられるもので
   あることを特徴とする特異的培地。
2. （２）試料中に存在することがある競合性のいづれの目
   標外微生物もこれらが栄養源−指示物質を代謝できない
   ようにするのに有効量の抗生物質をさらに含有し、この
   抗生物質は目標微生物に対しては無効である、特許請求
   の範囲第１項に記載の培地。
3. （３）試料−変性分子が、栄養源−指示物質の代謝によ
   つて放出された場合に、検査試料の色を変える色原体で
   ある、特許請求の範囲第１項に記載の培地。
4. （４）検査試料中のＥ．ｃｏｌｉの存在または不存在を
   決定するために検査試料に添加するための特異的培地で
   あつて、Ｅ．ｃｏｌｉの生育の支持に必要な必須成分お
   よびＥ．ｃｏｌｉが代謝でき、そして代謝されると、試
   料の色を変える色原体を放出する、Ｂ−グルクロニダー
   ゼ酵素の色原体性基質の有効量を含有することを特徴と
   する特異的培地。
5. （５）Ｂ−グルクロニダーゼの色原体性基質がオルトニ
   トロフエニル−Ｂ−Ｄグルクロニド、Ｂ−ナフタルアミ
   ド−Ｂ−Ｄ−グルクロニド、アルフア−ナフトール−Ｂ
   −Ｄ−グルクロニド、メチルウンビリフエリル−Ｂ−Ｄ
   −グルクロニドおよびブロモ−クロル−インドール−Ｂ
   −Ｄ−グルクロニドよりなる群から選ばれるグルクロニ
   ドまたはその混合物である、特許請求の範囲第４項に記
   載の培地。
6. （６）競合性のいづれの微生物も、これらが色原体性基
   質を代謝できないようにするのに有効な抗生物質を有効
   量でさらに含有する、特許請求の範囲第４項に記載の培
   地。
7. （７）抗生物質がグラム陽性細菌に対して選択的に有効
   である、特許請求の範囲第６項に記載の培地。
8. （８）検査試料中のグラム陰性細菌の存在または不存在
   を決定するために検査試料に添加する特異的培地であつ
   て、グラム陰性細菌の生育を支持するための必須成分の
   有効量、検査試料中のいづれの酵母菌およびグラム陽性
   細菌もこれらが栄養源を代謝できなくするに有効な抗生
   物質の有効量、およびグラム陰性細菌が代謝でき、そし
   て代謝されると、検査試料の色を変える色原体を放出す
   るＬ−アラニン　アミノペプチダーゼ酵素の色原体性基
   質を含有することを特徴とする特異的培地。
9. （９）Ｌ−アラニン　アミノペプチダーゼの色原体性基
   質がＬ−アラニン−Ｂ−オルトニトロフェニル、Ｂ−ナ
   フタルアミド−Ｂ−Ｌ−アラニン、アルフア−ナフトー
   ル−Ｂ−Ｌ−アラニン、メチルウンビリフエリル−Ｂ−
   Ｌ−アラニンよりなる群から選ばれるアラニンまたはそ
   の混合物である、特許請求の範囲第８項に記載の培地。
10. （１０）検査試料中の目標微生物の存在または不存在を
    決定するために検査試料に添加する特異的培地であつて
    、目標微生物の生育を支持するに必要な必須成分の必要
    量および目標微生物が代謝でき、そして検査試料中の生
    きている微生物に関して、目標微生物だけが代謝できる
    培地中の唯一の栄養源である栄養源−指示物質の有効量
    を含有し、この栄養源−指示物質は代謝性分子およびこ
    の栄養源−指示物質が目標微生物により代謝された場合
    にだけ放出され、これにより試料の感知できる特性が変
    えられる試料−変性分子を含む、非殺菌水溶性粉末形態
    の特異的培地。
11. （１１）水性検査試料に添加した後に、この試料中の目
    標微生物の存在または不存在を決定できる非殺菌水溶性
    粉末状特異的培地であつて、窒素含有化合物約１０〜約
    ５０重量％、目標微生物の生育に必須のアミノ酸約０．
    ０６〜約１．０重量％、目標微生物の生育に必須のビタ
    ミン類約０．０９〜約０．６０重量％、目標微生物の生
    育に必須の元素約０．０５〜約０．７０重量％、目標微
    生物の生育に必須の塩類約６．４〜約８５重量％、およ
    び培地中の唯一の栄養源であつて、目標微生物が代謝で
    き、そして試料中のその他の生きている微生物は代謝で
    きない栄養源である栄養源−指示物質約１．２０〜約２
    ．０重量％を含有し、この栄養源−指示物質は目標微生
    物により代謝されると、試料の感知できる特性を変える
    分子を放出するものであることを特徴とする特異培地。
12. （１２）検査試料中の目標微生物の存在または不存在を
    決定するための試料の試験方法であつて、ａ）少なくと
    も一つの既知量の検査試料を得る工程、 ｂ）この検査試料に、目標微生物の生育に必須の成分の
    有効量および目標微生物が代謝でき、そして検査試料中
    のその他の生きている微生物が代謝できない培地中の唯
    一の栄養源である栄養源−指示物質の有効量を含有し、
    この栄養源−指示物質は目標微生物により代謝されると
    、検査試料の感知できる特性を変えるのに有効なもので
    ある、検査試料中に可溶性の培地を予め定められた量で
    加える工程、および ｃ）混合された検査試料と培地とを少なくとも約２０時
    間あるいは前記特性が変えられて目標微生物の存在また
    は不存在が確証されるまで監視する工程、 を含む、試験方法。
13. （１３）培地を検査試料１．０ｍｌ、検査試料０．１ｍ
    ｌおよび検査試料０．０１ｍｌに加え、検査試料と培地
    との各混合物を特性変化について監視して、検査試料中
    の目標微生物の濃度を確証する、特許請求の範囲第１２
    項に記載の方法。
14. （１４）検査試料−培地混合物を約２０℃〜約４４．５
    ℃の範囲の温度でその監視期間にわたりインキュベート
    する工程をさらに含む、特許請求の範囲第１３項に記載
    の方法。
15. （１５）検査試料に、目標微生物以外のいづれかの微生
    物が栄養源−指示物質を代謝できなくするに有効量の抗
    生物質を加える工程をさらに含む、特許請求の範囲第１
    ２項に記載の方法。