ES2286859T3 - Procedimiento y agente de determinacion de una actividad enzimatica del tipo desaminasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección y de identificación y / o cuantificación de una actividad enzimática del tipo desaminasa, de microorganismos, según el cual, se procede a poner en contacto un inóculo susceptible de poder contener un microorganismo que tenga una actividad desaminasa, con un medio de cultivo para microorganismos, caracterizado por el hecho de que, el medio de cultivo, comprende, por lo menos, un agente de detección, el cual permite evidenciar, mediante la formación de un producto coloreado con un agente revelador, una actividad enzimática del tipo desaminasa, siendo el citado agente de revelación, un L-aminoácido de la fórmula (I) general siguiente: R-CH2-CH-COOH (I) ¿ NH2 en la cual, - R, representa un radical de aminoácido cíclico, sustituido por 1 a 3 grupos X, idénticos o diferentes, - X, representa un grupo que limita la difusión del a-aminoácido, mediante la desaminación de aminoácido cíclico, y X, se elige de entre el metilo, el bencilo, el carboxibenzoílo, el dansilo, la naftalina-sulfonilo, el tosil-sulfonilo, el mesitilen-sulfonilo.
Description
Procedimiento y agente de determinación de una
actividad enzimática del tipo desaminasa.
La presente invención, se refiere, a un
procedimiento de detección y de identificación y/o de cuantificación
de una actividad enzimática del tipo desaminasa, en un medio de
cultivo para microorganismos, y a un agente de detección, adaptados
para este procedimiento, al procedimiento de preparación de estos
compuestos y agentes de detección, así como a los medios de cultivo
para aplicar el citado procedimiento.
La detección y la identificación de los
microorganismos, son muy importantes, principalmente, en medicina,
en la industria agro-alimentaria, par el control del
entorno medioambiental (agua...). Los microorganismos, pueden ser
investigados en cuanto a lo referente a su patogenicidad, como
indicadores de contaminación, para el seguimiento de procedimientos
de fabricación y otros.
Las técnicas de selección y de identificación de
los microorganismos, se basan actualmente, en la búsqueda o
investigación de antígenos o de anticuerpos, el cultivo, en medio
selectivo o no, o incluso en la búsqueda o investigación de
actividades metabólicas y, especialmente, enzimáticas (por ejemplo,
actividades osidasas, estearasas, peptidasas, oxidasas, etc.).
De una forma frecuente, los procedimientos de
detección y de identificación y/o de cuantificación de los
microorganismos, asocian varias de estas técnicas. El cultivo, se
utiliza así, de este modo, para multiplicar y seleccionar los
microorganismos buscados o investigados. Con la finalidad de
simplificar su detección, se ha propuesto el proceder a evidenciar
las actividades bioquímicas, introduciendo moléculas que producen
una coloración o una fluorescencia, directamente en el medio de
cultivo. Tales medios de cultivo, se denominan medios de detección.
Las actividades bioquímicas, pueden evidenciarse mediante diversos
procedimientos, tales como los consistentes en:
- la modificación físico - química del medio :
cambio del valor pH, en presencia de un indicador coloreado, o
fluorescente (metil-umbeliferona,...),
- el cambio del potencial redox, revelado con la
ayuda de un indicador coloreado (sales de tetrazolio,...), o
fluorescente ((EP - A - 0 424 293),
- la hidrólisis de moléculas que liberan un
compuesto coloreado o fluorescente (indoxilo, naftol,
cumarina...),
- la reacción de una molécula producida por los
microorganismos, con un compuesto que se encuentra presente en el
medio, dando como resultado una coloración (detección de indol,
James et al., 1986).
Se sabe que, los medios gelificados (o sólidos),
se encuentran particularmente bien adaptados al cultivo y al
aislamiento de los microorganismos, a partir de una extracción, así
como a la detección de microorganismos " diana", en el seno de
una mezcla, fijada, de microorganismos.
Se conoce un procedimiento de diferenciación de
las bacterias del grupo "Proteus", de las otras enterobacterias
(Sverre Dick Henriksen, State Institute for Public Health,
Bacteriological Departament, - Instituto estatal para la salud
pública, Departamento bacteriológico -, Oslo, Noruega, 6 de junio de
1950). Este procedimiento, aplica una cantidad igual, en medio de
gelosa, de D- y L-fenilalanina, en presencia de sal
de hierro. La reacción coloreada verde obtenida, en comparación con
el test de ensayo de la urelasa, si bien es positivo para
identificar el grupo Proteus, éste se presenta, no obstante, como
siendo un test de ensayo pesado, en cuanto a lo referente a su
puesta en ejecución.
Se conoce también, todavía, el documento de
GIAMMANCO & PIGNATO ("Rapid identification of
micro-organismes from urinary tract infections by
beta-glucuronidase, phenylalanine deaminase,
cytochrome oxidase and indole tests on isolation media", -
Identificación rápida de microorganismos procedentes del tracto
urinario, mediante tests de ensayo de glucuronidasa,
fenilalanina-desaminasa,
citocromo-oxidasa, e indol, en medio de aislamiento
-, JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY, volumen 41, nº 6, diciembre de
1994, páginas 389 - 392), el cual divulga, para la detección de una
actividad desaminasa, bacterias del grupo de las Proteeae, la
utilización de los aminoácidos naturales, tales como el triptofano
y la fenilalanina, en combinación con una sal de hierro
(FeCl_{3}).
Se conoce también, todavía, el documento de
MANAFI & ROTTER ("A new plate medium for rapid presumtive
identification and diferentiation on Enterobacteriaceae", - Un
nuevo medio de placa, para una rápida presunta identificación y
diferenciación de enterobacterias -, INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD
MICROBIOLLGY, volumen 14, nº 2, noviembre de 1991, páginas 127 -
134), el cual divulga, para la detección de una actividad desaminasa
de las bacterias del grupo de las Proteeae, la utilización del
triptofano, solo, con sal de hierro (citrato de hierro amoniacal.
Este documento, menciona, para otros marcadores de actividad
enzimática (4-metilumbeliferona, nitrofenilo), el
hecho de que, una difusión de estos marcadores, es penalizante. La
única solución, para minimizar el efecto, es la consistente en
incubar los medios, durante un tiempo reducido.
Se conoce, todavía, el documento de PELOUX &
LEFORT ("Lysine deaminasa of the
Proteus-Providencia group, by means of the Edward
and Fife lisine-iron medium", - Lisina-
desaminasa del grupo Proteus-Providencia, por
mediación del medio de lisina - hierro, de Edwards and Fife -).
Valores prácticos de este medio, para diferenciar las
enterobacterias "FEUILL. BIOL"., volumen 13, nº 68, 1972,
páginas 37 - 42), que comparan la actividad de tres aminoácidos
(triptofano, fenilalanina y lisina), para la detección de la
desaminasa, en asociación con una sal de hierro.
Se conoce, todavía, el documento de SIVOLODSKII
("Modification of a method for the determination of triptophan
deaminasa and phenylalanine deaminasa content in bacteria", -
Modificación de un procedimiento para la determinación del
contenido de triptofano-desaminasa y
fenilalanina-desaminasa, en bacterias -, LAB. DELO,
nº 3, 1982, páginas 166 - 168), el cual propone del añadir
hidrolizados enzimáticos de proteínas, constituidos por mezclas de
aminoácidos naturales, de péptidos, y de otros compuestos, para
detectar las actividades triptofano y
fenilalanina-desaminasas.
Se conoce aún, todavía, la publicación del
documento de solicitud de patente internacional WO - A - 92/00 068,
la cual divulga compuestos de histidina, sustituidos, que actúan en
calidad de antagonistas de los receptores de la angiotensina II.
Estos compuestos, según la fórmula (II) y los ejemplos, comprenden,
además, la sustitución del grupo amina o carboxilo.
Se conocen aún, además, las solicitudes de
patentes internacionales US - A - 5.643.743 y US - A - 5.411.867,
las cuales divulgan el triptofano, para la detección de
triptofanasa, enzima ésta diferente de las desaminasas.
Se conoce aún, además, la solicitud de patente
estadounidense US - A - 4.603.108, la cual divulga, como substrato
para detectar la fenilanina-desaminasa, la
D,L-beta-(p-nitrofenil)-alanina.
La lectura de la reacción, se efectúa, o bien ya sea a 480 nm, sin
la ayuda de un revelador para la
fenilalaina-desaminasa, o bien ya sea mediante la
dosificación del amoníaco puro, para la
leucina-desaminasa.
Se conoce, finalmente, la solicitud de patente
estadounidense US - A - 5.541.082, la cual divulga, para la
detección de las desaminasas, los aminoácidos fenilalanina y
triptofano, los cuales permiten obtener un color anaranjado, que se
difunde en el medio.
Estos documentos, divulgan la utilización de
aminoácidos naturales, lo cual es incompatible con una limitación
de la difusión del alfa-ceto-ácido. La única
solución propuesta, por parte de algunos de estos documentos, es la
consistente en limitar el tiempo de incubación, lo cual es muy
perjudicial, para la calidad de detección. Ahora bien, la
limitación de la difusión, es una prueba de la diferenciación de
varias colonias microbianas presentes en un mismo medio. A saber,
estos documentos, divulgan la utilización de aminoácidos
artificiales y modificados, los cuales no responden a la fórmula
(I) de la invención, y que pueden, además, proponer una aplicación
diferente, como por ejemplo, el antaganismo, con los receptores de
angioferina II.
A pesar de los tests de ensayo biológicos que
existen actualmente en el mercado, se verifica el hecho de que no
se dispone, actualmente, de medios que se encuentren particularmente
bien adaptados y que sean fáciles de aplicar, especialmente, en
medio de gelosa, para detectar e identificar y/o cuantificar, en un
cultivo plurimicrobiano, una actividad enzimática del tipo
desaminasa, de microorganismos.
La presente invención, se propone pues, como
objetivo, el resolver este problema.
Un primer objetivo de la presente invención,
consiste en un procedimiento de detección y de identificación y/o
cuantificación de una actividad enzimática del tipo desaminasa, de
microorganismos, según el cual, se procede a poner en contacto un
inóculo susceptible de poder contener un microorganismo que tenga
una actividad desaminasa, con un medio de cultivo para
microorganismos.
El medio de cultivo, comprende, por lo menos, un
agente de detección, el cual permite evidenciar, mediante la
formación de un producto coloreado con un agente revelador, una
actividad enzimática del tipo desaminasa.
El citado agente de revelación, es un
L-aminoácido de la fórmula (I) general
siguiente:
en la
cual,
- R, representa un radical de aminoácido
cíclico, sustituido por 1 a 3 grupos X, idénticos o diferentes,
- X, representa un grupo que limita la difusión
del \alpha-aminoácido, mediante la desaminación de
aminoácido cíclico, y se elige, de una forma apropiada, de entre
el metilo, el bencilo, el carboxibenzoílo, el dansilo, la
naftalina-sulfonilo, el
tosil-sulfonilo, el
mesitilen-sulfonilo,
pudiéndose encontrar sustituido, el compuesto de
la fórmula (I), por diferentes grupos que no interfieran con la
función del grupo X.
Por "grupo que limita la difusión", se
entenderá,
- cualquier grupo del tipo hidrófobo, que limite
la difusión, en el medio hidrófilo, ó
- cualquier grupo que permita el asociar,
mediante enlaces débiles, especialmente, hidrófobos, o de unirse,
mediante uno o varios enlaces covalentes, especialmente, el tiol, a
los constituyentes de las células de los microorganismos, tales
como la pared, la membrana, las proteínas...
A título de test de ensayo que define los grupos
que limitan la difusión, se procede a inocular un "spot"
(punto luminoso), en el centro de dos placas de petri,
respectivamente, un L-aminoácido cíclico, y un
agente de detección correspondiente, en concordancia con la
presente invención. Se procede a medir los diámetros de la difusión
de los \alpha-ceto-ácidos, producidos por la
actividad enzimática del tipo desaminasa del inoculado. El diámetro
de difusión del agente de detección en concordancia con la presente
invención, debe ser inferior al de L-aminoácido
cíclico, y se considerará, entonces, el hecho de que, el agente de
detección, limita la difusión del a-aceto-ácido
producido por la desaminación del L-aminoácido.
Se entenderá, por "Radical R de aminoácido
cíclico", los radicales R cíclicos o heterocíclicos, tales como
el indol, el fenilo, el hidroxifenilo, y el imidazol, que pueden
seguir una reacción de sustitución por el grupo X. Estos
aminoácidos, comprenden a los aminoácidos naturales o sintéticos, o
modificados, especialmente, mediante sustitución.
Se entenderá, por "grupo que no interfiere con
la función del grupo X", cualquier grupo que no impida, al grupo
X, limitar la difusión del a-aminoácido.
En el procedimiento en concordancia con la
presente invención, la adición de, por lo menos, un agente de
detección, en las concentraciones adaptadas, no inhibe la
multiplicación de los microorganismos, en los medios de cultivo
apropiados. Se puede por lo tanto utilizar el agente de detección,
añadiéndolo al medio de cultivo de los microorganismos, antes del
inicio del cultivo, o al inicio del cultivo.
Una de las ventajas importantes del
procedimiento que utiliza agentes de detección en concordancia con
la presente invención, reside en el hecho de que, en presencia de
una actividad enzimática del tipo desaminasa, éste proporciona,
después de la adición de un agente revelador, productos coloreados
que no se difunden en el medio, especialmente, en el medio
gelificado.
El procedimiento según la presente invención,
puede por lo tanto utilizarse, de una forma ventajosa, en medio
gelificado. Por supuesto, éste puede también utilizarse en medio
líquido, o sobre soporte sólido, en ausencia de gelificante.
El procedimiento en concordancia con la presente
invención, permite, en medio plurimicrobiano, el detectar e
identificar, o incluso también cuantificar, los microorganismos que
tengan una actividad enzimática del tipo desaminasa y, esto, sin
interferir con la detección de otros microorganismos. Muy al
contrario, el procedimiento de la presente invención, permite,
mediante la acción de las reacciones enzimáticas producidas, el
revelar, de una forma distinta, mediante colores que definen el
tipo de microorganismo, el microorganismo o los microorganismos
presentes en el medio.
El procedimiento según la presente invención,
aporta por lo tanto la ventaja, además de detectar y de identificar
una actividad enzimática del tipo desaminasa, en el medio de
cultivo, de permitir una aplicación o puesta en ejecución simple y
poco costosa.
En una forma de realización preferida, en
concordancia con la presente invención, el agente revelador, es una
sal de catión.
La sal de catión, al permitir evidenciar el
agente de detección mediante la formación de un producto coloreado,
puede añadirse al medio de cultivo, al mismo tiempo que el agente de
detección, o bien, después de la puesta en cultivo de los
microorganismos. En efecto, la persona experta en el arte
especializado de la técnica, sabrá determinar, según el medio de
cultivo utilizado, el hecho de si es más ventajoso, o es más
preferible, el añadir la sal de catión, al mismo tiempo que el
agente de detección, o después de la puesta en cultivo de los
microorganismos. Se prefiere, no obstante, principalmente, en medio
de gelosa, añadir el agente revelador al medio de cultivo, al mismo
tiempo que el agente de detección.
La reacción que se efectúa entre el agente de
detección y la desaminasa, y después, el agente de revelación, en
presencia de flavoproteína, cuando se utiliza, por ejemplo, como
agente de detección, la fenilalanina, es la reacción general
siguiente:
El ácido fenilpirúvico obtenido, el cual es un
alfa-ceto-ácido, se asocia con el cloruro de hierro,
actuando como agente quelante, para proporcionar una coloración
verde. Así, de este modo, cuando un tubo que contiene una
composición de este tipo, se expone al oxígeno atmosférico, la
densidad de coloración, aumenta.
Según la naturaleza del aminoácido utilizado, el
color final obtenido, varía. Así, por ejemplo, en el caso de la
histidina, la coloración, es de una tonalidad marrón.
Esta reacción, se respeta, en el caso en donde,
el grupo fenilo, se remplaza por otro ciclo y se sustituye de una a
tres veces por un grupo X, según la fórmula (I).
Los micro-organismos detectados
e identificados y/o cuantificados por la actividad enzimática del
tipo desaminasa según el procedimiento de la presente invención
pertenecen, principalmente, al grupo Proteus.
En una forma de realización muy preferencial,
según la presente invención, se añade, igualmente, al citado medio
de cultivo, por lo menos otro agente de detección que permita el
evidenciar, mediante la formación de un producto coloreado o
fluorescente, una actividad enzimática diferente de la que se
evidencia mediante el compuesto de la fórmula general (II). Puede
tratarse, por ejemplo, de una actividad estearasa, osidasa, o
peptidasa. Se pueden también obtener informaciones suplementarias,
en unión con una ausencia de coloración (o de fluorescencia), o en
unión con una coloración modificada con relación a la coloración
obtenida con un solo substrato enzimático. El otro agente de
detección de la fórmula (I), según la presente invención. Así, por
ejemplo, se elegirá otro agente de detección capaz de proporcionar
un producto reactivo que tenga un color diferente con respecto al
color obtenido con los agentes de detección de la fórmula (I). El
otro agente de detección (o segundo agente de detección),
permitirá, por lo tanto, el revelar, gracias a su color propio, o
gracias a su fluorescencia, la presencia de una actividad enzimática
de la cual éste es específico. Si la actividad enzimática del tipo
desaminasa, detectable por los agentes de detección de la fórmula
(I) en concordancia con la presente invención, se encuentra
igualmente presente, y es revelable por un color característico, se
obtendrá una coloración modificada, diferente del citado color
característico, y diferente, también, del citado color propio
proporcionado por el segundo agente de detección. En los ejemplos
que se facilitan posteriormente, a continuación, se proporcionan
ejemplos de utilización de varios agentes de detección, en el medio
de cultivo. En el bien entendido, los resultados obtenidos, pueden
variar, por una parte, mediante la elección del agente de
detección, según la invención, que se utilice, el segundo (o más)
agentes de detección utilizado(s), y los diferentes
microorganismos presentes en el medio de cultivo.
Los otros agentes de detección que sirven para
evidenciar las actividades enzimáticas diferentes son,
especialmente, pero no de una forma exclusiva, los derivados de
indoxilo, de cumarina, de resorufina, de naftol, de naftilamina, de
nitrofenol, de nitroanilina, de rodamina, de hidroxiquinoleína, de
fluoresceína, etc.
Entre estos otros agentes de detección que
pueden utilizarse en asociación con los agentes de detección en
concordancia con la presente invención, se pueden citar,
especialmente, la
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronida,
el
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
la
L-alanina-7-amino-4-metil-cumarina,
la
4-metil-umbelilferil-N-acetil-\beta-D-galactosaminida,
el
resurfin-\beta-D-galactósido,
el sulfato de \beta-naftilo, el naftol
AS-BI \beta-galactósido, la
L-alanina \beta-naftilamida, el
O-nitrofenol-\beta-D-galactósido,
la
carboxibenzoil-L-arginina-p-nitroanilida,
la rodamina 110 bis-(L-leucina amida), el diacetato
de fluoresceína.
Un segundo objeto de la presente invención, es
la utilización de compuestos que tienen la fórmula (I) general
siguiente:
en la
cual,
- R, representa un radical de aminoácido
cíclico, sustituido por 1 grupos X, elegido entre el metilo, el
bencilo, el carboxibenzoílo, el dansilo, la
naftalina-sulfonilo, el
tolueno-sulfonilo, el
mesitilen-sulfonilo,
para detectar e identificar y/o cuantificar una
actividad enzimática del tipo desaminasa de microorganismo.
La abreviación "N-im", para
un compuesto de la L-histidina, y
"N-im", para un compuesto del
L-triptofano, significa el hecho de que, el átomo
de nitrógeno del núcleo imidazol (His) o del átomo de nitrógeno del
núcleo indol (Trp), se encuentra sustituido.
Un tercer objeto de la presente invención, es un
agente de detección consistente en la
O-(2-naftaleno-sulfonil)tirosina.
Se prefiere, de una forma todavía más
particular, el hecho de que, X, se elija de entre el
naftaleno-sulfonilo, el
tolueno-sulfonilo y el
N-ind-mesitileno-sulfonilo.
Entre los compuestos sintetizados, los mejores
resultados, se han obtenido con la
O-naftaleno-sulfonil-L-tirosina,
la
O-tolueno-sulfonil-L-tirosina
y el
N-ind-mesitilen-2-sulfonil-L-triptofano.
Gracias a estos compuestos, ha sido posible desarrollar un medio de
cultivo, de gelosa, que permita detectar una colonia que exprese una
actividad enzimática del tipo desaminasa, comprendida en el seno de
cultivo pluri-microbiano. Adicionalmente, además,
la coloración marrón obtenida por estos compuestos, permanece en las
proximidades de la colonia desaminasa^{+}, y no afecta al aspecto
de las colonias desaminasa^{-}, incluso próximas.
Como ejemplo de agentes de detección
particularmente preferidos, en medio de gelosa, se pueden citar:
- la
O-naftaleno-sulfonil-tirosina.
- la
4-O-tolueno-sulfonil-L-tirosina.
- la
N-tolueno-sulfonil-L-histidina.
Se prefiere de una forma particular, igualmente,
el utilizar, en medio líquido, la
N-tolueno-sulfonil-L-histidina.
Un cuarto objeto de la presente invención, es el
procedimiento de preparación de los compuestos y de los agentes de
detección en concordancia con la invención, de fórmula general (I),
tal y como se define respectivamente, anteriormente, arriba, que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- - formilación del resto R,
- (b)
- - adición de una sal de X, sobre el resto R formilo, según (a)
- (c)
- - desformilación del resto R sustituido según (b).
Un quinto objeto de la presente invención, es un
medio de cultivo de microorganismos, el cual comprende, además de
los ingredientes necesarios para el cultivo de los citados
microorganismos, por lo menos un agente de detección, tal y como se
ha definido anteriormente, arriba.
Los agentes de detección de la fórmula
X-L-aminoácido cíclico, se utilizan
a unas concentraciones ponderales suficientes como para
proporcionar reacciones coloreadas observables. Estas
concentraciones, pueden determinarse mediante las experiencias de
rutina, por parte la persona experta en el arte especializado de la
técnica.
En una forma de realización preferida, la
concentración ponderal, del agente, o de los agentes de detección,
en el medio de cultivo, se encuentra comprendida dentro de unos
márgenes situados entre 0,025 y 5 g/l de medio de cultivo.
En una forma de realización muy preferida, la
concentración ponderal, del agente, o de los agentes de detección,
en el medio de cultivo, se encuentra comprendida dentro de unos
márgenes situados entre 0,1 y 2 g/l de medio de cultivo y, de una
forma preferible, ésta se encuentra comprendida dentro de unos
márgenes situados entre 0,2 y 0,6 g/l.
En otra forma de realización preferencial, el
medio de cultivo, comprende igualmente un agente revelador, de una
forma preferente, una sal de catión, por ejemplo, de citrato de
hierro amoniacal. La concentración del agente revelador, no es
limitativa, ésta puede ser inferior, igual, o superior a la del
agente de detección de la fórmula (I).
En otra forma preferencial de realización de la
presente invención, el medio de cultivo, se encuentra en forma de
gelosa.
En una forma de realización muy preferencial, en
concordancia con la presente invención, el medio de cultivo,
comprende igualmente por lo menos un agente de detección que permite
el evidenciar, mediante la formación de un producto coloreado o
fluorescente, una actividad enzimática diferente a la evidenciada
mediante el compuesto de la fórmula general (I).
Como ejemplo del medio de gelosa, se puede
incorporar
O-tolueno-sulfonil-L-tirosina
a 0,5 g/l de citrato de hierro, a 0,5 g/l, al medio de cultivo, en
el medio siguiente:
Extracto de corazón-cerebro
\dotl5 g/l
Bio-Soyasa
\dotl5 g/l
Tampón tris
\dotl1 g/l
Fosfato monopotásico
\dotl1 g/l
Agar
\dotl17,5 g/l
medio éste, el cual se puede
inocular con diferentes microorganismos a Gram negativo o a Gram
positivo. Solamente las cepas que pertenecen al grupo Proteus,
forman colonias marrones, después de una incubación de un transcurso
de tiempo de 18 a 24 horas. Las cepas que no pertenecen al grupo
Proteus, forman colonias que conservan el aspecto que éstas tienen
sobre el mismo medio, desprovisto de
O-tolueno-sulfonil-L-tirosina.
Las características y ventajas de la presente
invención, se ilustran mediante los ejemplos que se facilitan abajo,
a continuación.
Se procedió a disolver
L-tirosina (60 g, 0,33 mmol), en ácido fórmico al
98% (400 ml), y se enfrió a una temperatura de 10ºC. Se añadió
anhídrido acético (192 ml, 1,73 mol), en cuatro partes, durante un
transcurso de tiempo de cinco minutos, manteniendo,
simultáneamente, una temperatura de 10ºC. Se procedió, a
continuación, a agitar la mezcla, durante un transcurso de tiempo
de 60 minutos, a una temperatura de 10ºC, y se mantuvo, a
continuación, a la temperatura ambiente, durante un transcurso de
tiempo de 30 minutos. Se añadió agua (192 ml), bajo régimen de
agitación, a una temperatura de 10 - 15ºC, durante un tiempo de 30
minutos y, a continuación, la mezcla, se sometió a evaporación,
hasta la obtención de un residuo seco, bajo la acción de presión
reducida, a una temperatura de 70ºC. El sólido aceitoso residual,
se disolvió en un volumen mínimo de agua hirviendo y, a
continuación, se enfrió, para producir finos cristales, blancos, de
N-formil-L-tirosina
(60,6 g, 88%).
Procedimiento
A
Se procedió a disolver
N-formil-L-tirosina
(14,0 g, 0,668 mol), en acetona (250 ml) y, la solución, se diluyó
con agua (190 ml). El pH, se ajustó a un valor de 9,7, mediante la
adición de una solución de carbonato sódico saturado y, a
continuación, se procedió a añadir una solución de cloruro de
naftaleno-2-sulfonilo (15 g, 0,0668
mol) en acetona (42 ml), por goteo, durante un tiempo de 20 minutos,
a la temperatura ambiente, al mismo que se mantiene el valor pH a
un valor de 9,7, mediante la adición de una solución de carbonato
sódico. La mezcla, se agitó durante un tiempo de 60 minutos y
después, se dejó en reposo, durante un tiempo de 12 horas, después
de lo cual, la acetona, se evaporó en una gran parte, bajo una
presión reducida, a una temperatura de 50ºC. la solución residual,
se enfrió a una temperatura de 5ºC y, a continuación, se extrajo con
éter (2 x 50 ml). La fase acuosa, se acidificó, a continuación,
hasta la obtención de pH de un valor de aproximadamente 3,5,
produciendo un precipitado blanco, denso, el cual se recogió
mediante filtración, y se secó en una estufa, bajo la acción del
vacío, a una temperatura de 60ºC, para proporcionar un sólido de
color blanco (24,57 g, 92%).
Se procedió a poner la
N-formil-O-(2-naftaleno-sulfonil)-tirosina
(24,57 g, 0,0615 mol), en suspensión, en acetona (105 ml), y se
añadió en una pequeña cantidad, a una mezcla de reflujo de ácido
clorhídrico concentrado (240 ml) y de agua (240 ml). La mezcla, se
calentó a reflujo, durante un tiempo de 3 horas y, a continuación,
se vertió en agua (750 ml), bajo agitación, y enfriamiento a una
temperatura de 10ºC. El pH, se ajustó a un valor de 3,5 y, el
precipitado blanco resultante, se recuperó mediante filtración, y se
secó en una estufa, bajo la acción del vacío, a una temperatura de
50ºC, para proporcionar una materia en polvo, de color blanco,
limpia (21,25 g, 94%). El producto, podría todavía purificarse,
mediante una solución de hidróxido sódico acuoso, y la adición de
ácido. El rendimiento productivo del producto seco, era de un
79%.
El rendimiento total obtenido, a partir de la
L-tirosina, es del 65%.
\newpage
La síntesis de la
4-O-tolueno-sulfonil-L-tirosina,
se efectuó según dos procedimientos siguientes:
Procedimiento
A
El compuesto, se preparó en conformidad con el
procedimiento descrito en el ejemplo 1, pero procediendo a
sustituir el cloruro de
naftaleno-2-sulfonilo, por el
equivalente molar de cloruro de tolueno-sulfonilo.
El rendimiento total, en producto, era del 56%.
Procedimiento
B
Se procedió a disolver sulfato de cobre
pentahidratado (54 g, 20 mmol), en agua (100 ml), bajo régimen de
agitación, y se añadió, en continuo, una solución de hidróxido
potásico (2,25 g, 40 mml) en agua. Después de un transcurso de
tiempo de 15 minutos, la suspensión, se puso en reposo, se filtró y,
el residuo, se lavó con una pequeña cantidad de agua y, a
continuación, se secó parcialmente, para producir un "residuo
azul".
Se procedió a poner L-tirosina
(7,2 g, 40 mmol), en suspensión, en agua (100 ml) y se añadió
hidróxido potásico acuoso (3,36 g, 60 mmol). A esta solución
caliente, se le añadió hidróxido de cobre, anteriormente preparado,
arriba. La solución resultante, de tonalidad de color azul oscuro,
del complejo de cobre, se acidificó cuidadosamente, hasta un pH 8.
El precipitado de color púrpura, el cual se formó progresivamente,
se aisló mediante filtración, se lavó con agua y metanol, y se secó
al aire, para proporcionar 7,4 g de complejo. Éste, se puso en
suspensión, en metanol (80 ml), y se procedió a añadir una solución
decarbonato sódico (3,7 g, 35 mmol), bajo agitación. El complejo de
cobre, el cual solamente se disolvió, necesitó la utilización de
metanol, para clarificarlo. A la solución agitada, filtrada, se le
añadió, de una forma gradual, una solución de cloruro de
4-tolueno-sulfonilo (6,55 g, 35
mmol) en metanol (60 ml). El pH, se mantuvo a un valor comprendido
entre 9 y 11, mediante la adición periódica de carbonato de sodio
acuoso. Después de un transcurso de tiempo de 2 horas, la
suspensión, se filtró y el residuo, se lavó con metanol. Las etapas
de lavado y de filtración, se combinaron y, la suspensión, se
sometió a evaporación, a una temperatura de 45ºC, para extraer el
metanol.
El sólido de color azul resultante, se
descompuso mediante agitación vigorosa, con ácido clorhídrico (15
ml) y hielo (30 g). El sólido de color verde pálido, se extrajo y
se disolvió directamente en agua caliente (100 a 120 ml). Un
enfriamiento y ajuste del pH a un valor de 7,5, produjeron una gran
cantidad de un precipitado blanco. Éste, se extrajo mediante
filtración. El residuo, se redisolvió en un volumen similar de agua
caliente, que contenía EDTA (300 mg), para retirar las trazas de
iones cúpricos y, el pH, se ajustó, de nuevo, a un valor de 7,5. El
producto, se aisló en forma de un sólido de color blanco plateado,
después de filtración y secado (6,1 g, 52%).
Se procedió a disolver
N-a-t-BOC-L-tirosina
(2,81 g, 10 mmol), en piridina anhidra (15 ml). A esta solución, se
le añadió, lentamente, cloruro de 2,4-6
trimetilbenzoílo (1,92 g, 10,5 mmol). La temperatura, se mantuvo a
un nivel comprendido dentro de unos márgenes situados entre 15ºC y
25ºC. Después de una agitación durante un transcurso de tiempo de
30 minutos, la mezcla reactiva, se vertió sobre agua helada. El
sólido pegajoso, se sometió a una extracción en diclorometano (2 x
50 ml) y, la capa orgánica, se secó sobre sulfato magnésico
anhidro. La evaporación del disolvente, condujo a la obtención de un
sólido vidrioso, que cristalizaba lentamente.
El producto, se desprotegió, procediendo a
disolverlo en una pequeña cantidad de acetato de etilo, y mediante
la adición de cloruro de hidrógeno (3 M), en acetato de etilo (5
ml). La solución agitada gradualmente, se depositó en forma de un
sólido blanco. Se obtuvo una precipitación máxima, mediante la
adición de dietil-éter (30 ml).
El producto, se extrajo mediante filtración,
bajo la acción del vacío, se lavó con éter, y se secó en un
desecador bajo la acción del vacío (2,5 g, 69%).
Se procedió a poner en suspensión
N-a-t-BOC-N-in-mesitilen-2-sulfonil-L-triptofano
(1,0 g, 1,5 mmol), en acetato de etilo (5 ml) y, a la solución
agitada, se añadió una solución de cloruro de hidrógeno (3 M) en
acetato de etilo (2,5 ml). Se formó un precipitado blanco,
rápidamente, y se intensificó al mismo tiempo que la agitación.
Después de un transcurso de tiempo de 2 horas, la suspensión, se
filtró y, el residuo, se lavó con éter, se secó y se almacenó. Si
bien la cromatografía en capa fina, mostraba únicamente un
componente (bajo la visualización mediante ultravioleta), el
producto, se encontraba probablemente contaminado con cloruro de
diciclohexilamonio. No se efectuó ningún ensayo, para extraer este
contaminante y, el producto, se utilizó tal cual, para ser sometido
a test de ensayo. El rendimiento productivo, fue de 0,68 g.
Se procedió a disolver la
N-a-t-BOC-N-im-tosil-L-histidina
(1,0 g, 2,44 mmol), en una solución de cloruro de hidrógeno (3 M)
en acetato de etilo (5 ml). Después de agitación durante un tiempo
de 2 horas, el compuesto, se aisló bajo la forma de una sal de
hidrocloruro, tal y como se describe en el ejemplo 4, y proporcionó
un sólido de color blanco (0,64 g, 76%).
De la misma manera, se procedió a preparar la
O-(2,6-diclorobencil)-L-tirosina,
la
N-im-benciloxicarbonil-L-histidina,
y la
Np-benciloximetil-L-histidina,
mediante protecciones de intermediarios comercialmente obtenible en
el mercado, para la síntesis de los péptidos.
Se procedió a realizar ensayos, para ilustrar el
interés de los compuestos de la fórmula (I), en concordancia con la
presente invención, para la detección de las bacterias del género
Proteus, sobre medios gelificados.
Se procedió a preparar dos medios, según las
técnicas habituales. Éstos, tenían la misma composición, con la
excepción del agente de detección utilizado para la evidenciación de
la actividad enzimática del tipo desaminasa.
La composición de los medios I y II, para un
litro del medio final, es la siguiente:
Extracto de corazón-cerebro
(BioMerieux)
\dotl5 g/l
Bio-Soyasa (BioMerieux)
\dotl5 g/l
Tampón tris (Prolabo)
\dotl1 g/l
Fosfato monopotásico (Merk)
\dotl1 g/l
Agar (BioMerieux)
\dotl17,5 g/l
Citrato de hierro amoniacal (Sigma)
\dotl0,5 g/l
El valor pH del medio, se ajusta a un valor de
aproximadamente 7,2.
En el medio, el agente de detección de la
actividad enzimática de tipo desaminasa, utilizado, es el aminoácido
natural L-tirosina, a 1,5 g/l; en el medio II, el
agente de detección de la actividad enzimática del tipo desaminasa,
utilizado, es la
4-O-tolueno-sulfonil-L-tirosina,
a 0,5 g/l.
Sobre estos dos medios, se cultivaron,
directamente, 12 cepas de bacterias, en placas de Petri. Las cepas
procedentes de la colección de la firma solicitante, pertenecen a
las especies siguientes: Escherichia coli (2 cepas),
Enterobacter cloacae (1 cepa), Morganella morganii (2
cepas), Proteus mirabilis (2 cepas), Proteus vulgaris
(2 cepas), Enterococus faecalis (1 cepa), Staphilococcus
sprophyticus (1 cepa). Además, se cultivó también, en placas de
Petri, una mezcla de una cepa de E. coli y de una cepa de
P. mirabilis. Las colonias formadas, se examinaron
visualmente, respectivamente, después de un tiempo de 24 y de 48
horas de incubación, según las interpretaciones siguientes:
- las colonias marrones, corresponden a cepas
que producen una desaminasa perteneciente, a priori, al grupo
Proteus (representado aquí, mediante las especies: M.
morganii, P. mirabilis, P. vulgaris),
- las colonias blancas, corresponden a cepas que
no producen la enzima anteriormente citada, perteneciendo éstas,
pues, a otras especies de bacterias que deberán entonces
identificarse con la ayuda de las técnicas habituales.
- la difusión del precipitado marrón, alrededor
de la colonia, se aprecia, según una escala
semi-cuantitativa (ninguna, débil, fuerte).
- los resultados, se presentan en la tabla I
que se facilita a continuación.
1 : colonias marrones
* : número de cepas, "-" = 0.
\newpage
Tal y como resalta de la tabla I facilitada
anteriormente, arriba, el procedimiento según la presente invención,
permite una detección de las bacterias del grupo Proteus. En
efecto, para el cultivo sobre el Medio I, no se distingue más que
un tipo de colonias marrones translúcidas, sobre un fondo de un
medio de color naranja, mientras que, sobre el medio II en
concordancia con la presente invención, resaltan dos tipos de
colonias: las unas, marrones y, las otras, traslúcidas, sobre el
fondo de un medio incoloro a marrón, en las cercanías de las
colonias coloreadas.
Mientras que, el procedimiento según la presente
invención, se encuentra adatado de una forma más ventajosa a la
detección de una actividad enzimática, del tipo desaminasa, en medio
gelificado o sobre un soporte sólido, éste puede igualmente
utilizarse en medio líquido.
Se procedió a preparar dos medios, según las
técnicas habituales. Éstos tienen la misma composición, con la
excepción del agente de detección utilizado para revelar la
actividad enzimática del tipo desaminasa.
La composición de los medios III y IV, para un
litro del medio final, es la siguiente:
Extracto de
corazón-cerebro(BioMerieux)
\dotl5 g/l
Bio-Soyasa (BioMerieux)
\dotl5 g/l
Tampón tris (Sigma)
\dotl1 g/l
Fosfato monopotásico (Merk)
\dotl1 g/l
Citrato de hierro amoniacal (Sigma)
\dotl0,5 g/l
El pH del medio, se ajustó a un valor de
aproximadamente 7,2.
En el medio III, el agente de detección de la
actividad enzimática del tipo desaminasa utilizado, es el aminoácido
natural L-histidina, a 1,5 g/; en el medio IV, el
agente de detección de la actividad enzimática del tipo desaminasa,
utilizado, es la
N-tolueno-sulfonilo-L-histidina,
a 0,5 g/l. Los medios, se repartieron estérilmente, en tubo de
ensayo.
Estos dos medios, se inocularon con 12 cepas de
bacterias descritas en el ejemplo 6. Los tubos, se incubaron
durante un transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de
37ºC, y se examinaron visualmente, después de un transcurso de
tiempo de 48 horas, según la interpretación siguiente:
- el amarronamiento del tubo, se traduce por la
presencia de una actividad enzimática del tipo desaminasa y, por lo
tanto, de una bacterias del grupo Proteus.
- la ausencia de amarronamiento, significa la
ausencia de bacteria del grupo Proteus.
Los resultados obtenidos, se recopilan en la
tabla II que se facilita abajo, a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
* : número de cepas, "-" = 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como resalta de la tabla II facilitada
anteriormente, arriba, en medio líquido, el agente de detección
según la presente invención, permite, como la histidina, el
diferenciar bacterias pertenecientes al grupo Proteus, de la que no
pertenecen a dicho grupo, con una sensibilidad y una especificidad
elevada, después de un transcurso de tiempo de 48 horas.
Se procedió, asimismo, a proceder a realizar
tests de ensayo, para valorar la posibilidad de detectar,
simultáneamente, una actividad enzimática del tipo desaminasa según
la presente invención, así como otra actividad enzimática.
\newpage
Para ello, se procedió a preparar tres medios,
según las técnicas habituales. El primero (Medio V), corresponde al
Medio II del ejemplo 6, en el cual, la
4-O-tolueno-sulfonilo-L-tirosina,
se reemplazó por
4-O-dansil-L-tirosina,
a la misma concentración, y el segundo (Medio V), corresponde al
mismo medio, pero con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
a 0,1 g/l, en lugar del substrato de desaminasa, y correspondiendo,
el tercero (Medio VII), al medio VI aditivado con
4-O-dansil-L-tirosina,
a 0,5 g/l.
Sobre estos tres medios, las 12 cepas de
bacterias descritas en el ejemplo 6, se cultivaron directamente en
placas de Petri. Adicionalmente, además, se cultivó igualmente una
mezcla de una cepa de K. pneumoniae y de una cepa de P. mirabilis,
en placa de Petri. Las placas, se incubaron a una temperatura de
37ºC, durante un transcurso de tiempo de 24 horas. Las colonias
formadas, se examinaron visualmente, después de un tiempo de
incubación de 24 horas, según las interpretaciones siguientes:
- las colonias marrones, correspondían a cepas
que producían una desaminasa perteneciente, a priori, al
grupo Proteus (la cual se encuentra representada, aquí, por las
especies: M. morganii, P. mirabilis, P. vulgaris),
- las colonias azules, correspondían a las
cepas que expresaban una actividad
\beta-D-glucósido, y que
hidrolizaban al
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido;
- las colonias blancas, correspondían a las
cepas que no producían las enzimas anteriormente citadas,
arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados obtenidos, se recopilan en la
tabla III que se facilita abajo, a continuación:
Tal y como resalta de la tabla III facilitada
anteriormente, arriba, el procedimiento según la presente
invención, permite una detección de las bacterias del grupo
Proteus, y no interfiere con las colonias
\beta-gluosidae, incluso en las formas en
mezclas. En efecto, para el cultivo e la mezcla de K. pneumoniae y
de P. mirabilis, sobre el Medio VII, se distinguen perfectamente
los dos tipos de colonias, las unas marrones y las otras azules.
Adicionalmente, además, si una bacteria expresa simultáneamente las
dos actividades enzimáticas (\beta-glucosidae y
desaminasa), esto se traduce por la formación de colonias que tienen
un color resultante de una mezcla de color azul y de color marrón,
tal y como es el caso para una cepa de P. vulgaris sobre el medio
VII.
El procedimiento y los compuestos en
concordancia con la presente invención, se encuentran, de una forma
especial, perfectamente adaptados al aislamiento y a la
identificación de los miroorganismos urinarios. El medio VIII, se
ha desarrollado para esta aplicación, y tiene la composición
siguiente:
Extracto de corazón-cerebro
(BioMerieux)
\dotl5 g/l
Bio-Soyasa (BioMerieux)
\dotl5 g/l
Tampón tris (Sigma)
\dotl1 g/l
Fosfato monopotásico (Merk)
\dotl1 g/l
Citrato de hierro amoniacal (Sigma)
\dotl0,5 g/l
4-O-tolueno-sulfonilo-L-tirosina
\dotl0,4 g/l
5-bromo-4-cloro-indolil-\beta-D-glucósido
(Biosynth)
\dotl0,06 g/l
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronido(Biosynt)
\dotl0,25 g/l
Metil-\beta-D-glucuronido
(Sigma)
\dotl0,1 g/l
El pH del medio, se ajustó a un valor de
aproximadamente 7,2.
Sobre este medio, se procedió a cultivar,
directamente, en placas de Petri, 25 cepas de bacterias. Las cepas
procedentes de la colección del solicitante, pertenecen a las
especies siguientes: E. coli (3 cepas), Citrobacter
diversus (2 cepas), E. cloacae (2 cepas), K.
peneumoniae (2 cepas), M. morganii (2 cepas), P.
mirabilis (3 cepas), P. vulgaris (2 cepas), E.
faecalis (2 cepas), Staphilococcus aureus (2 cepas),
S. sprophyticus (3 cepas), Candida albicans (2 cepas).
Adicionalmente, además, se cultivó también, en placas de Petri, una
mezcla de una cepa de E. coli, de una cepa de K.
pneumoniae y de una cepa de P. mirabilis. Las colonias
formadas, se examinaron visualmente, respectivamente, después de un
tiempo de 24 y de 48 horas de incubación, según las interpretaciones
siguientes:
- las colonias marrones, corresponden a cepas
que producen una desaminasa perteneciente, a priori, al grupo
Proteus (representado aquí, mediante las especies: M. morganii,
P. mirabilis, P. vulgaris);
- las colonias rosa-tirio
corresponden a cepas que producen una
\beta-D-glucuronidasa, que
pertenecen a priori, a la especie E. coli;
- las colonias rosa-tirio
corresponden a cepas que producen una
\beta-D-glucuronidasa,
pertenecientes, a priori, o bien ya sea al grupo de la
Klebsiella/Enterobacter/Serratia, o bien ya sea al grupo
Entorococcus;
- las colonias blancas, corresponden a cepas que
no producen las enzimas anteriormente citadas, perteneciendo éstas,
pues, a otras especies de bacterias o de levaduras, que deberán
entonces identificarse con la ayuda de las técnicas habituales.
- los resultados, se presentan en la tabla IV
que se facilita abajo, a continuación.
* : número de cepas, "-" = 0.
Mezcla p. micro. = mezcla plurimicrobiana
* : número de cepas, "-" = 0.
Tal y como se desprende de la tabla IV
facilitada anteriormente, arriba, el procedimiento en concordancia
con la presente invención, permite una detección de las principales
bacterias urinarias, incluyendo las que se encuentran en mezclas. En
efecto, es posible el detectar, sobre el medio VIII, cuatro tipos
de colonias diferentes (incolora, rosa-tirio, azul y
marrón), incluso en el caso de cultivo plurimicrobiano. Un medio de
este tipo, es particularmente de utilidad, debido al hecho de que,
éste, permite detectar, desde el aislamiento, la gran mayoría de los
microorganismos urinarios, simplificando este proceso, y la
identificación, y el análisis de las muestras por muy complejas que
sean, aportando, por lo tanto, de este modo, simultáneamente, una
ganancia en la calidad del análisis y en su costo.
Claims (18)
1. Procedimiento de detección y de
identificación y/o cuantificación de una actividad enzimática del
tipo desaminasa, de microorganismos, según el cual, se procede a
poner en contacto un inóculo susceptible de poder contener un
microorganismo que tenga una actividad desaminasa, con un medio de
cultivo para microorganismos,
caracterizado por el hecho de que, el
medio de cultivo, comprende, por lo menos, un agente de detección,
el cual permite evidenciar, mediante la formación de un producto
coloreado con un agente revelador, una actividad enzimática del tipo
desaminasa,
siendo el citado agente de revelación, un
L-aminoácido
de la fórmula (I) general siguiente:
en la
cual,
- R, representa un radical de aminoácido
cíclico, sustituido por 1 a 3 grupos X, idénticos o diferentes,
- X, representa un grupo que limita la difusión
del \alpha-aminoácido, mediante la desaminación de
aminoácido cíclico, y X, se elige de entre el metilo, el bencilo,
el carboxibenzoílo, el dansilo, la
naftalina-sulfonilo, el
tosil-sulfonilo, el
mesitilen-sulfonilo.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, el agente revelador, es
una sal de catión.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, el agente revelador, se
añade al medio de cultivo, al mismo tiempo que el agente de
detección.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, el agente revelador, se
añade al medio de cultivo, después de la puesta en cultivo de los
microorganismos.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, los microorganismos
detectados e identificados y/o cuantificados por la actividad
enzimática del tipo desaminasa, pertenecen al género Proteus.
6. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que se procede a añadir,
también, al citado medio de cultivo, por lo menos otro agente de
detección, el cual permite evidenciar, mediante la formación de un
producto coloreado o fluorescente, una actividad enzimática
diferente de la evidenciada mediante el compuesto de la fórmula
general (I).
7. Agente de detección, consistente en la
O-(2-naftaleno-sulfonil)tirosina.
8. Utilización de un compuesto que tiene la
fórmula general (I) siguiente:
en la
cual,
- R, representa un radical de aminoácido
cíclico, sustituido por un grupo X,
- X, se elige de entre el metilo, el bencilo, el
carboxibenzoílo, el dansilo, la naftalina-sulfonilo,
el tosil-sulfonilo, el
mesitilen-sulfonilo,
para detectar e identificar y/o cuantificar una
actividad enzimática del tipo desaminasa de microorganismo.
9. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que, el compuesto, es la
O-(2-naftaleno-sulfonil)-tirosina.
10. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que, el compuesto, es la
4-O-tolueno-sulfonil)-L-tirosina.
11. Utilización, según la reivindicación 8,
caracterizada por el hecho de que, el compuesto, es la
N-tolueno-sulfonil-histidina.
12. Procedimiento de preparación de los
compuestos según la reivindicación 8, que comprende las etapas
siguientes:
- (d)
- - formilación del resto R,
- (e)
- - adición de una sal de X, sobre el resto R formilo, según (a)
- (f)
- - desformilación del resto R sustituido según (b).
13. Medio de cultivo de microorganismos, el cual
comprende, además de los ingredientes necesarios para el cultivo de
los citados microorganismos, por lo menos un agente de detección, o
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
14. Medio de cultivo, según la reivindicación
13, caracterizado por el hecho de que, la concentración
ponderal, del agente, o de los agentes de detección, se encuentra
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,025 y 5 g/l de
medio de cultivo.
15. Medio de cultivo, según las reivindicaciones
13 y 14, caracterizado por el hecho de que, la concentración
ponderal, del agente, o de los agentes de detección, se encuentra
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,1 y 2 g/l de
medio de cultivo y, de una forma preferible, ésta se encuentra
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,2 y 0,6
g/l.
16. Medio de cultivo, según la reivindicación
13, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende
igualmente un agente revelador, de una forma preferible, una sal de
catión, por ejemplo, citrato de hierro amoniacal.
17. Medio de cultivo, según la reivindicación
13, caracterizado por el hecho de que, éste es en forma de
medio de gelosa.
18. Medio de cultivo, según las reivindicaciones
13 y 17, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende
igualmente por lo menos otro agente de detección, el cual permite
evidenciar, mediante la formación de un producto coloreado o
fluorescente, una actividad enzimática diferente de la evidenciada
mediante el compuesto de la fórmula general (I).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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