JP2002501756A - 微生物のペプチダーゼを検出するインドールアミン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、培地に着色又は蛍光を形成することにより、ゲル化した培地を含めて微生物の培地においてペプチダーゼ活性を検出し得る式：Ｘ−ＮＨ−Ｒ（式中Ｘは随意に置換されたインドール−３−イル基を表わし、Ｒは特にアミノ酸のアシル残基又はペプチドのアシル残基を表わす）の化合物に関する。本発明は微生物を検出するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は微生物の培養におけるアミノペプチダーゼ活性又はペプチダーゼ活性
を発現させるのにインドールアミン誘導体を基剤とする少なくとも１種の化合物
の使用に関し、並びにかかる酵素活性を検出するかあるいはこの活性を発現する
又は発現しない微生物を同定する方法及び培地に関する。

【０００２】 「アミノペプチダーゼ」は、アシルアミノ酸と第１級アミンとの間で形成した
アミド基を加水分解により開裂し得る酵素に対して一般に与えられた用語であり
、「ペプチダーゼ」はペプチドの アシル残基を第１級アミンとの間で形成した アミド基を加水分解により開裂し得る酵素に対して与えられた用語である。本発
明においては、用語「ペプチダーゼ」は、前述の如きペプチダーゼとアミノペプ
チダーゼとの両方を状況に応じて言及し得る。

【０００３】 微生物の検出及び同定は、特に医薬産業、農産物産業では又は環境の監視（例
えば水質管理）にきわめて重要である。微生物は汚染指示体としてそれらの病原
性について探求されあるいは製造方法の監視について探求されている。

【０００４】 微生物を検出し同定する技術は、現在特有のヌクレオチド配列を探索するのに
基づくか、抗原又は抗体を探索するのに基づくか、選択性の培地又は非選択性の
培地で培養することに基づくか、あるいは代謝活性及び特に酵素活性（例えばオ
シダーゼ(osidase)、エステラーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ等の活性）を 探索するのに基づく。

【０００５】 通常微生物を検出し同定する方法は、これらの技術の若干を組合せるものであ
る。かくして培養を用いて所望の微生物を増殖させ且つ選択する。微生物の検出
を簡素化するためには、着色又は蛍光を生ずる分子を培地に直接導入することに
より生化学活性を発現することが提案されている。かかる培地は検出培地と呼ば
れる。探求した生化学活性は種々の方法によって発現させることができ、例えば
（イ)培地を物理化学的に改質することにより発現させることができる。例えば 着色した又は蛍光性の指示薬（メチルウンベリフェロン）を用いて発現されるｐ
Ｈ変更により発現させることができ、 （ロ）着色した（テトラゾリウム塩）又は蛍光性の指示薬を用いて発現される、
レドックス電位を変化させることにより発現させることができ、 （ハ）微生物によって生じた分子を、培地に存在し且つ着色を生ずる化合物と反
応させることにより発現させることができ、 （ニ）あるいは別法として着色した化合物又は蛍光性の化合物（ナフトール、ク
マリン）を放出する分子を加水分解することにより発現させることができる。

【０００６】 検出される加水分解は一般に、微生物によって生じた酵素と天然又は合成の酵
素基質との反応の結果である。これらの酵素活性は例えば次の酵素の活性である
：エステラーゼ（例えばリパーゼ、ホスファターゼ）、オシダーゼ（β−ガラク
トシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）、ペプ
チダーゼ（アラニン、アミノペプチダーゼ、トリプシナーゼ、ゼラチナーゼ）、
ＤＮＡｓｅｓ、デカルボキシラーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ、トリプトファ
ナーゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ等。

【０００７】 ゲル化した培地は、微生物を培養し試料から微生物を単離するのに特に良く適
しており並びに微生物の混合物中の「目標」微生物を検出するのに特に良く適し
ていることが更に知られている。これらの培地上で微生物は肉眼で検出し得るコ
ロニーを形成し、求める生化学活性のある生成物はそれらの産生場所に局在する
のが高度に望ましい。この局在によって、実際近隣が同じ活性を発現しないなら
ばコロニーをその近隣から区別させ得る。かくして例えばｐＨの変化（仏国特許
公開第2,671,100号）、エステラーゼ活性（仏国特許第2,457,323号）、オシダー
ゼ活性（仏国特許公開第2,684,110号）等を検知する種々の方法を用い得る。幾 つかの菌種又は菌株を検出するために及び／又は検出の感度及び／又は特異性を
増大させるためにこれらの検出方法の幾つかを勿論互いに用いることができる。

【０００８】 米国特許第5210022号及び第5358854号はβ−ガラクトシダーゼの作用に感作性
の発色基質を記載している。これらの３−ヒドロキシインドール由来の基質は例
えばインドリル−β−Ｄ−ガラクトシドであり、そのインドール核は４、５、６
又は７位にハロゲン置換基を担持し得る。

【０００９】 欧州特許公開第0,224,830号は尿試料中のグラム陰性菌を検出する方法を記載 しており、該方法では或る種のカニから生ずる天然抽出物を尿試料に添加し、次
いで培養後に試料を、発色性脱離基含有ペプチド基質を含有する支持体と接触さ
せる。用いた天然抽出物はプロ酵素を含有し、試料がグラム陰性菌を十分な個数
で含有するならば、これらの細菌の内毒素はプロ酵素を賦活化して、支持体上に
着色した生成物を形成しながらペプチド基質を開裂し得る酵素にする。

【００１０】 現在、微生物のアミノペプチダーゼ活性及びペプチダーゼ活性を検出するのに
、ゲル化した培地に適当である手段は利用されていない。特に、これまで用いた
酵素基質はゲル化した培地に拡散する着色した分子又は蛍光性の分子を放出する
欠点があり、あるいはＵ．Ｖ．照射でのみ発現される（ナフチルアミン又はアミ
ノクマリンの場合）着色分子又は蛍光性分子を放出するか、あるいは試薬の添加
を必要とする（ナフチルアミンの場合）着色分子又は蛍光性分子を放出する欠点
があり、あるいはその着色が微生物学で用いた反応培地で比較的不十分な対照を
有する（ニトロアニリンの場合）という欠点がある。

【００１１】 本発明においては、（アミノ酸）−ＢＩＡ又は（ペプチド）−ＢＩＡの如き用
語は３−アシルアミノ−５−ブロモインドールの如き化合物を記載し、そのアシ
ル基は前記アミノ酸又は前記ペプチドのアシル基である。

【００１２】 Ｌ−ロイシン−アミノペプチダーゼは、加水分解後に着色した化合物を生ずる
、略してL-Leu-BIAとして知られるＬ−ロイシン−３−（５−ブロモインドール アミン）とも呼ばれる酵素基質、３−Ｌ−ロイシル−アミノ−５−ブロモインド
ールにより、哺乳類の組織断片で証明されていることは既知である：パールソン
(Pearson)らのLab. Invest., 12:712 (1963)参照。1967年に、ヤルボーロー（Ya
rborough）らの細網内皮系学会誌（J.Reticuloendoth. Soc.,）4:390はパールソ
ンらの技術を同様な用途（組織断片）で反復した。ヤルボーローらは、カリウム フェリシアナイド又はフェロシアナイド又は硫酸銅の混合物を添加すると酵素
反応を阻害すると明細に記している。

【００１３】 1975年にローダ（Lojda）及びハブランコバ（Havrankova）の組織化学43:355 はテトラゾリウム塩とフェナジン メトサルフェートとの混合物を添加すること
により酵素基質L-Leu-BIAを用いる方法を改良することを提案し、観察される着 色した反応は、この場合にはテトラゾリウム塩のホルマザンへの還元から誘導さ
れる。

【００１４】 本願の優先権主張日後に刊行された国際特許公開WO98/04735号は、着色した生
成物の形成により微生物の培養におけるペプチダーゼ活性を証明する発現剤とし
て、アシル基がロイシル残基及びアラニル残基から選ばれる５−ブロモインドー
ルアミンアシル化誘導体の使用を記載している。

【００１５】 本発明を生ずる研究の途中で、特にゲル化した培地上で、培養した微生物を検
出するのにこの酵素基質を用いることが可能であるであるか否かについて研究を
行なった。予備試験中に、L-Leu-BIA又はL-Pro-BIAは、以下の実施例１に記載さ
れるオシダーゼの探求に現在用いた培地に添加される。この培地で培養した微生
物が何であろうとも（特にエシェリチア、クレプシエラ、シトロバクテル、プソ
イドモナス、エンテロコッカス、スタフィロコッカス及びストレプトコッカス属
の細菌）、ロイシン−アミノペプチダーゼ又はプロリン−アミノペプチダーゼ活
性を証明することはできなかった。ローダ及びハブランゴバにより提案された試
薬を添加すると、L-Leu-BIA又はL-Pro-BIAでのペプチダーゼ活性を発現させるこ
となく微生物の生長を多少とも全体的に阻害することに反映される。

【００１６】 逆に、７−Ｌ−ロイシルアミノ−４−メチルクマリン（L-Leu-AMC）又は７− Ｌ−プロリルアミノ−４−メチルクマリン（L-Pro-AMC）を実施例１からの同じ 培地に添加するならば、蛍光（及びかくしてロイシン−アミノペプチダーゼ活性
又はプロリン−アミノペプチダーゼ活性）がこれらの同じ微生物の若干で検出さ
れる（実施例１参照）。同様に、この培地でオシダーゼ基質（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−カラクトシド及び６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−グルクロニド）を用いると、微生物のβ−ガラクトシダーゼ活性及
びβ−グルクロニダーゼ活性が検出し得る。

【００１７】 以下の実施例２で用いた培地でL-Leu-BIA又はL-Pro-BIAを用いるとペプチダー
ゼ活性を証明することもできなかった。

【００１８】 今般見出された所によれば、インドールアミン誘導体での結果が不在であるこ
とは、微生物との不適合性に因るものではなくあるいは培養中の微生物の増殖阻
害に因るものではなくて、本質的に培地の条件に因るものである。実際に見出さ
れた所によれば、別の培地を用いることによりインドールアミン誘導体で微生物
のペプチダーゼ活性を発現させ得る。或る培地は用いることができて別の培地は
用いることができないという理由は知られていない。然しながら、以下の実験部
分に記載したのと同様な簡単な定常試験により、適当であるか又は不適当である
培地及び／又は成分を決定し且つ発現することができる。本発明はかくして先ず
、前述のインドールアミン由来のペプチダーゼ基質を用いて微生物の培養で対応
の酵素活性を発現し得る培地を見出し得ることを特に調査し且つ確保することに
在る。

【００１９】 かくして、用い得る培地は以下の成分を含有する次の如くであると特に見出さ
れた： 酵母エキス ０．５〜２５ｇ／ｌ ゼラチン ペプトン ０．５〜２５ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０〜５０ｇ／ｌ 及び随意に ｐＨ調節剤、ｐＨ＝３〜９に十分な量 及び／又は ゲル化剤 ５〜３５ｇ／ｌ

【００２０】 ゲル化剤は慣用のゲル化剤例えば寒天である。

【００２１】 選択したｐＨは、研究した微生物に適当であるｐＨである。ゲル化した培地の
場合には、ｐＨは５〜９であるのが好ましい。ｐＨは例えば塩酸又は炭酸ナトリ
ウムで調節し得る。

【００２２】 微生物がＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性を発現するか又は発現しない
かに応じて、例えばL-Pro-BIAをかかる培地に添加するならば且つ微生物での接 種を行なうならば、褐色又は無色のコロニーが得られる。

【００２３】 アシル基がアミノ酸のアシル残基又はペプチドのアシル残基である３−アシル
アミノ−インドールの如き基質で匹敵し得る結果が得られる。

【００２４】 本発明の要旨はかくしてトレーサー試薬として次式（Ｉ）： Ｘ−ＮＨ−Ｒ （Ｉ） （式中Ｘは随意に置換されたインドール−３−イル基を表わし、Ｒはアミノ酸の
アシル残基又はペプチドのアシル残基を表わし、Ｒに存在する１個以上のアミン
基は場合によっては保護された形であっても良い）を有する少なくとも１種の化
合物の使用であって、該トレーサー試薬は微生物の培地に添加されるものであり
しかも該培地における着色又は蛍光の形成により該培地でペプチダーゼ活性を発
現し得るかあるいは該培地でペプチダーゼ活性を発現する微生物又は微生物群の
存在を発現しうるものであり、但し前記式（Ｉ）の化合物（但しＸは５−ブロモ
インドール−３−イル基を表わし、Ｒはロイシル残基又はアラニル残基を表わす
）の使用を除外した、式（Ｉ）の化合物の使用である。勿論、本発明の使用によ
って、適当な場合には求めるペプチダーゼ活性の不在及び／又は求める微生物（
群）の不在を観察することができる。

【００２５】 Ｒがアシル残基を表わすアミノ酸又はペプチドは次式 ＲＣＯＯＨ を満足させる。

【００２６】 前記式（Ｉ）の化合物において、Ｒに存在するアミン基（アミン基群）及び特
にＮ−末端アミン基は所望ならば、ペプチド化学で通常用いる一時的なアミン保
護基を用いて特に保護される形であっても良い。かかる保護基の存在又は不在は
、求めるペプチダーゼ活性が研究した培地に存在する時には、着色生成物又は蛍
光生成物の形成に影響を有しない。

【００２７】 前記式（Ｉ）でＸにより表わされるインドリル基は１、４、５、６及び７位の
少なくとも１つで１個以上の置換基を含有し得る。前記の置換基は特にハロゲン
、低級アルキル、アリール、アラルキル、低級アルコキシ及びアラルコキシ置換
基から選択し得る。本発明では、アラルキル及びアラルコキシ置換基のアルキル
基と同様に、低級アルキル及び低級アルコキシ置換基は特に１〜４個の炭素原子
を含有する。ハロゲン置換基はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素、特に塩素及び／
又は臭素であり得る。アリール置換基は特に、例えば低級アルキル、ハロゲン又
は低級アルコキシ基で随意に置換されたフェニル基である。１位に随意に存在す
る置換基は特に低級アルキル置換基例えばメチル基である。Ｘにより表わされる
置換したインドール−３−イル基のうちでは、特に４−クロロ−、６−クロロ−
、５−ブロモ−、１−メチル−、４−メチル−、５−メチル−、４，７−ジメチ
ル−、４，６−ジクロロ−、６，７−ジクロロ−、４−クロロ−５−ブロモ−、
４，５，７−トリクロロ−、４，６，７−トリクロロ−、４−クロロ−５−ブロ
モ−７−メチル−、５−メトキシ−、５−ベンジル−、５−ベンジルオキシ及び
５−フェニルインドール誘導体を挙げ得る。

【００２８】 Ｒ基がアミノ酸のアシル残基を表わす時の式（Ｉ）において、Ｒは例えばアラ
ニル、プロリル、ピログルタミル又はアルギニル残基である。Ｒ基がペプチドの
アシル残基を表わす時は、このペプチドは１０個までのアミノ酸残基、特に５個
までのアミノ酸残基及び特に３個までのアミノ酸残基を含有し得る。Ｒ基が誘導
されるペプチドのうちでは、Ｃ−末端アミノ酸残基がロイシン、アラニン、プロ
リン及びアルギニン残基から選択されるペプチドが特に挙げられる。ペプチドの
例としては、ＲがAla-Phe-Pro-を表わす式（Ｉ）の誘導体を与えるアラニル−フ
ェニルアラニル−プロリンが挙げられる。

【００２９】 前記式（Ｉ）の化合物は水性媒質に可溶性である。該化合物はペプチド合成で
用いた常法により製造し得る。式Ｘ−ＮＨ₂（但しＸは前述の如くである）のイ ンドールアミンを特にアミノ酸の誘導体又はペプチドの誘導体と反応させること
ができ、該アミノ酸又はペプチドは式ＲＨ（但しＲは前述の如くである）を満足
させるものである。前記のアミノ酸誘導体又はペプチド誘導体は、通常の第１級
アミン官能基−保護基を用いて保護される１個以上のアミン基と活性化カルボキ
シル基とを有する誘導体である。活性化したカルボキシル基は、第１級アミンと
の反応によりアミド形成を促進させるカルボキシル基誘導体例えば混成無水物基
である。混成無水物は例えば酸を低級アルキル クロロホルミエートと反応させ
ることにより得られることは知られている。

【００３０】 保護基及びそれらの使用は周知である：例えばR.A. Boissonasの「有機化学の
進歩」（Adv. in Organic Chemistry）方法及び結果、第３巻、インターサイエ ンス出版社(1963)１５９頁以降参照。本発明の場合には、特にペプチド化学で用
いた何れかの第１級アミン−保護基例えばＮ−Ｃｂｚ（Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニル）又はＮ−Ｂｏｃ（Ｎ−ブチルオキシカルボニル）を用いることができ、
これらは一時的なアミン基−保護基であると知られており、所望ならば簡単な酸
加水分解により元に戻すことができる。式Ｘ−ＮＨ₂のインドールアミンを、活 性化したカルボキシル基と保護したアミン基とを有する誘導体と反応させ、次い
で場合によっては１個以上のアミン基を脱保護することにより、式（Ｉ）の化合
物が得られる。式Ｘ−ＮＨ₂のインドールアミンそれ自体は特にMadelungのリー ビッヒ アナレン デル シェミー（Leibigs Annalen der Chemie）405巻、58 〜95頁(1914)により記載された方法と同様な方法により得られる。

【００３１】 本発明はまた、微生物の培地におけるペプチダーゼ活性を発現する方法に関し
、前述の式（Ｉ）のトレーサー試薬を微生物の培地に添加し、培地中に着色した
化合物が形成されるかもしれないのを探求することからなり、着色化合物が形成
したならば求めるペプチダーゼ活性が存在し、着色生成物が形成されないならば
ペプチダーゼ活性は不在であると了解される。本発明の方法においては、対応の
ペプチダーゼ活性が存在する時式（Ｉ）の基質を着色生成物に転化させ得る能力
のために予備選択される培地を勿論用いる。前記した如き培地を特に用い得る。

【００３２】 本発明においては、「着色した生成物」は例えば白色灯で点灯した時固有の色
を有する生成物に対して与えた用語であり、あるいは紫外線又は可視光線を照射
した時に蛍光を発生する生成物に対して与えた用語であり、用語「着色」は白色
灯に点灯した時固有の色を有する着色した生成物の存在と、適当な波長の照射の
影響下に蛍光を発生する生成物の存在との両方を記載する。

【００３３】 着色した化合物が形成されるかもしれないのを探求する工程は、適当な場合に
は、求めるペプチダーゼ活性が存在するならば該活性が検出しうるに十分な程に
求める微生物が増殖するような培養期間後に勿論実施される。

【００３４】 本発明はまた微生物を培養するのに必要とされる成分に加えて前述の式（Ｉ）
の少なくとも１種の化合物を含有する微生物培地に関する。

【００３５】 式（Ｉ）の化合物は、求めるペプチダーゼ活性を検出するのに十分である濃度
で培地に添加する。この検出には、着色の出現又は場合によっては紫外線又は可
視光線照射下での蛍光の出現が、肉眼での又は適当な光学手段を用いての何れか
で求められる。この十分な濃度は定常の実験により各々の場合に予備決定できる
。培地は例えば２５〜２０００ｍｇ／Ｌの式（Ｉ）の化合物を含有できる。

【００３６】 式（Ｉ）の化合物の利点の１つは、ペプチダーゼ活性の存在下に形成される着
色した生成物はゲル化した培地では拡散しないことである。

【００３７】 式（Ｉ）の化合物はかくしてゲル化した培地で用い得る。勿論該化合物は液体
培地で用い得る。

【００３８】 更には、式（Ｉ）の基質は培地での微生物の増殖を阻害しない。かくして式（
Ｉ）の化合物は、所望ならば培養の開始前に、培養の開始時に又は培養の終了時
にを含めて何れかの時点で該化合物を培地に添加することにより用い得る。ゲル
化した培地の場合には、該培地のゲル化前に培地の製造中に式（Ｉ）の化合物を
導入するのが勿論好ましい。

【００３９】 本発明は、微生物を含有するか又は含有することもあり得る試料中で１種の微
生物又は微生物群を検出する方法に関する。この方法は、次の工程即ち試料を含
有する培地に前述の式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物を添加する工程と、該培
地中に着色した生成物又は蛍光性の生成物が形成されるかもしれないのを探求す
る工程と、適当な場合には求める微生物又は微生物群の真正試料で得られた着色
又は蛍光に対して実際に得られた着色又は蛍光を対比する工程とを包含する。か
かる方法においては検出は勿論、求める微生物により又は微生物群により、用い
た式（Ｉ）のトレーサー試薬が発現させ得るペプチダーゼ活性の発現又は発現不
在に基づくものである。

【００４０】 本発明の微生物を検出する方法の特定の具体例によると、着色した生成物又は
蛍光性の生成物の形成により、前述の式（Ｉ）の化合物を用いて発現される酵素
活性と同じであり得る酵素活性であるが、式（Ｉ）の化合物を用いて発現される
のとは異なる酵素活性であるのが一般的である酵素活性を検出する少なくとも１
種の別のトレーサー試薬をも培養物に添加し得る。酵素活性は例えばエステラー
ゼ活性、オシダーゼ活性又はペプチダーゼ活性であり得る。かくして、着色の不
在（又は蛍光の不在）に関連するかあるいは単一の酵素基質で得られる着色に関
して変更される着色に関連する別の情報が得られる。選択した別のトレーサー試
薬は式（Ｉ）のインドールアミン誘導体とは異なる特性を有するものであり：例
えば式（Ｉ）のインドールアミンによって生ずる色とは異なる色を有する反応生
成物を与え得る別のトレーサー試薬が選択されるものである。別のトレーサー試
薬（即ち第２のトレーサー試薬）はかくしてその固有の色に因り又はその蛍光に
因り特異的である酵素活性の存在を発現し得るものである。式（Ｉ）のインドー
ルアミン誘導体によって発現し得るペプチダーゼ活性がまた存在するならば、式
（Ｉ）の化合物を単独で用いた時に該化合物によって与えられる着色とは異なる
変化した着色であってしかもまた第２のトレーサー試薬によって与えられる固有
の色とも異なる変化した着色が得られるものである。若干の基質の使用例並びに
これから由来する情報は以下の実験部分に与えてある。勿論、結果は研究した微
生物の各々の種類又は菌株と共に変化し得る。興味のありそうな各々の場合は定
常の実験により前もっての研究を受けるべきである。

【００４１】 相異なる酵素活性を発現するのに用いられる複数の誘導体であって別のトレー
サー試薬として用い得る誘導体は既知のトレーサー試薬又はその同族体である。
該誘導体は特にインドキシル、クマリン、レゾルフィン、ナフトール、ナフチル
アミン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ローダミン、ヒドロキシキノリン
、フルオレセイン等の誘導体である。

【００４２】 インドールアミン誘導体と組合せて用い得るこれらの別のトレーサー試薬のう
ちで、特に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、Ｌ−アラニン−７−アミノ
−４−メチルクマリン、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
ガラクトサミド、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトシド、β−ナフチルサルフェ
ート、ＡＳ−ＢＩ β−Ｄ−ガラクトシド ナフトール、Ｌ−アラニン β−ナ
フチルアミド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトシド、カルボキシベン
ゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド、ローダミン−１１０−ビス（Ｌ
−ロイシンアミド）、ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルコシド及びフルオレセ
イン ジアセテートが挙げられる。

【００４３】 本発明の特徴及び利点は次の実施例で例証される。

【００４４】実施例１ 培地は水に加えて次の成分を含有する； ミート ペプトン １５ｇ／ｌ カゼイン ペプトン ３ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ トリス緩衝液 ０．５ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム １ｇ／ｌ グルコース １ｇ／ｌ ピルビン酸ナトリウム ２ｇ／ｌ 寒天 １３ｇ／ｌ D.I.F.C.O．社により市販 D.I.F.C.O．社により市販 L-Pro-BIA又は７−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチルクマリン（L-Pro-AMC）を
２００ｍｇ／ｌの濃度でこの培地に添加する。かくして得られしかもペトリ皿に
分布させた種々の培地に微生物を接種した。ペトリ皿は４８時間３７℃で培養し
た。２４時間及び４８時間の培養後に形成されたコロニーを周囲の光線中で及び
ＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）下に肉眼で検査した。色又は蛍光の存在を記録
した。研究した微生物は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及び鵞口瘡カンジダ
（Candida albicans）であった。

【００４５】 ２４時間又は４８時間培養した後に、L-Pro-BIAを含有する培地では着色は見 られないが、これらの培地はL-Pro-AMCを含有する培地で発現されるL-Pro-ペプ チダーゼ活性を含有し；この場合にはＵＶ照射下での蛍光の発生が見られる。

【００４６】 L-Ala-BIA、L-Leu-BIA、Ｌ−アラニン−７−アミノ−４−メチルクマリン（L-
Ala-AMC）又はＬ−ロイシン−７−アミノ−４−メチルクマリン（L-Leu-AMC）を
２００ｍｇ／Ｌの濃度で前記の培地に添加する時は、２４時間又は４８時間培養
後にブロモインドールアミン（ＢＩＡ）誘導体の場合には着色は見られない。逆
にアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）誘導体を用いると、大腸菌（Escherichia Co
li）、肺炎桿菌（Klabsiella Pneumoniae）、シトロバクター フロインディ（C
itrobacter freundii）、緑膿菌（P. aeruginosa）、ストレプトコカス アガラ
クチエ（Streptococcus agalactiae）、エンテロコカス ファエシウム（Entero
coccus faecium）及び化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）の場合にはＬ−
アラニン−アミノペプチダーゼ活性及びＬ−ロイシン−アミノペプチダーゼ活性
の存在が発現され、表皮ブドウ球菌ではこれらの活性の不在が発現される。

【００４７】実施例２ L-Pro-BIA又はL-Pro-AMCを４００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃で０．１Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７．３）に添加した。得られた培地を微量滴定プレートの凹部に分
散させ、該プレートに緑膿菌（P. aeruginosa）又は鵞口瘡カンジダ（C. albica
ns）の懸濁物を接種した。該プレートを３７℃で２４時間培養した。２４時間〜
４８時間培養した後に周囲の光線中で及びＵＶランプ下に凹部を肉眼で検査した
。

【００４８】 L-Pro-BIAをL-Pro-AMCで置換した凹部でL-Pro-アミノペプチダーゼ活性を発現
し得るとしても、L-Pro-BIAでは着色は見られなかった。

【００４９】 同様に、前記のリン酸塩緩衝液にL-Leu-BIAを添加すると大腸菌（E.coli）、 肺炎桿菌（K. pneumoniae）、シトロバクター フロインディ（Citrobacter fre
undii）、緑膿菌（P. aeruginosa）、ストレプトコカス アガラクチエ（S. aga
lactiae）、エンテロコカス ファエシウム（E. faecium）及び化膿連鎖球菌（S
. pyogenes）培養物ではＬ−ロイシン−アミノペプチダーゼ活性を検出すること
はできなかった。然るにこの活性は、L-Leu-AMCを用いて同じ緩衝液中でこれら の同じ細菌について２４〜４８時間後に蛍光の発生により検出される。

【００５０】実施例３ 培地は水に加えて以下の成分を含む： 酵母エキス ６ｇ／ｌ ゼラチン ペプトン ５ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８ｇ／ｌ Ｎａ₂ＣＯ₃ ０．１ｇ／ｌ 寒天 １３ｇ／ｌ バイオメリエックス社により市販 バイオメリエックス社により市販されたバイオ−ゲリトン（Bio-Gelytone） L-Pro-BIA、ピログルタミル−ＢＩＡ（Pyr-BIA）又はAla-Phe-Pro-BIAをこの 培地に添加した。ペトリ皿に分布させたこれらの種々の培地に種々の微生物：大
腸菌、肺炎桿菌、シトロバクター フロインディ、緑膿菌、ストレプトコカス
アガラクチエ、エンテロコカス ファエシウム、化膿連鎖球菌、表皮ブドウ球菌
、鵞口瘡カンジダ及びＣ．トロピカリス（tropicalis）を接種した。ペトリ皿を
３７℃で４８時間培養し、２４時間（Ｈ）及び４８時間（Ｈ）の培養後に形成さ
れたコロニーを肉眼で検査した。色も記録した。結果を以下の表１に示す。

【００５１】 １： − ＝着色なし ２： 褐色＝コロニーの色 ３： ＮＴ＝試験せず この実施例に用いた培地では、それぞれL-Pro-BIA、Pyr-BIA及びAla-Phe-Pro-
BIAを用いてＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性、ピログルタミル−アミノ ペプチダーゼ活性及びアラニン−フェニルアラニン−プロリン−ペプチダーゼ活
性をかくして発現させ得る。菌種Ｅ，ファエシウムの細菌（Ala-Phe-Pro-BIAで 無色のコロニー）は、研究したストレプトコカス属の細菌（Ala-Phe-Pro-BIAで 褐色の着色）とは特に区別し得る。菌種鵞口瘡カンジダ（C. albicans）の酵母 菌株（L-Pro-BIAで褐色のコロニー）もまた菌種Ｃ．トロピカリス（tropicalis ）の酵母菌株とも区別し得る。

【００５２】 同一の結果が、寒天なしの同様な液体培地で得られた。

【００５３】実施例４ L-Pro-BIA又はPyr-BIAを単独であるいは５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルコシド（X-Glu）、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ− グルコシド（Z-Glu）又は４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド （MUG1）と組合せて実施例３の培地に配合した。ペトリ皿に分散させたこれらの
種々の培地に微生物を接種した。ペトリ皿を４８時間３７℃で培養し、形成した
コロニーを周囲の光線中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）下に肉眼で検査
した。２４時間及び４８時間培養後に得られたコロニーの色を表２に示す。

【００５４】 Ｎ^*：培地Ｎｏ． Ｔ^**：培養時間 −：着色なし ＮＴ：試験せず ２４時間培養後に培地２、３及び４については、大腸菌（E.coli）（着色なし
）及び緑膿菌（P. aeruginosa）（褐色の着色）を他のグラム陰性菌から区別す ることができる。これらの培地については鵞口瘡カンジダ（C.albicans）をＣ．
トロピカリスから区別することもでき、２つの菌種は異なった色のコロニーを生
ずるからである。培地６、７及び８によって、Ｓ．アガラクチエ（agalactiae）
と菌種Ｅ．ファエシウム（faecium）及び化膿連鎖球菌（S. pyogenes）との間で
区別をすることができ、Ｓ．アガラクチエの菌株は無色のコロニーを与えるもの
であり、他の２つの菌株は着色したコロニーを与えるからである。２４時間の培
養後に、細菌Ｅ．ファエシウム（faecium）を研究した他の細菌から、それらの 特有の色（培地に因り変化し得る）に因り区別することもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トレーサー試薬として次式（Ｉ）： Ｘ−ＮＨ−Ｒ （Ｉ） 〔式中Ｘは随意に置換されたインドール−３−イル基を表わし、Ｒはアミノ酸の
   アシル残基又はペプチドのアシル残基を表わし、Ｒに存在する１個以上のアミン
   基は場合によっては保護された形であっても良い〕を有する少なくとも１種の化
   合物の使用であって、該トレーサー試薬は培地に添加されるものでありしかも該
   培地における着色又は蛍光の形成により微生物培養でペプチダーゼ活性を発現し
   得るかあるいは該培地でペプチダーゼ活性を発現する微生物又は微生物群の存在
   を発現し得るものであり、但し前記式（Ｉ）の化合物（但しＸは５−ブロモイン
   ドール−３−イル基を表わし、Ｒはロイシル残基又はアラニル残基を表わす）の
   使用を除外した、式（Ｉ）の化合物の使用。
2. 【請求項２】 Ｒはアミノ酸のアシル残基を表わすか又は１０個以下のアミ
   ノ酸残基を含有するペプチドのアシル残基を表わす請求の範囲第１項記載の使用
   。
3. 【請求項３】 前記のペプチドは５個以下のアミノ酸残基を含有し、特に３
   個以下のアミノ酸残基を含有する請求の範囲第２項記載の使用。
4. 【請求項４】 ＲはペプチドＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−のアシル残基を表わ
   す請求の範囲第２項又は第３項記載の使用。
5. 【請求項５】 前記ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基はロイシン、アラニン
   、プロリン又はアルギニン残基である請求の範囲第２項〜第４項の何れかに記載
   の使用。
6. 【請求項６】 Ｒはアラニル、プロリル、ロイシル、ピログルタミル又はア
   ルギニル残基を表わす請求の範囲第１項又は第２項記載の使用。
7. 【請求項７】 Ｘはインドール基の１位、４位、５位、６位又は７位の少な
   くとも１個所で置換されたインドール−３−イル基を表わす請求の範囲第１項〜
   第６項の何れかに記載の使用。
8. 【請求項８】 Ｘは５−ブロモインドール−３−イル基を表わす請求の範囲
   第１項〜第７項の何れかに記載の使用。
9. 【請求項９】 前記の培地はゲル化した培地である請求の範囲第１項〜第８
   項の何れかに記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記の培地は液体培地である請求の範囲第１項〜第７項の
    何れかに記載の使用。
11. 【請求項１１】 着色生成物又は蛍光生成物の形成により酵素活性を検出す
    るため少なくとも１種の別のトレーサー試薬も培地に添加する請求の範囲第１項
    〜第１０項の何れかに記載の使用。
12. 【請求項１２】 前記の別のトレーサー試薬は、式（Ｉ）のトレーサー試薬
    を用いて発現される酵素活性とは異なる酵素活性を検出することができる請求の
    範囲第１１項記載の使用。
13. 【請求項１３】 次の工程：即ち 微生物培地に次式（Ｉ）： Ｘ−ＮＨ−Ｒ （Ｉ） 〔式中Ｘは随意に置換されたインドール−３−イル基を表わし、Ｒはアミノ酸の
    アシル残基又はペプチドのアシル残基を表わし、Ｒに存在する１個以上のアミン
    基は場合によっては保護された形であっても良い〕の少なくとも１種の化合物〔
    但しＸが５−ブロモインドール−３−イル基を表わし、Ｒがロイシル又はアラニ
    ル残基を表わす式（Ｉ）の化合物を除外する〕を添加する工程と、 微生物培地中に着色生成物又は蛍光生成物が形成されるかもしれないのを探求
    する工程とからなり、着色生成物又は蛍光生成物の形成の有無はそれぞれペプチ
    ダーゼ活性が存在するか又は不在であると結論できると了解される、微生物培地
    におけるペプチダーゼ活性を発現させる方法。
14. 【請求項１４】 微生物群を含有するか又は含有することができる試料中の
    或る微生物又は微生物群を検出する方法において、次の工程、即ち 前記の試料を含有する培地に次式（Ｉ）： Ｘ−ＮＨ−Ｒ （Ｉ） （式中Ｘは随意に置換されたインドール−３−イル基を表わし、Ｒはアミノ酸の
    アシル残基又はペプチドのアシル残基を表わし、Ｒに存在する１個以上のアミン
    基は場合によっては保護した形であっても良い）の少なくとも１種の化合物〔但
    しＸが５−ブロモインドール−３−イル基を表わし、Ｒがロイシル又はアラニル
    残基を表わす式（Ｉ）の化合物を除外する〕を添加する工程と、 前記の培地中に着色生成物又は蛍光生成物が形成されるかもしれないのを探求
    する工程と 適当な場合には、探求する微生物又は微生物群の真正試料で得られた着色又は
    蛍光に対して、実際に得られた着色又は蛍光を対比する工程とからなる、微生物
    又は微生物群の検出方法。
15. 【請求項１５】 前記式（１）の化合物は請求の範囲第２項〜第８項の何れ
    かに定義した如くである請求の範囲第１３項又は第１４項記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記式（Ｉ）の化合物は、前記の微生物又は試料中に存在
    することができる微生物群の培養工程の開始前に又は培養工程の開始時に培地に
    添加する請求の範囲第１３項、第１４項又は第１５項記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記の培地はゲル化した培地であり、式（Ｉ）の化合物は
    培地のゲル化前に培地の製造中に導入する請求の範囲第１６項記載の方法。