DE69814361T2

DE69814361T2 - Identifikation von salmonella

Info

Publication number: DE69814361T2
Application number: DE69814361T
Authority: DE
Inventors: David John Newcastle-upon-Tyne PERRY; Michael Ford
Original assignee: Newcastle Upon Tyne Hospitals National Health Service Trust
Current assignee: Newcastle Upon Tyne Hospitals National Health Service Trust
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: ATE239798T1; DE69814361D1; WO1998055644A1; EP0961834A1; DK0961834T3; US6368817B1; ES2200346T3; CA2274246A1; AU7781398A; CA2274246C; EP0961834B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren des Vorliegens einer Salmonella-Spezies in einer Probe sowie Kulturmedien, die sich für derartige Identifizierungsverfahren eignen.
Mitglieder der Gattung Salmonella stellen die wichtigsten Ursachen von Nahrungsmittelvergiftungen im Vereinigten Königreich dar. Derzeit beinhaltet die einzige wirksame Diagnosemaßnahme die Züchtung und Isolierung des Verursacherorganismus aus dem Stuhl. Dies stellt aber kein einfaches Verfahren dar, da spezielle Medien und Reagenzien erforderlich sind, um eine relativ geringe Anzahl von Salmonellae aus einer gross en Anzahl von Kommensal-Organismen in der Darmflora zu isolieren. Für diesen Zweck wurden selektive Medien entwickelt, die sich auf die Sichtbarmachung einfacher biochemischer Merkmale, z. B. auf die Bildung von Schwefelwasserstoff oder die unterbleibende Fermentation von Lactose, stützen.
Ein Überblick über fünf Plattierungsmedien zur Isolierung von Salmonella- Spezies und ein Vergleich mit enterischem Hektoen-Agar, einem Standardmedium, findet sich bei Dusch et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 33 (4) (1995), S. 802–804. Bei sämtlichen Medien handelt es sich um feste Medien (Standardagar-Konzentration), mit Ausnahme eines halbfesten Mediums mit verringerter Agar-Konzentration. Bei den festen Medien werden die Verbindungen, die bei Vorliegen von mikrobiellem Wachstum gebildet werden, so gewählt, dass sie mit dem bloßen Auge sichtbar sind. Um zu gewährleisten, dass die sichtbar gemachten Verbindungen mit mikrobiellen Kolonien verbunden sind, dürfen diese Verbindungen im Kulturmedium nicht diffundieren. Bei diesen Medien wird typischerweise ein Test auf zwei verschiedene biochemische Eigenschaften von bakteriellen Kolonien durchgeführt. Die Ergebnisse sind so beschaffen, dass positive und negative Ergebnisse eines jeden der beiden Tests bei positiven oder negativen Ergebnissen des anderen Tests beobachtet werden können. Bei einigen biochemischen Tests wird die Aktivität spezieller Enzyme unter Verwendung von chromogenen Substraten beobachtet, wobei die Substrate ungefärbt oder nicht-fluoreszierend sind, die jedoch enzymatische Reaktionsprodukte ergeben, die gefärbt oder fluoreszierend sind, so dass sich Enzyme in Gegenwart der Substrate feststellen lassen. Gelegentlich kann das enzymatische Reaktionsprodukt mit einer weiteren Komponente des Kulturmediums unter Erzeugung eines sichtbaren Produkts, z. B. von Metallionen oder pH-Indikatoren, sofern das Reaktionsprodukt eine Säure oder Base ist, reagieren.
Es ist bekannt, dem Kulturmedium Substrate für zwei verschiedene Enzyme zuzusetzen, die zu unterschiedlichen enzymatischen Reaktionsprodukten führen, wobei jedes einzelne dieser Produkte in Gegenwart des anderen (und jedes der Substrate selbst) beobachtet werden kann.
Ein Enzymsubstrat, das üblicherweise bei der Identifizierung von Salmonella verwendet wird, ist ein Substrat für β-Galactosidase. Salmonella ist im allgemeinen bezüglich dieser Enzymaktivität negativ, während die meisten anderen Mitglieder der Enferobacfenaceae positiv sind. Ein β-Galactosidase-Substrat, dessen enzymatisches Reaktionsprodukt keiner Diffusion unterliegt, ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (XGal). Weitere Indoxyl-Verbindungen und halogenierte Indoxyl-Verbindungen eignen sich als Substrate und ergeben Reaktionsprodukte, die in Agar-Kulturmedien sichtbar und nicht-diffundierbar sind.
XGal wird als Substrat im Rambach-Medium, das beispielsweise in US-A-5 194 374 beschrieben ist, verwendet. Es wird in Kombination mit einem Alkandiol eingesetzt, das durch Salmonella unter Bildung eines sauren Reaktionsprodukts metabolisiert wird, das durch Einverleiben eines pH-Indikators, z. B. Neutralrot, sichtbar gemacht wird.
Gemäß EP-A-0 516 817 umfasst ein Kulturmedium zum Nachweis von Salmonella ein chromogenes β-Galactosidase-Substrat und zusätzlich Glucuronat und einen pH-Indikator. Dieses gemischte Medium soll selektiver als das Rambach-Medium sein, da fast sämtliche getesteten Salmonella-Spezies, jedoch wenige andere bakterielle Spezies Glucuronsäure fermentieren, was zu einer Absenkung des pH-Werts führt.
In WO-A-94/01952 wird eine 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Verbindung, die ein Substrat für ein Esterase-Enzym darstellt, zur Identifizierung von Salmonellae, die positiv für derartige Enzyme sind, verwendet. Beim Substrat handelt es sich um einen Ester einer C₇ _-10-Fettsäure. Es wird empfohlen, das Medium zu ergänzen, um Nicht-Salmonella-Bakterien zu beseitigen, indem man beispielsweise Eigenschaften ausnützt, die mit der Spaltung oder Verstoffwechselung von β-Galactosiden und β-Glucosiden (Salmonella ist bei beiden Produkten negativ) im Zusammenhang steht.
Vom Rambach-Medium und von der Kombination XGal-Glucuronsäure wurde von Dusch et al. festgestellt, dass sie suboptimale Empfindlichkeiten aufweisen. Ein weiteres Medium, das Xylose, Lysin und Tergitol-4 enthält, weist eine sehr gute Empfindlichkeit und Spezifität auf. Das Kulturmedium enthält das oberflächenaktive Mittel Tergitol 4 zur Hemmung von Proteus. Die Bildung von Schwefelwasserstoff aus Natriumthiosulfat im Medium wird durch Zusatz von Eisen(III)-Ionen sichtbar gemacht.
Es ist bekannt, dass Salmonella-Spezies α-Galactosidase bilden. Dieses Enzym ist jedoch vermutlich als schlechter Marker für Salmonella anzusehen, da es von zahlreichen verwandten Gattungen, wie Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter und Shigella erzeugt wird.
In Acta Microbiol Hung. Bd. 35(4) (1988), S. 389–395, erörtert I. Ketyi die α-Galactosidase-Aktivität verschiedener Spezies von Enterobakterien, einschließlich Salmonella, Shigella und E. coli. Er wies darauf. hin, dass die enzymatische Aktivität ein allgemeines Merkmal von Enterobacteriaceae ist. Er verwendete Melibiose als einen Indikator für in bezug auf α-Galactosidase positive Stämme, Bei Melibiose handelt es sich nicht um eine chromogene Verbindung.
In WO-A-96/30543 wird ein chromogenes β-Galactosidase-Substrat in Kombination mit einem Gemisch von Zuckern, einschließlich Mannit mit Xylose und Melibiose zum Identifizieren von Salmonella verwendet. Die Zucker werden unter Bildung von Säure gespalten. Das Wachstumsmedium enthält einen pH-Indikator. Jedoch handelt es sich bei den Säuren, die den pH-Wert verändern, um Produkte einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, an denen Produkte des Zuckerstoffwechsels beteiligt sind.
James et al. beschreiben in App. Env. Microbiol., Bd. 62 (10) (1996), S. 3868– 170 und in J. App. Microbiol. Bd. 82 (1996), S. 532–536, ein neues β-Galactosidase-Substrat zur Verwendung anstelle von XGal. Beim Substrat handelt es sich um ein Derivat von Cyclohexenesculetin, aus dem das Aglycon, das unter Hydrolyse durch β-Galactosidase freigesetzt wird, einen schwarz-braunen Komplex mit Eisen(III)-Ionen im Medium bildet. Das neue Substrat, CHE-Gal, ergab eine gute Korrelation mit XGal_; d.h. eine hohe Spezifität und eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweisen der β-Galactosidase-Aktivität.
Diese Cyclohexenesculetin-Substrate und andere Esculetin-Derivate werden in WO-A-97/41138 (nicht vor dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht) beschrieben und beansprucht.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht darauf, dass ein Bedürfnis nach Kulturmedien besteht, die sehr empfindlich gegenüber Salmonella sind, wobei sie aber hochspezifisch sind und dadurch anschließende Bestätigungstests auf ein Minimum beschränkt werden können. Diese Testtypen müssen häufig mit den herkömmlichen Medien von unzureichender Spezifität durchgeführt werden. Ein zweiter Aspekt der Erfindung beruht auf der Bereitstellung eines Mediums, das zwei chromogene Substrate umfasst, die leicht beobachtbare Ergebnisse liefern: Es lässt sich leicht eine visuelle Bestimmung der Gegenwart und der Abwesenheit von enzymatischen Reaktionsprodukten jedes einzelnen Substrats durchführen, unabhängig davon, ob das enzymatische Reaktionsprodukt des anderen Substrats vorliegt oder fehlt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren bereitgestellt, bei dem die folgenden Stufen durchgeführt werden:

1. eine Probe mit einem Verdacht auf einen Gehalt an Salmonella-Bakterien wird in Gegenwart eines Nährmediums gezüchtet,
2. die bakterielle Kultur wird mit jedem von zwei Enzymsubstraten in Kontakt gebracht, und
3. die Anwesenheit der enzymatischen Reaktionsprodukte von jedem der Substrate wird im Anschluss an die Stufe 2 festgestellt, um zu ermitteln, ob ein Wachstum von Salmonella-Spezies stattgefunden hat oder nicht, wobei es sich beim ersten Substrat um ein Substrat für ein Enzym, für das Salmonella negativ ist, handelt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich beim zweiten Substrat um ein Substrat für α-Galactodidase handelt und dass beide Substrate chromogen sind.

Die Erfinder nehmen an, dass hierbei erstmals α-Galactosidase als Marker für Salmonella verwendet wird, wobei ein für α-Galactosidase spezifisches chromogenes Substrat verwendet wird, d. h. ein Substrat, für das das enzymatische Reaktionsprodukt in Gegenwart von α-Galactosidase chromogen ist, ohne dass es weiteren enzymatischen Reaktionen unterworfen wird. Somit haben die Erfinder die Eignung einer Kombination von β-Galactosidase und α-Galactosidase als Marker zum Nachweis von Salmonella-Spezies erkannt. Das Verfahren eignet sich zur Durchführung der üblichen Tests zum Identifizieren von Salmonella. Es müssen keine speziellen Erwartungen bezüglich des Vorliegens von Salmonella in einer erfindungsgemäß getesteten klinischen Probe gegeben sein. Somit eignet sich die Erfindung zum Screening, um Salmonella auszuschließen (unter Erzielung eines negativen Ergebnisses) sowie auch für positive Tests.
Das Enzym zur Spaltung des ersten Substrats, für das Salmonella eine negative Aktivität zeigt, wird so gewählt, dass durch ein positives Ergebnis (Spaltung) eine große Anzahl von Enterobacteriaceae ausgeschlossen werden kann. Salmonellae sind negativ gegenüber β-Glucosidase, so dass ein Substrat für β-Glucosidase für diesen Zweck verwendet werden kann. Zahlreiche andere Enterobakterien sind ebenfalls negativ gegenüber β-Glucosidase. Die günstigsten Ergebnisse werden erreicht, wenn Substrate für dieses Enzym in Kombination mit einem weiterem Enzymsubstrat verwendet werden. Derartige weitere Substrate werden gewählt, um die Unterscheidung zwischen Salmonella und derartigen anderen β-Glucosidase-negativen Spezies zu unterstützen. In besonders zweckmäßiger Weise wird das erste Substrat so gewählt, dass es durch β- Galactosidase spaltbar ist. Beim Substrat soll es sich daher vorzugsweise um ein Derivat von β-D-Galactopyranosid handeln.
Obgleich die Erfindung in einer Gruppe von biochemischen Tests, die jeweils in einem individuellen Behälter durchgeführt werden, an einer einzigen bakteriellen Kolonie eingesetzt werden kann, ist es bevorzugt, dass das Verfahren für Proben angewendet wird, die ein Gemisch von bakteriellen Spezies enthalten, die zusammen auf einem Körper . des Kulturmediums mit einem einzigen Behälter gezüchtet werden. Beim Kulturmedium handelt es sich vorzugsweise um ein festes (geliertes) Medium, insbesondere auf Agar-Basis. Weitere herkömmliche Trägermaterialien für die Züchtung von Bakterien können verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt, enthält die Probe vorzugsweise ein Gemisch von bakteriellen Spezies. Es kann sich um eine direkte Probe handeln, die unter Anwendung einer geeigneten Technik auf das Kulturmedium überimpft wird. Somit kann es sich um eine Probe von Nahrungsmitteln, Wasser oder eine Körperflüssigkeit eines Patienten, üblicherweise Blut, Urin oder insbesondere Faeces, handeln. Alternativ kann eine direkte Probe vor Durchführung eines Verfahrens angereichert werden, indem man die direkte Probe auf eine Anreicherungsbrühe überimpft und die Brühe für eine bestimmte Zeitspanne, z. B. 24 Stunden züchtet, bevor man einen Teil der bakteriellen Kultur auf das Kulturmedium für das erfindungsgemäße Verfahren überimpft. Das Anreicherungsmedium wird so gewählt, dass es das Wachstum von Salmonella-Spezies gegenüber anderen üblichen Enterobakterien, wie E. coli und Proteus, begünstigt. Bei geeigneten Anreicherungsmedien handelt es sich beispielsweise um Tetrathionat- oder Selenit-Brühen.
Das Medium, in dem die erste erfindungsgemäße Züchtungsstufe durchgeführt wird, enthält vorzugsweise Komponenten, die das Wachstum von Salmonella begünstigen. Ein derartiges Medium kann Inhibitoren eines weiteren enterobakteriellen Wachstums, wie Brillantgrün, Gallensalze oder Natriumdesoxycholat, enthalten.
Sofern es sich bei der enzymatischen Aktivität, für die Salmonella negativ ist, um, β-Galactosidase handelt, wird die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise in Gegenwart eines β-Galactosidase-Promotors eines bekannten Typs durchgeführt, beispielsweise in Gegenwart von Lactose oder vorzugsweise von Isopropyf-β-D-thiogalactopyranosid.
Im Verfahren sind die Enzymsubstrate jeweils chromogen. Gemäß der vorliegenden Beschreibung umfasst der Ausdruck "chromogen" auch eine fluorogene Beschaffenheit. Die enzymatischen Reaktionsprodukte oder einzelnen Substrate sind vorzugsweise direkt sichtbar, beispielsweise in Form von gefärbten Verbindungen, gegebenenfalls in Gegenwart anderer Komponenten, wie Metallionen, wobei sie vorzugsweise mit dem bloßen Auge bei sichtbaren Licht erkennbar sind. Alternativ lassen sich die Reaktionsprodukte spektrophotometrisch durch Betrachtung der absorbierten-Strahlung einer vorbestimmten Wellenlänge oder fluorometrisch durch Betrachtung der Fluoreszenz nachweisen.
Alternativ können die direkten enzymatischen Reaktionsprodukte nach einer weiteren chemischen, nicht-enzymatischen Reaktion sichtbar sein.
Vorzugsweise ist das direkte Produkt der enzymatischen Spaltung ohne weitere chemische Reaktion nachweisbar, da derartige weitere Reaktionen unspezifisch sein können und zu falschen Ablesungen führen können. Die Erfindung umfasst nicht die Verwendung von pH-Indikatoren zum Identifizieren der Anwesenheit des Spaltungsprodukts.
Sofern beide Substrate in Form eines physikalischen Gemisches im gleichen Körper eines Kulturmediums vorliegen, muss es sich bei den enzymatischen Reaktionsprodukten der beiden Substrate um verschiedene Verbindungen handeln, von denen mindestens eines in Gegenwart der anderen und in Gegenwart beider Substrate selbst nachweisbar ist. Das andere Reaktionsprodukt kann zunächst maskiert sein oder sichtbar sein, sofern es vorliegt. Somit lassen sich beliebige Kombinationen von positiven und negativen Reaktionen im Reaktionsmedium feststellen.
Obgleich die Stufe der Kontaktbildung zwischen den Substraten und den gezüchteten Bakterien nach Durchführung der Züchtung für eine bestimmte Zeitspanne und in einer Stufe, in der kein weiteres bakterielles Wachstum oder Stoffwechsel mehr stattfindet, durchgeführt werden kann, findet die Züchtung vorzugsweise in Gegenwart der Enzymsubstrate statt. Somit werden die Substrate dem Kulturmedium bei Beginn der Züchtungsstufe 1 des Verfahrens einverleibt. Die Substrate sollen infolgedessen für Bakterien oder zumindest für Salmonella nichttoxisch sein, wobei ein Wachstum insbesondere für Salmonella ermöglicht wird.
Die Erfinder haben festgestellt, dass eine besonders geeignete Kombination von enzymatischen Substraten folgendes umfasst: ein Substrat, das ein enzymatisches Reaktionsprodukt. erzeugt, bei dem es sich um. eine Indoxyl-Verbindung, einschließlich einer halogensubstituierten Verbindung, handelt, und ein zweites Substrat, bei dem es sich um ein Esculetin, insbesondere eine 3,4-Cyclohexenesculetin-Verbindung, handelt. Sofern das letztgenannte Substrat verwendet wird, sollen während oder nach dem Kontakt der gezüchteten Bakterien mit dem Substrat Eisen(III)-Ionen mit dem Medium in Kontakt gebracht werden. Dies führt zur Erzeugung einer braun-schwarzen Farbe mit dem enzymatischen Reaktionsprodukt eines derartigen Substrats.
Vorzugsweise handelt es sich bei einem der Enzymsubstrate um ein Substrat für eine Glycosidase, z. B. β-Galactosidase, α-Galactosidase oder β-Glucosidase. Vorzugsweise handelt es sich bei einem der Substrate um ein Substrat für ein unterschiedliches Glycosidase-Enzym, obgleich es sich alternativ auch um ein Esterase-Substrat handeln kann. Vorzugsweise sind die beiden Substrate für verschiedene Glycosidase-Enzyme bestimmt. Insbesondere ist ein Substrat für α-Galactosidase und das andere für β-Galactosidase bestimmt.
Das Esculetin-Substrat ist beispielsweise an der 6- oder vorzugsweise an der 7-Hydroxyl-Gruppe durch ein Glycosid substituiert. Substituierte 3,4-Cyclohexenesculetin-Verbindungen, die nicht-diffundierbare Komplexe mit Metallionen, z. B. Eisen(III)-Ionen, bilden, können ebenfalls verwendet werden. Somit kann der Cyclohexen-Ring substituiert sein oder das Cumarin-Ringsystem kann substituiert sein, und zwar durch einen oder mehrere Substituenten.
Die Esculetin-Verbindung weist geeigneterweise die folgende allgemeine Formel auf:
wobei R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine andere Gruppe, die die anschließende Eisen-Chelatbildung nicht stört; bedeutet;
R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₈)-Alkylgruppe, eine (C₆- öder C₁₀)-Aryl-(C₁-C₈)-alkylgruppe oder eine gegebenenfalls modifizierte carboxylhaltige Gruppe der allgemeinen Formel – CH₂(CH₂)_nCOX bedeutet, worin n eine Zahl von 0 bis 3 bedeutet und X eine Hydroxylgruppe oder eine andere hydrophile Gruppe bedeutet,
und R³ alternativ eine Acylgruppe der allgemeinen Formel -COR darstellen kann, in der R eine (C₁-C₈)-Alkyl-, (C₆- oder C₁₀)-Aryl-(C₁-C₈)-alkyl- oder (C₅-C₈)-Cycloalkylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, dass zwischen R³ und R⁴ mindestens 3 Kohlenstoffatome enthalten sind;
oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅-C₈)-Cycloalkenring bilden; und
einer der Reste Y und Z eine enzymatisch abspaltbare Gruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom bedeutet;
oder ein pharniazeutisch verträgliches Salz oder Hydrat davon.
Nachstehend umfasst in der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck "Verbindung" auch ein "Salz" oder "Hydrat", sofern aus dem Zusammenhang nicht notwendigerweise etwas anderes hervorgeht.
Der Ausdruck "Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Ausdruck "Atom oder Gruppe, die die Eisen-Chelatbildung nicht stört", bezieht sich auf die Tatsache, dass eine der grundlegenden Maßnahmen zum Nachweis von Aglyconen der allgemeinen Formel (I) in einer Chelatbildung mittels der Hydroxylgruppen in den 6- und 7-Stellungen des Cumarin-Ringsystems besteht. Gruppen, die diese Chelatbildung nicht stören, können an R¹ und/oder R² substituiert sein. Zu Beispielen gehören Wasserstoff, Hydroxy, Halogen oder (C₁-C₆)-Alkyl. Beim Halogenatom kann es sich um ein Fluoratom oder ein Chloratom handeln und bei der niederen Alkylgruppe kann es sich um Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl oder Benzyl handeln.
Der hier verwendete Ausdruck "(C₁-C₈)-Alkyl" bezieht sich auf geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. Zu Beispielen für derartige Alkylgruppen gehören Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl. Reste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen können bevorzugt sein.
Der hier verwendete Ausdruck "(C₁-C₁₀)-Alkyl" bezieht sich auf geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Zu Beispielen für derartige Alkylgruppen gehören Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl und Decyl. Reste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen können bevorzugt sein.
Der Ausdruck "(C₈- oder C₁₀)-Aryl" umfasst Phenyl und Naphthyl.
Der hier verwendete Ausdruck "(C₅-C₈)-Cycloalken-Ring" bezieht sich auf einen alicyclischen Ring mit 5 bis 8 Atomen, der zusätzlich eine oder mehrere Doppelbindungen aufweist. Zu Beispielen für derartige Cycloalkenyl-Gruppen gehören Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cycloheptenyl und Cyclooctenyl.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen führt das Vorliegen eines asymmetrischen Kohlenstoffatoms zu rEntstehung von Enantiomeren. Das Vorliegen von mehreren asymmetrischen Kohlenstoffatomen führt zu Diastereoisomeren, die jeweils aus zwei Enantiomeren bestehen, wobei die entsprechende R- und S- Stereochemie an jedem chiralen Zentrum vorliegt. Die Erfindung ist so zu verstehen, dass sämtliche Diastereomeren, optisch aktiven Enantiomeren und Gemische davon umfasst werden.
Der Ausdruck "geeignetes Salz" bezieht sich auf. ein Salz, das durch Kontaktieren einer Verbindung der Formel (I) mit einer Säure oder einer Base, deren Gegenionen die beabsichtigte Verwendung der Verbindung nicht beeinträchtigt, hergestellt worden ist. Zu Beispielen gehören das Natriumsalz oder Magnesiumsalz eines Phosphat-Derivats oder das aus einem primären, sekundären oder tertiären Amin gebildete Salz, wobei es sich bei der Verbindung der allgemeinen Formel (I) um eine Carbonsäure handelt. Bei einem Beispiel für ein primäres Aminsalz kann es sich um das Cyclohexylammoniumsalz handeln, bei einem geeigneten sekundären Aminsalz kann es sich um ein Piperidinsalz handeln und bei einem tertiären Aminsalz kann es sich um ein Triethylaminsalz handeln.
Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) umfassen Produkte, die (unabhängig oder in einer belieben verträglichen Kombination) folgendes umfassen:
R¹ bedeutet Chlor oder vorzugsweise Wasserstoff;
R² bedeutet Chlor oder vorzugsweise Wasserstoff;
R³ bedeutet (C₁-C₄)-Alkyl und insbesondere Butyl oder Benzyl;
R⁴ bedeutet (C₁-C₄)-Alkyl; oder -CH₂(CH₂)_nCOX, wobei n eine Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist und X eine Hydroxylgruppe oder eine der folgenden hydrophilen Gruppen darstellt, nämlich:
-NHCH₂CONHCH₂CO₂H
-NHCH₂CONHCH₂CONHCH₂CO₂H
-NHCHCH₂CONH₂
-NHCH₂CH₂SO₃H
-N(CH₂CO₂H)₂ oder
R³ und R⁴ bilden zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅_₈)-Cycloalken-Ring und vorzugsweise einen Cyclopentenyl- oder Cyclohexenylring;
sofern R³ die Bedeutung -CH₂(CH₂)_nCOX hat, worin n eine Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist, hat die Gruppe X die vorstehend definierte Bedeutung;
bei der enzymatisch spaltbaren Gruppe, die durch Y oder Z wiedergegeben ist, handelt es sich um einen α- oder vorzugsweise β-verknüpften Zuckerrest, wie β- D-Glucose; β-D-Galactose, β-D-Xylose, β-D-Glycuronsäure oder N-Acetyt-β-D-glucosamin. Zuckerreste, die von Galactose abgeleitet sind, insbesondere β-D-Galactopyranoside stellen besonders bevorzugte Verbindungen dar.
Verbindungen, in denen R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebundenen sind, einen Cyclopenten- oder Cyclohexenring bilden, werden besonders bevorzugt.
Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist:
3,4-Cyclohexenesculetin-β-D-Galactosid:
Das enzymatische Reaktionsprodukt eines 3,4-Cyclohexenesculetin-Substrats liefert in Gegenwart von Eisen(III)-Ionen einen braun-schwarzen Komplex. Das enzymatische Reaktionsprodukt einer 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Verbindung ergibt in Gegenwart von Sauerstoff eine grüne oder blaue Färbung. Es stehen weitere Indoxyl-Derivate zur Verfügung, die unterschiedliche Substituenten aufweisen, so dass unterschiedlich gefärbte Reaktionsprodukte, z. B. magentafarben, rosa, blau und lachsrot, entstehen. Beliebige dieser Produkte können anstelle der 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Verbindung verwendet werden. Eine bakterielle Kolonie, die für das Enzym, das das Esculetin-Substrat spaltet, positiv ist, erzeugt in Gegenwart von Eisen(III)-Ionen eine schwarze Färbung. Kolonien, die für das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Substraf spaltende Enzym positiv sind, ergeben eine grüne Färbung. Kolonien, die für beide Enzyme positiv sind, lassen sich von Kolonien unterscheiden, die für das Enzym, bei dessen Substrat es sich um die Indolyl-Verbindung handelt, positiv sind, die aber für das andere Enzym negativ sind, oder von solchen, die für beide negativ sind. Das Reaktionsprodukt des Esculetin-Substrats maskiert jedoch das Reaktionsprodukt des Indoxyl-Substrats, so dass Kolonien, die für beide Enzyme positiv sind, nicht notwendigerweise von solchen Kolonien- unterschieden werden können, die nur für das Enzym, für das die Esculetin-Verbindung ein Substrat darstellt, positiv sind.
Das Esculetin-Substrat liegt im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 200 bis 500 mg/l im Agarmedium und vorzugsweise von etwa 300 mg/l vor. Das Indoxyl-Substrat liegt in Mengen bis zu 300 mg/l vor, obgleich es im allgemeinen nicht notwendig ist, Konzentrationen von mehr als 100 mg/l einzusetzen. Die Menge beträgt üblicherweise mindestens 35 mg/l und beispielsweise etwa 70 mg/l. Diese Konzentration an Eisen(III)-Ionen beträgt üblicherweise etwa 400 bis 1000 mg/l (bezogen auf Eisen(III)-ammoniumcitrat), z. B. etwa 500 mg/l.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine neue Zusammensetzung zur Verwendung bei der Züchtung von Bakterien bereitgestellt, die im Gemisch ein erstes chromogenes Enzymsubstrat für β-Galactosidase und ein zweites chromogenes Enzymsubstrat umfassen, wobei die Substrate so gewählt sind, dass es sich bei den enzymatischen Reaktionsprodukten der beiden Enzyme um verschiedene Verbindungen handelt, wobei die Zusammensetzung dadurch charakterisiert ist, dass es sich beim zweiten Substrat um ein Substrat für α-Galactosidase handelt.
Die neue Zusammensetzung gemäß diesem Aspekt der Erfindung eignet sich zur Verwendung im Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung vorzugsweise enthält die Zusammensetzung weitere Komponenten, die sich zur Durchführung der Züchtungsstufe von Bakterien eignen. Somit enthält sie einen oder mehrere Nährstoffe für ein bakterielles Wachstum und vorzugsweise eine Trägersubtanz, z. B. eine gelbildende Substanz, wie Agar. Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in einer trockenen hydratisierbaren Form vor, wobei sie unten Bildung eines einsatzbereiten Kulturmediums hydratisiert werden kann. Das Medium enthält vorzugsweise die übrigen Komponenten, die sich im Kulturmedium eignen, gemäß den vorstehend im Zusammenhang mit dem Verfahren gemachten Angaben.
Die Zusammensetzung soll ferner ein Eisen(III)-salz enthalten, das in Gegenwart des enzymatischen Reaktionsprodukts der Esculetin-Verbindung die schwarze Verbindung erzeugt. Eisen(III)-ammoniumcitrat wird zweckmäßigerweise verwendet, obgleich auch Eisen(III)-gluconat oder andere Salze alternative Quellen für Eisen(III)-Ionen darstellen.
Die Zusammensetzungen können auf selektiven Grundmedien basieren, die die normale mikrobielle Flora hemmen und ein selektives Wachstum von Salmonella ermöglichen. Zu bekannten Medien dieses Typs gehören Wismutsulfit-Agar, Brillantgrün-Agar, enterisches Hektoen-Agar und Salmonella/Shigella-Agar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine neue Verwendung eines chromogenen α-D-Galactosid-Enzym-Substrats zum Nachweis des Vorliegens einer Salmonella-Spezies in einer Probe mit gemischten Spezies bereitgestellt. Vorzugsweise wird der Nachweis durchgeführt, indem man die gemischte Probe auf einem Agarmedium züchtet. Chromogene α-Galactosidase-Substrate sind im Handel erhältlich. Beim Enzymsubstrat handelt es sich vorzugsweise um 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-galactopyranosid.
Nachstehend wird die Erfindung durch das folgende Beispiel erläutert:
Beispiel
Das folgende Basiskulturmedium wird hergestellt. Es begünstigt das Wachstum von Salmonella auf Kosten anderer Enterobakterien durch Einverleibung von Desoxycholat. DCA-Hynes-Base (pro Liter)

Rindfleischextrat 5,0 g

Ausgewogenes Pepton Nr. 1 5,0 g

Natriumcitrat 8,5 g

Natriumdesoxycholat 5,0 g

Agar Nr. 2 12,0 g

Chromogenes Gemisch (pro Liter)

5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-galactopyranosid 70 mg

3,4-Cyclohexenesculetin-β-D-galactopyranosid 300 mg

Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 30 mg
Sämtliche vorstehenden Bestandteile werden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst und 10 Minuten bei 116°C autoklavisiert. Anschließend wird das Agar in sterile Petri-Kunststoffschalen gegossen und verfestigt.
Bewertung
Mitglieder von Enterobactenaceae bekannter Identität wurden in Reinkultur erhalten und auf das neue selektive Medium überimpft. Sämtliche Platten wurden 18 Stunden bei 37°C inkubiert und auf die Farbbildung geprüft. Bei 1020 dieser Stämme wusste man, dass es sich um Salmonella handelte. Sie wurden aus Stuhlproben im Freeman Hospital (120 Stämme) und im Newcastle Regional Public Health Laboratory (900 Stämme) isoliert. Von den 1020 Salmonella-Stämmen erzeugten 1016 (99,6%) eine für Salmonella charakteristische grüne Kolonie. Unter den restlichen vier Stämmen waren drei Stämme, die keine α-Galactosidase erzeugten und farblos blieben. Dabei handelte es sich um zwei Stämme von Salmonella saint-paul und einen Stamm von Salmonella branderup. Beim restlichen Stamm handelte es sich um β-Galactosidase-bildende Salmonella arizonae, die anschließend eine schwarze Kolonie erzeugte.
Von den 300 Nicht-Salmonella-Stämmen erzeugte nur ein Stamm eine für Salmonella typische grüne Kolonie. Es handelte, sich hierbei um einen hochgradig atypischen Stamm von Escherichia coli, der keine β-Galactosidase bildete. 39 weitere Stämme von E. coli erzeugten typische schwarze Kolonien.
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass das Kulturmedium, das die Substrate für α-Galactosidase und β-Galactosidase enthält, äußerst empfindlich ist (99,6%) jedoch hochgradig spezifisch (99,9%) für den Nachweis von Salmonella. Ferner lassen sich die Ergebnisse leicht ablesen.

Claims

Verfahren, bei dem die folgenden Stufen durchgeführt werden: a) eine Probe mit Verdacht auf einen Gehalt an Salmonella-Bakterien wird in Gegenwart eines Nährmediums gezüchtet, b) die bakterielle Kultur wird mit jedem von zwei Enzymsubstraten in Kontakt gebracht, c) die Anwesenheit der enzymatischen Reaktionsprodukte von jedem der Substrate wird im Anschluss an Stufe b) festgestellt, um zu ermitteln, ob ein Wachstum von Salmonella-Spezies stattgefunden hat oder nicht, wobei es sich beim ersten Substrat um ein Substrat für ein Enzym, für das Salmonella negativ ist, handelt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich beim zweiten Substrat um ein Substrat für α-Galactosidase handelt und dass beide Substrate chromogen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei einem der Substrate um eine Indoxyl-Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Indoxylverbindung um eine 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Verbindung handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei einem der Enzymsubstrate um eine Esculetin-Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Esculetin-Verbindung um eine 3,4-Cyclöhexenesculetin-Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Esculetin-Verbindung die allgemeine Formel 1 aufweist
wobei R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine andere Gruppe, die die anschließende Eisen-Chelatbildung nicht stört, bedeutet; R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₈)-Alkylgruppe, eine (C₆- oder C₁ ₀)-Aryl-(C₁-C₈)-alkyfgruppe oder eine gegebenenfalls modifizierte carboxylhaltige Gruppe der allgemeinen Formel – CH₂(CH₂)_nCOX bedeutet, worin n eine Zahl von 0 bis 3 bedeutet und X eine Hydroxylgruppe oder eine andere hydrophile Gruppe bedeutet, und R³ alternativ eine Acylgruppe der allgemeinen Formel -COR darstellen kann, in der R eine (C₁-C₈)-Alkyl-, (C₆- oder C₁₀)-Aryl-(C₅-C₈)-alkyl- oder (C₅-C₈)-Cycloalkylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, das zwischen R³ und R⁴ mindestens 3 Kohlenstoffatome enthalten sind; oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅-C₈)-Cycloalkenring bilden; und einer der Reste Y und Z eine enzymatisch abspaltbare Gruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom bedeutet; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Hydrat davon.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoftatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅-C₈)-Cycloalkenring bilden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei einem der Enzymsubstrate um 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-galactopyranosid handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei einem der Enzymsubstrate um 3,4-Cyclohexenesculetin-β-D-galactopyranosid handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe, die gezüchtet wird, Enterobakterien enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Probe, die gezüchtet wird, sich von einem Anreicherungsverfahren ableitet, bei dem eine direkte Probe beispielsweise 24 Stunden in einer Anreicherungsbrühe gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Probe, die gezüchtet wird, eine direkte, nicht-angereicherte Probe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die direkte Probe aus Faeces stammt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe in Gegenwart eines Inhibitors von Enterobakterien, die sich von Salmonella unterscheiden, gezüchtet wird, der vorzugsweise unter Brillantgrün, Gallensalzen, Bismutsulfit, Hektoen-Medium und Desoxycholatsalzen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe auf einem festen Medium gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Kulturmedium, auf dem die Züchtung stattfindet, die beiden Enzymsubstrate enthält, wobei die Enzymsubstrate so ausgewählt sind, dass es sich bei den einzelnen enzymatischen Reaktionsprodukten um unterschiedliche Verbindungen, die im wesentlichen nicht im Kulturmedium diffundieren können, handelt.
Verwendung eines chromogenen α-Galactosidase-Substrats in Kombination mit einem chromogenen Substrat, das Salmonella-negativ ist, in einem Verfahren, bei dem eine gemischte Probe mit einem Verdacht auf Gehalt an einen Salmonella-Spezies gezüchtet wird, und bei dem die enzymatischen Reaktionsprodukte der Substrate optisch nachgewiesen werden, wobei ein positives Ergebnis des α-Galactosidase-Substrats allein als Indikator für das Vorliegen von Salmonella-Wachstum herangezogen wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei es sich beim Substrat um eine Indoxyl-Verbindung handelt.
Zusammensetzung zur Verwendung bei der Züchtung von Bakterien, umfassend in gemischter Form ein erstes chromogenes Enzymsubstrat für β-Galactosidase und ein zweites chromogenes Enzymsubstrat, wobei die Substrate so gewählt sind, dass es sich bei den enzymatischen Reaktionsprodukten (Chromophore) der beiden Enzyme um verschiedene Verbindungen handelt, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim zweiten Substrat um α-Galactosidase handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei es sich bei einem der Substrate um eine Indoxyl-Verbindung handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei es sich bei der Indoxylverbindung um eine 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Verbindung handelt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei es sich bei einem der Enzymsubstrate um eine Esculetin-Verbindung handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Esculetin-Verbindung um eine 3,4-Cyclohexenesculetin-Verbindung handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die Esculetin-Verbindung die allgemeine Formel 1 aufweist
wobei R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine andere Gruppe, die die anschließende Eisen-Chelatbildung nicht stört, bedeutet; R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₈)-Alkylgruppe, eine (C₆- oder C₁₀)-Aryl-(C₁-C₈)-alkylgruppe oder eine gegebenenfalls modifizierte carboxylhaltige Gruppe der allgemeinen Formel CH₂(CH₂)_nCOX bedeutet, worin n eine Zahl von 0 bis 3 bedeutet und X eine Hydroxylgruppe oder eine andere hydrophile Gruppe bedeutet, und R³ alternativ eine Acylgruppe der allgemeinen Formel -COR darstellen kann, in der R eine (C₁-C₈)-Alkyl-, (C₆- oder C₁₀)-Aryl-(C₁-C₈)-alkyl-oder (C₅-C₈)-Cycloalkylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, das zwischen R³ und R⁴ mindestens 3 Kohlenstoffatome enthalten sind; oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoftatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅-C₈)-Cycloalkenring bilden; und einer der Reste Y und Z eine enzymatisch abspaltbare Gruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom bedeutet; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Hydrat davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoftatomen, an die sie gebunden sind, einen (C₅-C₈)-Cycloalkenring bilden.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, enthaltend einen oder mehrere Nährstoffe für bakterielles Wachstum und eine Trägersubstanz.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, die in trockener, hydratisierbarer Form vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 27, enthaltend einen Inhibitor für das Wachstum von Enterobakterien, die sich von Salmonella unterscheiden.
Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei die Zusammensetzung der vorzugsweise unter Brillantgrün-Agar, Agar mit einem Gehalt an Gallensalzen, Bismutsulfit-Agar, Agar mit einem Gehalt an Desoxycholatsalzen, enterischem Agar mit einem Gehalt an Hektoen-Medium und Salmonella/Shigella-Agar ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 29, die einen Promotor für β-Galactosidase enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der Promotor unter Lactose und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ausgewählt ist.