JP2008017712A - 微生物培地 - Google Patents

Abstract

【課題】発色または蛍光酵素基質を用いて大腸菌群と腸内細菌科の食中毒菌を容易に判定できる微生物培地を提供すること。
【解決手段】下記の成分を含む微生物培地。
下記の成分を含む微生物培地。
（Ａ）微生物の生育栄養成分、
（Ｂ）胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、およびラウリル硫酸塩からなる群から選ばれる１種以上の成分、
（Ｃ）α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質、および
（Ｄ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質。
【選択図】なし

Description

本発明は微生物を培養検出分離するための培地に関する。さらに詳しくは食品や環境中の微生物による汚染度合いを判断するための大腸菌群および腸内細菌科の汚染指標菌および／または食中毒菌を測定するのに好適な微生物培地、およびこれを使用した汚染指標菌および／または食中毒菌の検出方法に関する。

従来の衛生指標菌検査はおもに一般生菌数と大腸菌群数を測定することによりなされている。しかし、腸内細菌科の重要な食中毒菌であるサルモネラのほとんどは大腸菌群に該当しないため、大腸菌群陰性でも腸内細菌科の細菌による食中毒が起こりうる。そこで、大腸菌群に代わり腸内細菌科を指標菌として検査する方法を採用する場合もある。

従来の腸内細菌科の検査方法は、まず食品等を滅菌生理食塩水またはペプトン加滅菌生理食塩水で懸濁し、滅菌生理食塩水またはペプトン加滅菌生理食塩水で１０倍希釈列を作製し、この希釈液１ｍＬを滅菌ペトリ皿に加えた後、あらかじめ溶解滅菌して約４５℃に保っておいた乳糖の代わりにグルコースを加えたバイオレットレッドバイル寒天培地を加えて混釈して、３５℃で培養し赤色のコロニーを計数する方法である。しかしこの検査方法は、前もって培地を調製し滅菌した後、寒天培地が固化しない温度に保っておく必要があるなど手間と時間がかかり、また腸内細菌科に属するか否かの判定に迷うコロニーがしばしば形成される。また、腸内細菌科には環境由来の非病原性菌も多数存在する。大腸菌群検査が食中毒菌汚染の可能性の指標であることを考慮すると、腸内細菌科全体を検査するより大腸菌群と腸内細菌科の食中毒菌を検査することはより合理的である。
一方、サルモネラ菌の検査方法として、サルモネラ菌陽性のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色酵素基質とサルモネラ菌陰性のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色酵素基質を含む培地を使用してサルモネラ菌を選択的に検出する方法も提案されている（特許文献１）。

ＷＯ９８／５５６４４

本発明の目的は、例えば、発色または蛍光酵素基質を用いて大腸菌群と腸内細菌科の食中毒菌を容易に判定できる培地を提供することであり、本発明者らがＷＯ９７／２４４３２において提案した、多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層からなるシートまたはフィルム状の培養器または培地を応用し、例えば、食品や環境中の大腸菌群および腸内細菌科の汚染指標菌および／または食中毒菌を測定するための従来の微生物培地に関する前述の問題点を解決することである。

本発明の培地は、大腸菌群および腸内細菌科の汚染指標菌および／または食中毒菌を簡易に測定するのに好適な培地、およびこの培地を使用して汚染指標菌および／または食中毒菌を検出する方法を提供するものである。
１．下記の成分を含む微生物培地。
（Ａ）微生物の生育栄養成分、
（Ｂ）胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、およびラウリル硫酸塩からなる群から選ばれる１種以上、
（Ｃ）α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質、および
（Ｄ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質。
２．微生物の生育栄養成分が、肉エキス、ペプトン類、および酵母エキスからなる群から選ばれる１種以上を含む、上記１に記載の微生物培地。
３．成分（Ａ）の含有量が２〜２０ｇ／Ｌ、成分（Ｂ）の含有量が０．０５〜２ｇ／Ｌ、成分（Ｃ）の含有量が０．００５〜１．０ｇ／Ｌ、成分（Ｄ）の含有量が０．００５〜１．０ｇ／Ｌの範囲である上記１または２に記載の微生物培地。
４．ｐＨ調整剤を含む、上記１から３のいずれか１項に記載の微生物培地。
５．ｐＨ調整剤の含有量が０．１〜１０ｇ／Ｌの範囲である、上記４に記載の微生物培地。
６．ゲル化剤を含む、上記１から５のいずれか１項に記載の微生物培地。
７．多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層を含む、上記１から６のいずれか１項に記載の微生物培地。
８．水溶性高分子化合物層が１〜４層である、上記７記載の微生物培地。
９．多孔質マトリックス層と２または３層の水溶性高分子化合物層とを含み、多孔質マトリックス層から最も離れた側の水溶性高分子化合物層に接して台紙を含んでもよい積層物が、その積層物より大きな粘着シートの中心部に多孔質マトリックス層が上になるように接着され、その上に前記積層物より大きな透明フィルムが多孔質マトリックス層に接しかつ前記積層物と中心部を合わせるように被せられ、この透明フィルムの前記積層物からはみ出している部分が粘着シートの前記積層物が接着されていない部分と接着されている上記７または８に記載の微生物培地。
１０．水溶性高分子化合物層全体に対する各成分の合計含有量の範囲を培地に対する目付で表すとき、成分（Ａ）が２〜１０ｇ／ｍ²、成分（Ｂ）が０．３〜３ｇ／ｍ²、成分（Ｃ）が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²、成分（Ｄ）が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²、ｐＨ調整剤が０．１〜１０ｇ／ｍ²である、上記７から９のいずれか１項に記載の微生物培地。
１１．水溶性高分子化合物層に含まれる水溶性高分子化合物が、鹸化度７５〜９５％、分子量２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールである、上記７から１０のいずれか１項に記載の微生物培地。
１２．多孔質マトリックス層が目付４０〜１００ｇ／ｍ²、通気度７０〜２４０Ｌ／ｍ²・ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布である、上記７から１１のいずれか１項に記載の微生物培地。
１３．粘着シートがアクリル系粘着剤またはゴム系粘着剤を塗布した、ポリエステルフィルム、白色ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルム、ポリオレフィン系合成紙またはポリオレフィンラミネート紙であり、透明フィルムがポリオレフィンフィルムまたは剥離処理ポリオレフィンフィルムである、上記９から１２のいずれか１項に記載の微生物培地。
１４．粘着シートの厚さが０．０７〜０．５ｍｍであり、透明フィルムの厚さが２０〜８０μｍである、上記９から１３のいずれか１項に記載の微生物培地。
１５．粘着シートと透明フィルムとの接着部分の一部をこの粘着シートの粘着力により接着している、上記９から１４のいずれか１項に記載の微生物培地。
１６．上記１から１５のいずれか１項に記載の微生物培地を使用することを特徴とする汚染指標菌および／または食中毒菌の検出方法。

本発明の微生物培地を用いれば、例えば、食品や環境中の大腸菌群と腸内細菌科の汚染指標菌および／または食中毒菌が容易に検出できる。また、本発明の微生物培地をシート状培地としたものを用いれば、（ｉ）培地調製の手間がいらず、大腸菌群と腸内細菌科の汚染指標菌および／または食中毒菌の検査が簡便に行える、(ｉｉ)通常の食品や環境検査に加え、例えば、曲面や多少の凹凸のある面でも直接検査対象をスタンプまたはふき取って検査することもできる、(ｉｉｉ)シート状であるため培養に場所をとらず、廃棄物も通常の検査に比べ大幅に減少するといった効果を有する。

本発明は下記の成分を必須成分として含む微生物培地である。
（Ａ）微生物の生育栄養成分、
（Ｂ）胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、およびラウリル硫酸塩からなる群から選ばれる１種以上、
（Ｃ）α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質、および
（Ｄ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質。
微生物の生育栄養成分（Ａ）の具体例としては、肉エキス、ペプトン類、および酵母エキス等が挙げられる。肉エキスには獣肉エキス及び魚肉エキス等がある。ペプトン類としては、ペプトン、ポリペプトン、トリプトン、ソイトン、大豆ぺプトンなどの名称で市販されているものが挙げられる。
胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸（塩）およびラウリル硫酸塩からなる群から選ばれる成分（Ｂ）は、サルモネラと大腸菌群の生育を促進させ、他の微生物の生育を抑制する選択剤としての機能を有する。従って、この明細書において成分（Ｂ）を「選択剤」ということもある。より選択性を高くするために２種以上含むことはより好ましい。また、選択性を上げるために抗生物質（例えば、マクロライド系抗生物質、リンコマイシン、グリンダマイシン、バシトラシン）などを加えても良い。

大腸菌群は乳糖から酸とガスを産生するグラム陰性桿菌として定義され、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を指標として測定できる。サルモネラのほとんどはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を有していないが、強いα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を有していることが知られている。α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性はサルモネラの他クレブシエラ属、エンテロバクター属、大腸菌なども有している。α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を指標とすれば大腸菌群と腸内細菌科の食中毒菌を同時に測定できる。

また、ＷＯ９７／２４４３２の多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層からなるシートまたはフィルム状の培養器または培地に応用すれば、省スペースで、培地調製の手間もいらず、より簡易に大腸菌群と腸内細菌科の食中毒菌を測定できる。

α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質（以下「発色または蛍光酵素基質」を「発色基質」または「発色剤」ということがある。）およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質は、寒天培地のようなゲル化剤を用いた培地または多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層からなるシートまたはフィルム状培地上で発色が観察できるものであればどのようなものでもよい。例えば、オキシインドール、ハロゲン置換オキシインドール、アルキル置換オキシインドールの誘導体等が好ましく用いられる。

異なる色の発色団を有するα−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質の組み合わせを用いれば、サルモネラと大腸菌群を異なった色に発色させることもできる。例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−β−Ｇａｌ）と５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトシド（Ｍａｇｅｎｔａ−α−Ｇａｌ）の組み合わせでは大腸菌群は青〜紫のコロニーとなり、サルモネラは赤いコロニーとなる。

多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層からなるシートまたはフィルム状の培地とするときには、α-Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−α−Ｇａｌ）、インドキシル−α−Ｄ−ガラクトシド、５−ブロモ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトシドなど青色系の発色団を有する発色基質を用い、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質として６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｓａｌｍｏｎ-β−Ｇａｌ）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｍａｇｅｎｔａ−β−Ｇａｌ）など赤色系の発色団を有する発色基質を用いるとサルモネラと大腸菌群の発色を区別しやすい。

ゲル状の固体培地とするときの本発明の培地を構成する成分は、好ましくは肉エキス、ペプトン類および酵母エキスから選ばれる１種以上の栄養成分（Ａ）の合計が２〜２０ｇ／Ｌ、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩（例えば、ナトリウム塩）およびラウリル硫酸塩（例えば、ナトリウム塩）からなる群から選ばれる１種以上の成分（Ｂ）の合計が０．０５〜２ｇ／Ｌ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質（Ｃ）が０．００５〜１．０ｇ／Ｌおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質（Ｄ）が０．００５〜１．０ｇ／Ｌであることが好ましい。
成分（Ａ）および（Ｂ）の含有量が上記範囲内にあると生育が良好であり、２４時間程度の培養で汚染指標菌および／または食中毒菌の測定が可能になるので好ましい。
成分（Ｃ）および（Ｄ）の発色基質の含有量が上記範囲内にあると発色が明瞭で、観察が容易であり、好ましい。
これら以外にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの誘導効果のある乳糖やＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などを加えることはより好ましい。これらのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの誘導効果剤の添加量は、好ましくは乳糖は０．５〜１０ｇ／Ｌ、ＩＰＴＧは１〜１００ｍｇ／Ｌである、

本発明の微生物培地のｐＨは、試料液を加えた状態で好ましくは４．５〜９．０、さらに好ましくは５〜８．５の範囲であることが望ましい。本発明の培地のｐＨ調整に使用するｐＨ調整剤としては、リン酸塩、炭酸塩、これらの混合物が挙げられ、その使用量は０．１〜１０ｇ／Ｌ程度であることが好ましい。ｐＨ調整剤の具体例としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。

シートまたはフィルム状培地とするときの本発明の培地を構成する成分は、水溶性高分子化合物層全体に対する各成分の合計含有量の範囲を培地に対する目付で表すとき、成分（Ａ）が２〜１０ｇ／ｍ²、成分（Ｂ）が０．３〜３ｇ／ｍ²、成分（Ｃ）のα−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²、および成分（Ｄ）のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色基質が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²であることが好ましい。
ゲル状の固体培地と同様に、成分（Ａ）および（Ｂ）の含有量が上記範囲内にあると生育が良好であり、２４時間程度の培養で汚染指標菌および／または食中毒菌の測定が可能になるので好ましい。
成分（Ｃ）および（Ｄ）の発色基質の含有量が上記範囲内にあると発色が明瞭で、観察が容易であり、好ましい。
ｐＨ調整剤の量は、好ましくは０．１〜１０ｇ／ｍ²である。
成分（Ｂ）の選択剤は、より選択性を高くするために２種以上含むことはより好ましい。また、選択性を上げるために抗生物質などを加えても良い。塩類はｐＨ調整に役立ち上記範囲であれば十分にｐＨ調整効果をもつ。これら以外にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの誘導効果のある乳糖やＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などを加えることはより好ましい。

本発明のシートまたはフィルム状培地の水溶性高分子化合物層を形成するための材料としては、試料液を加えたときに、水に溶解して１０ｃｐｓ（４０℃で測定した粘度）以上の高粘度を示し、微生物の生育を阻害しないものが好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリル酸誘導体、でんぷん誘導体、蛋白質、蛋白質誘導体、及び多糖類等が使用できる。この中でもポリビニルアルコールがより好ましく、鹸化度が７５〜９５％、分子量が２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールが特に好ましい。

本発明のシートまたはフィルム状培地に使用する多孔質マトリックス層を形成するための材料としては、ナイロン繊維、ポリアクリロニトリル繊維、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）繊維、エチレン酢酸ビニル共重合体繊維、ポリエステル繊維（親水化処理したポリエステル繊維がより好ましい）、ポリオレフィン繊維（親水化処理したポリオレフィン繊維がより好ましい）、及びポリウレタン繊維等の合成繊維、レーヨン繊維等の半合成繊維、羊毛（獣毛）、絹、コットン繊維、セルロース繊維、及びパルプ繊維等の天然繊維、ガラス繊維等の無機繊維等が例示でき、これらの繊維を用いて作られた編織布及び不織布等の布帛や、上記繊維の構成素材で作られた多孔質フィルムやスポンジなどが使用できる。

これらの中で好ましいのはナイロン繊維、コットン繊維、セルロース繊維、及びレーヨン繊維であるが、目付、通気度の調整が容易な編織布、不織布等の布帛を用いることが好ましい。不織布の中でも、さらに比較的容易に細繊維が得られるメルトブロー製法で作製した不織布や、分割繊維から製造した極細繊維不織布を特に好ましく用いることができる。従って、メルトブロー製法で作製したナイロン不織布が特に好ましい。そして、多孔質マトリックス層は、目付４０〜１００ｇ／ｍ²、通気度７０〜２４０Ｌ／ｍ²・ｓｅｃであることが好ましい。

本発明のシートまたはフィルム状培地に用いる多孔質マトリックス層は撥水性であってもよいが、親水性または親水化処理した多孔質マトリックス層を用いることにより、撥水性の多孔質マトリックス層よりも吸水速度が速くなり作業の能率が高くなる。さらに、これら多孔質マトリックス層の表面に水溶性物質を塗布しておくことが、微生物の分散をさらに向上できるため好ましい。水溶性物質としては、検査目的の微生物の生育を妨げないものであればどのようなものでも構わないが、水溶性高分子化合物層に添加した栄養成分や塩類が好ましい。界面活性剤や発色基質を塗布してもよい。

本発明のシートまたはフィルム状培地に用いる粘着シートの材質は、検査目的の微生物の生育を阻害しないものであればどのようなもので良いが、透明フィルムを剥がしやすくするためにはある程度の腰が必要であり、曲面などをふき取るためには柔軟であることが好ましい。例えば、厚さ０．０７〜０．５ｍｍのポリエステルフィルム、白色ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルム、ポリオレフィン系合成紙またはポリオレフィンラミネート紙であれば、この条件を満たしている。粘着シートに使用する粘着剤も大腸菌の生育を阻害しないものであればどのようなものでも良いが、作業性を考えると粘着シートと透明フィルムとを再接着できさえすれば、粘着力は弱いほど好ましい。ゴム系およびアクリル系粘着剤が好ましく、再剥離タイプおよび微粘着タイプアクリル系粘着剤が特に好ましい。

透明フィルムも検査目的の微生物の生育を阻害しないものであればどのようなものでも良いが、厚みをもった積層物が粘着シートとの間にはいるため、柔軟性は必要である。ポリオレフィンフィルム、ポリエステルフィルム、ナイロンフィルムなどが使用でき、剥がしやすくするために剥離剤処理を施したものでも良い。透明フィルムの開け閉めなど作業性からはポリオレフィンフィルムが好ましく、厚さ２０〜１００μｍのポリプロピレンフィルムが特に好ましい。

本発明の微生物培地の好ましい実施態様は、少なくとも１層の水溶性高分子化合物層を有する。このとき、水溶性高分子化合物層は１層であってもよいが、２層以上の多層であってもよく、本発明においては２層または３層であることが好ましい。水溶性高分子化合物層を多層とする場合には、水溶性高分子化合物溶液を塗り重ねて作製することができる。また、数層に分けて作製した水溶性高分子化合物層を貼り合わせることで、多層とすることもできる。

仮に水溶性高分子化合物層を多孔質マトリックス層に近い順にアルファベット順の記号を付けるとする。水溶性高分子化合物層が、Ａ層、及びＢ層の２層から構成されている場合、Ａ層は、微生物の生育栄養成分、発色剤、及び選択剤を含むことが好ましく、Ｂ層は、微生物の生育栄養成分、発色剤、および選択剤を含んでいてもよいが、水溶性高分子化合物のみから構成されていてもよい。

また、水溶性高分子化合物層が、Ａ層、Ｂ層、及びＣ層の３層から構成されている場合、少なくともＡ層、Ｂ層のいずれか一方またはその両方に、微生物の生育栄養成分、発色剤、および選択剤が含まれることが好ましく、Ｃ層は水溶性高分子化合物のみから構成されることが好ましい。多孔質マトリックス層から最も離れた水溶性高分子化合物層であるＣ層を、水溶性高分子化合物のみから構成することで、水溶性高分子化合物層に添加する微生物の生育栄養成分を減量でき、生育栄養成分の利用効率が高くできるため好ましい。

なお、発色剤や選択剤の組み合わせによっては、混合することで反応を起こす場合がある。そのような場合には、反応しやすい成分を別々の層に分けて加えることが好ましい。また、水溶性高分子化合物層を多層構造にする場合には、各層が密着していることが好ましい。また、あまりに多くの層を形成しても製造工程の増加に伴うコストアップに見合う効果が得られないので、５層を越えた多層とすることにはあまり意味はない。

多孔質マトリックス層から最も離れた水溶性高分子化合物層のさらに下層に樹脂フィルムが積層されていてもよい。この樹脂フィルムは、例えば、水溶性高分子化合物層を製造する際に台紙フィルムとして用いたフィルムなどである。使用する際、必要に応じて水溶性高分子化合物層から取り除いてもよい。この樹脂フィルムの原料としては、ポリエステル、ポリオレフィン、及びナイロンから選ばれた少なくとも１種の樹脂が用いられる。これらの樹脂からなる樹脂フィルムを用いることで、粘着シートとの接着性が良好となるため好ましい。また、微生物培養器または微生物培地は、どのような形に切断して利用してもよい。

以下に、シート状の微生物培地の作製方法について説明する。
ポリエステル等のフィルムを台紙として、その上に、微生物の生育栄養成分、発色剤、選択剤等を含有する水溶性高分子化合物の水溶液を塗布し、乾燥または半乾燥状態の水溶性高分子化合物層とする。なお、この水溶性高分子化合物層は２層以上の多層構造であっても良い。多層構造の場合、いずれかの層に微生物の生育栄養成分、発色剤、選択剤等が含有されていればよい。さらに水溶性高分子化合物層上に、多孔質マトリックス層を積層して乾燥する。なお、水溶性高分子化合物層を多層構造とするときは多孔質マトリックス層と接する最上層の水溶性高分子化合物の目付は、１〜２０ｇ／ｍ²とすることが好ましい。

多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを積層して乾燥する工程において、水溶性高分子化合物層が１層の場合、水溶性高分子化合物の水溶液が半乾燥状態で、多孔質マトリックス層を積層するか、または、乾燥状態であれば水または微生物の生育栄養成分を含んだ水を加えて湿らせた多孔質マトリックス層を積層する。水溶性高分子化合物層を２層以上とする場合、既に形成された水溶性高分子化合物層の上に水溶性高分子化合物の水溶液を塗布して、そのまま、または半乾燥状態で多孔質マトリックス層を積層するか、または、乾燥後、水または微生物の生育栄養成分等を含んだ水を加えて湿らせた多孔質マトリックス層を積層すればよい。

また、乾燥後、さらに必要に応じて多孔質マトリックス層上に水溶性高分子化合物の水溶液を塗布し乾燥する工程を加えてもよい。なお、得られたシート状微生物培地から、必要に応じて台紙を剥がしてもよい。次に、得られたシート状微生物培地を必要に応じて適当な大きさに切断し、粘着剤を塗布したシートまたはフィルムに接着し、透明フィルムを被せ、袋やシャーレに入れる等の措置を施し、エチレンオキサイドガス等により滅菌を施してもよい。

具体的に、本発明の微生物培地が、３層の水溶性高分子化合物層から構成される場合の作製方法について以下に説明する。
ポリエステル等の樹脂フィルム上に、水溶性高分子化合物の水溶液を塗布・乾燥し、水溶性高分子化合物層（Ｃ層）を作製する。この層上に微生物の生育栄養成分、発色剤、選択剤等を含んだ水溶性高分子化合物の水溶液を塗布・乾燥し、水溶性高分子化合物層（Ｂ層）を作製する。さらにこの層上に微生物の生育栄養成分、選択剤、発色剤等を含んだ水溶性高分子化合物の水溶液を塗布し、水溶性高分子化合物層（Ａ層）を作製し、Ｃ層、Ｂ層、Ａ層からなる水溶性高分子化合物層の積層体とする。さらに、この積層体上に生育栄養成分、発色剤、選択剤等を含まない多孔質マトリックス層、またはそれらを含む多孔質マトリックス層を積層して乾燥することにより、３層の水溶性高分子化合物層から構成される本発明の微生物培地が得られる。多孔質マトリックス層に接する水溶性高分子化合物層中の水溶性高分子化合物の目付は１〜２０ｇ／ｍ²であることが好ましい。

多孔質マトリックス層の乾燥後、その表面にペプトン、酵母エキス、肉エキス、アミノ酸混合物、糖類等の微生物の生育栄養成分または塩化ナトリウム、リン酸塩、炭酸塩等の塩類の水溶液または栄養成分と塩類の混合水溶液を多孔質マトリックス層表面に塗布し乾燥してもよい。なお、必要に応じて、台紙フィルムとして用いた樹脂フィルムを乾燥後に取り除いてもよい。

本発明においては、得られた微生物培地を適当な大きさに切断し、これをより大きな粘着シートに接着する。このとき、樹脂フィルムを付着したままで使用する場合には、微生物培地の樹脂フィルム側に粘着シートを接着し、また樹脂フィルムを取り除いた場合には、水溶性高分子化合物層側に粘着シートを接着する。更に、この上から透明フィルムを被せ、微生物培地の周りの微生物培地が接着されていない粘着シート部分に透明フィルムを接着してもよい。このとき、またはこの後、（１）透明フィルムと粘着シートの一端をずらし、粘着シートと透明フィルムとの間の粘着力よりさらに強い粘着力を有する粘着テープで接着する方法、（２）透明フィルムと粘着シートの一端を粘着シートと透明フィルムとの間の粘着力よりさらに強い粘着力を有する両面テープで接着する方法、または、（３）透明フィルムまたは粘着シートまたは両者の一端に、残りの部分よりさらに強い接着力を有する粘着剤を塗布するなどの方法、によって粘着シートと透明フィルムとの間の粘着力をさらに強くしてもよく、さらに、エチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施してもよい。

他の実施態様として、本発明の微生物培地が、２層の水溶性高分子化合物層から構成される場合の作製方法について以下に説明する。
ポリエステル等の樹脂フィルム上に、微生物の生育栄養成分、発色剤、選択剤等を含む水溶性高分子化合物の水溶液または水溶性高分子化合物のみからなる水溶液を塗布し・乾燥し、水溶性高分子化合物層（Ｂ層）を作製する。さらに、この層上に微生物の生育栄養成分、発色剤、選択剤等を含む水溶性高分子化合物の水溶液または水溶性高分子化合物のみからなる水溶液を塗布することで、水溶性高分子化合物層（Ａ層）を作製し、Ｂ層、Ａ層からなる水溶性高分子化合物層の積層体とする。この積層体上に多孔質マトリックス層または微生物の生育栄養成分等を含ませた多孔質マトリックス層を積層して乾燥することにより、２層の水溶性高分子化合物層から構成される本発明の微生物培地が得られる。なお、Ａ層に使用する微生物の生育栄養成分は、必要に応じ、熱変性または熱分解しやすいものであってもよい。なお、多孔質マトリックス層に接する水溶性高分子化合物層（Ａ層）中の水溶性高分子化合物の目付は、１〜２０ｇ／ｍ²の範囲であることが非常に好ましい。

いかなる方法で作製したシート状またはフィルム状の微生物培地であっても、水溶性高分子化合物層間、あるいは、樹脂フィルムを取り除かない場合における水溶性高分子化合物層と樹脂フィルムとの間は密着していることが好ましく、水溶性高分子化合物層と多孔質マトリックス層は少なくともその一部が接着していればよい。また、透明フィルムと粘着シートとの接着された部分には隙間のないことが好ましい。

次に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
水１２５ｍｌに鹸化度８９％、分子量８３０００のポリビニルアルコール１５ｇを加えて加熱溶解後、厚さ２０μｍ、サイズ０．５ｍ×０．５ｍのポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃で５分間加熱して乾燥し、第１の水溶性高分子化合物層とした。この層に、前記のポリビニルアルコール７．５ｇ、肉エキス１ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、胆汁末０．１８ｇ、リン酸二カリウム０．０６３ｇ、硝酸カリウム０．１２５ｇ、乳糖１ｇを水６３ｍｌに溶解して得た水溶液を塗布し、１１０℃で７分間乾燥して第２の水溶性高分子化合物層とした。この第２の水溶性高分子化合物層の上に、前記のポリビニルアルコール２．５ｇ、乳糖・１水和物０．０２５ｇ、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０５ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０５ｇを水５０ｍＬに溶解して塗布し、この上に目付６５ｇ／ｍ²、通気度１１０Ｌ／（ｍ²・ｓｅｃ）のナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ、１００℃で３０秒間乾燥した。最後に、ペプトン２ｇ、デオキシコール酸ナトリウム２ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．２ｇを水０．５Ｌに溶解した水溶液を、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて不織布上に塗布して、１００℃で２０秒間乾燥し培地積層物を作製した。この積層物を４５×４５ｍｍに切断し、厚さ０．１ｍｍ、８０×８５ｍｍに切断した（株）共和製アクリル系微粘着タイプ粘着剤塗布１００μｍ厚白色ポリエステル粘着シートの中央部に接着した後、０．０６ｍｍ厚、８０×８５ｍｍポリプロピレンフィルムを８５ｍｍ方向が５ｍｍずれるように粘着シートに接着し、（株）共和製９ｍｍ巾バックシーリングテープをずらした部分を覆うように接着して、エチレンオキサイドガス滅菌を行ってシート状の微生物培地を作製した。

実施例２
表１に示す菌株を、普通ブイヨンで一夜培養し、滅菌生理食塩水で数十ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した菌懸濁液１ｍLを実施例１で作製した微生物培地に加え、３５℃２４時間培養した。表１に示すようにサルモネラは青緑、大腸菌群は紫色のスポットとして観察され、サルモネラおよび大腸菌群以外の株による発色は認められなかった。

実施例３
鶏肉２５ｇを緩衝ペプトン水２２５ｍＬに入れ、３５℃１６時間培養した。
あらかじめ滅菌生理食塩水１ｍＬを加えておいた実施例１で作製した微生物培地に上記培養液１白金耳を画線した。３５℃２４時間培養すると紫色に加え、青色のスポットの観察される微生物培地があった。青色スポットを釣菌し、普通寒天培地で培養後、普通寒天培地上に生育した１コロニーを１本ずつのＴＳＩ半高層培地、ＬＩＭ培地に移植し、３５℃２４時間培養した。ＴＳＩ半高層培地、ＬＩＭ培地はサルモネラ属と判定される結果を示した。

実施例４
ペプトン１０ｇ、ピルビン酸ナトリウム１ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、リン酸一カリウム５ｇ、リン酸二カリウム２．２ｇ、硝酸カリウム２．５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５ｇ、デオキシコール酸ナトリウム０．２ｇ、乳糖５ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１ｇ、寒天１５ｇに水１Ｌを加え懸濁後、１２１℃１５分オートクレーブ処理し、よく混合後、滅菌シャーレに分注固化した。
表２に示す菌株を、普通ブイヨンで一夜培養し、滅菌生理食塩水で数百ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した菌懸濁液０．１ｍＬを上記培地に加え、コーンラージ棒を用いて培地全体に塗布した。３５℃２４時間培養した結果、表２に示すようにサルモネラおよび大腸菌群は青色のスポットとして観察され、サルモネラおよび大腸菌群以外の株による発色は認められなかった。

Claims (16)

1. 下記の成分を含む微生物培地。
   （Ａ）微生物の生育栄養成分、
   （Ｂ）胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、およびラウリル硫酸塩からなる群から選ばれる１種以上、
   （Ｃ）α−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質、および
   （Ｄ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発色または蛍光酵素基質。
2. 微生物の生育栄養成分が、肉エキス、ペプトン類、および酵母エキスからなる群から選ばれる１種以上を含む、請求項１に記載の微生物培地。
3. 成分（Ａ）の含有量が２〜２０ｇ／Ｌ、成分（Ｂ）の含有量が０．０５〜２ｇ／Ｌ、成分（Ｃ）の含有量が０．００５〜１．０ｇ／Ｌ、成分（Ｄ）の含有量が０．００５〜１．０ｇ／Ｌの範囲である、請求項１または２に記載の微生物培地。
4. ｐＨ調整剤を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の微生物培地。
5. ｐＨ調整剤の含有量が０．１〜１０ｇ／Ｌの範囲である、請求項４に記載の微生物培地。
6. ゲル化剤を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の微生物培地。
7. 多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の微生物培地。
8. 水溶性高分子化合物層が１〜４層である、請求項７に記載の微生物培地。
9. 多孔質マトリックス層と２または３層の水溶性高分子化合物層とを含み、多孔質マトリックス層から最も離れた側の水溶性高分子化合物層に接して台紙を含んでもよい積層物が、その積層物より大きな粘着シートの中心部に多孔質マトリックス層が上になるように接着され、その上に前記積層物より大きな透明フィルムが多孔質マトリックス層に接しかつ前記積層物と中心部を合わせるように被せられ、この透明フィルムの前記積層物からはみ出している部分が粘着シートの前記積層物が接着されていない部分と接着されている請求項７または８に記載の微生物培地。
10. 水溶性高分子化合物層全体に対する各成分の合計含有量の範囲を培地に対する目付で表すとき、成分（Ａ）が２〜１０ｇ／ｍ²、成分（Ｂ）が０．３〜３ｇ／ｍ²、成分（Ｃ）が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²、成分（Ｄ）が０．０２〜１．２ｇ／ｍ²、ｐＨ調整剤が０．１〜１０ｇ／ｍ²である、請求項７から９のいずれか１項に記載の微生物培地。
11. 水溶性高分子化合物層に含まれる水溶性高分子化合物が、鹸化度７５〜９５％、分子量２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールである、請求項７から１０のいずれか１項に記載の微生物培地。
12. 多孔質マトリックス層が目付４０〜１００ｇ／ｍ²、通気度７０〜２４０Ｌ／ｍ²・ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布である、請求項７から１１のいずれか１項に記載の微生物培地。
13. 粘着シートがアクリル系粘着剤またはゴム系粘着剤を塗布した、ポリエステルフィルム、白色ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルム、ポリオレフィン系合成紙またはポリオレフィンラミネート紙であり、透明フィルムがポリオレフィンフィルムまたは剥離処理ポリオレフィンフィルムである、請求項９から１２のいずれか１項に記載の微生物培地。
14. 粘着シートの厚さが０．０７〜０．５ｍｍであり、透明フィルムの厚さが２０〜８０μｍである、請求項９から１３のいずれか１項に記載の微生物培地。
15. 粘着シートと透明フィルムとの接着部分の一部をこの粘着シートの粘着力により接着している、請求項９から１４のいずれか１項に記載の微生物培地。
16. 請求項１から１５のいずれか１項に記載の微生物培地を使用することを特徴とする汚染指標菌および／または食中毒菌の検出方法。