ES2201311T3 - Procedimiento de puesta en evidencia de una actividad enzimatica de microorganismos. - Google Patents

Procedimiento de puesta en evidencia de una actividad enzimatica de microorganismos.

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ES2201311T3 ES97935649T ES97935649T ES2201311T3 ES 2201311 T3 ES2201311 T3 ES 2201311T3 ES 97935649 T ES97935649 T ES 97935649T ES 97935649 T ES97935649 T ES 97935649T ES 2201311 T3 ES2201311 T3 ES 2201311T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE AL MENOS UN COMPUESTO DE FORMULA: X - NH - R, EN LA CUAL X REPRESENTA UN GRUPO 5 - BROMOINDOL - 3 - ILO Y R EL RESTO ACILO DE UN ACIDO AMINADO ELEGIDO ENTRE LA LEUCINA Y LA ALANINA, COMO AGENTE REVELADOR PARA DETECTAR, POR FORMACION DE UN PRODUCTO COLOREADO, UNA ACTIVIDAD DE PEPTIDASA EN UN CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

Description

Procedimiento de puesta en evidencia de una actividad enzimática de microorganismos.
La presente invención se refiere a un procedimiento de puesta en evidencia de una actividad enzimática de microorganismos. Un procedimiento de este tipo puede ser utilizado para la identificación de microorganismos que expresen o no esta actividad enzimática.
La detección y la identificación de los microorganismos son muy importantes en particular en medicina, en la industria agroalimentaria, para el control del medio (por ejemplo el control del agua...). Los microorganismos pueden ser buscados por su patogenicidad, como indicadores de contaminación, o también para el control de procedimientos de fabricación.
Las técnicas de detección y de identificación de microorganismos se basan en la actualidad en la búsqueda de secuencias nucleótidas características, en la búsqueda de antígenos o de anticuerpos, el cultivo, en medio selectivo o no, o también en la búsqueda de actividades metabólicas y en particular enzimáticas (por ejemplo actividades de oxidasas, de esterasas, de peptidasas, de oxidasas, etc.).
Muy a menudo, los procedimientos de detección y de identificación de los microorganimos asocian varias de estas técnicas. El cultivo es así utilizado para multiplicar y seleccionar los microorganismos buscados. Con el fin de simplificar su detección, se ha propuesto poner en evidencia unas actividades bioquímicas introduciendo unas moléculas que producen una coloración o una fluorescencia, directamente en el medio de cultivo. Dichos medios son denominados medios de detección. Las actividades bioquímicas pueden ser puestas en evidencia mediante diversos métodos tales como:
-
la modificación fisicoquímica del medio: cambio de pH señalado con ayuda de un indicador coloreado o fluorescente (metilumbeliferona).
-
el cambio del potencial redox señalado con ayuda de un indicador coloreado (sal de tetrazolium) o fluorescente,
-
la reacción de una molécula producida por los microorganismos con un compuesto presente en el medio, que conduce a una coloración.
-
la hidrólisis de moléculas que liberan un compuesto coloreado o fluorescente (naftol, cumarina).
Las hidrólisis detectadas son en general el resultado de la acción de una enzima producida por el microorganismo sobre un substrato enzimático natural o sintético. Estas actividades enzimáticas son por ejemplo las de las enzimas siguientes: esterasas (por ejemplo lipasas, fosfatasas), oxidasas (\beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, N- acetilhexosaminidasa), peptidasas (alanina-aminopeptidasa, tripsinasa, gelatinasa) ADNasas, descarboxilasas, desaminasas, ureasas, triptofanasas, oxidasas, catalasas, etc.
Se sabe que los medios gelificados están particularmente bien adaptados para el cultivo y para el aislamiento de microorganismos a partir de una toma de muestras, así como para la detección de microorganismos "diana" en el seno de una mezcla de microorganismos. En estos medios, los microorganismos forman unas colonias detectables a simple vista, y es muy deseable que los productos de las actividades bioquímicas buscadas permanezcan localizados sobre su emplazamiento de producción. Ello permite en efecto, distinguir una colonia de sus vecinas si éstas no expresan las mismas actividades. Se pueden así utilizar diversos métodos que detectan por ejemplo unos cambios de pH (FR-A-2 671 100), unas actividades de esterasas (FR-2 457 323), unas actividades de oxidasas (FR-A- 2 684 110) etc. Evidentemente, es posible utilizar conjuntamente varios de estos métodos, con el fin de poner en evidencia varias especies o cepas, y/o acrecentar la sensibilidad y/o la especificidad de la detección.
En la actualidad no se dispone de medios, adaptados a los medios gelificados, para poner en evidencia unas actividades de L-Alanina-aminopeptidasas, D-Alanina- aminopeptidasas y L-Leucina-aminopeptidadasas de los microorganismos. En efecto, los substratos enzimáticos utilizados hasta hoy liberan unas moléculas coloreadas o fluorescentes que difunden en los medios gelificados y/o que no son identificadas más que por irradiación U.V. (es el caso de la naftilamina o de la aminocumarina) y/o después de la acción de reactivos (es el caso de la naftilamina), o cuya coloración está poco contrastada en los medios reaccionales utilizados en microbiología (es el caso de la nitroanilina).
Se sabe que la L-Leucina-aminopeptidasa ha sido puesta en evidencia en unos cortes histológicos de mamíferos gracias a un substrato enzimático, la L-Leucina-3-(5- Bromoindolamina), abreviado L-Leu-BIA, que produce después de hidrólisis un compuesto coloreado; véase Pearson et al., 1963, Lab. Invest.,12:712. En 1967, Yarborough et al., J. Reticuloendoth. Soc., 4: 390 han retomado la técnica de Pearson et al. en unas aplicaciones similares (cortes histológicos). Han precisado que la adición de una mezcla de ferri- y ferro-cianuro de potasio o de sulfato de cobre inhibe la reacción.
En 1975 Lodja y Havránková, Histochemistry, 43: 355 propusieron mejorar el método utilizando el substrato l-Leu-BIA, añadiendo una mezcla de sal de Tetrazolio y de fenazina metosulfato, proviniendo entonces la reacción coloreada observada de la reducción de la sal de tetrazolio en formazan.
Durante los trabajos que han conducido a la presente invención, se ha buscado si era posible utilizar la L-Leu-BIA como substrato enzimático en la detección de microorganismos cultivados en particular en medios gelificados. Durante los ensayos preliminares, se ha añadido L-Leu-BIA en el medio descrito en el ejemplo 1 a continuación. Este medio es utilizado corrientemente para la búsqueda de oxidasas.
No ha sido posible poner en evidencia una actividad de peptidasa, cualquiera que sea el microorganismo cultivado en este medio (Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Pseudomonas, Enterococcus, staphylococus, Streptococcus).
Por el contrario, si se añade en este mismo medio L-Leucina-7-amino-4-metil-cumarina (L-Leu-AMC), se detecta una fluorescencia con algunos de estos mismos microorganismos. Asimismo en este medio, con unos substratos de oxidasas (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosida y 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronido), se pueden detectar las actividades de \beta-galactosidasa y de \beta-glucoronidasa de los microorganismos. La adición de los reactivos propuestos por Lodja y Havránková se traduce en una inhibición más o menos completa del crecimiento de los microorganismos sin permitir la revelación de una actividad de peptidasa con la L-Leu-BIA.
Asimismo, con el medio utilizado a continuación en el ejemplo 2, no se ha podido poner en evidencia una actividad de la peptidasa con la L-Leu-BIA, mientras que el substrato L-Leu-AMC permite detectar esta actividad en el mismo medio.
Se ha descubierto ahora que la ausencia de resultados con los derivados de BIA no se debía a una incompatibilidad con los microorganismos o a una inhibición de su multiplicación en cultivo, sino que se debía esencialmente a las condiciones del medio. Se ha descubierto efectivamente que era posible detectar la actividad de peptidasa de microorganismos con la L-Leu-BIA, utilizando otros medios de cultivo. Las razones por las cuales ciertos medios son utilizables, y otros no, no son conocidas. Sin embargo, es posible determinar y poner a punto, mediante unas simples experiencias de rutina, parecidas a las descritas a continuación en la parte experimental, los medios y/o ingredientes que son convenientes y los que no. Por lo tanto, en principio la invención ha consistido en particular en buscar, y en mostrar que era posible encontrar unos medios de cultivo en los cuales los substratos de peptidasas derivados de la 5-bromoindolamina mencionados más arriba son utilizables para poner en evidencia las actividades enzimáticas correspondientes en un cultivo de microorganismos.
Se ha descubierto así que el siguiente medio es utilizable:
- Extracto de levadura 0,5-25 g/l
- Peptona de gelatina 0,5-25 g/l
- NaCl 0-50 g/l
y eventualmente:
- Agente regulador del pH, q.s.p pH = 3 a 9
y/o:
- Agente gelificante 5-35 g/l
El pH seleccionado es un pH conveniente para el microorganismo estudiado. En el caso de un medio gelificado, el pH es preferentemente de 5 a 9. Se puede ajustar el pH, por ejemplo, con ácido clorhídrico o con carbonato de sodio.
Si se añade a un medio de este tipo L-Leu-BIA, y si se siembra con unos microorganismos, se obtienen después de cultivo unas colonias pardas o incoloras según que los microorganismos expresen o no una actividad de L-Leucina-aminopeptidasa.
Unos resultados comparables han sido obtenidos con los substratos L-Ala-BIA y D-Ala-BIA.
La invención tiene por lo tanto por objeto la utilización de por lo menos un compuesto de fórmula:
X-NH-R
en la cual X representa un grupo 5-bromoindolo-3-ilo y R representa el resto acilo de un ácido aminado seleccionado entre la leucina y la alanina, permitiendo poner en evidencia como agente revelador, por la formación de un producto coloreado, una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos.
En particular el grupo R representa un resto acilo de L-Leu, L-Ala o D-Ala.
Los substratos cuya utilización constituye el objeto de la presente solicitud, no inhiben la multiplicación de los microorganismos en los medios de cultivo apropiados. Se puede por lo tanto utilizar el agente revelador añadiéndolo al medio de cultivo de los microorganismos, antes del inicio del cultivo o durante el inicio del cultivo.
Una de las ventajas importantes de los agentes reveladores utilizados según la invención es que en presencia de la actividad de peptidasa buscada, dan unos productos coloreados que no se difunden en el medio gelificado.
Pueden por lo tanto ser utilizados en medio gelificado. Pueden también, evidentemente, ser utilizados en medio líquido.
Según un modo de realización particular, se puede añadir al cultivo, además, por lo menos otro agente revelador que permita poner en evidencia, por la formación de un producto coloreado o fluorescente, una actividad enzimática generalmente diferente a la que es puesta en evidencia con ayuda de unos compuestos de fórmula X-NH-R tal como los definidos más arriba. Puede tratarse por ejemplo de una actividad de esterasa, de oxidasa o de peptidasa. Se pueden así obtener informaciones suplementarias, en unión con una ausencia de coloración (o de fluorescencia) o en unión con una coloración modificada con respecto a la coloración obtenida con un solo substrato enzimático. El otro agente revelador seleccionado tendrá unas propiedades diferentes a las de los derivados de BIA: por ejemplo, se seleccionará otro agente revelador capaz de dar un producto reaccional que tenga un color diferente al color pardo obtenido con los derivados de BIA. El otro agente revelador (o segundo agente revelador) permitirá por lo tanto revelar, gracias a su propio color, o gracias a su fluorescencia, la presencia de una actividad enzimática de la que es específico. Si la actividad de peptidasa revelable por los derivados de BIA está también presente, se obtendrá una coloración modificada, diferente a dicho color pardo y diferente también a dicho color propio dado por el segundo agente revelador. Estos ejemplos de utilización de varios substratos, así como las informaciones que se pueden obtener de éstos, son dados a continuación en la parte experimental. Evidentemente, los resultados pueden variar con cada especie o cepa de microorganismo estudiado.
Cada caso susceptible de interés debe por lo tanto ser objeto de estudios preliminares según unos experimentos de rutina.
Los derivados que sirven para poner en evidencia unas actividades enzimáticas diferentes, y utilizables como otros agentes reveladores, son en particular unos derivados de indoxilo, de cumarina, de resorufina, de naftol, de naftilamina, de nitrofenol, de nitroanilina, de rodamina, de hidroxiquinoleina, de fluoresceína, etc.
Entre estos derivados que pueden ser utilizados en asociación con los derivados de BIA, se pueden citar en particular el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucoronida, el 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido, la L-alanina-7-amino-4-metil-cumarina, el 4-metil-umbeliferil-N-acetil-\beta-D-galactosaminida, el resorufin-\beta-D-galactosida, el sulfato de \beta-naftilo, el naftol AS-BI \beta-D-galactosida, el L-alanina \beta-naftilamida, el o-nitrofenol-\beta-D-galactosida, el carboxibenzoilo-L-arginina-p-nitroanilido, la rodamina 110 bis-(L-leucina amida), la hidroxiquinoleina-\beta-D-glucósido y el diacetato de fluoresceína.
La invención tiene también por objeto un procedimiento de puesta en evidencia una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos, en el cual se añade al medio de cultivo de dichos microorganismos un agente revelador que permite poner en evidencia dicha actividad por la formación de un producto coloreado, caracterizado porque dicho agente revelador comprende por lo menos un compuesto de fórmula:
X-NH-R,
en la cual X y R están definidos como anteriormente.
Se puede añadir el compuesto X-NH-R antes del inicio del cultivo, o durante el cultivo, o incluso al final del cultivo. La realización del procedimiento de la invención implica por lo tanto cultivar los microorganismos estudiados, entendiéndose que se puede realizar este cultivo antes o después de añadir el compuesto X-NH-R, y que se puede también realizar esta adición durante el cultivo. Evidentemente, se realiza el cultivo propiamente dicho por incubación de un medio de cultivo apropiado en unas condiciones que permiten la multiplicación de los microorganismos estudiados. Las composiciones de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo que son convenientes son conocidas o pueden ser determinadas mediante unos experimentos de rutina.
La invención tiene también por objeto un medio de cultivo de microorganismos que contienen, además de los ingredientes necesarios para el cultivo de dichos organismos, por lo menos un compuesto de fórmula X-NH-R.
Los derivados de fórmula X-NH-R son utilizados en unas concentraciones suficientes para dar unas reacciones coloreadas observables. Estas concentraciones, que pueden ser determinadas por experimentos de rutina, pueden variar generalmente de 25 a 2000 mg por litro de medio de cultivo.
Las características y ventajas de la invención son ilustradas por los siguientes ejemplos.
Ejemplos Ejemplo 1 El medio de cultivo contiene, además del agua:
- Peptona de carne* 15 g/l
- Peptona de caseína** 3 g/l
- NaCl 5g/l
- Tampon Tris 0,5 g/l
- Na_{2}HPO_{4} 1 g/l
- Citrato de sodio 1 g/l
- Glucosa 1 g/l
- Piruvato de sodio 2 g/l
- Agar 13 g/l
A este medio, se añade o bien L-Ala-BIA, o bien L-Leu-BIA, o bien L-Ala-AMC o bien L-Leu-AMC, en unas concentraciones de 200 mg/l. Se siembran los diferentes medios obtenidos, repartidos en cajas de Petri, con unos microorganismos. Las cajas han sido puestas en incubación a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas han sido examinadas visualmente con luz ambiente y bajo una lámpara de U.V. (longitud de onda = 365 nm) después de 24 y 48 horas de incubación. El color o la presencia de fluorescencia han sido anotados. Los microorganismos estudiados eran: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Streptococcus pyogenes, Staphilococcus epidermidis y Candida albicans. Los resultados son presentados en la tabla I siguiente:
TABLA I
Cepas L-Ala-AMC L-Ala-SIA L-Leu-AMC L-Leu-BIA
E. coli 24h Fluo^{1} -^{2} Fluo -
48h Fluo - Fluo -
K. pneumoniae 24h Fluo - Fluo -
48h Fluo - Fluo -
C. freundii 24h Fluo - Fluo -
48h Fluo - Fluo -
P. aeruginosa 24h Fluo - - -
48h Fluo - Fluo -
S. agalactiae 24h - - Fluo -
48h Fluo - Fluo -
E. faecium 24h - - - -
48h Fluo - Fluo -
S. pyogenes 24h - - Fluo -
48h Fluo - Fluo -
S. epidermidis 24h - - - -
48h - - - -
C. albicans 24h - - NT^{3} NT
48h Fluo - NT NT
^{1}: Fluo= Fluorescencia
^{2}: - = ausencia de fluorescencia y/o ausencia de coloración.
^{3}: NT= no testado 
\newpage
El medio utilizado en este ejemplo permite poner en evidencia las actividades L-Alanina-aminopeptidasa y
L-Leucina-aminopeptidasa con los reactivos L-Ala-AMC y L-Leu-AMC, respectivamente, pero cuando se utilizan
la L-Ala-BIA, y la L-Leu-BIA no se detecta ninguna hidrólisis.
Ejemplo 2
En un tampón de fosfato 0,1 M pH 7,3 a 25ºC se añade o bien L-Leu-BIA, o bien L-Leu-AMC, en unas concentraciones de 400 mg/l. Los medios obtenidos han sido repartidos en los pozos de las placas de microtitrado y sembrados con unas suspensiones de microorganismos. Las placas han sido puestas en incubación 24 horas a 37ºC. Los pozos han sido examinados visualmente con luz ambiental y bajo una lámpara U.V., como anteriormente. Después de 24 y 48 horas de incubación, el color o presencia de fluorescencia han sido anotados. Los resultaos están presentes en la tabla II seguidamente:
TABLA II
Cepas L-Leu-AMC L-Leu-BIA
E. coli 24h Fluo^{1} -^{2}
48h Fluo -
K. pneumoniae 24h Fluo -
48h Fluo -
C. freundii 24h Fluo -
48h Fluo -
P. aeruginosa 24h - -
48h Fluo -
S. agalactiae 24h Fluo -
48h Fluo -
E. faecium 24h - -
48h Fluo -
S. pyogenes 24h Fluo -
48h Fluo -
S. epidermidis 24h - -
48h - -
^{1}: Fluo= Fluorescencia
^{2}: - = ausencia de fluorescencia y/o ausencia de coloración
Así, con el medio utilizado en este ejemplo, es posible poner en evidencia la actividad de L-Leucina-aminopeptidasa con L-Leu-AMC, pero cuando se utiliza la L-Leu-BIA no se detecta ninguna hidrólisis.
Ejemplo 3
El medio de cultivo contiene, además del agua:
- Extracto de levadura* 6 g/l
- Peptona de gelatina** 5g/l
- NaCl 8 g/l
- Na_{2}CO_{3} 0,1 g/l
- Agar 13 g/l 
\newpage
A este medio se añade o bien, L-Ala-BIA, o bien L-Leu-BIA, o bien L-Leu- AMC, o bien L-Leu-AMC, en unas concentraciones de 200 mg/l. Se siembran los diferentes medios obtenidos, repartidos en placas de Petri, con los mismos microorganismos que los utilizados en el ejemplo 1. Las cajas son puestas en incubación durante 48 horas a 37ºC. Las colonias formadas han sido examinadas visualmente con luz ambiente y bajo una lámpara U.V. (longitud de onda = 365 nm) después de 24 y 48 horas de incubación. El color o presencia de fluorescencia han sido anotados. Los resultados son presentados en la tabla III siguiente:
TABLA III
Cepas L-Ala-AMC L-Ala-BIA L-Leu-AMC L-Leu-BIA
E. col 24h Fluo^{1} Pardo Fluo -^{2}
Gram negativo 48h Fluo Pardo Fluo Pardo
K. pneumoniae 24h Fluo Pardo Fluo -
Gram negativo 48h Fluo Pardo Fluo Pardo
C. freundi 24h Fluo Pardo Fluo Pardo
granegativoi 48h Fluo Pardo Fluo Pardo
P. aeruginosa 24h Fluo Pardo - -
Gram negativo 48h Fluo Pardo Fluo Pardo
S. agalactiae 24h - - Fluo -
Gram positivo 48h Fluo Pardo Fluo -
E. faecium 24h - - - -
Gram positivo 48h Fluo Pardo Fluo -
S. pyogenes 24h - - Fluo -
Gram positivo 48h Fluo Pardo Fluo -
S. epidermidis 24h - - - -
Gram positivo 48h - - - -
C. albicans 24h - - NT^{3} NT
48h Fluo Pardo NT NT
^{1}: Fluo = fluorescencia
^{2}: - = ausencia de fluorescencia y/o ausencia de coloración
^{3}: NT= no testado
El medio utilizado en este ejemplo permite poner en evidencia las actividades de L-Alanina-aminopeptidasa y de L-Leucina-aminopeptidasa con la L-Ala-AMC y la L-Leu-AMC, respectivamente, así como con la L-Ala-BIA y la L-Leu-BIA. Estos dos últimos substratos dan de todas formas unas reacciones a veces más tardías. Por el contrario, permiten distinguir las bacterias con Gram negativo de las bacterias con Gram positivo. En efecto:
-
tras 24 horas de incubación con L-Ala-BIA, las bacterias Gram positivo no muestran coloración, mientras que las bacterias Gram negativo dan una coloración parda;
-
y tras 48 horas con L-Leu-BIA: las bacterias Gram positivo no muestran coloración, mientras que las bacterias Gram negativo dan una coloración parda.
Ejemplo 4
En el medio del ejemplo 3, se ha añadido o bien L-Leu-BIA o bien L-Ala- BIA, solas o en combinación con o bien 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido (X-Glu), o bien con 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido (Z-Glu), o bien con 4-metilumbel-liferil-\beta-D-glucósido (MUGI), o bien con 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-acetato (X-Ac).
Las concentraciones de estos diferentes substratos son las siguientes:
- L-Leu-BIA : 200 mg/l
- L-Ala-BIA: 200 mg/l
- X-Glu: 200 mg/l
- Z-Glu: 200 mg/l
- MuGl: 200 mg/l
Se siembran estos diferentes medios repartidos en placas de Petri con unos microorganismos. Las cepas estudiadas son las mismas que en los ejemplos anteriores. Las cajas son puestas en incubación durante 48 horas a 37ºC, y las colonias formadas son examinadas visualmente con luz ambiente y bajo una lámpara U.V. (longitud de onda = 365 nm). Los resultados de observación de los colores de las colonias obtenidas después de 24 y 48 horas de incubación son presentados en la tabla IV:
(Tabla pasa a página siguiente)
1
En los medios 2, 3 y 4 es posible distinguir después de 24 horas de incubación los Enterococcus (E. faecium) que solos dan una coloración diferente al pardo o gris. Los medios 2, 3 y 4 permite también, después de 24 horas de cultivo, distinguir las bacterias Gram positivo, que presentan o bien una ausencia de coloración o bien una coloración diferente al pardo y al gris. Los medios 7, 8 y 9 permiten unas distinciones similares, pero después de 48 horas de incubación. En el medio 5 después de 48 horas de incubación únicamente S. Epidemidis da unas colonias de color turquesa, dando las otras bacterias unas colonias pardas a gris azuladas.
Se precisa que cuando los substratos están presentes solos en el medio reaccional, la presencia de una oxidasa y la hidrólisis resultante del 5-bromo-4-cloruro-3-indolil-\beta-D-glucósido (X-Glu) provoca la aparición de un color azul turquesa, la hidrólisis del 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido (Z-Glu) provoca la aparición de un color rosa púrpura. La hidrólisis del 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucósido (MUGI) provoca la aparición de una fluorescencia azul bajo la lámpara de U.V. (longitud de onda = 365 nm); y que, en presencia de una esterasa, la hidrólisis resultante del 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-acetato (X-Ac) provoca la aparición de un color azul turquesa.
Ejemplo 5
El medio de cultivo contiene, además del agua:
- Extracto de levadura* 6 g/l
- Peptona de gelatina** 5 g/l
- NaCl 8 g/l
- Na_{2}CO_{3} 0,1 g/l
En este medio, se añade o bien L-Leu-BIA o bien L-Ala-BIA, solas, o en combinación entre ellas, o en combinación con 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-acetato (X-Ac).
Las concentraciones de estos diferentes substratos son las siguientes:
- L-Leu-BIA: 300 mg/l
- L-Ala-BIA: 300 mg/l
- X-Ac: 200 mg/l
Los medios obtenidos han sido repartidos en unas placas de microtitrado y sembrados con una suspensiones de microorganismos, como anteriormente. Las placas han sido puestas en incubación 48 horas a 37ºC. Los colores de los pozos obtenidos después de 24 y 48 horas de incubación están presentados en la tabla V:
TABLA V
L-leu-BIA L-Ala-BIA L-Ala-BIA + L-Ala-BIA
L-Leu-BIA + X-Ac
Cepas nº del medio 1 2 3 4
E. coli 24h - Pardo Pardo Gris
48h Pardo Pardo Pardo Gris
K. pneumoniae 24h Pardo Pardo Pardo Gris
48h Pardo Pardo Pardo Gris
C. freundii 24h Pardo Pardo Pardo Gris
48h Pardo Pardo Pardo Gris
P. aeruginosa 24h Pardo Pardo Pardo Gris
48h Pardo Pardo Pardo Gris
S. agalactiae 24h - - Pardo Gris -Azul
48h - Pardo Pardo Gris-Azul
(Tabla V continuación)
L-leu-BIA L-Ala-BIA L-Ala-BIA + L-Ala-BIA
L-Leu-BIA + X-Ac
Cepas nº del medio 1 2 3 4
E. faecium 24h - - Pardo Gris-Azul
48h - - Pardo Gris-Azul
S. pyogenes 24h - - Pardo Gris-Azul
48h Pardo Pardo Pardo Gris-Pardo
S. epidermidis 24h - - - Turquesa
48h - - - Turquesa
Se observa que con los medios 3 y 4 es posible distinguir el S. epidermidis de las otras bacterias. Con el medio 1 es posible diferenciar unas bacterias con Gram negativo de las de Gram positivo (salvo el S.pyogenes) después de 48 horas de incubación. El medio 2 permite la diferenciación de las bacterias Gram positivo y Gram negativo después de 24 horas de incubación.
Ejemplo 6
El medio de cultivo contiene, además del agua:
- Extracto de carne de buey* 3 g/l
- Peptona de gelatina** 5 g/l
- NaCl 8 g/l
- Agar 15 g/l
Se añade a este medio o bien L-ala-BIA, o bien L-Ala-AMC, en unas concentraciones de 300 mg/l y 200 mg/l respectivamente. Se siembran los diferentes medios obtenidos repartidos en cajas de Petri, con unos microorganismos. Las cajas son puestas en incubación 48 horas a 37ºC. Las colonias formadas han sido examinadas visualmente con luz ambiental y bajo la lámpara de U.V. como anteriormente, después de 24 y 48 horas de incubación. El color o la presencia de fluorescencia han sido anotados. Los resultados son presentados en la tabla VI siguiente:
TABLA VI
Cepas L-Ala-AMC L-Ala-BIA
E. coli 24h Fluo^{1} Pardo
48h Fluo Pardo
K. pneumoniae 24h Fluo Pardo
48h Fluo Pardo
C. freundii 24h Fluo Pardo
48h Fluo Pardo
P. aeruginosa 24h Fluo -
48h Fluo Pardo
S. agalactiae 24h -^{2} -
48h Fluo -
E. faecium 24h - -
48h Fluo -
(Tabla VI continuación)
Cepas L-Ala-AMC L-Ala-BIA
S. pyogenes 24h - -
48h Fluo Pardo
S. epidermidis 24h - -
48h - -
C. albicans 24h - -
48h Fluo Pardo
^{1}: Fluo = Fluorescencia
^{2}: - = ausencia de fluorescencia y/o ausencia de coloración
Con el medio utilizado en este ejemplo, es por lo tanto posible poner en evidencia la actividad de L-alanina-aminopeptidasa con L-ala-AMC así como con L-ala-BIA.

Claims (9)

1. Utilización de por lo menos un compuesto de fórmula:
X-NH-R
en la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa el resto acilo de un ácido aminado seleccionado entre la leucina y la alanina, permitiendo poner en evidencia como agente revelador, por la formación de un producto coloreado, una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la cual R representa un resto acilo de L-Leu, L-Ala o D-Ala.
3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicho cultivo es realizado en medio gelificado.
4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la cual dicho cultivo es realizado en medio líquido.
5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual además se añade a dicho cultivo por lo menos otro agente revelador que permite poner en evidencia, por la formación de un producto coloreado o fluorescente, una actividad enzimática diferente a la puesta en evidencia según la reivindicación 1.
6. Procedimiento de puesta en evidencia de una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos, en el cual se añade al medio de cultivo de dichos microorganismos un agente revelador que permite poner en evidencia dicha actividad por la formación de un producto coloreado, caracterizado porque dicho agente revelador comprende por lo menos un compuesto de fórmula:
X-NH-R
en la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa el resto acilo de un ácido aminado seleccionado entre la leucina y la alanina.
7. Medio de cultivo de microorganismos que contiene, además de los ingredientes necesarios para el cultivo de dichos microorganismos, por lo menos un compuesto de fórmula:
X-NH-R
en la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa el resto acilo de un ácido aminado seleccionado entre la leucina y la alanina.
8. Medio de cultivo según la reivindicación 7, que contiene de 25 a 2000 mg/l de dicho compuesto.
9. Medio de cultivo según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque se trata de un medio gelificado.
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