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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und
Identifizieren und/oder Quantifizieren einer Enzymaktivität des Desaminasetyps
in einem Kulturmedium für
Mikroorganismen und ein Nachweismittel, das an dieses Verfahren
angepasst ist, das Verfahren zur Herstellung dieser Nachweismittel
und -verbindungen, sowie die Kulturmedien für die Durchführung dieses
Verfahrens.
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Der
Nachweis und die Identifikation von Mikroorganismen sind äußerst wichtig,
insbesondere in der Medizin, der Agrar- und Nahrungsmittelsindustrie,
für die
Umweltkontrolle (Wasser usw.). Die Mikroorganismen können aufgrund
ihrer Pathogenität,
als Indikatoren für
eine Kontamination, für
die Durchführung
von Herstellungsverfahren und andere Zwecke untersucht werden.
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Techniken
für den
Nachweis und die Identifikation von Mikroorganismen beruhen derzeit
auf der Untersuchung von charakteristischen Nukleotidsequenzen,
der Untersuchung von Antigenen oder Antikörpern, der Kultivierung in
einem selektiven oder nichtselektiven Medium oder auch auf der Untersuchung
von Stoffwechselaktivitäten,
insbesondere Enzymaktivitäten
(zum Beispiel Osidase-, Esterase-, Peptidase-Oxydaseaktivitäten usw.).
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Am
häufigsten
vereinigen die Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren und/oder
Quantifizieren von Mikroorganismen mehrere der genannten Techniken.
So wird das Kultivieren für
die Vermehrung und Selektion der untersuchten Mikroorganismen eingesetzt.
Um ihren Nachweis zu erleichtern, wurde vorgeschlagen, biochemische
Aktivitäten
dadurch nachzuweisen, daß man
Moleküle,
die zu einer Färbung
oder einer Fluorescenz führen,
direkt dem Kulturmedium zugibt. Solche Medien werden als Nachweismedien
bezeichnet. Die biochemischen Aktivitäten können mit unterschiedlichen
Methoden nachgewiesen werden, wie z.B.:
- – chemisch-physikalische
Veränderung
des Mediums: Veränderung
des pH-Werts in Gegenwart eines gefärbten Indikators oder eines
fluoreszierenden Indikators (Methyl-umbelliferon usw.),
- – die
Veränderung
des Redoxpotentials wird mit Hilfe eines gefärbten Indikators (Tetrazoliumsalze
usw.) oder eines fluoreszierenden Indikators ( EP-A-0 424 293 ) nachgewiesen,
- – Hydrolyse
von Molekülen,
die eine gefärbte
oder fluoreszierende Verbindung freisetzten (Indoxyl, Naphthol,
Cumarin usw.),
- – Reaktion
zwischen einem von den Mikroorganismen produzierten Molekül mit einer
in dem Medium vorliegenden Verbindung, die zu einer Färbung führt (Indolnachweis,
James et al., 1986).
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Es
ist bekannt, daß sich
mit Agar verfestigte Medien (oder feste Medien) besonders gut für die Kultur und
Isolation von Mikroorganismen ausgehend von einer Probe sowie für den Nachweis
von "Ziel"-Mikroorganismen
innerhalb einer Mischung von Mikroorganismen-taxa eignen.
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Ein
Verfahren zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Gruppe Proteus
und anderen Enterobakterien ist bekannt (Sverre Dick Henriksen,
Staatliches Institut für
Gesundheitswesen, Bacteriologische Abteilung, Oslo, Norwegen, 6.
Juni 1950). Bei diesem Verfahren werden gleiche Mengen D- und L-Phenylanalin
in Gegenwart eines Eisensalzes in einem mit Agar verfestigten Medium
eingesetzt. Die erhaltene grün
gefärbte
Reaktion wird im Vergleich mit dem Ureasetest als schwierig durchzuführender
Test beschrieben, obwohl sie sich gut für die Identifikation der Proteus-Gruppe
eignet.
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Ebenfalls
bekannt ist die Arbeit von Giammanco & Pignato ("Rapid identification of micro-organisms from
urinary tract infections by betaglucuronidase, phenylalanine deaminase,
cytochrome oxidase and indole tests an isolation media", [Schnellidentifikation
von Mikroorganismen von Harnwegsinfektionen durch beta-Glucuronidase; Phenylalanindesaminase;
Cytochromoxidase- und Indoltests auf Isolationsmedien], Journal of
Medical Microbiology, Bd. 41, Nr. 6, Dezember 1994, Seiten 389-392),
die den Einsatz von natürlichen
Aminosäuren
wie Tryptophan und Phenylalanin in Kombination mit einem Eisensalz
(FeCl3) für den Nachweis einer Desaminaseaktivität von Bakterien
der Gruppe Proteeae beschreibt.
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Ebenfalls
bekannt ist die Arbeit von Manafi & Rotter ("A new plate medium for rapid presumptive
identification and differentiation of Enterobacteriaceae" [Neues Plattenmedium
für die
vermutete Schnellidentifikation und -differenzierung von Enterobacteriaceae],
International Journal of Food Microbiology, Band 14, Nr. 2, November
1991, Seiten 127-134), die die Verwendung von Tryptophan alleine
mit einem Eisensalz (Eisen(III)-ammoniumcitrat) für den Nachweis
einer Desaminaseaktivität
von Bakterien der Gruppe Proteeae beschreibt. In dieser Arbeit wird
für andere
Enzymaktivitätsmarker
(4-Methylumbelliferon, Nitrophenyl) erwähnt, daß ein Diffundieren dieser Marker
von Nachteil ist. Die einzige Lösung,
um diesen Effekt auf ein Minimum zu reduzieren, besteht darin, die
Medien kürzer
zu inkubieren.
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Ebenfalls
bekannt ist die Arbeit von "Peloux & Lefort "Lysinedeaminase of
the Proteus-Providencia group by means of the Edwards and Fife lysine-iron
medium. Practical value of this medium for differentiating enterobacteria" [Lysindesaminase
der Proteus-Providencia-Gruppe
mit Hilfe des Lysin-Eisen-Mediums nach Edwards und Fife. Praktischer
Wert dieses Mediums zur Differenzierung von Enterobakterien], FEUILL.
BIOL., Band 13, Nr. 68, 1972, Seiten 37-42) in der die Aktivität von drei
Aminosäuren
(Tryptophan, Phenylalanin und Lysin) für den Nachweis der Desaminase
gemeinsam mit einem Eisensalz verglichen wird.
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Ebenfalls
bekannt ist die Arbeit von Sivolodskii ("Modification of a method for the determination
of tryptophan deaminase and phenylalanin deaminase content in bacteria" [Modifikation eines
Verfahrens zur Bestimmung des Tryptophandeaminase- und Phenylalanindeaminasegehalts
in Bakterien], LAB. DELO., Nr. 3, 1982, Seiten 166-168), in der
vorgeschlagen wird, enzymatische Proteinhydrolisate, die aus Mischungen
von natürlichen
Aminosäuren,
Peptiden und anderen Verbindungen bestehen, für den Nachweis von Tryptophan-
und Phenylalanindeaminase-Aktivitäten zuzusetzen.
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Ebenfalls
bekannt ist die Patentanmeldung
WO-A-92/00068 , in der substituierte Histidinverbindungen, die
als Antagonisten der Angiotensin-II-Rezeptoren wirken, beschrieben
werden.
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Diese
Verbindungen, gemäß Formel
(I) und den Beispielen, enthalten unter anderem die Substitution der
Amino- oder Carboxylgruppe.
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Ebenfalls
bekannt sind die Patente
US-A-5,643,743 und
US-A-5,411,867 ,
die Tryptophan für
den Nachweis der Tryptophanase, eines Enzyms, das sich von den Desaminasen
unterscheidet, beschreiben.
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Ebenfalls
bekannt ist das Patent
US-A-4,603,108 ,
das D,L-beta-(p-Nitrophenyl)-alanin als Substrat für den Nachweis
der Phenylanalindesaminase beschreibt. Das Ablesen der Reaktion
erfolgt entweder bei 480 nm ohne Zusatz eines Entwicklers für die Phenylalanindesaminase
oder durch quantitative Bestimmung des Ammoniak für die Leucindesaminase.
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Schließlich ist
auch das Patent
US-A-5,541,082 bekannt,
das die Aminosäuren
Phenylalanin und Tryptophan für
den Nachweis von Desaminasen beschreibt, wobei man mit diesen Aminosäuren eine
Orangefärbung
erhält,
die in das Medium diffundiert.
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Diese
Arbeiten beschreiben die Verwendung von natürlichen Aminosäuren, was
mit einer Limitierung der Diffusion der α-Ketosäure unvereinbar ist. Die einzige
Lösung,
die in manchen dieser Schriften vorgeschlagen wird, besteht wiederum
darin, die Inkubationszeit zu limitieren, was sich sehr negativ
auf die Qualität
des Nachweises auswirkt. Nun ist Einschränkung der Diffusion ein Maß für die Differenzierung
von mehreren Mikroorganismenkolonien, die in ein- und demselben
Medium vorhanden sind. Diese Dokumente beschreiben also die Verwendung
von künstlichen
und modifizierten Aminosäuren,
die nicht der Formel (I) entsprechen und können weiterhin eine unterschiedliche
Anwendung vorschlagen, wie zum Beispiel den Antagonismus mit Angiotension-II-Rezeptoren.
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Trotz
der derzeit am Markt erhältlichen
biochemischen Tests ist man sich darüber im klaren, daß man derzeit über keine
besonders gut geeigneten und leicht durchzuführenden Mittel, insbesondere
auf mit Agar verfestigtem Medium, zum Nachweisen und Identifizieren
und/oder Quantifizieren einer Enzymaktivität des Desaminasetyps von Mikroorganismen
in einer Kultur von mehreren Mikroorganismen verfügt.
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Dieses
Problem soll nun mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden.
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Ein
erster Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen
und Identifizieren und/oder Quantifizieren einer Mikroorganismen-Enzymaktivität des Desaminasetyps,
bei dem man ein Inokulum, das einen Mikroorganismus mit Desaminaseaktivität enthalten
kann, mit einem Kulturmedium für
Mikroorganismen in Kontakt bringt,
wobei das Kulturmedium mindestens
ein Nachweismittel enthält,
mit dem man durch Bildung eines gefärbten Produkts mittels eines
Entwicklers eine Enzymaktivität
des Desaminasetyps nachweisen kann,
wobei es sich bei dem Nachweismittel
um eine zyklische L-Aminosäure
der folgenden allgemeinen Formel (I) handelt:
in der
- – R einen
zyklischen Aminosäurerest
bedeutet, der durch 1 bis 3 gleiche oder verschiedene Gruppen X
substituiert ist,
- – X
eine Gruppe bedeutet, die die Diffusion der durch Desaminierung
der zyklischen Aminosäure
erzeugten α-Ketosäure limitiert,
und aus der Reihe Methyl, Benzyl, Carboxybenzyl, Dansyl, Naphthalinsulfonyl,
Tosylsulfonyl und Mesitylensulfonyl stammt,
wobei die Verbindung
der Formel (I) durch verschiedene Gruppen, die nicht die Funktion
der Gruppe X stören,
substituiert sein kann.
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Unter "Gruppe, die die Diffusion
limitiert" versteht
man:
- – jede
Gruppe des hydrophoben Typs, die die Diffusion in ein hydrophiles
Medium limitiert, oder
- – jede
Gruppe, die sich an schwache Bindungen, insbesondere hydrophobe
schwache Bindungen, an die Bestandteile von Mikroorganismenzellen
wie die Wand, die Membran, die Proteine usw. anlagern kann bzw. die sich
mit einer oder mehreren kovalenten Bindungen, insbesondere Thiolbindungen,
an diese Bestandteile binden kann.
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Als
Test um die Gruppen, die die Diffusion limitieren, zu definieren,
führt man
mittig von zwei Petrischalen eine Spot-Inokulation mit einer zyklischen
L-Aminosäure
und einem erfindungsgemäßen Nachweismittel durch.
Man mißt
die Durchmesser der Diffusion der durch die Enzymaktivität des Desaminasetyps
des Inokulationsmittels erzeugten α-Ketosäuren. Der Durchmesser der Diffusion
des erfindungsgemäßen Nachweismittels
muß kleiner
als der der zyklischen L-Aminosäure sein,
es wird nun angenommen, daß das
Nachweismittel die Diffusion der durch Desaminierung der L-Aminosäure erzeugten α-Ketosäure limitiert.
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Unter "Rest R einer zyklischen
Aminosäure" versteht man zyklische
oder heterozyklische Reste R wie Indol, Phenyl, Hydroxyphenyl und
Imidazol, die durch eine Gruppe X substituiert sein können. Diese
Aminosäuren
umfassen die natürlichen
oder synthetischen oder modifizierten, insbesondere durch Substitution
modifizierten, Aminosäuren.
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Unter "Gruppe, die nicht
die Funktion der Gruppe X stört" versteht man jede
Gruppe, die nicht die Gruppe X daran hindert, die Diffusion der α-Ketosäure zu limitieren.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
verhindert der Zusatz von mindestens einem Nachweismittel in geeigneter
Konzentration nicht, daß sich
die Mikroorganismen in dem entsprechenden Kulturmedium vermehren.
Man kann daher das Nachweismittel so einsetzen, daß man es
vor dem Beginn der Kultur oder zum Beginn der Kultur zu dem Kulturmedium
der Mikroorganismen zugibt.
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Einer
der großen
Vorteile des Verfahrens, bei dem erfindungsgemäße Nachweismittel eingesetzt
werden, ist, daß es
bei Vorhandensein einer Enzymaktivität des Desaminasetyps nach Versetzen
mit einem Entwickler zu gefärbten
Produkten führt,
die nicht in das Medium, insbesondere ein geliertes Medium, diffundieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann daher vorteilhaft in einem gelierten Medium eingesetzt werden.
Es kann natürlich
auch in einem Flüssigmedium
oder an einem festen Träger
ohne Gelbildner eingesetzt werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
es, Mikroorganismen mit einer Enzymaktivität des Desaminasetyps in einem
Medium mit verschiedenen Mikroorganismen nachzuweisen und zu identifizieren,
ja sogar zu quantifizieren, ohne den Nachweis von anderen Mikroorganismen
zu stören.
Ganz im Gegenteil ermöglicht
es das erfindungsgemäße Verfahren
aufgrund der erzeugten Enzymreaktionen auf klare Weise durch Farben,
die die Art des Mikroorganismus definieren, den Mikroorganismus,
bzw. die Mikroorganismen in dem Medium aufzuzeigen.
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Abgesehen
vom Nachweis und der Identifikation einer Enzymaktivität des Desaminasetyps
in einem Kulturmedium weist das erfindungsgemäße Verfahren daher den Vorteil
auf, daß es
einfach und kostengünstig durchzuführen ist.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
handelt es sich bei dem Entwickler um ein Kationensalz.
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Das
Kationensalz, das das Nachweismittel durch Bildung eines gefärbten Produkts
anzeigen kann, kann dem Kulturmedium gleichzeitig mit dem Nachweismittel
oder auch nach der Kultur der Mikroorganismen zugegeben werden.
Der Fachmann weiß ja
je nach dem verwendeten Kulturmedium, ob es vorteilhafter ist, oder
ob es bevorzugt ist, das Kationensalz gleichzeitig mit dem Nachweismittel
oder nach der Kultur der Mikroorganismen zuzugeben. Man bevorzugt
jedenfalls insbesondere bei einen gelierten Medium, den Entwickler
gleichzeitig mit dem Nachweismittel zur Kultur zuzugeben.
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Die
Reaktion, die zwischen dem Nachweismittel und der Desaminase und
anschließend
dem Entwickler in Gegenwart von Flavoprotein, wenn man zum Beispiel
Phenylalanin als Nachweismittel einsetzt, stattfindet, entspricht
der folgenden allgemeinen Reaktion:
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Die
erhaltene Phenylbrenztraubensäure,
bei der es sich um eine α-Ketosäure handelt,
lagert sich an das Eisenchlorid, das als Chelator dient, an und
führt so
zu einer grünen
Färbung.
Wenn also ein Röhrchen, das
solch eine Zusammensetzung enthält,
dem Luftsauerstoff ausgesetzt wird, verstärkt sich die Intensität der Färbung.
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Je
nach der Art der verwendeten Aminosäure schwankt die schlußendlich
erhaltene Farbe. Beim Histidin zum Bespiel ist die Färbung braun.
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Diese
Reaktion gilt auch dann, wenn die Phenylgruppe durch einen anderen
Zyklus ersetzt und ein- bis dreifach durch eine Gruppe X gemäß Formel
(I) substituiert wird.
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Die
erfindungsgemäß durch
die Enzymaktivität
des Desaminasetyps nachgewiesenen und identifizierten und/oder quantifizierten
Mikroorganismen gehören
insbesondere zur Gruppe der Proteus.
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In
einer stark bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung gibt man zu dem Kulturmedium noch mindestens ein weiteres
Nachweismittel mit dem durch Bildung eines gefärbten oder fluoreszierenden
Produkts eine Enzymaktivität,
die sich von der mit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) nachgewiesenen
Enzymaktivität
unterscheidet, nachgewiesen werden kann, zu. Es kann sich zum Beispiel
um eine Esterase-, Osidase- oder Peptidaseaktivität handeln.
So kann man in Kombination mit einer fehlenden Färbung (oder fehlenden Fluorescenz)
oder in Kombination mit einer im Vergleich zu der mit einem einzigen
Enzymsubstrat erzielten Färbung
modifizierten Färbung
zusätzliche
Informationen erhalten. Das weitere Nachweismittel der erfindungsgemäßen Formel
(I). So wird man zum Beispiel ein weiteres Nachweismittel wählen, das
fähig ist,
ein Reaktionsprodukt mit einer unterschiedlichen Farbe als der mit
den Nachweismitteln der Formel (I) erzielten Farbe zu ergeben. Mit
dem weiteren Nachweismittel (oder zweiten Nachweismittel) kann man
daher aufgrund seiner Eigenfarbe oder aufgrund einer Fluorescenz
das Vorliegen einer Enzymaktivität,
für die
es spezifisch ist, aufzeigen. Wenn die mit den Nachweismitteln der
erfindungsgemäßen Formel
(I) nachweisbare Enzymaktivität
des Desaminasetyps ebenfalls vorliegt und durch eine charakteristische
Farbe aufzeigbar ist, wird man zu einer veränderten Färbung gelangen, die sich von
der charakteristischen Farbe unterscheidet und auch von der Eigenfarbe,
die sich durch das zweite Nachweismittel ergibt. Anwendungsbeispiele
für mehrere
Nachweismittel in ein- und demselben Kulturmedium finden sich in
den Beispielen unten. Natürlich
können
die Ergebnisse einerseits in Abhängigkeit
von der Wahl des erfindungsgemäßen eingesetzten
Nachweismittels, des zweiten (oder mehreren) eingesetzten Nachweismittels
und den in dem Kulturmedium vorliegenden verschiedenen Mikroorganismen
schwanken.
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Die
weiteren Nachweismittel dienen zum Aufzeigen von unterschiedlichen
Enzymaktivitäten,
und es handelt sich dabei insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, um
Derivate des Indoxyls, des Cumarins, des Resorufins, des Naphthols,
des Naphthylamins, des Nitrophenols, des Nitroanilins, des Rhodamins,
des Hydroxychinolins, des Fluoresceins usw.
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Unter
den weiteren Nachweismitteln, die gemeinsam mit den erfindungsgemäßen Nachweismitteln eingesetzt
werden können,
sind insbesondere die folgenden zu nennen: 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucoronid,
6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucosid,
L-Alanin-7-amino-4-methylcumarin, 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-galactosaminid,
Resorufin-β-D-galactosid, β-Naphthylsulfat,
Naphthol-AS-BI-β-D-galactosid,
L-Alanin-β-naphthylamid,
O-Nitrophenol-β-D-galactosid,
Carboxybenzoyl-L-arginin-p-nitroanilid,
Rhodamin-110-bis-(L-leucinamid), sowie Fluoresceindiacetat.
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Ein
zweiter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen
der folgenden allgemeinen Formel (I)
in der
- – R einen
zyklischen Aminosäurerest
bedeutet, der durch eine aus der Reihe Methyl, Benzyl, Carboxybenzol,
Dansyl, Naphthalinsulfonyl, Toluolsulfonyl und Mesitylensulfonyl
gewählte
Gruppe substituiert ist, zum Nachweisen und Identifizieren und/oder
Quantifizieren einer Mikroorganismen-Enzymaktivität des Desaminasetyps.
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Die
Abkürzungen "N-im" für eine Verbindung
des L-Histidins
und "N-im" für eine Verbindung
des L-Tryptophans
bedeuten, daß das
Stickstoffatom des Imidazolkerns (His) oder das Stickstoffatom des
Indolkerns (Trp) substituiert ist.
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Ein
dritter Gegenstand der Erfindung ist ein Nachweismittel, das aus
O-(2-Naphthalinsulfonyl)tyrosin besteht.
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Weiterhin
wird ganz besonders bevorzugt das X aus der Reihe Naphthalinsulfonyl,
Tuluolsylfonyl und N-ind-Mesithylensulfonyl
stammt.
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Unter
den synthetisierten Verbindungen wurden die besten Ergebnisse mit
O-Naphthalinsulfonyl-L-tyrosin, O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin und N-ind-Mesithylen-2-sulfonyl-L-tryptophan
erzielt. Mit diesen Verbindungen konnte man ein mit Agar verfestigtes
Kulturmedium entwickeln, das es ermöglicht, eine Kolonie, die eine Enzymaktivität des Desaminasetyps
exprimiert, nachzuweisen und zwar auch innerhalb einer Kultur von
verschiedenen Mikroorganismen. Außerdem verbleibt die mit diesen
Verbindungen erhaltene braune Färbung
in der Nähe
der desaminasepositiven Kolonie und beeinflußt das Aussehen von desaminasenegativen
Kolonien nicht, auch wenn diese in der Nähe liegen.
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Als
Beispiel für
Nachweismittel, die besonders bei mit Agar verfestigtem Medium bevorzugt
sind, sind zu nennen:
- – O-Naphthalinsulfonyltyrosin,
- – 4-O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin,
- – N-Toluolsulfonyl-L-histidin.
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Bei
einem Flüssigmedium
verwendet man ebenfalls besonders bevorzugt N-Toluolsulfonyl-L-histidin.
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Ein
vierter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren
zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen und Nachweismitteln
der allgemeinen Formel (I) wie jeweils oben definiert, umfassen die
folgenden Schritte:
- (a) Formylierung des Rests
R,
- (b) Addition des formylierten Rests nach (a) an ein Salz von
X,
- (c) Deformylierung des gemäß (b) substituierten
Rests R.
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Ein
fünfter
Gegenstand der Erfindung ist ein Kulturmedium für Mikroorganismen, das zusätzlich zu
den für
die Kultur dieser Mirkoorganismen erforderlichen Bestandteilen noch
mindestens ein Nachweismittel wie oben definiert umfaßt.
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Die
Nachweismittel der Formel X-L-zyklische Aminosäure werden in Gewichtskonzentrationen
eingesetzt, die ausreichen, daß beobachtbare
Farbreaktionen entstehen. Diese Konzentrationen können durch
routinemäßige Versuchstätigkeit
vom Fachmann bestimmt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Gewichtskonzentration des bzw. der Nachweismittel(s) zwischen
0,025 und 5 g/l des Kulturmediums.
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In
einer stark bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Gewichtskonzentration des bzw. der Nachweismittel(s) in dem
Kulturmedium zwischen 0,1 und 2 g/l vorzugsweise zwischen 0,3 und
0,6 g/l.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Kulturmedium weiterhin einen Entwickler, vorzugsweise ein Kationensalz,
zum Beispiel Eisenammoniumcitrat. Die Konzentration am Entwickler
ist nicht limitierend und kann kleiner, gleich oder größer derjenigen
des Nachweismittels der Formel (I) sein.
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In
einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Kulturmedium
in mit Agar verfestigter Form vor.
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In
einer stark bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das Kulturmedium
noch mindestens ein weiteres Nachweismittel, mit dem durch Bildung
eines gefärbten
oder fluoreszierenden Produkts eine Enzymaktivität, die sich von der mit der
Verbindung der allgemeinen Formel (I) nachgewiesenen Enzymaktivität unterscheidet,
nachgewiesen werden kann.
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Als
Beispiel für
mit Agar verfestigtes Medium kann man in das Kulturmedium wie unten
beschrieben O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin in einer Konzentration von
0,5 g/l und Eisencitrat in einer Konzentration von 0,5 g/l einarbeiten:
| Herz-Hirn-Extrakt | 5
g/l |
| Bio-Soyase | 5
g/l |
| Tris-Puffer | 1
g/l |
| Kaliumdihydrogeriphosphat | 1
g/l |
| Agar | 17,5
g/l, |
und man kann dieses Medium mit verschiedenen gramnegativen
oder grampositiven Mikroorganismen inokulieren. Nur diejenigen Stämme, die
zur Gruppe Proteus gehören,
bilden nach ungefähr
18-24 ständiger
Inkubation braune Kolonien. Diejenigen Stämme, die nicht zur Gruppe Proteus
gehören,
bilden Kolonien, die gleich aussehen wie auf demselben Medium ohne
O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin.
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Die
Eigenschaften und Vorteile der Erfindungen werden in den folgenden
Beispielen veranschaulicht.
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Beispiel 1
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Synthese von 2-O-Naphthalinsulfonyl-L-tyrosin
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Synthese von N-Formyl-L-tyrosin
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L-Tyrosin
(60 g; 0,33 mol) wurde in 98%iger Ameisensäure (400 ml) gelöst und auf
10°C abgekühlt. Das
Essigsäureanhydrid
(192 ml; 1,73 mol) wurde in vier Portionen im Verlauf von fünf Minuten
zugegeben, wobei eine Temperatur von 10°C gehalten wurde. Anschließend wurde
der Ansatz 60 Minuten lang bei 10°C gerührt und
anschließend
30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Es wurde im Verlauf
von 30 Minuten unter Rühren
bei 10-15°C
mit Wasser (192 ml) versetzt und der Ansatz wurde anschließend unter
verringertem Druck bei 70°C
zu einem trockenen Rückstand
eingedampft. Der verbleibende ölige
Feststoff wurde in sehr wenig kochendem Wasser gelöst und anschließend abgekühlt, wodurch
man feine weiße
Kristalle von N-Formyl-L-tyrosin
erhielt (60,6 g; 88%).
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Synthese von N-Formyl-O-(2-naphthalinsulfonyl)tyrosin
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Vorgehensweise A
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N-Formyl-L-tyrosin
(14,0 g; 0,0668 mol) wurde in Aceton (250 ml) gelöst und die
Lösung
wurde mit Wasser (190 ml) verdünnt.
Der pH-Wert wurde durch Versetzen mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung auf
9,7 eingestellt und man versetzte anschließend tropfenweise im Verlauf
von 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Lösung von Naphthalin-2-sulfonylchlorid
(15 g; 0,0668 mol) in Aceton (42 ml), wobei der pH-Wert durch Versetzen
mit Natriumcarbonatlösung
auf. 9,7 gehalten wird. Der Ansatz wurde 16 Minuten lang gerührt und
12 Stunden stehen gelassen, wonach der Großteil des Acetons unter verringertem
Druck bei 50°C abgedampft
wurde. Die verbleibende Lösung
wurde auf 5°C
gekühlt
und anschließend
mit Ether (2 × 50
ml) extrahiert. Die wäßrige Phase
wurde anschließend
auf pH 3,5 angesäuert,
wodurch ein dichter weißer
Niederschlag entstand, der abfiltriert und im Ofen im Vakuum bei
60°C getrocknet wurde,
wodurch man einen weißen Feststoff
erhielt (24,57 g; 92%).
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Deformylierung
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Das
N-Formyl-O-(2-naphthalinsulfonyl)-tyrosin (24,57 g; 0,0615 mol)
wurde in Aceton (105 ml) suspendiert und in einer kleinen Menge
zu einer Rückflußmischung
aus konzentrierter Salzsäure
(240 ml) und Wasser (240 ml) gegeben. Der Ansatz wurde 3 Stunden
lang am Rückfluß erhitzt
und anschließend
unter Rühren
und Abkühlen
auf 10°C
in Wasser gegossen (750 ml). Der pH-Wert wurde auf 3,5 eingestellt
und der erhaltene dichte weiße
Niederschlag wurde abfiltriert und in einem Ofen in einem Vakuum
bei 50°C
getrocknet, wodurch man ein sauberes weißes Pulver erhielt (21,25 g;
94%). Das Produkt könnte
noch mit einer Natronlauge und Versetzen mit Säure weiter aufgereinigt werden.
Die Ausbeute an trockenem Produkt betrug 79%.
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Die
Gesamtausbeute im Bezug auf das L-Tyrosin beträgt 64%.
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Beispiel 2
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Synthese von 4-O-Tosyl-L-tyrosin
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Die
Synthese von 4-Toluolsulfonyl-L-tyrosin erfolgte gemäß den folgenden
zwei Vorgehensweisen:
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Vorgehensweise A
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Die
Verbindung wurde gemäß der in
Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise hergestellt, wobei jedoch
das Naphthalin-2-sulfonylchlorid durch das molare Äquivalent
Toluolsulfonylchlorid ersetzt wurde. Die Gesamtausbeute am Produkt
betrug 56%.
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Vorgehensweise B
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Kupfersulfat-pentahydrat
(5 g; 20 mmol) wurde unter Rühren
(100 ml) gelöst
und kontinuierlich mit einer Lösung
von Kaliumhydroxid (2,25 g; 40 mmol) in Wasser versetzt. Nach 15
Minuten wurde die Suspension stehen gelassen, dann abfiltriert und
der Rückstand
wurde mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und anschließend teilweise
getrocknet, wodurch man zu einem "blauen" Rückstand
gelangt.
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Das
L-Tyrosin (7,2 g; 40 mmol) wurde wieder in Wasser (100 ml) suspendiert
und wäßriges Kaliumhydroxid
wurde zugegeben. Diese heiße
Lösung
wurde mit dem oben hergestellten Kupferhydroxid versetzt. Die entstandene
dunkelblaue Lösung
des Kupferkomplexes wurde sorgfältig
auf pH 8 angesäuert.
Der purpurfarbene Niederschlag, der sich fortschreitend gebildet
hatte, wurde abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und
an der Luft getrocknet, wodurch man 7,4 g Komplex erhielt. Dieser
wurde wieder in Methanol (80 ml) suspendiert und unter Rühren mit
einer Natriumcarbonatlösung
(3,7 g; 35 mm) versetzt. Der Kupferkomplex, der nur gelöst vorlag,
mußte
mit Methanol geklärt
werden. Die filtrierte Lösung
wurde unter Rühren
nach und nach mit einer Lösung
von 4-Toluolsulfonylchlorid (6,55 g; 35 mmol) in Methanol (60 ml)
versetzt. Der pH-Wert wurde durch gelegentliches versetzen mit wäßrigem Natriumcarbonat
zwischen 9 und 11 gehalten. Nach 2 Stunden wurde die Suspension
filtriert und der Rückstand
wurde mit Methanol gewaschen. Die Wasch- und Filtrationsschritte
wurden vereinigt und die Suspension wurde zur Entfernung des Methanols
bei 45°C
eingedampft.
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Der
entstandene blaue Feststoff wurde durch kräftiges Rühren mit Salzsäure (15
ml) und Eis (30 g) zersetzt. Der hellgrüne Feststoff wurde entfernt
und direkt in heißem
Wasser (100 bis 120 ml) gelöst.
Durch Abkühlung
und Einstellen des pH-Werts auf 7,5 erhielt man eine große Menge
weißen
Niederschlag. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert. Der Rückstand
wurde wieder in einem ähnlichen
Volumen an heißem
Wasser enthaltend EDTA (300 mg) gelöst, um die Spuren an Kupferionen
zu entfernen, und der pH-Wert wurde wiederum auf 7,5 eingestellt.
Das Produkt wurde nach Filtration und Trocknen in Form eines silbrig-weißen Feststoffs
isoliert (6,1 g; 52%).
-
Beispiel 3
-
Synthese von O-Mesitoyl-L-tyrosin
-
N-a-t-BOC-L-Tyrosin
(2,81 g; 10 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (15 ml) gelöst. Diese
Lösung wurde
langsam mit 2,4-6-Trimethylbenzoylchlorid (1,92 g, 10,5 mmol) versetzt.
Die Temperatur wurde zwischen 15°C
und 25°C
gehalten. Nach 30 minütigem
Rühren
wurde der Ansatz auf Eiswasser gegossen. Der klebrige Feststoff
wurde in Dichlormethan (2 × 50
ml) extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser (3 × 50 ml)
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Abdampfung des Lösungsmittels
gelangte man zu einem glasartigen Feststoff, der langsam kristallisierte.
Das Produkt wurde durch Lösen
in einer kleinen Menge Essigester und Versetzen mit einer Lösung von
Chlorwasserstoff (3M) in Essigester (5 ml) entschützt. Eine
gerührte
Lösung
setzte sich nach und nach in Form eines weißen Feststoffs ab. Die maximale
Niederschlagsbildung wurde durch Versetzen mit Diethylether (30
ml) erzielt.
-
Das
Produkt wurde durch Vakuumfiltration gewonnen, mit Ether gewaschen
und im Exsikkator im Vakuum getrocknet (2,5 g; 69%).
-
Beispiel 4
-
Synthese von N-in-Mesitylen-2-sulfonyl-L-tryptophan
-
N-a-t-BOC-N-in-Mesitylen-2-sulfonyl-L-tryptophan
(1,0 g; 1,5 mmol) wurde in Essigester (5 ml) suspendiert und die
Lösung
wurde unter Rührung
mit einer Lösung
von Chlorwasserstoff (3 M) in Essigester (2,5 ml) versetzt. Es bildete
sich rasch ein weißer
Niederschlag, der gleichzeitig mit dem Rühren intensiver wurde. Nach
2 Stunden wurde die Suspension filtriert und der Rückstand
wurde mit Ether gewaschen, getrocknet und aufbewahrt. Obwohl sich
in der Dünnschichtchromatographie
nur ein Bestandteil (bei Sichtbarmachung mit Ultraviolet) zeigte,
war das Produkt vermutlich mit Dicyclohexylammoniumchlorid verunreinigt.
Es wurde kein Versuch durchgeführt,
diese Verunreinigung zu entfernen, und das Produkt wurde als solches
für die
Prüfung eingesetzt.
Die Ausbeute betrug 0,68 g.
-
Beispiel 5
-
Synthese von M-im-(4-Toluolsulfonyl)-L-histidin
-
N-a-t-BOC-N-im-Tosyl-L-histidin
(1,0 g; 2,44 mmol) wurde in einer Lösung von Chlorwasserstoff (3
M) in Essigester (5 ml) gelöst.
Nach 2 ständigem
Rühren
wurde die Verbindung in Form eines Hydrochloridsalzes wie in Beispiel
4 beschrieben isoliert und ergab einen weißen Feststoff (0,64 g; 76%).
-
Auf
gleiche Art und Weise wurden O-(2,6-Dichlorbenzyl-L-tyrosin, N-im-Benzyloxycarbonyl-L-histidin und
Np-benzyloxymethyl-L-histidin
durch vorübergehenden
Schutz, wie er im Handel für
die Peptidsynthese erhältlich
ist, hergestellt.
-
Zur
Erläuterung
des Vorteils von erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) für
den Nachweis von Bakterien der Gattung Proteus auf gelierten Medien
wurden Versuche durchgeführt.
-
Beispiel 6
-
Es
wurden zwei Medien mit den üblichen
Techniken hergestellt. Sie weisen dieselbe Zusammensetzung auf, mit
Ausnahme des für
den Nachweis der Enzymaktivität
des Desaminasetyps verwendeten Nachweismittels.
-
Die
Zusammensetzung von Medium I und Medium II für einen Liter schlußendliches
Medium lautet folgendermaßen:
| Hirn-Herz-Extrakt
(bioMérieux) | 5
g/l |
| bio-Soyase
(bioMérieux) | 5
g/l |
| Tris-Puffer
(Prolabo) | 1
g/l |
| Kaliumdihydrogenphosphat
(Merck) | 1
g/l |
| Agar
(bioMérieux) | 17,5
g/l |
| Eisenammoniumcitrat
(Sigma) | 0,5
g/l |
-
Der
pH-Wert der Medien wurde auf ungefähr 7,2 eingestellt.
-
Bei
Medium I handelt es sich bei dem verwendeten Nachweismittel für die Enzymaktivität des Dasaminasetyps
um die natürliche
Aminosäure
L-Tyrosin in einer Konzentration von 1,5 g/l; bei Medium II handelt es
sich bei dem verwendeten Nachweismittel für die Enzymaktivität des Desaminasetyps
um 4-O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin
in einer Konzentration von 0,5 g/l.
-
Auf
beiden Medien wurden 12 Bakterienstämme direkt in einer Petrischale
kultiviert. Die Stämme stammen
von der Sammlung der Anmelderin und gehören zu den folgenden Arten:
Escherichia coli (2 Stämme),
Enterobacter cloacae (1 Stamm), Klebsiella pneumoniae (1 Stamm),
Morganella morganii (2 Stämme), Proteus
mirabilis (2 Stämme),
Proteus vulgaris (2 Stämme),
Enterococcus faecalis (1 Stamm), Staphylococcus saprophyticus (1
Stamm). Außerdem
wurden eine Mischung eines Stamms von E. coli und eines Stamms von P.
mirabilis in einer Petrischale gezüchtet. Die Schalen wurden 48
Stunden lang bei 37°C
inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden visuell geprüft, und
zwar nach 24 bzw. 48 ständiger
Inkubation, und folgendermaßen ausgewertet:
- – die
braunen Kolonien entsprechen Stämmen,
die eine Desaminase produzieren, und die a priori zu der Gruppe
Proteus (hier mit den Arten M. morganii, P. mirabilis, P. vulgaris
als Stellvertreter) gehören;
- – die
weißen
Kolonien entsprechen Stämmen,
die das oben genannte Enzym nicht produzieren, und die daher zu
anderen Bakterienarten, die noch mit traditionellen 10 Techniken
zu identifizieren sind, gehören;
- – die
Diffusion des braunen Niederschlags um die Kolonie herum wird anhand
einer halb-quantitativen Skala (keine Diffusion, schwache Diffusion,
starke Diffusion) ausgewertet.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle I unten angeführt: TABELLE I
| | | nach 24
Stunden | nach 48
Stunden |
| | | Kolonien | Diffusion | Kolonien | Diffusion |
| Arten | Medium | braune | keine | schwache | starke | braune | keine | schwache | starke |
| E.
coli | I | -* | - | - | - | - | - | - | - |
| (2 Stämme) | II | - | - | - | - | - | - | - | - |
| E.
cloacae | I | - | - | - | - | - | - | - | - |
| (1 Stamm) | II | - | - | - | - | - | - | - | - |
| K. Pneumoniae | I | - | - | - | - | 1 | - | 1 | |
| (1 Stamm) | II | - | - | - | - | - | - | - | - |
| M.
morganii | I | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - | 2 |
| (2 Stämme) | II | 2 | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - |
| P.
mirabilis | I | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - | 2 |
| (2 Stämme) | II | 2 | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - |
| P.
vulgaris | I | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - | 2 |
| (2 Stämme) | II | 2 | 2 | - | - | 2 | 2 | - | - |
| E.
faecalis | I | - | - | - | - | - | - | - | - |
| (1 Stamm) | II | - | - | - | - | - | - | - | - |
| S.
saprophyticus | I | - | - | - | - | - | - | - | - |
| (1 Stamm) | II | - | - | - | - | - | - | - | - |
- *: Anzahl Stämme, "-" =
0
-
Wie
aus Tabelle I oben hervorgeht, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren
den Nachweis von Bakterien 5 der Gruppe Proteus. Spezifisch findet
man für
die Kultur auf Medium I nur eine Art von durchsichtigbrauner Kolonie
gegen einen Hintergrund von orangefarbenem Medium, während das
erfindungsgemäße Medium
II zwei Arten von Kolonien ergibt: zum einen 10 braune und zum anderen
durchsichtige gegen einen Hintergrund eines farblosen Mediums, das
in der Nähe
der gefärbten
Kolonien braun ist.
-
Beispiel 7
-
Obwohl
das erfindungsgemäße Verfahren
sich besser für
den Nachweis einer Enzymaktivität
des Desaminasetyps auf geliertem Medium oder festem Träger eignet,
kann es auch im Flüssigmedium
eingesetzt werden.
-
Es
wurden zwei Medien mit den üblichen
Techniken hergestellt. Sie weisen dieselbe Zusammensetzung auf,
mit Ausnahme des für
den Nachweis der Enzymaktivität
des Desaminasetyps verwendeten Nachweismittels.
-
Die
Zusammensetzung von Medium III und Medium IV für einen Liter schlußendliches
Medium lautet folgendermaßen.
| Hirn-Herz-Extrakt
(bioMérieux) | 5
g/l |
| bio-Soyase
(bioMérieux) | 5
g/l |
| Tris-Puffer
(Sigma) | 1
g/l |
| Kaliumdihydrogenphosphat
(Merck) | 1
g/l |
| Eisenammoniumcitrat
(Sigma) | 0,5
g/l |
-
Der
pH-Wert der Medien wurde auf ungefähr 7,2 eingestellt.
-
Bei
Medium III handelt es sich bei dem verwendeten Nachweismittel für die Enzymaktivität des Desaminasetyps
um die natürliche
Aminosäure
L-Histidin in einer Konzentration von 1,5 g/l; bei Medium IV handelt es
sich bei dem verwendeten Nachweismittel für die Enzymaktivität des Desaminasetyps
um 4-N-Toluolsulfonyl-L-histidin
in einer Konzentration von 0,5 g/l. Die Medien wurden steril in
Probenröhrchen
verteilt.
-
Diese
zwei Medien wurden mit den zwölf
im Beispiel 6 15 beschriebenen Bakterienstämmen inokuliert. Die Röhrchen wurden
48 Stunden lang bei 37°C
inkubiert und nach 48 Stunden visuell gemäß der folgenden Auswertung
geprüft:
- – Braunwerden
des Röhrchens
zeigt das Vorhandensein einer Enzymaktivität des Desaminasetyps und daher
ein Bakterium der Gruppe Proteus an,
- – fehlendes
Braunwerden zeigt das Fehlen von Bakterien der Gruppe Proteus an.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle II unten dargestellt:
| | Braunwerden
des Mediums |
| | Nach 48
Stunden |
| Arten | Medium | Stark | Schwach | Kein |
| E.
coli | III | - | 2 | - |
| (2
Stämme) | IV | - | - | 2 |
| E.
cloacae | III | - | 1 | - |
| (1
Stamm) | IV | - | - | 1 |
| K.
pneumoniae | III | - | 1 | - |
| (1
Stamm) | IV | - | - | 1 |
| M.
morganii | III | 1 | 1 | - |
| (2
Stämme) | IV | 2 | - | - |
| P.
mirabilis | III | 2 | - | - |
| (2
Stämme) | IV | 2 | - | - |
| P.
vulgaris | III | 2 | - | - |
| (2
Stämme) | IV | 2 | - | - |
| E.
faecalis | III | 1 | - | - |
| (1
Stamm) | IV | - | - | 1 |
| S.
saprophyticus | III | - | - | 1 |
| (1
Stamm) | IV | - | - | 1 |
-
Wie
aus Tabelle II oben hervorgeht, ermöglicht es das erfindungsgemäße Nachweismittel,
wie L-Histidin, in Flüssigmedium
zwischen Bakterien, die zur Gruppe Proteus, und solchen, die nicht
zu dieser Gruppe gehören,
nach 48 Stunden mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu unterscheiden.
-
Beispiel 8
-
Es
wurden auch Tests durchgeführt,
um die Möglichkeit
des gleichzeitigen Nachweises einer Enzymaktivität des erfindungsgemäßen Desaminasetyps
sowie einer weiteren Enzymaktivität zu prüfen.
-
Zu
diesem Zweck wurden drei Medien nach den üblichen Techniken hergestellt.
Das erste Medium (Medium V) entspricht Medium II aus Beispiel 6,
wobei das 4-O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin
durch 4-O-Dansyl-L-tyrosin in derselben Konzentration ersetzt wurde,
das zweite Medium (Medium VI) entspricht demselben Medium, jedoch
mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid
in einer Konzentration von 0,1 g/l statt dem Desaminasesubstrat,
und das dritte Medium (Medium VII) entspricht Medium VI mit einem
Zusatz von 0,5 g/l 4-O-Dansyl-L-tyrosin.
-
Auf
diesen drei Medien wurden die zwölf
in Beispiel 6 beschriebenen Bakterienstämme direkt in Petrischalen
kultiviert. Außerdem
wurde eine Mischung eines Stamms von K. pneumoniae und eines Stamms
von P. mirabilis ebenfalls in einer Petrischale kultiviert. Die
Schalen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten
Kolonien wurden nach 24 ständiger
Inkubation visuell nach der folgenden Auswertung geprüft:
- – die
braunen Kolonien entsprechen Stämmen,
die eine Desaminase produzieren, und die a priori zu der Gruppe
Proteus (hier mit den Arten M. morganii, P. mirabilis, P. vulgaris
als Stellvertreter) gehören;
- – die
blauen Kolonien entsprechen Stämmen,
die eine β-D-Glucosidaseaktivität aufweisen
und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid
hydrolisieren;
- – die
weißen
Kolonien entsprechen Stämmen,
die die oben genannten Enzyme nicht produzieren.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle III unten dargestellt: TABELLE III
| | | 24 Stunden |
| | | Färbung der
Kolonien |
| Arten | Medium | Ungefärbt | Blau | Bräunlich-Blau | Braun |
| | V | 2 | | - | - |
| E.
coli | VI | 2 | - | - | - |
| (2
Stämme) | VII | 1 | - | - | 1 |
| | V | 1- | - | - | - |
| E.
cloacae | VI | - | 1 | - | - |
| (1
Stamm) | VII | - | 1 | - | - |
| | V | 1 | - | - | - |
| K.
pneumoniae | VI | - | 1 | - | - |
| (1
Stamm) | VII | - | 1 | - | - |
| | V | - | - | - | 2 |
| M.
morganii | VI | 2 | - | - | - |
| (2
Stämme) | VII | - | - | - | 2 |
| | V | - | - | - | 2 |
| P.
mirabilis | VI | 2 | - | - | - |
| (2
Stämme) | VII | - | - | - | 2 |
| | V | - | - | - | 2 |
| P.
vulgaris | VI | - | 2 | - | - |
| (2
Stämme) | VII | - | - | 2 | - |
| | V | 1 | - | - | - |
| E.
faecalis | VI | - | 1 | - | - |
| (1
Stamm) | VII | - | 1 | - | - |
| | V | 1 | - | - | - |
| S.
saprophyticus | VI | 1 | - | - | - |
| (1
Stamm) | VII | 1 | - | - | - |
- *: Anzahl Stämme, "-" =
0
-
Wie
aus Tabelle III oben hervorgeht ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren
einen Nachweis von Bakterien der Gruppe Proteus und stört nicht
den Nachweis von β-Glucosidase-Kolonien,
auch nicht in Mischung.
-
Spezifisch
kann für
die Kulturen der Mischung von K. pneumoniae und P. mirabilis auf
Medium VII gut zwischen den zwei Arten von Kolonien unterscheiden
werden, wobei die einen braun und die anderen blau sind. Exprimiert
weiterhin ein Bakterium gleichzeitig beide Enzymaktivitäten β-Glucosidase
und Desaminase), so äußert sich
dies in der Bildung von Kolonien, die eine Farbe aufweisen, die
eine Mischung aus blau und braun darstellt, wie dies für einen
Stamm von P. vulgaris auf Medium VII der Fall ist.
-
Beispiel 9
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
und erfindungsgemäße Verbindungen
eignen sich insbesondere sehr gut für die Isolation und Identifikation
von Mikroorganismen im Harn. Medium VIII wurde für Zweck entwickelt und weist
die folgende Zusammensetzung auf:
| Herz-Hirn-Extrakt
(bioMérieux) | 5
g/l |
| bio-Soyase
(bioMérieux) | 5
g/l |
| Tris-Puffer
(Sigma) | 1
g/l |
| Kaliumdihydrogenphosphat
(Merck) | 1
g/l |
| Eisenammoniumcitrat
(Sigma) | 0,5
g/l |
| 4-O-Toluolsulfonyl-L-tyrosin | 0,4
g/l |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid
(Biosynth) | 0,06
g/l |
| 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucoronid
(Biosynth) | 0,25
g/l |
| Methyl-D-glucoronid
(Sigma) | 0,1
g/l |
-
Der
pH-Wert der Medien wurde auf etwa 7,2 eingestellt.
-
Auf
diesem Medium wurden 25 Bakterien direkt in Petrischalen kultiviert.
Die Stämme
stämmen
aus der Sammlung der Anmelderin und gehören zu den folgenden Arten:
E. coli (3 Stämme),
Citrobacter diversus (2 Stämme),
E. cloacae (2 Stämme),
K. pneumoniae (2 Stämme),
M. morganii (2 Stämme),
P. mirabilis (3 Stämme),
P. vulgaris (2 Stämme),
E. faecalis (2 Stämme),
Staphylococcus aurelus (2 Stämme),
S. saprophyticus (3 Stämme),
Candida albicans (2 Stämme).
-
Außerdem wurde
auch eine Mischung eines Stamms von E. coli, eines Stamms von K.
pneumoniae und eines Stamms von P. mirabilis in einer Petrischale
kultiviert, Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Die gebildeten Kolonien wurden visuell nach 24 bzw. 48 ständiger Inkubation
nach den folgenden Auswertungen untersucht:
- – die braunen
Kolonien entsprechen Stämmen,
die eine Desaminase produzieren, und die a priori zu der Gruppe
Proteus (hier mit den Arten M. morganii, P. mirabilis, P. vulgaris
als Stellvertreter) gehören;
- – die
pupurrosa Kolonien entsprechen Stämmen, die eine β-D-Glucoronidase
produzieren und a priori zur Art E. coli gehören;
- – die
blauen Kolonien entsprechen Stämmen,
die eine β-D-Glucosidase produzieren
und a priori entweder zur Gruppe Klebsiella/Enterobacter/Serratia
oder zur Gattung Enterococcus gehören;
- – die
weißen
Kolonien entsprechen Stämmen,
die die oben genannten Enzyme nicht produzieren und gehören daher
zu anderen Arten von Bakterien oder Hefen, die noch mit Hilfe von üblichen
Techniken zu identifizieren sind.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle IV unten dargestellt:
-
Wie
aus Tabelle IV oben hervorgeht ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren
einen Nachweis der wichtigsten Bakterien im Harn auch in Mischung.
Spezifisch ist es möglich,
auf Medium VIII vier Arten von unterschiedlichen Kolonien (ungefärbte, purpurrosa,
blaue und braune) nachzuweisen und zwar sogar bei der Kultur von
mehreren Mikroorganismen. Solch ein Medium ist deshalb besonders
nützlich,
da es bei der Isolation den Nachweis des Großteils der im Harn befindlichen
Mikroorganismen ermöglicht
und aufgrund dieser Tatsache sowohl die Identifikation als auch
die Analyse von sehr komplexen Stichproben vereinfacht, was gleichzeitig
eine Verbesserung der Analysenqualität und eine günstigere
Kostengestaltung bedeutet.
