JP3717945B2 - 微生物の酵素活性を表示する方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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-
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Description
【０００１】
【本発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の酵素活性を表示するための方法に関する。そのような方法は、この酵素活性を示すことができ又は示すことができないところの微生物の識別のために使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の検出及び識別は、とりわけ医薬において、農業食品工業において、（例えば、水を規制する等のための）環境規制のために、非常に重要である。微生物は、汚染指標としてのそれらの病原性のために所望されることができ、またはあるいは、製造プロセスを制御するために所望されることができる。
【０００３】
微生物を検出しかつ識別するための技術は今日、固有のヌクレオチド配列のサーチ、選択培地又は非選択培地において培養する抗原又は抗体のサーチ、またはあるいは、代謝及びとりわけ酵素活性（例えば、オシダーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ等の活性）のサーチに基く。
【０００４】
通常、微生物を検出及び識別するための方法は、これらの技術のいくつかを併有する。従って、培養は、所望の微生物を増殖及び選択するために使用される。これらの検出を単純化するために、培地に、直接的に着色又は蛍光を生ずるところの分子を導入することにより生化学的活性を表示することが提案された。そのような培地は、検出培地と言われる。生化学的活性は、種々の方法、例えば、
-培地の物理化学的な変更、即ち着色指示薬又は蛍光指示薬（メチルウンベリフェロン）を使用して示されるｐＨの変化、
-着色指示薬（テトラゾリウム塩）又は蛍光指示薬を使用して示される酸化還元電位の変化、
-着色をもたらす、培地中に存在する化合物と微生物により生産される分子の反応、
-着色化合物又は蛍光化合物（ナフトール、クマリン）を放出する、分子の加水分解により表示され得る。
【０００５】
検出される加水分解は通常、天然又は合成酵素基質上の微生物により生産される酵素の作用の結果である。これらの酵素活性は例えば、次の酵素、即ち、エステラーゼ（例えば、リパーゼ、ホスファターゼ）、オシダーゼ（β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、Ｎ-アセチル-ヘキソサミニダーゼ）、ペプチダーゼ（アラニン-アミノペプチダーゼ、トリプシナーゼ、ゲラチナーゼ）、ＤＮＡゼ、デカルボキシラーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ、トリプトファナーゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素活性である。
【０００６】
ゲル化された培地はとりわけ、サンプルから微生物を培養及び単離するために適しており、並びに微生物の混合物において「ターゲット」微生物を検出するために適していることは公知である。これらの培地において、微生物は裸眼で検出され得るコロニーを形成し、かつ研究される生化学的活性の生成物がそれらの生成サイトにとどめられたままであることが大いに所望される。もし、一つのコロニーに隣接するコロニーが同一の活性を示さないなら、このことは効果的に、その隣接するコロニーから一つのコロニーを区別することを可能にする。従って、種々の検出方法、例えば、ｐＨの変化（フランス国特許第２，６７１，１００号公報）、エステラーゼ活性（フランス国特許第２，４５７，３２３号公報）、オシダーゼ活性（フランス国特許第２，６８４，１１０号公報）等が使用され得る。もちろん、いくつかの種又は株菌を表示するため、及び／又は検出の感度及び／又は特異性を増大するためにこれらの方法のいくつかを結合して使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
微生物のＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ、Ｄ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼの活性を表示するための、ゲル化された培地のために敵するところの利用し得る方法は現在ない。この理由は、今日まで使用された酵素基質は、ゲル化された培地中に拡散し、及び／又は（ナフチルアミン又はアミノクマリンの場合に）ＵＶ照射によってのみ示され、及び／又は（ナフチルアミンの場合に）試薬の作用後にのみ示されるところの着色分子又は蛍光分子を放出すること、あるいは着色分子又は蛍光分子の着色が（ニトロアニリンの場合に）微生物学において使用される反応培地中で比較的弱いコントラストを示すことである。
【０００８】
加水分解の後に着色化合物を生成するところの、略語Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡとして公知の酵素基質、Ｌ-ロイシン-３-（５-ブロモインドールアミン）により、Ｌ-ロイシン-アミノペプチダーゼが哺乳動物の組織学の分野において表示されたことは公知である。Pearsonらの1963年,Lab.Invest.，第12号:第712頁を参照せよ。1967年、YarboroughらのJ.Reticuloendoth.Soc.,第4号:第390頁に、Pearsonらの技術が類似の適用（組織構造の薄片）において繰り返された。彼らは、フェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウム又は硫酸銅の混合物を添加することが反応を抑制することを指摘した。
【０００９】
1975年、Lojda及びHavrankovaのHistochemistry，第43号:第355頁において、テトラゾリウム塩及びフェナジンメトサルフェートの混合物を添加することにより基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡを使用する方法を改善することが提案された。この場合に、観察された着色反応は、ホルマザンへのテトラゾリウム塩の還元から誘導される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明をもたらすところの研究中に、とりわけゲル化された培地上で培養された微生物の検出において酵素基質としてＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡを使用することが可能であるかどうかに関して研究が実行された。予備テストの間に、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが、下記の実施例１において述べられた培地に加えられた。この培地は通常、オシダーゼのためのサーチに使用される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この培地において培養された微生物（Escherichia coli，Klebsiella,Citrobacter，Pseudomonas，Enterococcus，Staphylococcus，Streptococcus）にかかわりなくペプチダーゼ活性を表示することはできなかった。
【００１２】
他方、もし、Ｌ-ロイシン-７-アミノ-４-メチルクマリン（Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ）がこの同一の培地に加えられるなら、蛍光がこれらの微生物のいくつかにより検出される。同様に、この培地において、オシダーゼ基質（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトシド及び６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド）により、微生物のβ-ガラクトシダーゼ及びβ-グルクロニダーゼ活性が検出され得る。Lojda及びHavrankovaにより提案された試薬の添加は、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによるペプチダーゼ活性の発露を許すことなしに、微生物の成長のほぼ完全な抑制により思案された。
【００１３】
同様に、下記の実施例２において使用された培地を用いて、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによりペプチダーゼ活性を表示することができなかったのに対して、基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣは、同じ培地においてこの活性が検出されることを可能にする。
【００１４】
ＢＩＡ誘導体による結果がないことは、微生物との不適合性又は培養の間の微生物の増殖の抑制の故ではなく、本質的には培地の条件の故であったことが今発見された。実際、他の培地を使用してＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡにより微生物のペプチダーゼ活性を示すことが可能であることが発見された。ある培地が使用されることができ、そして他の培地が使用されることができない理由は知られていない。それにもかかわらず、適切又は不適切なところの培地及び／又は成分を、下記の実験の項目で述べられる実験に類似する簡単なルーチンの実験により決定しかつ発展させることができる。従って、本発明は第一に、とりわけ、上記の５-ブロモインドールアミン誘導ペプチターゼ基質が、微生物の培養株において対応する酵素活性を表示するために使用され得るところの培地を探すこと、及び見出すことが可能であることを示すことから成っていた。
【００１５】
従って、とりわけ、次の培地
-酵母エキス ０．５〜２５ｇ／リットル
-ゼラチンペプチド ０．５〜２５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ０〜５０ ｇ／リットル
、及び任意的に
-ｐＨ調節剤 ｐＨ＝３〜９に十分な量
、及び／又は
-ゲル化剤 ５〜３５ ｇ／リットル
が使用されることができることが発見された。
【００１６】
選ばれるｐＨは、研究される微生物のために適しているところのｐＨである。ゲル化された培地の場合に、ｐＨは好ましくは５〜９である。ｐＨは、例えば、塩酸又は炭酸ナトリウムを使用して調節され得る。
【００１７】
もし、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡがそのような培地に加えられ、かつ培養後に微生物による接種が実行されるなら、褐色又は無色のコロニーは、微生物がＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を示すか又は示さないかどうかに依存して得られる。
【００１８】
類似する結果が、基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ及びＤ-Ａｌａ-ＢＩＡにより得られた。
【００１９】
従って、本発明の対象は、０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む培地中の微生物の培養株におけるペプチダーゼ活性を、着色生成物の形成により表示することを可能にするところのトレーサとして、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘは、５-ブロモインドール-３-イル基を示し、そしてＲは、ロイシン及びアラニンから選ばれるアミノ酸のアシル残基を示す）
の化合物の少なくとも一つを使用する方法である。
【００２０】
とりわけ、基Ｒは、Ｌ-Ｌｅｕ、Ｌ-Ａｌａ又はＤ-Ａｌａのアシル残基を表す。
【００２１】
その使用が本出願の対象を形成するところの基体は、適切な培地において微生物の増殖を抑制しない。従って、トレーサーは、培養の開始前、又は培養の開始時に微生物の培地にそれを加えることにより使用され得る。
【００２２】
本発明に従って使用されるトレーサの重要な利点の一つは、調査されるペプチダーゼ活性の存在下に、これらが、ゲル化された培地中に拡散しないところの着色生成物を与えることである。
【００２３】
従って、これらはゲル化された培地において使用され得る。もちろん、これらはまた、液状の培地において使用され得る。
【００２４】
特定の実施態様によれば、着色生成物又は蛍光生成物の形成により、上記において定義された式Ｘ-ＮＨ-Ｒの化合物を使用して表示される酵素活性と通常異なるところの酵素活性を表示することを可能にするところの少なくとも一つの他のトレーサーがまた、培地に加えられ得る。例えば、これらは、エステラーゼ、オシダーゼ又はペプチダーゼ活性であり得る。従って、更なる情報は、着色（又は蛍光）の不存在に関連して、あるいはただ一つの酵素基質により得られる着色に関係して変更されるところの着色に関連して得られ得る。選ばれたトレーサーは、ＢＩＡ誘導体の性質とは異なる性質を有するであろう。例えば、ＢＩＡ誘導体により得られる褐色と異なる色を持つ反応生成物を与えることができる他のトレーサーが選ばれるであろう。従って、他のトレーサー（又は第二のトレーサー）は、その固有の色により又はその蛍光により、それが固有であるところの酵素活性の存在を示すことを可能にするであろう。もし、ＢＩＡ誘導体により示され得るところのペプチダーゼ活性がまた存在するなら、該褐色と異なり、かつまた第二のトレーサーにより与えられる該固有の色と異なる変更された着色が得られるであろう。いくつかの基質の使用の例並びにそこから誘導され得るところの情報は、実験の項目で下記において与えられる。言うまでもなく、結果は、研究される微生物の各々の種又は菌株により変化し得る。
【００２５】
従って、興味あるべき各々の場合は、ルーチンの実験に従う先の研究を経なければならない。
【００２６】
種々の酵素活性を表示するために使用され、かつ他のトレーサーとして使用され得るところの誘導体は、とりわけ、インドキシル、クマリン、レゾルフィン、ナフトール、ナフチルアミン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ローダミン、ヒドロキシキノリン、フルオレセイン等の誘導体である。
【００２７】
ＢＩＡ誘導体と組み合わされて使用され得るところのこれらの誘導体のうち、とりわけ、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド、Ｌ-アラニン-７-アミノ-４-メチルクマリン、４-メチルウンベリフェリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-ガラクトサミニド、レゾルフィン-β-Ｄ-ガラクトシド、β-ナフチルサルフェート、ＡＳ-ＢＩ β-Ｄ-ガラクトシドナフトール、Ｌ-アラニンβ-ナフチルアミド、ｏ-ニトロフェノール-β-Ｄ-ガラクトシド、カルボキシベンゾイル-Ｌ-アルギニン-ｐ-ニトロアニリド、ローダミン-１１０-ビス（Ｌ-ロイシンアミド）、ヒドロキシキノリン-β-Ｄ-グルコシド及びフルオレセインジアセテートが挙げられ得る。
【００２８】
本発明の対象はまた、着色生成物の形成によりペプチダーゼ活性を表示することを可能にするところのトレーサーが微生物の培地に加えられるところの、微生物培養株におけるペプチダーゼ活性を表示するための方法であり、該トレーサーが、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘ及びＲは上記同じに定義される）の化合物の少なくとも一つを含み、及び該培地が０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含むことを特徴とする。
化合物Ｘ-ＮＨ-Ｒは、培養の開始前若しくは培養中、又は培養の終りにさえ加えられ得る。従って、本発明の方法の使用は研究される微生物を培養することを含み、ここで、この培養は化合物Ｘ-ＮＨ-Ｒの添加前又は添加後に実行されることができ、かつこの添加がまた培養の間に実行されることができることが理解される。言うまでもなく、実際の培養は、研究される微生物を増殖することを可能にするところの条件下で適切な培地の培養により実行される。適切な培地の組成及び培養条件は公知であり、又はルーチンの実験により決定され得る。
【００２９】
本発明の対象はまた、式Ｘ-ＮＨ-Ｒの化合物の少なくとも一つ、及び０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む微生物のための培地である。
【００３０】
式Ｘ-ＮＨ-Ｒの誘導体は、観察され得る着色反応を与えるために十分なところの濃度で使用される。ルーチンの実験により決定され得るところのこられの濃度は、培地の１リットル当り２５〜２０００ｍｇで通常変えられ得る。
【００３１】
本発明の特徴及び利点は、続く実施例により説明される。
【００３２】
実施例
【実施例１】
培地は、水のほかに、
-肉ペプトン* １５ｇ／リットル
-カゼインペプトン** ３ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ５ｇ／リットル
-トリス緩衝剤 ０．５ｇ／リットル
-Ｎａ2ＨＰＯ4 １ｇ／リットル
-クエン酸ナトリウム １ｇ／リットル
-グルコース １ｇ／リットル
-ピルビン酸ナトリウム ２ｇ／リットル
-寒天 １３ｇ／リットル
＊D.I.F.C.O.により販売されたもの
**D.I.F.C.O.により販売されたもの
を含む。
【００３３】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣが、２００ｍｇ／リットルの濃度においてこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温された。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。研究された微生物は、Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，Citrobacter freundii，Pseudomonas aeruginosa，Streptococcus agalactiae，Enterococcus faecium，Streptococcus pyogenes，Staphylococcus epidermidis及びCandida albicansであった。結果は、下記の表Iに示されている。
【００３４】
【表１】
【００３５】
この実施例において使用された培地は、試薬Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ及びＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ夫々によりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチ ダーゼ活性を表示することを可能にするが、Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ及びＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが使用される時、加水分解は検出されない。
【００３６】
【実施例２】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣが、４００ｍｇ／リットルの濃度まで、２５℃において０．１ＭのｐＨ７．３のホスフェート緩衝液に加えられた。得られた培地は、ミクロ滴定板のくぼみに分配され、そして微生物の懸濁物により接種された。該板は、３７℃において２４時間保温された。該くぼみは、上記と同様に、環境光中及びＵＶランプの下に視覚的に試験された。２４時間及び４８時間の保温の後に、蛍光の存在の色が示された。結果は下記の表IIに示されている。
【００３７】
【表２】
【００３８】
このように、この実施例において使用された培地と共に、Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣによりＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を表示することが可能であるが、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが使用される時、加水分解は検出されない。
【００３９】
【実施例３】
培地は、水のほかに、
-酵母エキス* ６ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-Ｎａ2ＣＯ3 ０．１ｇ／リットル
-寒天 １３ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio Merieuxより販売されたBio-gelytone
【００４０】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣは、２００ｍｇ／リットルの濃度までこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、実施例１において使用されたと同一の微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温される。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。結果は、下記の表IIIに示されている。
【００４１】
【表３】
【００４２】
この実施例において使用された培地は、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ及びＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ夫々により、並びにＬ-Ａｌａ-ＢＩＡ及びＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を表示することを可能にする。しかし、これらの後の二つの基質は、時折、遅れて反応を与える。他方、これらは、グラム陽性のバクテリアからグラム陰性のバクテリアを区別することを可能にする。実際、-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡによる２４時間の保温の後に、グラム陽性のバクテリアは着色を与えないが、その一方、グラム陰性のバクテリアは褐色の着色を与え、かつ-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによる４８時間の保温の後に、グラム陽性のバクテリアは着色を与えないが、その一方、グラム陰性のバクテリアは褐色の着色を与える。
【００４３】
【実施例４】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＢＩＡが、実施例３の培地に、単独で、又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｘ-Ｇｌｕ）、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｚ-Ｇｌｕ）、４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルコシド（ＭＵＧＩ）又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）と共に加えられた。
【００４４】
これらの種々の基質の濃度は下記の通りである。即ち、
-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｘ-Ｇｌｕ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｚ-Ｇｌｕ： ２００ｍｇ／リットル
-ＭＵＧＩ： ２００ｍｇ／リットル
【００４５】
ペトリ皿に分配されたこれらの種々の培地は、微生物により接種される。研究される株菌は、上記の実施例におけるものと同一である。該皿は３７℃において４８時間保温され、そして形成されたコロニーは、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。２４時間及び４８時間の保温の後に得られたコロニーの色の観察の結果は、表IV中に示されている。
【００４６】
【表４】
【００４７】
培地２、３及び４において、２４時間の保温後に、ただ一つのみが褐色又は灰色以外の着色を与えるところのEnterococcusバクテリア（E．faecium）を区別することができる。培地２、３及び４はまた、２４時間の培養後に、着色がないか又は褐色若しくは灰色以外の着色のいずれかを示すところのグラム陽性のバクテリアを区別することを可能にする。培地７、８及び９は、４８時間の保温後を除いて、同様な区別を可能にする。４８時間の保温後に培地５において、ただS．epidermidisのみが青緑色に着色したコロニーを与え、他のバクテリアは褐色から青-灰色のコロニーを与える。
【００４８】
下記の基質が反応培地中に単独で存在する時、オシダーゼの存在及び５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｘ-Ｇｌｕ）の加水分解の結果は青緑-青色の出現をもたらし、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｚ-Ｇｌｕ）の加水分解は紫-桃色の出現をもたらすことが示されなければならない。４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルコシド（ＭＵＧＩ）の加水分解は、ＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に青色の蛍光の出現をもたらし、そしてエステラーゼの存在下に、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）の加水分解の結果は、青緑-青色の出現をもたらす。
【００４９】
【実施例５】
培地は、水のほかに、
-酵母エキス* ６ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-Ｎａ2ＣＯ3 ０．１ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio Merieuxより販売されたBio-gelytone
【００５０】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＢＩＡが、単独若しくは一緒に、又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）と共にこの培地に加えられる。
【００５１】
これらの種々の基質の濃度は下記の通りである。即ち、
-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ： ３００ｍｇ／リットル
-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ： ３００ｍｇ／リットル
-Ｘ-Ａｃ： ２００ｍｇ／リットル
である。
【００５２】
得られた培地は、上記のようにして、ミクロ滴定板中に分配され、そして微生物の懸濁物により接種された。該板は３７℃において２４時間保温された。２４時間及び４８時間の保温の後に得られたくぼみの色は表Vに示されている。
【００５３】
【表５】
【００５４】
培地３及び４により、他のバクテリアからS．epidermidisを区別することができることが分かる。培地１より、４８時間の保温後に、グラム陽性の細胞（S．pyogenesのためを除く）からグラム陰性のバクテリアを区別することができる。培地２は、２４時間の保温後にグラム陽性及びグラム陰性のバクテリアの区別を可能にする。
【００５５】
【実施例６】
培地は、水にほかに、
-牛肉エキス* ３ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-寒天 １５ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio-gelytone（Bio Merieux）
【００５６】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＡＭＣは、夫々３００ｍｇ／リットル及び２００ｍｇ／リットルの濃度までこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温される。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、上記のように環境光中で及びＵＶランプの下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。結果は下記の表VIに示されている。
【００５７】
【表６】
【００５８】
従って、この実施例において使用された培地と共に、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ並びにＬ-Ａｌａ-ＢＩＡによりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ活性を表示することを可能にする。
【本発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の酵素活性を表示するための方法に関する。そのような方法は、この酵素活性を示すことができ又は示すことができないところの微生物の識別のために使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の検出及び識別は、とりわけ医薬において、農業食品工業において、（例えば、水を規制する等のための）環境規制のために、非常に重要である。微生物は、汚染指標としてのそれらの病原性のために所望されることができ、またはあるいは、製造プロセスを制御するために所望されることができる。
【０００３】
微生物を検出しかつ識別するための技術は今日、固有のヌクレオチド配列のサーチ、選択培地又は非選択培地において培養する抗原又は抗体のサーチ、またはあるいは、代謝及びとりわけ酵素活性（例えば、オシダーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ等の活性）のサーチに基く。
【０００４】
通常、微生物を検出及び識別するための方法は、これらの技術のいくつかを併有する。従って、培養は、所望の微生物を増殖及び選択するために使用される。これらの検出を単純化するために、培地に、直接的に着色又は蛍光を生ずるところの分子を導入することにより生化学的活性を表示することが提案された。そのような培地は、検出培地と言われる。生化学的活性は、種々の方法、例えば、
-培地の物理化学的な変更、即ち着色指示薬又は蛍光指示薬（メチルウンベリフェロン）を使用して示されるｐＨの変化、
-着色指示薬（テトラゾリウム塩）又は蛍光指示薬を使用して示される酸化還元電位の変化、
-着色をもたらす、培地中に存在する化合物と微生物により生産される分子の反応、
-着色化合物又は蛍光化合物（ナフトール、クマリン）を放出する、分子の加水分解により表示され得る。
【０００５】
検出される加水分解は通常、天然又は合成酵素基質上の微生物により生産される酵素の作用の結果である。これらの酵素活性は例えば、次の酵素、即ち、エステラーゼ（例えば、リパーゼ、ホスファターゼ）、オシダーゼ（β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、Ｎ-アセチル-ヘキソサミニダーゼ）、ペプチダーゼ（アラニン-アミノペプチダーゼ、トリプシナーゼ、ゲラチナーゼ）、ＤＮＡゼ、デカルボキシラーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ、トリプトファナーゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素活性である。
【０００６】
ゲル化された培地はとりわけ、サンプルから微生物を培養及び単離するために適しており、並びに微生物の混合物において「ターゲット」微生物を検出するために適していることは公知である。これらの培地において、微生物は裸眼で検出され得るコロニーを形成し、かつ研究される生化学的活性の生成物がそれらの生成サイトにとどめられたままであることが大いに所望される。もし、一つのコロニーに隣接するコロニーが同一の活性を示さないなら、このことは効果的に、その隣接するコロニーから一つのコロニーを区別することを可能にする。従って、種々の検出方法、例えば、ｐＨの変化（フランス国特許第２，６７１，１００号公報）、エステラーゼ活性（フランス国特許第２，４５７，３２３号公報）、オシダーゼ活性（フランス国特許第２，６８４，１１０号公報）等が使用され得る。もちろん、いくつかの種又は株菌を表示するため、及び／又は検出の感度及び／又は特異性を増大するためにこれらの方法のいくつかを結合して使用することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
微生物のＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ、Ｄ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼの活性を表示するための、ゲル化された培地のために敵するところの利用し得る方法は現在ない。この理由は、今日まで使用された酵素基質は、ゲル化された培地中に拡散し、及び／又は（ナフチルアミン又はアミノクマリンの場合に）ＵＶ照射によってのみ示され、及び／又は（ナフチルアミンの場合に）試薬の作用後にのみ示されるところの着色分子又は蛍光分子を放出すること、あるいは着色分子又は蛍光分子の着色が（ニトロアニリンの場合に）微生物学において使用される反応培地中で比較的弱いコントラストを示すことである。
【０００８】
加水分解の後に着色化合物を生成するところの、略語Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡとして公知の酵素基質、Ｌ-ロイシン-３-（５-ブロモインドールアミン）により、Ｌ-ロイシン-アミノペプチダーゼが哺乳動物の組織学の分野において表示されたことは公知である。Pearsonらの1963年,Lab.Invest.，第12号:第712頁を参照せよ。1967年、YarboroughらのJ.Reticuloendoth.Soc.,第4号:第390頁に、Pearsonらの技術が類似の適用（組織構造の薄片）において繰り返された。彼らは、フェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウム又は硫酸銅の混合物を添加することが反応を抑制することを指摘した。
【０００９】
1975年、Lojda及びHavrankovaのHistochemistry，第43号:第355頁において、テトラゾリウム塩及びフェナジンメトサルフェートの混合物を添加することにより基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡを使用する方法を改善することが提案された。この場合に、観察された着色反応は、ホルマザンへのテトラゾリウム塩の還元から誘導される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明をもたらすところの研究中に、とりわけゲル化された培地上で培養された微生物の検出において酵素基質としてＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡを使用することが可能であるかどうかに関して研究が実行された。予備テストの間に、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが、下記の実施例１において述べられた培地に加えられた。この培地は通常、オシダーゼのためのサーチに使用される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この培地において培養された微生物（Escherichia coli，Klebsiella,Citrobacter，Pseudomonas，Enterococcus，Staphylococcus，Streptococcus）にかかわりなくペプチダーゼ活性を表示することはできなかった。
【００１２】
他方、もし、Ｌ-ロイシン-７-アミノ-４-メチルクマリン（Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ）がこの同一の培地に加えられるなら、蛍光がこれらの微生物のいくつかにより検出される。同様に、この培地において、オシダーゼ基質（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトシド及び６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド）により、微生物のβ-ガラクトシダーゼ及びβ-グルクロニダーゼ活性が検出され得る。Lojda及びHavrankovaにより提案された試薬の添加は、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによるペプチダーゼ活性の発露を許すことなしに、微生物の成長のほぼ完全な抑制により思案された。
【００１３】
同様に、下記の実施例２において使用された培地を用いて、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによりペプチダーゼ活性を表示することができなかったのに対して、基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣは、同じ培地においてこの活性が検出されることを可能にする。
【００１４】
ＢＩＡ誘導体による結果がないことは、微生物との不適合性又は培養の間の微生物の増殖の抑制の故ではなく、本質的には培地の条件の故であったことが今発見された。実際、他の培地を使用してＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡにより微生物のペプチダーゼ活性を示すことが可能であることが発見された。ある培地が使用されることができ、そして他の培地が使用されることができない理由は知られていない。それにもかかわらず、適切又は不適切なところの培地及び／又は成分を、下記の実験の項目で述べられる実験に類似する簡単なルーチンの実験により決定しかつ発展させることができる。従って、本発明は第一に、とりわけ、上記の５-ブロモインドールアミン誘導ペプチターゼ基質が、微生物の培養株において対応する酵素活性を表示するために使用され得るところの培地を探すこと、及び見出すことが可能であることを示すことから成っていた。
【００１５】
従って、とりわけ、次の培地
-酵母エキス ０．５〜２５ｇ／リットル
-ゼラチンペプチド ０．５〜２５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ０〜５０ ｇ／リットル
、及び任意的に
-ｐＨ調節剤 ｐＨ＝３〜９に十分な量
、及び／又は
-ゲル化剤 ５〜３５ ｇ／リットル
が使用されることができることが発見された。
【００１６】
選ばれるｐＨは、研究される微生物のために適しているところのｐＨである。ゲル化された培地の場合に、ｐＨは好ましくは５〜９である。ｐＨは、例えば、塩酸又は炭酸ナトリウムを使用して調節され得る。
【００１７】
もし、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡがそのような培地に加えられ、かつ培養後に微生物による接種が実行されるなら、褐色又は無色のコロニーは、微生物がＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を示すか又は示さないかどうかに依存して得られる。
【００１８】
類似する結果が、基質Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ及びＤ-Ａｌａ-ＢＩＡにより得られた。
【００１９】
従って、本発明の対象は、０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む培地中の微生物の培養株におけるペプチダーゼ活性を、着色生成物の形成により表示することを可能にするところのトレーサとして、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘは、５-ブロモインドール-３-イル基を示し、そしてＲは、ロイシン及びアラニンから選ばれるアミノ酸のアシル残基を示す）
の化合物の少なくとも一つを使用する方法である。
【００２０】
とりわけ、基Ｒは、Ｌ-Ｌｅｕ、Ｌ-Ａｌａ又はＤ-Ａｌａのアシル残基を表す。
【００２１】
その使用が本出願の対象を形成するところの基体は、適切な培地において微生物の増殖を抑制しない。従って、トレーサーは、培養の開始前、又は培養の開始時に微生物の培地にそれを加えることにより使用され得る。
【００２２】
本発明に従って使用されるトレーサの重要な利点の一つは、調査されるペプチダーゼ活性の存在下に、これらが、ゲル化された培地中に拡散しないところの着色生成物を与えることである。
【００２３】
従って、これらはゲル化された培地において使用され得る。もちろん、これらはまた、液状の培地において使用され得る。
【００２４】
特定の実施態様によれば、着色生成物又は蛍光生成物の形成により、上記において定義された式Ｘ-ＮＨ-Ｒの化合物を使用して表示される酵素活性と通常異なるところの酵素活性を表示することを可能にするところの少なくとも一つの他のトレーサーがまた、培地に加えられ得る。例えば、これらは、エステラーゼ、オシダーゼ又はペプチダーゼ活性であり得る。従って、更なる情報は、着色（又は蛍光）の不存在に関連して、あるいはただ一つの酵素基質により得られる着色に関係して変更されるところの着色に関連して得られ得る。選ばれたトレーサーは、ＢＩＡ誘導体の性質とは異なる性質を有するであろう。例えば、ＢＩＡ誘導体により得られる褐色と異なる色を持つ反応生成物を与えることができる他のトレーサーが選ばれるであろう。従って、他のトレーサー（又は第二のトレーサー）は、その固有の色により又はその蛍光により、それが固有であるところの酵素活性の存在を示すことを可能にするであろう。もし、ＢＩＡ誘導体により示され得るところのペプチダーゼ活性がまた存在するなら、該褐色と異なり、かつまた第二のトレーサーにより与えられる該固有の色と異なる変更された着色が得られるであろう。いくつかの基質の使用の例並びにそこから誘導され得るところの情報は、実験の項目で下記において与えられる。言うまでもなく、結果は、研究される微生物の各々の種又は菌株により変化し得る。
【００２５】
従って、興味あるべき各々の場合は、ルーチンの実験に従う先の研究を経なければならない。
【００２６】
種々の酵素活性を表示するために使用され、かつ他のトレーサーとして使用され得るところの誘導体は、とりわけ、インドキシル、クマリン、レゾルフィン、ナフトール、ナフチルアミン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ローダミン、ヒドロキシキノリン、フルオレセイン等の誘導体である。
【００２７】
ＢＩＡ誘導体と組み合わされて使用され得るところのこれらの誘導体のうち、とりわけ、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド、Ｌ-アラニン-７-アミノ-４-メチルクマリン、４-メチルウンベリフェリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-ガラクトサミニド、レゾルフィン-β-Ｄ-ガラクトシド、β-ナフチルサルフェート、ＡＳ-ＢＩ β-Ｄ-ガラクトシドナフトール、Ｌ-アラニンβ-ナフチルアミド、ｏ-ニトロフェノール-β-Ｄ-ガラクトシド、カルボキシベンゾイル-Ｌ-アルギニン-ｐ-ニトロアニリド、ローダミン-１１０-ビス（Ｌ-ロイシンアミド）、ヒドロキシキノリン-β-Ｄ-グルコシド及びフルオレセインジアセテートが挙げられ得る。
【００２８】
本発明の対象はまた、着色生成物の形成によりペプチダーゼ活性を表示することを可能にするところのトレーサーが微生物の培地に加えられるところの、微生物培養株におけるペプチダーゼ活性を表示するための方法であり、該トレーサーが、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘ及びＲは上記同じに定義される）の化合物の少なくとも一つを含み、及び該培地が０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含むことを特徴とする。
化合物Ｘ-ＮＨ-Ｒは、培養の開始前若しくは培養中、又は培養の終りにさえ加えられ得る。従って、本発明の方法の使用は研究される微生物を培養することを含み、ここで、この培養は化合物Ｘ-ＮＨ-Ｒの添加前又は添加後に実行されることができ、かつこの添加がまた培養の間に実行されることができることが理解される。言うまでもなく、実際の培養は、研究される微生物を増殖することを可能にするところの条件下で適切な培地の培養により実行される。適切な培地の組成及び培養条件は公知であり、又はルーチンの実験により決定され得る。
【００２９】
本発明の対象はまた、式Ｘ-ＮＨ-Ｒの化合物の少なくとも一つ、及び０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む微生物のための培地である。
【００３０】
式Ｘ-ＮＨ-Ｒの誘導体は、観察され得る着色反応を与えるために十分なところの濃度で使用される。ルーチンの実験により決定され得るところのこられの濃度は、培地の１リットル当り２５〜２０００ｍｇで通常変えられ得る。
【００３１】
本発明の特徴及び利点は、続く実施例により説明される。
【００３２】
実施例
【実施例１】
培地は、水のほかに、
-肉ペプトン* １５ｇ／リットル
-カゼインペプトン** ３ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ５ｇ／リットル
-トリス緩衝剤 ０．５ｇ／リットル
-Ｎａ2ＨＰＯ4 １ｇ／リットル
-クエン酸ナトリウム １ｇ／リットル
-グルコース １ｇ／リットル
-ピルビン酸ナトリウム ２ｇ／リットル
-寒天 １３ｇ／リットル
＊D.I.F.C.O.により販売されたもの
**D.I.F.C.O.により販売されたもの
を含む。
【００３３】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣが、２００ｍｇ／リットルの濃度においてこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温された。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。研究された微生物は、Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，Citrobacter freundii，Pseudomonas aeruginosa，Streptococcus agalactiae，Enterococcus faecium，Streptococcus pyogenes，Staphylococcus epidermidis及びCandida albicansであった。結果は、下記の表Iに示されている。
【００３４】
【表１】
この実施例において使用された培地は、試薬Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ及びＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ夫々によりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチ ダーゼ活性を表示することを可能にするが、Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ及びＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが使用される時、加水分解は検出されない。
【００３６】
【実施例２】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣが、４００ｍｇ／リットルの濃度まで、２５℃において０．１ＭのｐＨ７．３のホスフェート緩衝液に加えられた。得られた培地は、ミクロ滴定板のくぼみに分配され、そして微生物の懸濁物により接種された。該板は、３７℃において２４時間保温された。該くぼみは、上記と同様に、環境光中及びＵＶランプの下に視覚的に試験された。２４時間及び４８時間の保温の後に、蛍光の存在の色が示された。結果は下記の表IIに示されている。
【００３７】
【表２】
このように、この実施例において使用された培地と共に、Ｌ-Ｌｅｕ-ＡＭＣによりＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を表示することが可能であるが、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡが使用される時、加水分解は検出されない。
【００３９】
【実施例３】
培地は、水のほかに、
-酵母エキス* ６ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-Ｎａ2ＣＯ3 ０．１ｇ／リットル
-寒天 １３ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio Merieuxより販売されたBio-gelytone
【００４０】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ、Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ又はＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣは、２００ｍｇ／リットルの濃度までこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、実施例１において使用されたと同一の微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温される。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。結果は、下記の表IIIに示されている。
【００４１】
【表３】
この実施例において使用された培地は、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ及びＬ-Ｌｅｕ-ＡＭＣ夫々により、並びにＬ-Ａｌａ-ＢＩＡ及びＬ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ及びＬ-ロイシン-アミノペプチダーゼ活性を表示することを可能にする。しかし、これらの後の二つの基質は、時折、遅れて反応を与える。他方、これらは、グラム陽性のバクテリアからグラム陰性のバクテリアを区別することを可能にする。実際、-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡによる２４時間の保温の後に、グラム陽性のバクテリアは着色を与えないが、その一方、グラム陰性のバクテリアは褐色の着色を与え、かつ-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡによる４８時間の保温の後に、グラム陽性のバクテリアは着色を与えないが、その一方、グラム陰性のバクテリアは褐色の着色を与える。
【００４３】
【実施例４】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＢＩＡが、実施例３の培地に、単独で、又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｘ-Ｇｌｕ）、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｚ-Ｇｌｕ）、４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルコシド（ＭＵＧＩ）又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）と共に加えられた。
【００４４】
これらの種々の基質の濃度は下記の通りである。即ち、
-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｘ-Ｇｌｕ： ２００ｍｇ／リットル
-Ｚ-Ｇｌｕ： ２００ｍｇ／リットル
-ＭＵＧＩ： ２００ｍｇ／リットル
【００４５】
ペトリ皿に分配されたこれらの種々の培地は、微生物により接種される。研究される株菌は、上記の実施例におけるものと同一である。該皿は３７℃において４８時間保温され、そして形成されたコロニーは、環境光中で及びＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に視覚的に試験された。２４時間及び４８時間の保温の後に得られたコロニーの色の観察の結果は、表IV中に示されている。
【００４６】
【表４】
培地２、３及び４において、２４時間の保温後に、ただ一つのみが褐色又は灰色以外の着色を与えるところのEnterococcusバクテリア（E．faecium）を区別することができる。培地２、３及び４はまた、２４時間の培養後に、着色がないか又は褐色若しくは灰色以外の着色のいずれかを示すところのグラム陽性のバクテリアを区別することを可能にする。培地７、８及び９は、４８時間の保温後を除いて、同様な区別を可能にする。４８時間の保温後に培地５において、ただS．epidermidisのみが青緑色に着色したコロニーを与え、他のバクテリアは褐色から青-灰色のコロニーを与える。
【００４８】
下記の基質が反応培地中に単独で存在する時、オシダーゼの存在及び５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｘ-Ｇｌｕ）の加水分解の結果は青緑-青色の出現をもたらし、６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルコシド（Ｚ-Ｇｌｕ）の加水分解は紫-桃色の出現をもたらすことが示されなければならない。４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルコシド（ＭＵＧＩ）の加水分解は、ＵＶランプ（波長＝３６５ｎｍ）の下に青色の蛍光の出現をもたらし、そしてエステラーゼの存在下に、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）の加水分解の結果は、青緑-青色の出現をもたらす。
【００４９】
【実施例５】
培地は、水のほかに、
-酵母エキス* ６ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-Ｎａ2ＣＯ3 ０．１ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio Merieuxより販売されたBio-gelytone
【００５０】
Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＢＩＡが、単独若しくは一緒に、又は５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-アセテート（Ｘ-Ａｃ）と共にこの培地に加えられる。
【００５１】
これらの種々の基質の濃度は下記の通りである。即ち、
-Ｌ-Ｌｅｕ-ＢＩＡ： ３００ｍｇ／リットル
-Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ： ３００ｍｇ／リットル
-Ｘ-Ａｃ： ２００ｍｇ／リットル
である。
【００５２】
得られた培地は、上記のようにして、ミクロ滴定板中に分配され、そして微生物の懸濁物により接種された。該板は３７℃において２４時間保温された。２４時間及び４８時間の保温の後に得られたくぼみの色は表Vに示されている。
【００５３】
【表５】
培地３及び４により、他のバクテリアからS．epidermidisを区別することができることが分かる。培地１より、４８時間の保温後に、グラム陽性の細胞（S．pyogenesのためを除く）からグラム陰性のバクテリアを区別することができる。培地２は、２４時間の保温後にグラム陽性及びグラム陰性のバクテリアの区別を可能にする。
【００５５】
【実施例６】
培地は、水にほかに、
-牛肉エキス* ３ｇ／リットル
-ゼラチンペプトン** ５ｇ／リットル
-ＮａＣｌ ８ｇ／リットル
-寒天 １５ｇ／リットル
＊Bio Merieuxより販売されたもの
**Bio-gelytone（Bio Merieux）
【００５６】
Ｌ-Ａｌａ-ＢＩＡ又はＬ-Ａｌａ-ＡＭＣは、夫々３００ｍｇ／リットル及び２００ｍｇ／リットルの濃度までこの培地に加えられる。ペトリ皿に分配された得られた種々の培地は、微生物により接種される。該皿は、３７℃において４８時間保温される。形成されたコロニーは、２４時間及び４８時間の保温の後に、上記のように環境光中で及びＵＶランプの下に視覚的に試験された。色又は蛍光の存在が示された。結果は下記の表VIに示されている。
【００５７】
【表６】
従って、この実施例において使用された培地と共に、Ｌ-Ａｌａ-ＡＭＣ並びにＬ-Ａｌａ-ＢＩＡによりＬ-アラニン-アミノペプチダーゼ活性を表示することを可能にする。
Claims (9)
- ０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む培地中の微生物の培養株におけるペプチダーゼ活性を、着色生成物の形成により表示することを可能にするところのトレーサーとして、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘは、５-ブロモインドール-３-イル基を示し、かつＲは、ロイシン及びアラニンから選ばれるアミノ酸のアシル残基を示す）
の化合物の少なくとも一つを使用する方法。 - Ｒが、Ｌ-Ｌｅｕ、Ｌ-Ａｌａ又はＤ-Ａｌａのアシル残基を示すところの請求項１記載の方法。
- 該培養株がゲル化された培地において調製されるところの請求項１又は２記載の方法。
- 該培養株が液状の培地において調製されるところの請求項１又は２記載の方法。
- 請求項１に従って表示される酵素活性と異なる酵素活性を、着色生成物又は蛍光生成物の形成により表示することを可能にするところの少なくとも一つの他のトレーサーが、培地に更に加えられるところの請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
- 着色生成物の形成によりペプチダーゼ活性を表示することを可能にするところのトレーサーが微生物の培地に加えられるところの、微生物の培養株におけるペプチダーゼ活性を表示するための方法において、該トレーサーが、
式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘは、５-ブロモインドール-３-イル基を示し、そしてＲは、ロイシン及びアラニンから選ばれるアミノ酸のアシル残基を示す）
の化合物の少なくとも一つを含み、及び該培地が０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含むことを特徴とする方法。 - 式 Ｘ-ＮＨ-Ｒ
（ここで、Ｘは、５-ブロモインドール-３-イル基を示し、そしてＲは、ロイシン及びアラニンから選ばれるアミノ酸のアシル残基を示す）
の化合物の少なくとも一つ、及び０．５〜２５ｇ／リットルの酵母エキス、０．５〜２５ｇ／リットルのゼラチンペプトン、及び０〜５０ｇ／リットルのＮａＣｌを含む微生物の培地。 - 上記化合物の２５〜２０００ｍｇ／リットルを含むところの請求項７記載の培地。
- 培地がゲル化された培地であることを特徴とする請求項７又は８記載の培地。
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