ES2200346T3 - Identificacion de salmonela. - Google Patents
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- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO MEDIO DE CULTIVO PARA IDENTIFICAR LA PRESENCIA DE SALMONELLA EN MUESTRAS DE ENTEROBACTERIAS, ESPECIALMENTE HECES, QUE CONTIENE DOS SUSTRATOS ENZIMATICOS CROMOGENICOS, UNO DE LOS CUALES ES UN SUSTRATO PARA AL - D - GALACTOSIDASA, PARA EL CUAL SALMONELLA ES POSITIVA. EL OTRO SUSTRATO ES UNO PARA EL CUAL SALMONELLA ES NEGATIVA, COMO BE - D GALACTOSIDASA. DICHOS SUSTRATOS SE INCORPORAN EN UN MEDIO DE AGAR. LOS RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS PUEDEN OBSERVARSE FACILMENTE, SIENDO UNO DE LOS SUSTRATOS ESCULETINA, PREFERIBLEMENTE UN COMPUESTO DE CICLOHEXENOESCULETINA, EN PRESENCIA DE IONES FERRICOS, QUE PRODUCE UN COLOR NEGRO. EL OTRO SUSTRATO ES UN COMPUESTO INDOXILO, POR EJEMPLO UN COMPUESTO 5 - BROMO - 4 - CLORO - 3 - INDOLILO, QUE PRODUCE UN PRODUCTO DE REACCION ENZIMATICA COLOREADO DE VERDE.
Description
Identificación de salmonela.
La presente invención se refiere a procedimientos
para identificar la presencia de la especie Salmonella en
una muestra, así como medios de cultivo adecuados para dichos
procedimientos de identificación.
Los miembros del género Salmonella
constituyen las más importantes causas de envenenamiento de
alimentos en el Reino Unido. Actualmente, el único medio efectivo
de diagnosis implica el aislamiento de cultivo del organismo
causante a partir de las heces. Sin embargo, éste no es un medio
sencillo sino especializado y se necesitan reactivos para aislar
números relativamente pequeños de Salmonella desde una
cantidad relativa de microflora intestinal. Se han desarrollado
medios selectivos para este propósito que se basa en la
visualización de características bioquímicas simples, tales como
producción de sulfuro de hidrógeno o no fermentación de
lactosa.
Una revisión útil de cinco medios de cultivo en
placas para aislamiento de la especie Salmonella y una
comparación con respecto al agar entérico de Hektoen, un medio
estándar, se describe por Dusch et al en J. Clin. Microbial
(1995) 33(4), 802 a 804. Todos los medios de cultivo,
menos uno, son sólidos (concentración de agar estándar) mientras que
uno es un medio de concentración de agar reducida semisólido. Para
los medios sólidos, los compuestos que se producen en la presencia
de crecimiento microbiano son seleccionados para ser visibles a
simple vista. Para que los compuestos visualizados estén asociados
con colonias microbianas, dichos compuestos deben ser no
difusibles en el medio de cultivo. Estos medios suelen probarse
para dos características bioquímicas diferentes de las colonias
bacterianas y los resultados son tales que los resultados
positivos y negativos de cada uno de los dos ensayos pueden
observarse con respecto a los resultados positivos o negativos del
otro ensayo. Algunos de los ensayos bioquímicos observan la
actividad de enzimas específicas mediante el uso de substratos
cromogénicos que son decolorados o no fluorescentes, pero que
generan productos de reacción enzimática, que son coloreados o
fluorescentes y pueden, por lo tanto, ser observados en la
presencia de los substratos. A veces, el producto de reacción
enzimática puede reaccionar con otro componente del medio de
cultivo para generar el producto visible, por ejemplo iones
metálicos o indicadores de pH, donde el producto de la reacción es
un ácido o base.
Es conocido incluir en los substratos del medio
de cultivo dos enzimas diferentes que tengan distintos productos
de reacción enzimática, cada uno de los cuales puede observarse en
la presencia del otro (y de cada uno de los propios
substratos).
Un substrato de enzimas que se suele utilizar en
la identificación de la Salmonella es un substrato para
\beta-galactosidasa. La Salmonella suele
ser negativa para esta actividad enzimática, pero los demás
miembros de las Enterobacteriaceae son positivos. Un
substrato de \beta-galactosidasa, cuyo producto
de reacción enzimática no es difusible es el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido (XGal). Otros compuestos de indoxilo y de indoxilo halogenado son útiles como substratos y tienen productos de reacción que son visibles y no difusibles en medios de cultivos de agar.
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido (XGal). Otros compuestos de indoxilo y de indoxilo halogenado son útiles como substratos y tienen productos de reacción que son visibles y no difusibles en medios de cultivos de agar.
X-Gal se utiliza como un
substrato en el medio Rambach, descrito inter alia en el
documento US-A-5194374. Se utiliza
en combinación con un alcanodiol, que es metabolizado por
Salmonella para formar un producto de reacción ácida, que se
visualiza mediante la incorporación de un indicador del pH tal
como rojo neutro.
En el documento
EP-A-0516817, un medio de cultivo
para detectar Salmonella comprende un substrato de
\beta-galactosidasa cromogénico y, además, glucuronato y un indicador del pH. Este medio mixto se alega que es más selectivo que el medio de Rambach, puesto que casi todas las especies de Salmonella objeto del ensayo, pero pocas otras especies bacterianas fermentan con el ácido glucurónico dando lugar a un descenso del valor del pH.
\beta-galactosidasa cromogénico y, además, glucuronato y un indicador del pH. Este medio mixto se alega que es más selectivo que el medio de Rambach, puesto que casi todas las especies de Salmonella objeto del ensayo, pero pocas otras especies bacterianas fermentan con el ácido glucurónico dando lugar a un descenso del valor del pH.
En el documento
WO-A-94/01952, un compuesto de
5-bromo-cloro-3-indolilo,
que es un substrato para una enzima de esterasa, se utiliza para
identificar Salmonella, que son positivas para dichas
enzimas. El substrato es un éster de un ácido graso
C_{7-10}. Se recomienda que el medio puede
complementarse para eliminar las bacterias no-Salmonella, tal
como utilizando propiedades relacionadas con la segmentación o
metabolismo de \beta-galactósidos y
\beta-glucósidos (para ambos substratos la
Salmonella es negativa).
El medio de Rambach y la combinación de
X-gal y ácido glucurónico se encontraron por Dusch
et al como teniendo sensibilidades no óptimas. Otro medio
constituido por xilosa, lisina y Tergitol 4 tiene muy buena
sensibilidad y especificidad. El medio de cultivo incluye el
Tergitol 4 surfactante para inhibir a Proteus y determinando
la formación de sulfuro de hidrógeno a partir del tiosulfato
sódico en el medio que se visualiza mediante la incorporación de
iones férricos.
Es conocido que la especie Salmonella
produce \alpha-galactosidasa, pero es probable
que la enzima sería considerada un marcador eficiente para la
Salmonella, puesto que se produce por muchos géneros
afines, tales como Escherichia, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter y Shigella.
En Acta Microbiol Hung. (1988) 35(4),
389-395, Ketyi, I. Examina la actividad de la
\alpha-galactosidasa de varias especies de
enterobacterias incluyendo Salmonella, Shigella y E.
coli. Indicó que la actividad enzimática es una característica
general de las Enterobacteriaceae. Utilizó melibiosa como un
indicador de cepas positivas con
\alpha-galactosidasa. La melibiosa no es un
compuesto cromogénico.
En el documento
WO-A-9630543, se utiliza un
substrato de \beta-galactosidasa cromogénico en
combinación con una mezcla de azúcares con la inclusión de mannitol,
con xilosa y melibiosa para identificar la Salmonella. Los
azúcares son disociados para formar ácidos y el medio de
crecimiento contiene un indicador del pH. Sin embargo, los ácidos
que cambian el pH son productos de una serie de reacciones
enzimáticas sobre el producto de metabolismo del azúcar.
James et al en App. Env. Microbiol.
(1996), 62(10) 3868-170 y en J. App.
Microbiol. (1996), 82, 532-536, describen un nuevo
substrato de \beta-galactosidasa para uso en
lugar de X-Gal. El substrato es un derivado de
ciclohexenoesculerina, del que la aglicona derivada mediante
hidrólisis por \beta-galactosidasa forma un
complejo de color
negro-pardo con iones férricos en el medio. El nuevo substrato, CHE-Gal, proporcionó una buena correlación con
X-Gal, es decir, una alta especificidad y alta sensibilidad para detectar la actividad de \beta-galactosidasa.
negro-pardo con iones férricos en el medio. El nuevo substrato, CHE-Gal, proporcionó una buena correlación con
X-Gal, es decir, una alta especificidad y alta sensibilidad para detectar la actividad de \beta-galactosidasa.
Estos substratos de ciclohexenoesculetina y otros
derivados de esculetina se describen con más detalle y reivindican
en el documento WO-A-9741138 (no
publicado en la fecha de prioridad de la presente invención).
Un aspecto de la presente invención está basado
en la necesidad de medios de cultivos que sean muy sensibles a la
Salmonella aunque sigan siendo muy específicos, reduciendo
así al mínimo los ensayos confirmatorios posteriores. Estos tipos
de ensayos suelen necesitar realizarse con los medios
inadecuadamente específicos de la técnica anterior. Un segundo
aspecto de la invención está basado en la provisión de un medio que
esté constituido por dos substratos cromogénicos, que proporciona
resultados fácilmente observables. Una determinación visual puede
realizarse fácilmente con respecto a la presencia y ausencia de
productos de reacción enzimática de cada substrato, haciendo caso
omiso de la presencia o ausencia del producto de reacción
enzimática del otro substrato.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se proporciona un nuevo procedimiento en el que se llevan a cabo
las etapas siguientes:
- 1.
- una muestra sospechosa de contener bacterias Salmonella es cultivada en presencia de un nutriente,
- 2.
- el cultivo bacteriano se pone en contacto con cada uno de dos substratos de enzimas,
- 3.
- la presencia de los productos de reacción enzimática de cada uno de los substratos es objeto de acceso después de la etapa 2 para determinar si ha tenido lugar, o no, el crecimiento de la especie Salmonella.
en el que el primer substrato es un substrato
para una enzima para la cual la Salmonella es negativa,
estando caracterizado el procedimiento porque el segundo substrato
es un substrato para \alpha-galactosidasa y
porque ambos substratos son cromogénicos.
Los presentes inventores creen que es la primera
vez que se ha utilizado la \alpha-galactosidasa
como marcador para la Salmonella utilizando un substrato
cromogénico específico de la
\alpha-galactosidasa, es decir, un substrato para
el que el producto enzimático de la reacción, en la presencia de
\alpha-galactosidasa, es cromogénico sin estar
sujeto a nuevas reacciones enzimáticas. Por lo tanto, los
inventores han reconocido la utilidad de combinar
\beta-galactosidasa y
\alpha-galactosidasa como marcadores para detectar
la especie Salmonella. Este método es de utilidad para
realizar los ensayos usuales para identificar la Salmonella.
No es necesario para ello que exista ninguna expectativa específica
de la presencia de Salmonella en una muestra química objeto
de ensayo en la presente invención. Por lo tanto, la invención es
adecuada para determinar la exclusión de Salmonella (que
proporcione un resultado negativo) así como para ensayos
positivos.
La enzima para disociar dicho primer substrato,
cuya actividad de Salmonella sea negativa, se selecciona de
modo que un resultado positivo (segmentación) puede excluir un gran
número de Enterobacteriaceae. Las Salmonellaes son
negativas para la \beta-glucosidasa y por lo
tanto, podría utilizarse un substrato para
\beta-glucosidasa. Muchas otras enterobacterias
son también negativas para la \beta-glucosidasa.
Los mejores resultados se consiguen donde substratos para dicha
enzima se utilizan en combinación con otro substrato de enzima.
Dichos otros substratos serían seleccionados para ayudar a
distinguir la Salmonella de cualquier otra especie negativa
con la \beta-glucosidasa. Es muy conveniente que
el primer substrato se seleccione para ser disociable por medio de
la \beta-glucosidasa. Por lo tanto, el substrato
debería ser preferentemente un derivado de
\beta-D-galactopiranosido.
Aunque la invención puede utilizarse en un panel
de ensayos bioquímicos, cada uno de los cuales se realiza en un
recipiente individual, sobre una colonia bacteriana única, es
preferido que el procedimiento se utilice para muestras que
contengan una mezcla de especies bacterianas que sean cultivadas
juntas en un cuerpo de medio de cultivo en un recipiente único.
Como medio de cultivo es preferible un medio sólido (gelificado),
siendo conveniente que esté basado en agar. Pueden utilizarse
otros materiales de soporte convencionales para cultivos
bacterianos.
La muestra, como se mencionó anteriormente,
contiene preferentemente una mezcla de especies bacterianas. Puede
ser una muestra directa, inoculada utilizando una técnica adecuada
en el medio de cultivo. Por lo tanto, puede ser una mezcla de
alimento, agua o fluido corporal de un paciente, normalmente
sangre, orina o, más preferentemente, heces. Como alternativa, una
muestra directa puede, antes de realizar el procedimiento,
enriquecerse inoculando la muestra directa en un caldo de
enriquecimiento y cultivando el caldo durante un período de
tiempo, por ejemplo 24 horas, antes de inocular una parte del
cultivo bacteriano en el medio de cultivo para el procedimiento de
la invención. El medio de enriquecimiento se selecciona de modo
que favorezca el crecimiento de la especie Salmonella sobre
cualquier otra enterobacteria común tal como E. coli y
Proteus. Medios de enriquecimiento adecuados son, por
ejemplo, caldos de tetrationato o de selenito.
El medio en el que se realiza la primera etapa de
cultivo de la invención incluye preferentemente componentes que
favorecen el crecimiento de Salmonella. Por lo tanto, el
medio puede contener inhibidores conocidos de otro crecimiento
enterobacteriano, tales como sales biliares de color verde
brillante o sal de desoxicolato sódico.
Cuando la actividad enzimática para la que la
especie Salmonella es negativa es la
\beta-galactosidasa, la primera etapa del
procedimiento de la presente invención se realiza, de manera
preferible, en la presencia de un promotor de
\beta-galactosidasa de tipo conocido, por ejemplo
la lactosa o, más preferentemente,
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido.
En el procedimiento, los substratos enzimáticos
son cada uno cromogénico. En esta especificación, el término
cromogénico abarca el término fluorogénico. Los productos de la
reacción enzimática, o cada substrato, son, en una realización
preferible, directamente visibles, por ejemplo como compuestos
coloreados, de manera opcional en la presencia de otros
componentes tales como iones metálicos, y más preferentemente a
simple vista a la luz visible. Como alternativa, los productos de
la reacción pueden ser detectables por métodos
espectrofotométricos, observando la radiación absorbida de cualquier
longitud de onda predeterminada, o por medios fluorométricos
observando la fluorescencia.
Como alternativa, los productos directos de la
reacción enzimática pueden ser visibles después de otra reacción
química no enzimática.
Es preferible que el producto directo de la
segmentación enzimática sea detectable sin necesidad de otra
reacción química, puesto que dichas reacciones adicionales pueden
ser no específicas y causar falsas lecturas. La invención no
incluye el uso de indicadores del pH para identificar la presencia
del producto de la segmentación.
Cuando ambos substratos están en una mezcla
física en el mismo cuerpo del medio de cultivo, los productos de
la reacción enzimática de los dos substratos deben ser compuestos
diferentes, por lo menos uno de los cuales debe ser detectable en la
presencia del otro y en la presencia de ambos substratos. El otro
producto de la reacción podría enmascararse por el primero o ser
visible en su presencia. Por lo tanto, cualquier combinación de
reacción positiva y negativa puede observarse en el medio de
reacción.
Aunque la etapa de puesta en contacto de los
substratos con las bacterias cultivadas puede tener lugar después
de que se haya realizado el cultivo durante un período de tiempo y
en una etapa en la que no tenga lugar ningún crecimiento ni
metabolismo bacteriano, es preferible que el cultivo tenga lugar
en la presencia de los substratos de enzimas. Por lo tanto, los
substratos se incorporan al medio de cultivo al principio de la
fase 1 del procedimiento de cultivo. Los substratos deben, por
consiguiente, ser no tóxicos para las bacterias o por lo menos para
la Salmonella, permitiendo que tenga lugar el crecimiento
de, en particular, la Salmonella.
Los presentes inventores han descubierto que una
combinación de especial utilidad de substratos enzimáticos está
constituida por un substrato que genera un producto de reacción
enzimática que es un compuesto de indoxilo, incluyendo un compuesto
de halógeno sustituido y un segundo substrato que es una
esculetina, en particular un compuesto de
3,4-ciclohexenoesculetina. Donde se utiliza el
último substrato, durante o después de la puesta en contacto de
las bacterias cultivadas con el substrato, los iones férricos deben
entrar en contacto con el medio. Esto da lugar a la generación de
un color negro pardusco con el producto de la reacción enzimática
de dicho substrato.
En una realización preferible, uno de los
substratos de enzimas es un substrato para una glicosidasa, por
ejemplo, \beta-galactosidasa,
\alpha-galactosidasa o
\beta-glucosidasa. En otra realización
preferible, uno de los substratos es un substrato para una enzima de
glicosidasa diferente, aunque puede, como alternativa, ser un
substrato de esterasa. Es preferible que ambos substratos sean
para diferentes enzimas de glicosidasa. Más preferentemente, un
substrato es para
\alpha-galactosidasa y el otro es un substrato para \beta-galactosidasa.
\alpha-galactosidasa y el otro es un substrato para \beta-galactosidasa.
El substrato de esculetina es sustituido en el
radical 6- o, preferentemente, 7-hidroxilo por un
glicósido. Los compuestos de
3,4-ciclohexenoesculetina sustituidos, que producen
complejos no difusibles con iones metálicos, por ejemplo, iones
férricos, podrá también utilizarse en este caso. Por lo tanto, el
anillo de ciclohexeno puede sustituirse por uno o más sustituyentes
así como el sistema de anillo de coumarina.
El compuesto de esculetina presenta, en una forma
adecuada, la fórmula general
en la
que
cada uno de los radicales R^{1} y R^{2}
representan independientemente un átomo de hidrógeno o un átomo de
halógeno u otro grupo que no interfiera con la posterior quelación
del hierro;
cada uno de los radicales R^{3} y R^{4}
representa independientemente un átomo de hidrógeno o un
(C_{1}-C_{8}) alquilo o (C_{6} o C_{10})
arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o un grupo con
radical carboxilo, opcionalmente modificado, de fórmula
general
-CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un número desde 0 a 3 y X representa un grupo hidroxilo u otro grupo hidrofílico,
-CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un número desde 0 a 3 y X representa un grupo hidroxilo u otro grupo hidrofílico,
y, R^{3} puede representar, como alternativa,
un grupo acilo de fórmula general -COR, en donde R representa un
grupo (C_{1}-C_{8}) alquilo, (C_{6} o
C_{10}) arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o
(C_{5}-C_{8}) cicloalquilo,
a condición de que los radicales R^{3} y
R^{4} contengan, entre ellos, por lo menos tres átomos de
carbono;
o R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de
carbono a los que están unidos, formen un anillo de
(C_{5}-C_{8}) cicloalqueno y
uno de los radicales Y y Z representa el grupo
enzimáticamente disociable y el otro de Y y Z representa un átomo
de hidrógeno;
o su sal o hidrato adecuado del mismo.
En lo sucesivo, en esta memoria descriptiva, el
término "compuesto" incluye "sal" o "hidrato", a no
ser que el contexto lo requiera de otro modo.
Tal como aquí se utiliza el término
"halógeno" o su abreviatura "halo" significa flúor,
cloro, bromo y yodo.
La expresión "átomo o grupo que no interfiera
con la quelación del hierro" se refiere al hecho de que uno de
los principales medios de detección de agliconas de fórmula general
I es mediante quelación por medio de grupos hidroxilos en las
posiciones 6 y 7 del sistema de anillo de coumarina. Los grupos
que no interfieren con esta quelación pueden ser sustituidos con
R^{1} y/o R^{2}. Ejemplos incluyen hidrógeno, hidroxilo,
halógeno o (C_{1}-C_{6}) alquilo. El átomo de
halógeno puede ser un átomo de flúor o un átomo de cloro y el grupo
alquilo inferior puede ser metilo, etilo, propilo, butilo o
benzilo.
Tal como aquí se utiliza, el término
"(C_{1}-C_{8}) alquilo" se refiere a la
cadena recta o cadena bifurcada de grupos de hidrocarburos que
tienen de uno a ocho átomos de carbono. Ejemplos ilustrativos de
dichos grupos alquilo son metilo, etilo, propilo, isopropilo,
butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo,
neopentilo, hexilo, heptilo y octilo. Puede ser preferible de uno a
cuatro átomos de carbono.
Tal como aquí se utiliza el término
"(C_{1}-C_{10}) alquilo" se refiere a una
cadena recta o cadena bifurcada de grupos de hidrocarburo que
tienen de uno a diez átomos de carbono. Ejemplos ilustrativos de
dichos grupos alquilo son metilo, etilo, propilo, isopropilo,
butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo,
neopentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo y decilo. Puede ser
preferible de uno a seis átomos de carbono.
El término "(C_{6} o C_{10}) arilo"
incluye fenilo y naftilo.
Tal como aquí se utiliza, el término "anillo de
(C_{5}-C_{8}) cicloalqueno" se refiere a un
anillo alicíclico que tiene de 5 a 8 átomos y además, uno o más
enlaces dobles. Ejemplos ilustrativos de dichos grupos
cicloalquenilo son ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y
ciclooctenilo.
En compuestos de esta invención, la presencia de
un átomo de carbono asimétrico da lugar a enantiómeros. La
presencia de varios átomos de carbono asimétricos da lugar a
diastereoisómeros, cada uno de los cuales consiste en dos
enantiómeros, con la esterioquímica de radial R o S apropiada en
cada centro quiral. Queda entendido que la invención incluye todos
dichos diastereoisómeros, enantiómeros ópticamente activos y sus
mezclas.
\newpage
El término "sal adecuada" se refiere a una
sal preparada poniendo en contacto un compuesto de fórmula I con
un ácido o base, cuyo ion de contrapartida no interfiera con el uso
previsto del compuesto. Ejemplos incluyen la sal sódica o sal
magnésica de un derivado de fosfato o la sal formada a partir de
una amina primaria, secundaria o terciaria, donde el compuesto o
fórmula general I es un ácido carboxílico. Un ejemplo de una sal de
amina primaria puede ser la sal ciclohexilamónica, una sal de
amina secundaria adecuada puede ser la sal de piperidina y una sal
de amina terciaria puede ser la sal de trietilamina.
Los compuestos preferidos de la fórmula general I
incluyen aquéllos en los que, de manera independiente, o en
cualquier combinación compatible:
R^{1} es cloro o preferentemente hidrógeno;
R^{2} es cloro o preferentemente hidrógeno;
R^{3} es (C_{1}-C_{4})
alquilo, particularmente butilo o benzilo;
R^{4} es (C_{1}-C_{4})
alquilo o -CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un
número desde 0 a 3 y X representa un grupo hidroxilo o uno de los
siguientes grupos hidrofílicos, a saber:
-NHCH_{2}CONHCH_{2}CO_{2}H
-NHCH_{2}CONHCH_{2}CONHCH_{2}CO_{2}H
-NHCHCH_{2}CONH_{2}
-NH
\delm{C}{\delm{\para}{CO _{2} H}}HCH_{2}CONH_{2}
-NHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H
-N(CH_{2}CO_{2}H)_{2},
o
R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de
carbono a los que están unidos, forman un anillo de
(C_{5}-C_{8}) cicloalqueno, preferentemente un
anillo de ciclopentenilo o ciclohexenilo;
donde R^{3} es
-CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un número de
0 a 3 y luego el grupo X es como se definió anteriormente,
el grupo enzimáticamente segmentable,
representado por Y o Z, es un \alpha- o, preferentemente
\beta-residuo de azúcar enlazado tal como
\beta-D-glucosa,
\beta-D-galactosa,
\beta-D-xilosa,
\beta-D-ácido glicurónico o
N-acetil-\beta-D-glucosamina.
Los residuos de azúcar derivados de la galactosa, en particular
los \beta-D-galactopianósidos son
los compuestos más preferidos.
Los compuestos en los que R^{3} y R^{4},
junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un
anillo de ciclopenteno o un anillo de ciclohexeno son esencialmente
preferidos.
Un compuesto preferido de fórmula general (I)
es:
3,4-ciclohexenoesculetina-\beta-D-galactósido,
El producto de reacción enzimática de un
substrato de 3,4-ciclohexenoesculetina produce un
complejo de color negro pardusco en la presencia del ion férrico. El
producto de reacción enzimática de un compuesto de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo produce un color verde o azul en a presencia de oxígeno. Otros derivados de indoxilo están disponibles, que tienen distintos sustituyentes de modo que generen un producto de reacción de color diferente, por ejemplo que sea de color magenta, rosa, azul, rojo salmón y cualquiera de ellos puede utilizarse en lugar del compuesto de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. Una colonia bacteriana que sea positiva para la enzima que disocia el substrato de esculetina genera un color negro en la presencia de iones férricos. Las colonias que son positivas para la enzima que disocia el substrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo produce un color verde. Las colonias que sean positivas para ambas enzimas pueden distinguirse de las colonias que son positivas para la enzima de la que el compuesto de indolilo es un substrato, pero que son negativas para la otra enzima o negativas para ambas. El producto de reacción del substrato de esculetina enmascara el producto de reacción del substrato de indoxilo, pero de modo que las colonias que sean positivas para ambas enzimas no puedan distinguirse necesariamente de las que son positivas solamente para la enzima de la que el compuesto de esculetina es un substrato.
5-bromo-4-cloro-3-indolilo produce un color verde o azul en a presencia de oxígeno. Otros derivados de indoxilo están disponibles, que tienen distintos sustituyentes de modo que generen un producto de reacción de color diferente, por ejemplo que sea de color magenta, rosa, azul, rojo salmón y cualquiera de ellos puede utilizarse en lugar del compuesto de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. Una colonia bacteriana que sea positiva para la enzima que disocia el substrato de esculetina genera un color negro en la presencia de iones férricos. Las colonias que son positivas para la enzima que disocia el substrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo produce un color verde. Las colonias que sean positivas para ambas enzimas pueden distinguirse de las colonias que son positivas para la enzima de la que el compuesto de indolilo es un substrato, pero que son negativas para la otra enzima o negativas para ambas. El producto de reacción del substrato de esculetina enmascara el producto de reacción del substrato de indoxilo, pero de modo que las colonias que sean positivas para ambas enzimas no puedan distinguirse necesariamente de las que son positivas solamente para la enzima de la que el compuesto de esculetina es un substrato.
El substrato de esculetina suele estar presente
en una concentración aproximada de 200 a 500 mg/l en el medio de
agar, más preferentemente cerca de 300 mg/l. El substrato de
indoxilo está presente en cantidades de hasta 300 mg/l, aunque
suele ser innecesario utilizar concentraciones más altas que 100
mg/l. La cantidad suele ser por lo menos de 35 mg/l, por ejemplo
aproximadamente 70 mg/l. Esta concentración de iones férricos suele
ser de aproximadamente 400 a 1000 mg/l (basada en citrato férrico
amónico) por ejemplo unos 500 mg/l.
Según otro aspecto de la invención se proporciona
una nueva composición para uso en el cultivo de bacterias que está
constituida, en mezcla, por un primer substrato de enzima
cromogénico para \beta-galactosidasa y un segundo
substrato de enzima cromogénico, siendo seleccionados los
substratos de modo que los productos de reacción enzimática de las
dos enzimas sean compuestos diferentes y se caracterizan porque el
segundo substrato es un substrato para
\alpha-galactosidasa.
\alpha-galactosidasa.
La nueva composición de este aspecto de la
invención es adecuada para uso en el procedimiento del primer
aspecto de la invención. En una realización preferible, la
realización contiene otros componentes adecuados para realizar la
etapa de cultivo de las bacterias y por lo tanto, contiene uno o
más nutrientes para el crecimiento bacteriano y preferentemente una
sustancia de soporte, por ejemplo, una sustancia gelificante tal
como agar. En una realización preferible, la composición está en
una forma hidratable en seco, donde puede hidratarse para formar
un medio de cultivo dispuesto para su uso inmediato. El medio
contiene, en una realización preferible, los otros componentes
útiles en el medio de cultivo según se describió anteriormente en
relación con el procedimiento.
La composición debe contener sal férrica, que
genera el compuesto negro en la presencia del producto de reacción
enzimática del compuesto de esculetina. El citrato amónico férrico
se utiliza convenientemente aunque podría emplearse gluconato
férrico u otras sales como fuentes alternativas de iones
férricos.
Las composiciones pueden estar basadas en medios
basales selectivos, que inhiben la flora microbiana normal y
permiten el crecimiento selectivo de Salmonella. Medios
conocidos de este tipo son agar de sulfito de bismuto, agar verde
brillante, agar entérico Hektoen y agar de
Salmonella/Shigella.
Según otro aspecto de la invención se proporciona
un nuevo uso de un substrato de enzima
\alpha-D-galactósido cromogénico
para detectar la presencia de la especie Salmonella en una muestra
de especies mezcladas. En una realización preferible, la detección
se realiza con el cultivo de la muestra mixta en un medio de agar.
Substratos de \alpha-galactosidasa cromogénicos
están comercialmente disponibles. El substrato de enzima es
preferentemente
5-bromo-4-cloro-3-indolilo-\alpha-D-galactopiranosido.
5-bromo-4-cloro-3-indolilo-\alpha-D-galactopiranosido.
La invención se describe de forma más completa en
el ejemplo siguiente:
Se constituye el siguiente medio de cultivo base
que estimula el crecimiento de Salmonella a expensas de
otras enterobacterias mediante la incorporación de desoxicolato.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Base de DCA Hynes (por litro) \+\cr Extracto de vacuno \+
5,0 g\cr Peptona equilibrada nº 1 \+ 5,0 g\cr Citrato sódico \+
8,5 g\cr Desoxicolato sódico \+ 5,0 g\cr Agar nº 2 \+ 12,0
g\cr}
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Mezcla cromogénica (por litro) \+\cr
5-bromo-4-cloro-3-indolilo- \alpha -D-galactopiranosido
\+ 70 mg\cr
3,4-ciclohexenoesculetina- \beta -D-galactopiranosido
\+ 300 mg\cr Citrato amónico férrico \+ 500 mg\cr
Isopropil- \beta -D-tiogalactopiranosido
\+ 30
mg\cr}
Todos los ingredientes anteriores son disueltos
en 1 litro de agua destilada y se introducen en autoclave a una
temperatura de 116ºC durante 10 minutos. A continuación, el agar se
vierte en platos Petri de plástico estéril y se deja
sedimentar.
Los miembros de las Enterobacteriaceaes,
de identidad conocida, se obtuvieron en un cultivo puro y se
inocularon en el nuevo medio selectivo. Todas las placas fueron
incubadas a una temperatura de 37ºC durante 18 horas y examinadas
para la producción de color. 1.020 de estas cepas fueron conocidas
como de Salmonella y fueron consecutivamente aisladas de las
muestras de heces en el Hospital de Freeman (120 cepas) y en el
Laboratorio de Sanidad Pública Regional de Newcastle (900 cepas).
De las 1.020 cepas de Salmonella, 1.016 (99,6%) produjeron
una colonia verde característica de Salmonella. De las
restantes cuatro cepas hubieron tres cepas que no produjeron
\alpha-galactosidasa y permanecieron incoloras.
Éstas fueron dos cepas de Salmonella
saint-paul y una cepa de Salmonella
branderup. La cepa restante era una Salmonella arizonae
productora de \beta-galactosidasa que, en
consecuencia, produjo una colonia de color negro.
De las 300 cepas no de Salmonella,
solamente una cepa produjo una colonia de color verde típica de
Salmonella. Ésta era una cepa muy atípica de Escherichia
coli que no produjo \beta-galactosidasa.
Otras 39 cepas de E. coli produjeron una colonia de color
negro típica.
A partir de los resultados anteriores, puede
observarse que el medio de cultivo, incluyendo los substratos
para
\alpha-galactósido y \beta-galactósido es muy sensible (99,6%) pero es todavía muy específico (99,9%) para la detección de Salmonella. Asimismo, los resultados son fáciles de leer.
\alpha-galactósido y \beta-galactósido es muy sensible (99,6%) pero es todavía muy específico (99,9%) para la detección de Salmonella. Asimismo, los resultados son fáciles de leer.
Claims (31)
1. Procedimiento en el que se llevan a cabo las
etapas siguientes:
- a)
- una muestra sospechosa de contener bacteria Salmonella es cultivada en presencia de un nutriente,
- b)
- el cultivo bacteriano se pone en contacto con cada uno de dos substratos de enzimas,
- c)
- la presencia de los productos de reacción enzimática, de cada uno de los substratos, se evalúa después de la etapa 2 para determinar si ha tenido lugar, o no, el crecimiento de la especie Salmonella,
en el que el primer substrato es un substrato
para una enzima para la cual la Salmonella es negativa,
estando dicho procedimiento caracterizado porque el segundo
substrato es un substrato para
\alpha-galactosidasa y porque ambos substratos son
cromogénicos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que uno de los substratos es un compuesto de indoxilo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el compuesto de indoxilo es un compuesto de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que uno de los substratos de la
enzima es un compuesto de esculetina.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el compuesto de esculetina es un compuesto de
3,4-ciclohexenoesculetina.
3,4-ciclohexenoesculetina.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el compuesto de esculetina tiene la fórmula general I
cada uno de los radicales R^{1} y R^{2}
representa independientemente un átomo de hidrógeno o de halógeno
u otro grupo que no interfiera con la posterior quelación del
hierro; cada uno de los radicales R^{3} y R^{4} representa
independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo
(C_{1}-C_{8}) alquilo o (C_{6} o C_{10})
arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o un grupo de
carboxilo opcionalmente modificado de la fórmula general
-CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un número
de 0 a 3 y X representa un grupo hidroxilo u otros grupo
hidrofílico, y R^{3} puede representar alternativamente un grupo
acilo de la fórmula general -COR, en el que R representa un grupo
(C_{1}-C_{8}) alquilo, (C_{6} o C_{10})
arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o
(C_{5}-C_{8})
cicloalquilo,
a condición de que R^{3} y R^{4} contengan
entre ellos por lo menos tres átomos de carbono;
o R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de
carbono a los que están unidos, formen un anillo de
(C_{5}-C_{8}) cicloalqueno y
uno de Y y Z represente el grupo enzimáticamente
disociable y el otro de Y y Z represente un átomo de
hidrógeno;
o su sal o hidrato adecuado.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de carbono a los que
están unidos, forman un niallo de C_{5-8}
cicloalqueno.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que uno de los substratos de
enzimas es
5-bromo-4-cloro-3-indolilo-\alpha-D-galactopiranosido.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que uno de los substratos de
enzimas es
3,4-ciclohexenoesculetina-\beta-D-galactopiranosido.
\newpage
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra que se cultiva
contiene enterobacterias.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la muestra que se cultiva se deriva de un proceso de
enriquecimiento en el que una muestra directa es cultivada en un
caldo de enriquecimiento, por ejemplo, durante 24 horas.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la muestra que se cultiva en el procedimiento es una
muestra no enriquecida directa.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que la muestra directa es de
heces.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra se cultiva en
presencia de un inhibidor de enterobacterias que no sea
Salmonella, preferentemente seleccionado entre agar verde
brillante, sales biliares, sulfito de bismuto, medio Hektoen y
sales de desoxicolato.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra se cultiva en un
medio sólido.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el medio de cultivo en el que tiene lugar el cultivo
contiene los substratos de enzimas que se seleccionan de modo que
los productos de reacción enzimática de cada uno de ellos sea un
compuesto distinto y sea prácticamente no difusible en el medio de
cultivo.
17. Uso de un substrato de
\alpha-galactosidasa cromogénico en combinación
con un substrato cromogénico para el cual la Salmonella es
negativa, en un procedimiento en el que una muestra mixta
sospechosa de contener la especie Salmonella es cultivada y
en el que el producto de reacción enzimática de los substratos son
detectados por medios ópticos, de modo que un resultado positivo
del substrato de \alpha-galactosidasa solamente se
utiliza como un indicador de la presencia de crecimiento de
Salmonella.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que el
substrato es un compuesto de indoxilo.
19. Composición para su utilización en el cultivo
de bacteria que comprende, en condiciones de mezcla, un primer
substrato de enzima cromogénico para
\beta-galactosidasa y un segundo substrato de
enzima cromogénico, siendo los substratos seleccionados de modo
que los productos de reacción enzimática (los cromoforos) de las dos
enzimas sean compuestos distintos y está caracterizado
porque el segundo substrato es un substrato para
\alpha-galactosidasa.
20. Composición según la reivindicación 19, en la
que uno de los substratos es un compuesto de indoxilo.
21. Composición según la reivindicación 20, en la
que el compuesto de indoxilo es un compuesto de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
22. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en la que uno de los substratos es un
compuesto de esculetina.
23. Composición según la reivindicación 22, en la
que el compuesto de esculetina es un compuesto de
3,4-ciclohexenoesculetina.
3,4-ciclohexenoesculetina.
24. Composición según la reivindicación 22, en la
que el compuesto de esculetina tiene la fórmula general I
en la
que
cada uno de los radicales R^{1} y R^{2}
representan independientemente un átomo de hidrógeno o un átomo de
halógeno u otro grupo que no interfiera con la posterior quelación
del hierro;
cada uno de los radicales R^{3} y R^{4}
representa independientemente un átomo de hidrógeno o un
(C_{1}-C_{8}) alquilo o (C_{6} o C_{10})
arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o un grupo de
carboxilo, opcionalmente modificado, de fórmula general
-CH_{2}(CH_{2})_{n}COX, donde n es un número
desde 0 a 3 y X representa un grupo hidroxilo u otro grupo
hidrofílico, y, R^{3} puede representar, como alternativa, un
grupo acilo de fórmula general -COR, en donde R representa un grupo
(C_{1}-C_{8}) alquilo, (C_{6} o C_{10})
arilo (C_{1}-C_{8}) alquilo o
(C_{5}-C_{8}) cicloalquilo,
a condición de que los radicales R^{3} y
R^{4} contengan, entre ellos, por lo menos tres átomos de
carbono;
o R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de
carbono a los que están unidos, formen un anillo de
(C_{5}-C_{8}) cicloalqueno y
uno de los radicales Y y Z representa el grupo
enzimáticamente disociable y el otro de Y y Z representa un átomo
de hidrógeno;
o su sal o hidrato adecuado del mismo.
25. Composición según la reivindicación 24, en la
que R^{3} y R^{4}, junto con los átomos de carbono a los que
están unidos, forman un anillo de C_{5-8}
cicloalqueno.
26. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 25, que contiene uno o más nutrientes para
el crecimiento bacteriano y una sustancia de soporte.
27. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 26, que está en una forma hidratable en
seco.
28. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 27, que contiene un inhibidor de crecimiento
enterobacteriano distinto de la Salmonella.
29. Composición según la reivindicación 28, en la
que la composición es preferentemente seleccionada de entre agar
verde brillante, agar que contenga sales biliares, agar de sulfito
de bismuto, agar que contenga sales de desoxicolato, agar entérico
de Hektoen y agar de Salmonella/Shigella.
30. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 29, que contiene un promotor de
\beta-galactosidasa.
31. Composición según la reivindicación 30, en la
que el promotor se selecciona entre lactosa e
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido.
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido.
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