ES2298788T3

ES2298788T3 - Nuevos sustratos enzimaticos derivados de fenoxazinona y su utilizacion como indicador en la deteccion de microorganismos con actividad peptidasa.

Info

Publication number: ES2298788T3
Application number: ES04760775T
Authority: ES
Inventors: Arthur James; John Perry; Annette Rigby; Stephen Stanforth
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2003-05-13
Filing date: 2004-05-13
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2024-05-13
Also published as: BRPI0410269B1; EP1625117A1; ATE383350T1; DE602004011210T2; US7695930B2; WO2004101536A1; CN100372841C; BRPI0410269B8; CN1788005A; US20060121551A1; EP1625117B1; FR2854893B1; US20080286820A1; DE602004011210D1; FR2854893A1; US7420054B2; JP4515456B2; JP2007501018A; BRPI0410269A

Abstract

Sustrato enzimático cromogénico, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (I): (Ver fórmula) en la que - R1 y R2 forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno de fórmula: (Ver fórmula) o un anillo de coumarina opcionalmente sustituido de fórmula: (Ver fórmula) - o bien R1 y R2, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C6, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR¿, un grupo -C(O)NR¿R¿, un grupo -SO3H o un grupo sulfonamida, - R3 y R4 forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno opcionalmente sustituido de fórmula: (Ver fórmula) - o bien R3 y R4, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR¿, un grupo -C(O)NR¿R¿, un grupo -SO3H o un grupo sulfonamida, a condición de que: (i) al menos uno de entre R1/R2 y R3/R4 forme, con el anillo de fenilo al que está unido, un anillo de naftaleno o de coumarina opcionalmente sustituido tal como se ha definido anteriormente y (ii) cuando R1 y R2 forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina opcionalmente sustituido, R3 y R4 no formen, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno opcionalmente sustituido, - R5 y R6, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C (O)OR¿, un grupo -C(O)NR¿R¿, o un grupo alquilo de C1-C6, a condición de que R6 represente un átomo de halógeno cuando R1/R2 y R3/R4 formen cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, - R7 y R8, representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C6, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo carboxialquilo, un grupo carboxilo o un grupo ácido sulfónico, - o bien R7 y R8, junto con los dos átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo de C4-C6, - R9 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de bromo, un átomo de cloro, un grupo benzoilo, un grupo -CO2H o un grupo -SO3H, a condición de que cuando R9 es diferente a un átomo de hidrógeno, entonces R5 es un átomo de hidrógeno, - R¿ representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C6, - R¿ representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C6, - o bien R¿ y R¿, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un núcleo heterocíclico que contiene uno o varios heteroátomos, - A representa al menos un aminoácido y - X representa un agente de bloqueo o nada.

Description

Nuevos sustratos enzimáticos derivados de fenoxazinona y su utilización como indicador en la detección de microorganismos con actividad peptidasa.

La presente invención se refiere a nuevos sustratos enzimáticos cromógenos para la detección de actividad peptidasa. Estos sustratos pueden utilizarse en las aplicaciones que comprenden una etapa de hidrólisis enzimática que produce una señal físico-química, particularmente en microbiología, bioquímica, inmunología, biología molecular, histología, etc. En comparación con los sustratos existentes, la mayor parte fluorógenos, los sustratos cromogénicos de la invención pueden utilizarse particularmente en un medio gelificado para la detección de microorganismos, ya que producen una coloración que no se difunde en el medio de reacción y que por lo tanto se concentra a nivel de las colonias.

La invención también se refiere a medios de reacción que contienen dichos sustratos, a la utilización de los sustratos o de los medios para la detección de bacterias Gram negativas, Gram positivas y levaduras que expresan una actividad peptidasa y a procedimientos de utilización.

Se denomina generalmente aminopeptidasa a una enzima capaz de escindir mediante hidrólisis el grupo amida formado entre un acilo de un aminoácido y una amina primaria y se denomina peptidasa a una enzima capaz de escindir mediante hidrólisis el grupo amida formado entre el resto acilo de un péptido y una amina primaria. En la presente solicitud, el término "peptidasa" puede representar, dependiendo del caso, tanto una peptidasa como una aminopeptidasa, tal como se han definido anteriormente.

Los sustratos cromogénicos enzimáticos para la detección de la actividad peptidasa que no se difunden, se describen y ya se conocen en el estado de la técnica. De este modo, dichos sustratos son abarcados por las solicitudes de patente WO-A-98/04765 y WO-A-99/38995 depositadas por los Solicitantes. Sin embargo, estos sustratos presentan diferentes inconvenientes: su síntesis es difícil, la pureza es reducida y los rendimientos pobres. Además, para una utilización en medios de cultivo, es preciso definir una composición del medio muy exacta para observar una coloración. La patente US 6.235.493 describe un procedimiento de detección de una proteasa mediante la utilización de violeta de cresilo. Sin embargo, estos sustratos son sustratos fluorescentes y se utilizan para la detección de la actividad proteasa en células o tejidos de origen mamífero. Ninguno de los demás sustratos actualmente descritos puede utilizarse en medios sólidos para la detección de microorganismos en cultivos mixtos.

Las moléculas derivadas de fenoxazinona son conocidas por su capacidad para producir fluorescencia. Estas moléculas pueden utilizarse:

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- como indicadores ácido-básicos como se describe por ejemplo en el documento Stuzka, V. et al., 1963, Collection Czech. Chem. Commun., 28, 1399-1407 o bien,

- como marcadores fluorescentes por ejemplo para seguir las modificaciones de conformaciones de las proteínas, como se describe en el documento Nakanishi J. et al., 2001, Analytical Chemistry, 73(13), 2920-2928.

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Ningún derivado de la fenoxazinona se ha utilizado nunca como sustrato enzimático.

De acuerdo con la presente invención, se proponen nuevos sustratos cromogénicos enzimáticos para la detección de microorganismos que expresan una actividad peptidasa. La invención también se refiere a medios de reacción que contienen dichos sustratos, así como a la utilización de los sustratos o de los medios para la detección de actividades peptidasas y a los procedimientos de utilización.

En efecto, los Solicitantes han descubierto de forma sorprendente que era posible detectar microorganismos que expresaban una actividad peptidasa mediante la utilización de derivados cromogénicos de la fenoxazinona que producen una coloración que no se difunde en el medio de reacción, por lo tanto concentrada a nivel de las colonias, demostrándose la actividad peptidasa mediante una modificación de la coloración de las colonias en el medio de cultivo.

Después de la siembra de los medios de reacción que contienen los sustratos de la invención con los microorganismos a ensayar, se observan colonias de incoloras a blancas cuando éstas no son capaces de hidrolizar el sustrato. Por el contrario, se observan colonias coloreadas cuando éstas son capaces de hidrolizar el sustrato de la invención.

Los derivados de la fenoxazinona de la invención son al mismo tiempo cromogénicos y fluorógenos y tienen la ventaja de una buena sensibilidad de detección.

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De este modo, la presente invención se refiere a sustratos enzimáticos cromogénicos de fórmula (1):

1

en la que

- R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno de fórmula:

2

o un anillo de coumarina opcionalmente sustituido de fórmula:

3

- o bien R_{1} y R_{2}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', un grupo -SO_{3}H o un grupo sulfonamida.

- R_{3} y R_{4} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno opcionalmente sustituido de fórmula:

4

- o bien R_{3} y R_{4}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', un grupo -SO_{3}H o un grupo sulfonamida, a condición de que:

(i): al menos uno de entre R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forme, con el anillo de fenilo al que está unido, un anillo de naftaleno o de coumarina opcionalmente sustituido tal como se ha definido anteriormente y

(ii): cuando R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina opcionalmente sustituido, R_{3} y R_{4} no formen, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno opcionalmente sustituido,

- R_{5} y R_{6}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, a condición de que R_{6} represente un átomo de halógeno cuando R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} formen cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno.

- R_{7} y R_{8} representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo carboxialquilo, un grupo carboxilo o un grupo ácido sulfónico,

- o bien R_{7} y R_{8}, junto con los dos átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo de C_{4}-C_{6},

- R_{9} representa un átomo de hidrógeno, un átomo de bromo, un átomo de cloro, un grupo benzoilo, un grupo -CO_{2}H o un grupo -SO_{3}H, a condición de que cuando R_{9} es diferente a un átomo de hidrógeno, entonces R_{5} es un átomo de hidrógeno,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- R'' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- o bien R' u R'', junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un núcleo heterocíclico que contiene uno o varios heteroátomos,

- A representa al menos un aminoácido y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

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De acuerdo con la invención, se entiende particularmente por arilo, un núcleo aromático de C_{6}-C_{10}, particularmente fenilo, benzilo, 1-naftilo o 2-naftilo. Lo mismo ocurre para la parte arilo de los grupos aralquilo.

Los alquilos de acuerdo con la invención, en los grupos aralquilo y carboxialquilo, son también de C_{1}-C_{6}.

Se entiende por alquilo de C_{1}-C_{6} un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Como ejemplo pueden mencionarse, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, t-butilo, pentilo, isopentilo y hexilo.

Por átomo de halógeno se entiende cloro, bromo, yodo y flúor.

Por heteroátomo, se entiende un átomo diferente a un átomo de carbono, tal como O, N ó S.

Los núcleos heterocíclicos que pueden formar R' y R'' pueden ser de cualquier tamaño, pero preferiblemente contienen de 5 a 7 enlaces.

Los ejemplos de núcleo heterocíclico comprenden el núcleo morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidina e imidazolidina.

Los diferentes anillos de naftaleno y de coumarina formados por los sustituyentes R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} de acuerdo con la descripción de la invención, se representan incluyendo las líneas punteadas completadas con los sustituyentes correspondientes por cuestión de claridad y para permitir visualizar la posición de dichos anillos en los derivados de la fenoxazinona de fórmula (I) de la invención.

Los agentes de bloqueo de acuerdo con la invención, comprenden cualquier agente de bloqueo conocido por el especialista en la técnica que sea capaz de proteger a las aminas. Como ejemplo, puede mencionarse t-butoxicarbonilo (N-tBOC), 9-fluoreniloxicarbonilo, un agente de disolución tal como succinilo o bien un aminoácido no metabolizable, es decir, no natural, tal como el ácido pipecólico.

Los agentes de bloqueo no están presentes sistemáticamente en los compuestos de la invención. En este caso, es decir cuando los compuestos de la invención no poseen agentes de bloqueo (X es nada), los compuestos de la invención están en forma de sal tal como cloruro, bromuro o trifluoroacetato.

Los aminoácidos que se representan mediante A en la fórmula (I) son cualquier aminoácido conocido por el especialista en la técnica. De acuerdo con una realización de la invención, A representa un aminoácido o un péptido que tiene como máximo 10 aminoácidos en el que los aminoácidos son iguales o diferentes. Preferiblemente, por una cuestión de costes del sustrato, A representa un aminoácido o un péptido que tiene como máximo 4 aminoácidos en el que los aminoácidos son iguales o diferentes.

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De acuerdo con una realización, los compuestos de la invención tienen la fórmula (I):

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en la que

6

o un anillo de coumarina opcionalmente sustituido de fórmula:

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8

- R_{5} y R_{6}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'' o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, a condición de que

(i): R_{6} represente un átomo de hidrógeno cuando R_{1} y R_{2} formen, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno o de coumarina y

(ii): R_{6} represente un átomo de halógeno cuando R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} formen cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de benceno.

- R_{7} y R_{8}, representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo carboxialquilo, un grupo carboxilo o un grupo ácido sulfónico,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- R'' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- o bien R' y R'', junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un núcleo heterocíclico que contiene uno o varios heteroátomos,

- A representa al menos un aminoácido y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

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De acuerdo con otra realización, los compuestos de la invención se seleccionan entre compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, o bien R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina, o bien R_{3} y R_{4} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, siendo los otros sustituyentes tales como se han definido anteriormente, a condición de que cuando R_{1}/R_{2} forma un anillo de naftaleno o de coumarina con el anillo de fenilo al que están unidos, R_{3}/R_{4} no formen al mismo tiempo un anillo de naftaleno con el anillo de fenilo al que están unidos, y viceversa. De este modo, de acuerdo con esta realización, los sustratos enzimáticos son compuestos de la siguiente fórmula (I):

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en la que

10

o un anillo de coumarina opcionalmente sustituido de fórmula:

11

12

- o bien R_{3} y R_{4}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', un grupo -SO_{3}H o un grupo sulfonamida, a condición de que: uno y solamente uno entre R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forme, con el anillo de fenilo al que está unido, un anillo de naftaleno o de coumarina opcionalmente sustituido, como se ha definido anteriormente,

- R_{5} y R_{6}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'' o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- R_{7} y R_{8}, representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo carboxialquilo, un grupo carboxilo o un grupo ácido sulfónico.

- R_{9} representa un átomo de hidrógeno, un átomo de bromo, un átomo de cloro, un grupo benzoilo, un grupo -CO_{2}H o un grupo -SO_{3}H, a condición de que, cuando R_{9} es diferente a un átomo de hidrógeno, entonces R_{5} es un átomo de hidrógeno,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- R'' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- A representa al menos un aminoácido y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

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De acuerdo con una realización de la invención, A representa un aminoácido o un péptido que tiene como máximo 10 aminoácidos, en el que los aminoácidos son iguales o diferentes. Preferiblemente, A representa un aminoácido o un péptido que tiene como máximo 4 aminoácidos en el que los aminoácidos son iguales o diferentes.

De acuerdo con una realización particular, los compuestos de la invención son sustratos enzimáticos que tienen la siguiente fórmula (Ia):

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en la que R_{5}, R_{6} y A y X son tal como se han definido anteriormente.

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Los compuestos de fórmula (Ia) son compuestos de fórmula (I) en la que los radicales R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno y R_{3} y R_{4} son cada uno un átomo de hidrógeno.

Preferiblemente, en los compuestos de fórmula (Ia), R_{5} representa un átomo de hidrógeno, R_{6} representa un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno, tal como un átomo de cloro, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

De acuerdo con otra realización particular, los compuestos de la invención son sustratos enzimáticos de fórmula (Ib):

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en la que R_{5}, R_{7}, R_{8}, A y X son tal como se han definido anteriormente.

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Los compuestos de fórmula (Ib) son compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina y R_{3,} R_{4} y R_{6} son cada uno un átomo de hidrógeno.

Preferiblemente, en los compuestos de fórmula (Ib) de la invención, R_{5} es un átomo de hidrógeno, R_{7} y R_{8} representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo carboxialquilo o bien R_{7} y R_{8}, junto con los dos átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo de C_{4}-C_{6}, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina, y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

De acuerdo con otra realización particular más, los compuestos de la invención son sustratos enzimáticos de fórmula (Ic):

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en la que R_{5}, R_{6}, R_{9}, A y X son tal como se han definido anteriormente.

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Los compuestos de fórmula (Ic) son compuestos de fórmula (I) en la que los radicales R_{3} y R_{4} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, y R_{1} y R_{2} son cada uno un átomo de hidrógeno.

Preferiblemente, en los compuestos de fórmula (Ic), los grupos R_{5}, R_{6} y R_{9} representan cada uno un átomo de hidrógeno, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

De acuerdo con otra realización, los compuestos de la invención son sustratos enzimáticos de fórmula (Id):

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en la que R_{5}, R_{6}, A y X son tal como se han definido anteriormente.

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Los compuestos de fórmula (Id) son compuestos de fórmula (I) en la que los radicales R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forman cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno.

Los compuestos de la invención pueden preparase por varios procedimientos de fabricación en función del anillo que forman los radicales R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4}, ya formen R_{1}/R_{2}, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno o formen R_{1}/R_{2}, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina, o formen R_{3}/R_{4}, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno o formen R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4}, cada uno con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno.

De este modo, los compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, pueden preparase de acuerdo con el modo operatorio que se representa en el siguiente esquema 1:

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 1

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De acuerdo con el esquema 1 anterior, los compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno se preparan mediante la reacción de un compuesto 2-amino-5-nitrofenol apropiado (a) con la 1,4-naftoquinona halogenada apropiada (b), la cual se ha calentado previamente hasta el punto de ebullición y después se ha enfriado a 25ºC para formar la 9-nitro-benzo-[a]fenoxazinona correspondiente (c). A continuación este compuesto c se hace reaccionar con una mezcla de acetilacetonato de cobre II que previamente ha reaccionado con borohidruro de sodio para formar el compuesto (d). El compuesto (d) se hace reaccionar a continuación con uno o varios aminoácidos opcionalmente protegidos (6) en un baño enfriado a aproximadamente -12ºC, para dar el compuesto de fórmula (I). Debe observase en este caso que, por supuesto, cuando A es un único aminoácido, A' en el compuestos (6) corresponde a A del compuesto (I), pero comprendiendo un grupo hidroxilo suplementario. En otras palabras, cuando A es un único aminoácido, A' termina en -C(O)OH, mientras que A está unido a -NH mediante -C(O), que pierde el -OH. Cuando A es una cadena de al menos 2 aminoácidos, el último aminoácido de A' es tal como se ha descrito anteriormente, es decir que comprende, con respecto al último aminoácido de A, un grupo hidroxilo suplementario.

Los compuestos de fórmula (Ia) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno y R_{6} es un átomo de hidrógeno, pueden prepararse también de acuerdo con el procedimiento descrito en el esquema Ia a continuación.

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Esquema 1a

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De acuerdo con este esquema Ia los compuestos de fórmula (Ia) se preparan mediante la reacción de un compuesto 3-acetamidofenol apropiado (1) con un nitrito (2) tal como nitrito de sodio (X = Na), de potasio (X = K), etc., a una temperatura de -3ºC. El nitroso-acetamidofenol (3) obtenido de este modo, se hace reaccionar a continuación con 1,3-dihidroxinaftaleno (4) en un disolvente tal como butanol, calentándolo a una temperatura de aproximadamente 70ºC y después añadiéndole ácido sulfúrico concentrado y continuando el calentamiento hasta los 90ºC y después enfriándolo para formar 9-acetamido-benzo[a]fenoxazin-5-ona apropiada. A continuación, este último compuesto se hidroliza mediante calentamiento con ácido sulfúrico moderadamente concentrado para dar 9-amino-benzo[a]fenoxazin-5-ona (5). La última etapa es equivalente a la del esquema 1.

Los compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina, pueden preparase de acuerdo con el modo operatorio que se representa en el esquema 2 a continuación.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 2

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De acuerdo con el esquema 2 anterior, los compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina, pero también en la que, como se ha indicado en la definición general de los compuestos de fórmula (I), R_{6} es un átomo de hidrógeno, se preparan oxidando y clorando el derivado de p-fenilendiamina apropiado (7) en presencia del compuesto (8) para obtener N,N'-dicloro-p-benzoquinona diimina (9) de acuerdo con el procedimiento de Willstaetter y Mayer (1904, Chem. Ber., 37: 1498). A continuación este último compuesto se hace reaccionar en una solución alcohólica con 5,7-dihidroxicoumarina (10) para obtener la 7-amino-1,2-pirronil-fenoxazin-3-ona (11) apropiada. La última etapa es equivalente a la del esquema 1.

Los compuestos de fórmula (Ib), que son compuestos de fórmula (I) en la que R_{1} y R_{2} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de coumarina, pueden prepararse por supuesto mediante el procedimiento anterior.

Los compuestos de fórmula (I) en la que R_{3} y R_{4} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno pueden preparase de acuerdo con el modo operatorio que se representa en el siguiente esquema 3:

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 3

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De acuerdo con el esquema 3 anterior, los compuestos de fórmula (I) en la que R_{3} y R_{4} forman, con anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, pueden preparase mediante condensación del 2-naftol apropiado (12) con el 4-nitrosofenol apropiado (13) de acuerdo con el procedimiento de Fischer & Hepp (Berichte 36.2, 1807, 1903) para dar la naftohexazona apropiada (14). Este último compuesto (14) se hace reaccionar a continuación con clorhidrato de hidroxilamina (15) de acuerdo con el procedimiento de Kherman & Gottrau (Berichte 38, 2574, 1905) para obtener las formas hidroxiimina y aminocetona (compuestos 16 y 17, respectivamente). La última etapa es equivalente a la del esquema 1.

Los compuestos de fórmula (1c), que son compuestos de fórmula (I) en la que R_{3} y R_{4} forman, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, pueden prepararse por supuesto mediante el procedimiento anterior.

Finalmente, los compuestos de la invención de fórmula (I) en la que los radicales R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forman cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno (compuestos de fórmula (Id)), pueden preparase de acuerdo con el modo operatorio que se representa en el siguiente esquema 4:

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Esquema 4

21

De acuerdo con el esquema 4 anterior, los compuestos de fórmula (I) en la que los radicales R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forman cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno, pueden preparase mediante condensación del ácido 1-amino-2-naftol-4-sulfónico apropiado (18) con la 2-hidroxi-1,4-naftoquinona apropiada (19) para producir el ácido dinaftoxazonasulfónico apropiado (20). Este compuesto (20) se calienta a continuación en presencia de amonio para producir aminodinaftoxazona (21). La última etapa de este modo operatorio es equivalente a la del esquema 1.

En los modos operatorios anteriores, los reactivos de partida (compuestos (1), (2), (4), (6), (7), (8), (10), (12), (13), (15), (18) y (19)) están disponibles en el mercado, particularmente de Aldrich.

La invención también se refiere a un medio de reacción que utiliza al menos un sustrato cromogénico enzimático de fórmula (I) tal como se ha definido anteriormente, en solitario o en combinación con al menos otro sustrato enzimático específico de una actividad enzimática diferente de la detectada por el sustrato de acuerdo con la invención.

En efecto, cuando los microorganismos que expresan una actividad peptidasa se siembran en o sobre un medio de reacción que contiene los compuestos de la invención, se produce una coloración que no se difunde en o sobre el medio de reacción y por lo tanto que se concentra a nivel de las colonias.

Por medio de reacción de acuerdo con la invención, se entiende un medio que permite el desarrollo de al menos una actividad enzimática de al menos un microorganismo.

Este medio de reacción puede servir únicamente como medio de revelado o como medio de cultivo y de revelado. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos se realiza antes de la siembra y en el segundo caso, el medio de reacción constituye también el medio de cultivo, lo que constituye una realización particular de la invención.

El medio de reacción puede ser sólido, semi-sólido o líquido. Por medio sólido, se entiende por ejemplo un medio gelificado.

El agar es el medio tradicional sólido en microbiología para el cultivo de microorganismos, pero también es posible utilizar gelatina o agarosa. En el mercado están disponibles cierto número de preparaciones, como por ejemplo la gelosa Columbia, gelosa Trypcase-soja, gelosa Mac Conkey, gelosa Sabouraud o, de forma más general, las descritas en el documento Handbook of Microbiological Media (CRC Press).

Preferiblemente, cuando el medio de reacción es también un medio de cultivo, está en forma gelificada.

La cantidad de agar en el medio de reacción es de 2 a 40 g/l y preferiblemente de 9 a 25 g/l.

Los sustratos enzimáticos de la invención pueden utilizarse en un amplio intervalo de pH, particularmente entre pH 5,5 y 10.

La concentración de sustrato enzimático de la invención en el medio de reacción está comprendida entre 0,025 y 0,40 g/l y ventajosamente, esta concentración es de 0,05 g/l. En efecto, a esta concentración de sustrato se obtiene un mejor contraste de coloración.

El medio de reacción puede comprender al menos otro sustrato específico de una actividad enzimática diferente de la detectada por el sustrato de acuerdo con la invención. La hidrólisis enzimática del o de los otros sustratos genera una señal detectable, diferente de la señal detectada por el sustrato de la invención, como por ejemplo productos coloreados o fluorescentes diferentes, para permitir la verificación como detección y/o identificación y/o cuantificación de uno o varios microorganismos.

Como otro sustrato específico, pueden mencionarse los sustratos de tipo indoxilo, tales como 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-\beta-D-glucósido (BIOSYNTH) o 5-bromo-6-cloro-3-indoxilo-\beta-D-galactósido (BIOSYNTH) o cualquier otro sustrato utilizado en la detección de microorganismos.

La concentración del otro sustrato enzimático específico está comprendida generalmente entre 0,01 y 2 g/l. El especialista en la técnica podrá determinar fácilmente dicha concentración en función del sustrato utilizado.

El medio de reacción también puede comprender uno o varios elementos en combinación, tales como aminoácidos, peptonas, hidratos de carbono, nucleótidos, minerales, vitaminas, antibióticos, tensioactivos, tampones, sales de fosfato, de amonio, de sodio y de metales. Los ejemplos de medios se describen en las Solicitudes de Patente de los Solicitantes, EP 656 421 y WO99/09 207.

Los sustratos enzimáticos y medios de reacción de la invención son, por lo tanto, útiles en el diagnóstico de microorganismos con actividad peptidasa.

De este modo, la presente invención también se refiere a la utilización de un sustrato enzimático cromogénico de fórmula (I) o de un medio de reacción tal como se ha definido anteriormente, para la detección y/o identificación y/o cuantificación de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa.

La invención también se refiere a un procedimiento para la detección y/o identificación y/o cuantificación de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa, caracterizado porque consiste en:

\bullet: disponer de un medio de reacción, tal como se ha definido anteriormente,

\bullet: sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

\bullet: dejar incubar, y

\bullet: revelar la presencia de al menos una actividad peptidasa en solitario o en combinación con al menos otra actividad enzimática diferente de esta misma actividad peptidasa.

Las etapas de siembra y de incubación las conocen ampliamente los especialistas en la técnica.

Por ejemplo, la temperatura de incubación es de 37ºC. Tratándose de la atmósfera de incubación, es indiferente que ésta sea anaerobia o aerobia. Sin embargo, la incubación se realiza preferiblemente en anaerobiosis ya que esto mejora la actividad enzimática.

El revelado se realiza a ojo mediante visualización de un cambio de color que no se difunde en el medio de reacción, y que por lo tanto se concentra a nivel de las colonias.

Como microorganismos que pueden diagnosticarse gracias al sustrato enzimático de la invención, pueden mencionarse las bacterias Gram negativas, Gram positivas y las levaduras.

Como bacterias Gram negativas pueden mencionarse las bacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella y Legionella.

Como bacterias Gram positivas pueden mencionarse las bacterias de los siguientes géneros: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Mycobacteria y Corynebacteria.

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Los ejemplos de levaduras comprenden las levaduras de los siguientes géneros: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces y Trichosporon.

Las muestras biológicas a analizar son cualquier muestra clínica, como una extracción de saliva, de sangre, de orina, de heces o de cualquier otra muestra cuyo análisis pueda ayudar a un médico a emitir un diagnóstico. La muestra también puede ser una muestra de producto obtenido de o básico para la industria alimentaria y/o farmacéutica, en la que sea preciso garantizar la ausencia de microorganismos patógenos o identificar una flora contaminante o detectar microorganismos específicos.

Los sustratos cromogénicos de la invención, en los que A es alanita, tienen la ventaja de que permiten diferenciar las bacterias Gram negativas de las bacterias Gram positivas.

De este modo, otro objeto de la invención consiste en un procedimiento para la diferenciación en bacterias de su pertenencia a los gérmenes Gram positivos o a los gérmenes Gram negativos, caracterizado porque consiste en:

\bullet: disponer de un medio de reacción, tal como se ha definido anteriormente y en el que el sustituyente A del sustrato cromogénico es alanina,

\bullet: sembrar el medio con la muestra biológica a ensayar,

\bullet: dejar incubar, y

\bullet: revelar la presencia de al menos una coloración sinónima de la presencia de germen(es) Gram negativo(s).

Tratándose de los sustratos cromogénicos en los que A es prolina, estos tienen la ventaja de que permiten diferenciar la levadura de la especie Candida albicans de las especies Candida tropicalis y Candida glabrata.

De este modo, otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para la diferenciación de la levadura de la especie Candida albicans de las de las especies Candida tropicalis y Candida glabrata, caracterizado porque consiste en:

\bullet: disponer de un medio de reacción tal como se ha definido anteriormente y en el que el sustituyente A del sustrato cromogénico es prolina,

\bullet: sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

\bullet: dejar incubar, y revelar la presencia de al menos una coloración sinónima de la presencia de la levadura de la especie Candida albicans.

La invención se entenderá mejor con ayuda de los siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no limitante.

Ejemplo 1 Síntesis de 9-aminobenzo[a]fenoxazino-5-na

(compuesto (5) con R_{3}=R_{4}=R_{5}=H)

1.1 Preparación de 2-nitroso-5-acetamidofenol

Se han disuelto 9 g de 3-acetaminofenol (Aldrich) en una solución acuosa (100 ml) que contiene 2,8 g de hidróxido de sodio. Se ha enfriado la solución a -3ºC utilizando un baño de hielo-sal y se han añadido 5 g de nitruro de sodio en agua (12 ml).

Se ha añadido, a partir de un embudo de decantación, una solución de ácido fosfórico diluido con una cantidad igual de agua (25 ml) a la solución agitada. Dicha adición se ha realizado a una velocidad tal que la temperatura se mantiene a 0ºC o por debajo de esta temperatura. A continuación se forma un precipitado rojo-pardo. Después de una hora de agitación vigorosa suplementaria, se ha ajustado el pH para garantizar una acidez total (pH < 2).

Se ha filtrado la suspensión espesa obtenida de este modo y se ha lavado cuidadosamente el resto con agua fría para retirar el exceso de ácido y de sales. Después de la aspiración apropiada, se ha secado el resto en un secador al vacío. Se han obtenido 7,36 g de 2-nitroso-5-acetamidofenol con un rendimiento del 68,6%.

1.2 Preparación de 9-acetaminobenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se han disuelto 1,8 g del producto en bruto obtenido en el punto 1.1 anterior y 1,60 g de 1,3-dihidroxinaftaleno (Aldrich) en 50 ml de butan-1-ol mientras se agitan y se calientan a 70ºC. Se ha añadido gota a gota 1 g de ácido sulfúrico concentrado a la solución calentada y se continúa el calentamiento a 90ºC. Después de 30 minutos se ha dejado enfriar a la mezcla. Se ha eliminado la fase sólida mediante filtración con aspiración y se ha lavado con un poco de etanol. Después del secado, se ha obtenido el compuesto del título con un rendimiento del 76%.

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Se ha sometido al producto obtenido a una cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice utilizando acetato de etilo/tolueno (3:1) como fase móvil. Se ha obtenido una mancha naranja clara-amarilla (R_{f} = 0,8).

1.3 Preparación de 9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se han disuelto 1,5 g del compuesto obtenido en el punto 12 anterior en un volumen mínimo de ácido sulfúrico y de agua (1:1), mientras se agita y se calienta a 100ºC hasta que se extrae una muestra y se diluye en agua y después se extrae en acetato de etilo, que ya no presenta producto de partida por cromatografía en capa fina. Se ha agitado la solución oscura obtenida de este modo y se ha calentado hasta la temperatura de ebullición durante varios minutos y después se ha enfriado y se ha vertido en un baño de hielo-agua (300 ml). Se ha divido finamente la base precipitada y a continuación se ha calentado a 40ºC y se ha dejado en reposo durante una noche. Se ha dejado decantar el líquido sobrenadante, se ha filtrado la suspensión del producto y se ha lavado con agua. Después del secado, se ha obtenido el producto deseado con un rendimiento del 78%.

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Ejemplo 2 Aminoacilación de 9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona

(Compuesto de fórmula (I) en la que R_{1}/R_{2} forman un naftaleno, R_{3}=R_{4}=R_{5}=R_{6}=H, A = un aminoácido y X = N-t-BOC)

Se han disuelto 0,52 g (2 mmoles) del compuesto aminado en cuestión, obtenido en el ejemplo 1 en 15 ml de dimetilformamida (calidad de cromatografía líquida de alta resolución) mientras se calientan, y después en 10 ml de tetrahidrofurano. Esta solución se ha hidrogenado en un matraz con tres bocas utilizando hidrógeno (producido a partir de borohidrato de sodio/ácido acético), así como 0,1 g de paladio sobre carbono al 10% como catalizador. El color violeta oscuro obtenido ha sido sustituido por un aspecto verde fluorescente. Se ha continuado la hidrogenación durante 30 minutos, se ha cerrado el matraz y se ha dejado en reposo durante una noche.

Se han disuelto 3 mmoles de aminoácido protegido con N-tBOC en 10 ml de THF anhidro y se han enfriado a -12ºC (baño de hielo/sal). Se han añadido a la solución refrigerada de este modo 0,33 g (3,3 mmoles) de N-metilmorfolina y después se han añadido suavemente, a entre -12ºC y -9ºC, 0,42 g (3,1 mmoles) de cloroformiato de isobutilo. Después de 5 minutos, se ha vertido la mezcla de reacción con el anhídrido mixto anterior en la solución agitada de amina reducida, se ha pre-refrigerado al menos a -5ºC mientras que se introducía el hidrógeno para evitar una reoxidación. Después de 10 minutos, se ha cerrado el matraz y se ha agitado el contenido durante 5 horas suplementarias a temperatura ambiente.

Se ha filtrado la mezcla de reacción y se ha retirado el disolvente (THF) mediante evaporación rotatoria. Se ha vertido la solución de DMF en una mezcla de agua-hielo bien agitada y se ha filtrado el precipitado, se ha lavado con agua y se ha secado al aire. Se ha disuelto el producto bruto en diclorometano (DCM) y se ha lavado con hidróxido de sodio diluido (0,2 M) y después con agua. Después del secado con sulfato de magnesio, se ha eliminado el disolvente.

En algunos casos, la filtración del extracto de DCM a través de un cono de gel de sílice ha eliminado los restos de material de base que puede observarse por cromatografía en capa fina.

El compuesto obtenido en este ejemplo puede desprotegerse a continuación de la siguiente manera: se disuelve el producto en un volumen reducido de acetato de etilo y se agita con una cantidad igual de acetato de etilo saturado con cloruro de hidrógeno durante 1 hora. Se añade éter anhidro en exceso y se filtra rápidamente la sal de clorhidrato precipitada y después se lava con éter suplementario o con éter/alcohol mineral y después se seca al vacío.

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Ejemplo 3 Síntesis de 9-amino-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{1}/R_{2} forman un naftaleno y R_{3}=R_{4}=R_{5}=H y R_{6} = -C(O)OR' con R' = C_{2}H_{5})

3.1 Preparación de 1,3-dihidroxinaftoato de etilo

Se ha producido este compuesto a partir de malonato de dietilo y cloruro de fenilacetilo de acuerdo con el procedimiento de Meyer y Bloch (Org. Synth. Coll., Vol 3, pág. 132).

3.2 Preparación de 9-acetamido-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se han disuelto 1,8 g (10 mmoles) de 2-nitroso-5-acetamidofenol y 2,08 g (9 mmoles) de 1,3-dihidroxinaftoato de etilo en 60 ml de butanol calentando y se han agitado a 70ºC. Se ha añadido progresivamente gota a gota ácido sulfúrico concentrado y se ha calentado la solución progresivamente a aproximadamente 90ºC. Después de 30 minutos, se ha enfriado la mezcla de reacción y se ha mantenido a 5ºC durante una noche.

Se ha eliminado el producto rojo mediante filtración con aspiración y se ha lavado con un poco de etanol.

Después del secado, se ha obtenido 9-acetamido-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona con un rendimiento del 65%.

3.3 Preparación de 9-amino-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se ha disuelto la 9-acetamido-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona obtenida en el punto 3.2 en una mezcla de ácido sulfúrico (3 ml) y de etanol (3 ml). Se ha calentado la mezcla a 80ºC mientras se añadía progresivamente agua (1 ml). El color púrpura característico de la amina ha aparecido rápidamente. Se ha continuado la hidrólisis hasta que la muestra, diluida con agua y después extraída con acetato de etilo, ya no presentaba 9-acetamido-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona en cromatografía en capa fina.

Se ha vertido la mezcla de reacción en 150 ml de agua helada y se ha recogido el producto mediante filtración con aspiración y después se ha lavado con agua y se ha secado. El producto se ha obtenido con un rendimiento del 85%.

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Ejemplo 4 Aminoacilación de 9-amino-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se ha procedido como se ha descrito en el ejemplo 2, utilizando el producto obtenido en el ejemplo 3 y utilizando el aminoácido apropiado, protegido con N-t-Boc.

Para la desprotección del compuesto aminado, éste se ha disuelto en 2 ml de ácido trifluoroacético, operación seguida de una precipitación en éter. De este modo se ha obtenido el producto en forma de polvo naranja homogéneo por cromatografía en capa fina.

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Ejemplo 5 Síntesis de 9-amino-6-clorobenzo[a]fenoxazin-5-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{1}/R_{2} forman un naftaleno y R_{3}=R_{4}=R_{5}=H y R_{6}=Cl)

5.1 Preparación de 9-nitro-6-clorobenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se han añadido 1,54 g (10 mmoles) de 2-amino-nitrofenol del 95% de pureza (Aldrich), a una suspensión de 2,26 g (10 mmoles) de 2,3-dicloro-1,4-naftoquinona (Fluka) en etanol, calentada previamente hasta el punto de ebullición y después enfriada a 25ºC. Se ha agitado la mezcla y se ha añadido 1 g de acetato de sodio anhidro. Después de varias horas, se ha formado un precipitado pardo-naranja. Después de 24 horas de agitación continua, se ha aislado el sólido mediante filtración con aspiración, se ha secado y se ha recristalizado en ácido acético caliente (rendimiento del 65%).

5.2 Preparación de 9-amino-6-clorobenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se han agitado 130 mg (1 mmol) de acetilacetonato de cobre II, se han suspendido en 10 ml de etanol, con 0,18 g (5 mmoles) de borohidruro de sodio a temperatura ambiente hasta la formación de un compuesto pardo obtenido de esta catálisis (aproximadamente 10 minutos). Se han añadido a esta mezcla 1,29 g (4 mmoles) del compuesto obtenido en el punto 5.1 anterior en forma de una suspensión en 10 ml de propan-1-ol y después 0,37 g (10 mmoles) de borohidruro de sodio. Se ha agitado la mezcla durante 3 horas a 30ºC.

Después del enfriamiento, se ha vertido la mezcla de reacción en una mezcla de hielo/agua, después se ha recogido el producto en bruto por filtración y se ha secado. Éste se ha purificado por disolución en butan-1-ol caliente y por filtración para eliminar los productos que contenían cobre. Después de la concentración, el compuesto del título se ha cristalizado para dar 0,68 g de producto.

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Ejemplo 6 Aminoacilación de 9-amino-6-clorobenzo[a]fenoxazin-5-ona

Se ha procedido como se ha descrito en el ejemplo 2, utilizando el producto obtenido en el ejemplo 5 y utilizando el aminoácido apropiado, protegido con N-t-Boc.

Para la desprotección del compuesto aminado, también se ha procedido como se ha descrito en el ejemplo 2.

Ejemplo 7 Síntesis de 5-aminobenzo[a]fenoxazin-9-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{3}/R_{4} forman un naftaleno y R_{1}=R_{2}=R_{5}=R_{6}=R_{9}=H)

7.1 Preparación de naftofenoxazona

Se ha utilizado el procedimiento de Fisher y Hepp (anteriormente) sin modificación significativa realizando la condensación de 4-nitrosofenol y de 2-naftol en ácido acético glacial utilizando cloruro de zinc como agente de condensación.

Se ha recristalizado el producto en bruto en tolueno caliente/alcohol mineral con un rendimiento del 25%.

El 4-nitrosofenol utilizado en este caso es un producto comercial obtenido de Fluka que se ha transformado de la siguiente manera: se ha purificado este producto disolviéndolo en éter, filtrándolo a través de un papel Phase-Sep y agitándolo con Norita durante una hora. Después de la filtración, se ha evaporado por rotación la solución etérea hasta obtener un volumen reducido y se ha enfriado para obtener el producto cristalino de nitrosofenol puro.

7.2 Preparación del producto aminado

De acuerdo con el procedimiento de Kehrmann y Gottrau (anteriormente) se han mezclado 3,0 g de la naftofenoxazona obtenida en el punto 7.1 anterior y 3,0 g de clorhidrato de hidroxilamina con 200 ml de etanol absoluto y se han calentado progresivamente hasta la ebullición. El color rojo de la naftofenoxazona se ha sustituido progresivamente por un color naranja y se ha producido la precipitación del clorhidrato de la base. Se ha eliminado el precipitado mediante filtración, se ha lavado con un poco de etanol y después se ha secado para obtener el clorhidrato a un rendimiento del 63%.

Se ha descompuesto 1 g de la sal obtenida de este modo calentando con agua y después enfriando para dar un resto verde de la base libre. Se ha filtrado y se ha disuelto en algunos ml de etanol a 40ºC mientras se añadía una cantidad suficiente de HCl para la solución. La solución violeta-roja fluorescente se ha calentado con una cantidad suficiente de acetato de sodio anhidro para dar la base libre (agujas metálicas verde oscuro). Se ha filtrado el producto, se ha lavado con agua caliente y se ha secado para obtener un rendimiento del 97%.

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Ejemplo 8 Síntesis de 7-amino-1,2-(3',4'-ciclopenteno-2'-pironil)-fenoxazin-3-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{1}/R_{2} forman una coumarina, R_{7} y R_{8}, junto con los dos átomos de carbono a los que están unidos, forman un ciclopenteno y R_{3}=R_{4}=R_{5}=R_{6}=H)

8.1 Preparación de 5,7-dihidroxi-3,4-ciclopentenocoumarina

Se han mezclado de forma conjunta 3,02 g (24 mmoles) de floroglucinol y 3,12 g (20 mmoles) de 2-oxociclopentanocarboxilato de etilo en un pequeño matraz con ayuda de un poco de etanol. Después del enfriamiento, se han añadido a la mezcla agitada 30 ml de una mezcla de ácido sulfúrico/agua al 75% masa/masa. Se ha continuado la agitación a temperatura ambiente durante 48 horas. Se ha vertido el producto semisólido en una mezcla de hielo/agua bien agitada y se ha filtrado. Se ha lavado el resto minuciosamente con agua, se ha desecado por aspiración y se ha dejado secar al aire.

Una recristalización en etanol ha dado un producto homogéneo por cromatografía en capa fina. El rendimiento ha sido de 2,8 g.

8.2 Preparación del compuesto del título

Se han disuelto 2,18 g (10 mmoles) de la 5,7-dihidroxi-3,4-ciclopenteno-coumarina obtenida en el punto 8.1 anterior en 40 ml de etanol caliente y se han añadido 1,74 g (10 mmoles) de 1,4-dicloro-p-benzoquinona diimina a la solución agitada. La mezcla de reacción se ha llevado lentamente a la temperatura de reflujo anterior en un baño de agua durante varios minutos, tiempo durante el cual el líquido ha tomado un color violeta profundo. Después de 20 minutos suplementarios de reflujo, se ha vertido la mezcla de reacción en 250 ml de una mezcla de hielo/agua que contenía 2 g de acetato. El colorante se ha separado en forma de un precipitado azul oscuro. Se ha retirado el precipitado obtenido de este modo por filtración con aspiración y se ha lavado con agua. El producto secado (1,5 g) ha podido recristalizarse en ácido acético y butan-1-ol.

Ejemplo 9 Síntesis de 7-amino-1,2-(4'-metil-2'-pironil)-fenoxazin-3-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{1}/R_{2} forman una coumarina, R_{8} es un metilo y R_{7}=R_{3}=R_{4}=R_{5}=R_{6}=H)

9.1 Preparación de 5,7-dihidroxi-4-metilcoumarina

Se ha derretido de forma conjunta una mezcla de 2,77 g (22 mmoles) de floroglucinol y 2,6 g (20 mmoles) de acetoacetato de etilo, se ha enfriado y se han añadido rápidamente a la masa semisólida 40 ml de una mezcla de ácido sulfúrico/agua (75% p/p). Se ha agitado la mezcla durante 24 horas, tiempo durante el cual se ha formado una masa semisólida. Ésta se ha vertido en una mezcla de hielo/agua (300 ml) que contenía 5 g de acetato de sodio y se ha recogido el precipitado por filtración con aspiración.

Después del lavado repetido con agua y del secado, el producto en bruto se ha recristalizado en etanol caliente para dar 3,05 g de coumarina.

9.2 Preparación de 7-amino-1,2-(4'-metil-2'-pironil)-fenoxazin-3-ona

Se han disuelto 1,92 g (10 mmoles) de 5,7-dihidroxi-4-metilcoumarina en 50 ml de metanol anhidro. A la solución caliente agitada, se han añadido 7,5 g (0,125 mol) de urea para moderar la exotermia y reducir la cloración del producto. Se han añadido 1,74 g (10 mmoles) de 1,4-diclorobenzoquinonadiimina a la mezcla de reacción que se había calentado a la temperatura de reflujo durante 2 horas con agitación.

Se ha vertido la solución púrpura oscuro en una mezcla de agua/hielo bien agitada que contenía 10 g de acetato de sodio. Se ha eliminado el precipitado púrpura oscuro por filtración al vacío y se ha secado. Se ha purificado el producto en bruto suspendiéndolo en 200 ml de metanol calentado a 50ºC mientras se añadía progresivamente a la mezcla bien agitada una solución de 5 g de ditionito de sodio y de 5 g de carbonato de sodio en 20 ml de agua. Se ha formado un precipitado de color amarillo-pardo.

Se ha filtrado rápidamente la mezcla de reacción para aislar un precipitado del colorante en forma dihidro. Se ha lavado con una mezcla de hielo/agua que contenía un poco de ditionito de sodio y el precipitado humidificado de este modo se ha transferido a 100 ml de metanol. Se ha calentado a 40ºC la solución agitada rápidamente y se ha añadido agua progresivamente, lo que ha permitido reoxidar el colorante incoloro (en forma dihidro) y obtener un precipitado pardo-púrpura oscuro. Finalmente se han añadido 100 ml de agua para terminar la oxidación y la precipitación del colorante que se ha secado después de su retirada por filtración. Una cromatografía en capa fina ha indicado un único compuesto púrpura y varios restos del mismo compuesto en forma dihidro.

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Ejemplo 10 Síntesis de 7-amino-1,2-(3'-carboxietil-4'-metil-2'-pironil)-fenoxazin-3-ona

(Compuesto de fórmula I en la que R_{1}/R_{2} forman una coumarina, R_{7}=carboxietilo, R_{7}=metilo y R_{3}=R_{4}=R_{5}=R_{6}=H)

10.1 Preparación de 5,7-dihidroxi-4-metilcoumarina-3-propanoato de etilo

Se han mezclado de forma conjunta 2,77 g (22 mmoles) de floroglucinol y 4,60 g (20 mmoles) de acetilglutarato de dietilo, se han enfriado y se han agitado con 35 ml de una mezcla de ácido sulfúrico/agua al 75% masa/masa. Se ha continuado la agitación durante 48 horas. Se ha aislado el producto vertiéndolo en una mezcla de hielo/agua agitada y se ha filtrado por aspiración. Se ha lavado el resto minuciosamente con agua y se ha secado al aire.

Se ha transformado el producto directamente en el ácido libre suspendiéndolo en etanol y agitándolo con una solución acuosa de hidróxido de potasio (3 equivalentes molares). Después de 4 horas, el ácido ha precipitado mediante la adición de ácido clorhídrico 2 M a pH 2. Se ha retirado el copioso precipitado mediante filtración por aspiración, se ha lavado con agua y se ha secado por aspiración. Después del secado al aire, se ha obtenido el producto deseado a una cantidad de 3,8 g.

10.2 Preparación del compuesto del título

Se ha preparado este compuesto como en el ejemplo 8.1 a partir de 1,4-dicloro-p-benzoquinonadiimina y del ácido obtenido en el punto 10.1 anterior (cantidades equimolares). Se ha vertido la mezcla de reacción en una mezcla de hielo/agua añadiendo ácido clorhídrico hasta obtener un pH de 2 para asegurar una precipitación total de la forma de ácido carboxílico libre del colorante. La cantidad de producto seco obtenido ha sido de 2,2 g.

Ejemplo 11 Detección de microorganismos que expresan actividad leucina-peptidasa 11.1 Preparación de los medios de detección

Se ha preparado el medio de detección mezclando 1,4 g de biogelytone (bioMérieux), 0,84 g de extracto de carne (bioMérieux), 2,24 g de NaCl (Merck), 280 \mul de una solución de IPTG (Isopropiltio-\beta-D-galactopiranósido, BIOSYNTH) en agua (concentración 10 g/l) y 4,2 g de Agar europeo (bioMérieux).

A continuación se ha añadido el sustrato de la invención obtenido en el ejemplo 2, en el que el aminoácido es leucina (leucina-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona o Leu-ABP) o bien un sustrato de la técnica anterior que es leucina-aminometilcoumarina (Leu-AMC, BACHEM) de la siguiente manera: se han añadido 280 ml de agua osmotizada al medio y después se ha derretido al baño maría a 100ºC. Se ha esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC y se ha enfriado al baño maría a 50ºC.

A continuación se ha añadido el sustrato disuelto en DMSO (Merck) de acuerdo con las concentraciones que se indican en la siguiente tabla 1:

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TABLA 1

22

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A continuación se ha vertido el medio en una placa de Petri.

11.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Diez cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en cada uno de los medios. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. La coloración de estas colonias, la difusión, así como la intensidad de esta coloración se han anotado.

11.3 Resultados

Los resultados se expresan en intensidad de la coloración basándose en una escala arbitraria que va de 0 a 4, así como en difusión basándose también en una escala arbitraria que va de 0 a 4. Estos resultados se presentan en la tabla 2 a continuación, en la que:

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- Tª corresponde al tiempo de incubación, C^{b} corresponde al diámetro de crecimiento en mm, I^{C} corresponde a la intensidad de coloración, Co^{d} corresponde al color de la colonia y D^{c} corresponde a la difusión,

- A corresponde a azul fluorescente y R corresponde a rosa.

23

Los resultados que se indican en las Tablas 1 y 2 anteriores demuestran que los sustratos enzimáticos cromogénicos de la invención permiten diagnosticar bien microorganismos que expresan una actividad leucina peptidasa y que, con respecto a un sustrato de la técnica anterior, se observa una difusión muy reducida alrededor de la colonia.

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Ejemplo 12 Detección de microorganismos que expresan actividad Prolil-peptidasa 12.1 Preparación de los medios de detección

Se ha preparado los medios de detección mezclando 1,68 g de extracto de levadura (bioMérieux), 1,4 g de Biocase (bioMérieux), 1,26 g de extracto de malta (bioMérieux), 0,08 g de glucosa (Merck) y 3,92 g de Agar (bioMérieux).

Se han añadido 280 ml de agua osmotizada al polvo y después se ha derretido al baño maría a 100ºC. Se ha separado en dos matraces de 140 ml cada uno. Se ha esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC y se ha enfriado al baño maría a 50ºC.

A continuación se ha añadido al primer matraz L-Prolil-7-amino-4-metil-coumarina (Pro-AMC, Bachem) como control y en el segundo L-Prolil-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona (Pro-ABP, sustrato de la invención obtenido en el ejemplo 2 en el que el aminoácido es L-Prolina) a la concentración final de 50 mg/l.

12.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Nueve cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en cada uno de los medios. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. El tamaño de las colonias, su coloración, así como la intensidad de esta coloración se han anotado.

12.3 Resultados

Los resultados se expresan en la tabla 3 a continuación de acuerdo con las reglas y la nomenclatura enunciadas en el párrafo 11.3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Actividad prolil-peptidasa de microorganismos con sustratos Pro-AMC de la técnica anterior y Pro-ABP de la invención

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Los resultados que se indican en la tabla anterior demuestran que los sustratos enzimáticos cromogénicos de la invención permiten diagnosticar bien microorganismos que expresan una actividad prolil-peptidasa y particularmente separar las levaduras de la especie Candida albicans de las de las especies Candida tropicalis y Candida glabrata.

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Ejemplo 13 Detección de microorganismos que expresan actividad Alanil-peptidasa 13.1 Preparación de los medios de detección

Se han preparado los medios de detección mezclando 3,6 g de biogelytone (bioMérieux), 2,16 g de extracto de carne (bioMérieux), 1,26 g de extracto de malta (bioMérieux), 5,76 g de NaCl (Merck) y 10,8 g de agar (bioMérieux).

Se han añadido 720 ml de agua osmotizada al polvo y después se ha derretido al baño maría a 50ºC. Se ha separado en dos matraces de 360 ml cada uno. Se han esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC y se ha enfriado al baño maría a 100ºC.

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A continuación se ha añadido al primer matraz L-Alanil-7-amino-4-metil-coumarina (Ala-AMC, Bachem) como control a la concentración final de 50 mg/l y en el segundo L-Alanil-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona (Ala-ABP, sustrato de la invención obtenido en el ejemplo 2 en el que el aminoácido es L-Alanina) a la concentración final de 25 mg/l.

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13.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Veinticinco cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en cada uno de los medios. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. El tamaño de las colonias, su coloración, así como la intensidad de esta coloración se han anotado.

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13.3 Resultados

Los resultados se expresan en la tabla 4 a continuación de acuerdo con las reglas y la nomenclatura enunciadas en el párrafo 11.3.

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TABLA 4 Actividad Alanil-peptidasa de microorganismos con sustratos Ala-AMC de la técnica anterior y Ala-ABP de la invención

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Los resultados que se indican en la tabla anterior demuestran que los sustratos enzimáticos cromogénicos de la invención permiten diagnosticar bien microorganismos que expresan una actividad Alanil peptidasa y particularmente separar las bacterias Gram positivas (que no expresan la actividad) de las bacterias Gram negativas (que expresan la actividad).

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Ejemplo 14 Detección de microorganismos que expresan la actividad \beta-alanina peptidasa 14.1 Preparación de los medios de detección

Se han derretido al baño maría a 100ºC 300 ml del medio Columbia y se han esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC. A continuación se ha enfriado al baño maría a 50ºC.

Se ha separado este medio en 3 matraces de 100 ml y después se han añadido a 50ºC como sustratos, los de los ejemplos 4 y 6 para los que el aminoácido es \beta-alanina (respectivamente \beta-alanina-9-amino-6-carbetoxibenzo[a]fenoxazin-5-ona o \beta-Ala-ACAP y \beta-alanina-9-amino-6-clorobenzo[a]fenoxazin-5-ona o \beta-Ala-ACHP), disueltos en DMSO, de acuerdo con las concentraciones que se indican en la siguiente tabla 5:

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TABLA 5

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A continuación se han vertido en placas de Petri.

14.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Nueve cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en los medios preparados en el punto 14.1 anterior, de acuerdo con una inoculación multipunto a razón de 100.000 cfu/mancha. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas (una colonia por cepa) se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación.

14.3 Resultados

Los resultados se expresan en la tabla 6 a continuación de acuerdo con las reglas y la nomenclatura enunciadas en el párrafo 11.3 y donde RP significa rosa pálido.

TABLA 6

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Los resultados que se indican en la tabla anterior demuestran que los sustratos enzimáticos cromogénicos de la invención permiten diagnosticar bien una actividad \beta-alanina peptidasa específica de las cepas de P. aeruginosa, siendo el conjunto de las otras cepas negativas para esta actividad enzimática revelada por estos sustratos.

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Ejemplo 15 Detección de microorganismos que expresan una actividad alanina peptidasa utilizando sustratos para los que A es al menos dos aminoácidos 15.1 Preparación de los medios de detección

Se han derretido al baño maría a 100ºC 1000 ml de medio Columbia y se han esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC. A continuación se han enfriado al baño maría a 50ºC.

Se ha separado este medio en 5 matraces de 200 ml y después se han añadido a 50ºC como sustratos, los de los ejemplos 2 para los que A es:

- medio 1: L-alanina (L-alanina-9-arninobenzo[a]fenoxazin-5-ona o A-ABP),

- medio 2: L-alanina-L-alanina (L-alanina-L-alanina-9-aminobenzo-[a]fenoxazin-5-ona o AA-ABP),

- medio 3: L-alanina-L-alanina-L-alanina (L-alanina-L-alanina-L-alanina-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona o
AAA-ABP),

- medio 4: L-alanina-glicina (L-alanina-glicina-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona o AG-ABP) y

- medio 5: glicina-L-alanina (glicina-L-alanina-9-aminobenzo[a]fenoxazin-5-ona o GA-ABP),

disolviéndose cada sustrato en DMSO y utilizándolo a una concentración final de 50 mg/l.

A continuación se ha vertido en placas de Petri.

15.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Nueve cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en los medios preparados en el punto 15.1 anterior de acuerdo con una inoculación multipunto a razón de 15.000 cfu/mancha. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación.

15.3 Resultados

Los resultados se expresan en las tablas 7 y 8 a continuación de acuerdo con las reglas y la nomenclatura enunciadas en el párrafo 11.3 y donde R = rosa, RP = rosa pálido e I = incoloro.

TABLA 7

31

TABLA 8

33

Los resultados que se indican en las Tablas 7 y 8 anteriores demuestran que, sea cual sea la longitud de la cadena de aminoácidos de los sustratos enzimáticos cromogénicos de la invención, estos últimos permiten la detección de la expresión enzimática de cepas de microorganismos que poseen actividad alanina peptidasa. Además, debido a la naturaleza y al número de aminoácidos, es posible modificar tanto la especificidad como la sensibilidad o la toxicidad de los sustratos para el diagnóstico de dichas cepas en función de la cepa considerada.

Ejemplo 16 Detección de microorganismos asociando un sustrato de la invención y un sustrato de la técnica anterior 16.1 Preparación del medio de detección

Se han mezclado 3,3 g de extracto de levadura, 2,75 g de Biocase, 2,475 g de extracto de malta, 0,165 g de glucosa, 7,7 g de agar y se han añadido 550 ml de agua osmotizada.

Se ha derretido al baño maría a 100ºC y se ha esterilizado en un autoclave durante 15 minutos a 121ºC. A continuación se ha enfriado al baño maría a 50ºC.

Se ha añadido el sustrato de la invención preparado de acuerdo con el ejemplo 2, en el que el aminoácido es prolina, a razón de 0,05 g/l y 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-\beta-D-glucósido, como sustrato diferente de la técnica anterior, a razón de 0,05 g/l.

A continuación se ha distribuido en placas de Petri.

16.2 Siembra de las cepas de microorganismos

Doce cepas de microorganismos obtenidas de la colección de los Solicitantes, suspendidas en agua fisiológica, se han sembrado en colonias en el medio preparado en el punto 16.1 anterior. Las placas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de incubación.

16.3 Resultados

Los resultados, que se indican en la Tabla 9 a continuación, se expresan en crecimiento indicando el tamaño en mm, en actividad, en color, representando T el tiempo de incubación, R = rosa, N = naranja, V = verde, T = turquesa, M = marrón GN = gris naranja y GV = gris verde.

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TABLA 9

34

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Los resultados que se indican en la tabla 9 anterior demuestra que se observa bien una coloración característica de las actividades enzimáticas presentadas por las cepas de la siguiente manera:

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- una coloración rosa a naranja en el caso de las cepas que poseen únicamente actividad prolina peptidasa, debido a la hidrólisis del sustrato de la invención. (Escherichia coli, Morganella morganii, Acinetobacter baumanii, Hafnia alvei, Edwardsiella tarda y Candida albicans),

- una coloración turquesa en el caso de las cepas que poseen únicamente actividad \beta-glucosidasa, debido a la hidrólisis del sustrato de la técnica anterior (Staphylococcus sciuri, Enterococcus faecalis) y

- una coloración verde a marrón, procedente de la mezcla de las 2 coloraciones rosa/naranja y turquesa, para las cepas que poseen las dos actividades enzimáticas (Serratia marcescens, Serratia liquefadens, Klebsellia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Listeria innocua).

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Por consiguiente, es posible detectar varias actividades enzimáticas diferentes específicas de cada cepa en función de su metabolismo.

Claims

1. Sustrato enzimático cromogénico, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (I):

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en la que

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o un anillo de coumarina opcionalmente sustituido de fórmula:

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- o bien R_{1} y R_{2}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', un grupo -SO_{3}H o un grupo sulfonamida,

39

- R_{5} y R_{6}, independientemente uno de otro, representan un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo -C(O)OR', un grupo -C(O)NR'R'', o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, a condición de que R_{6} represente un átomo de halógeno cuando R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} formen cada uno, con el anillo de fenilo al que están unidos, un anillo de naftaleno,

- R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- R'' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C_{1}-C_{6},

- A representa al menos un aminoácido y

- X representa un agente de bloqueo o nada.

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2. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque uno y sólo uno de entre R_{1}/R_{2} y R_{3}/R_{4} forma, con el anillo de fenilo al que está unido, un anillo de naftaleno o de coumarina opcionalmente sustituido como se ha definido en la reivindicación 1.

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3. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (Ia):

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en la que R_{5}, R_{6}, A y X son como se han definido en la reivindicación 1.

4. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque R_{5} representa un átomo de hidrógeno, R_{6} representa un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

5. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (Ib):

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en la que R_{5}, R_{7}, R_{8}, A y X son como se han definido en la reivindicación 1.

6. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque R_{5} es un átomo de hidrógeno, R_{7} y R_{8} representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1}-C_{6}, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un carboxialquilo o bien R_{7} y R_{8}, junto con los dos átomos de carbono a los que están unidos, forman un anillo de C_{4}-C_{6}, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

7. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (Ic):

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en la que R_{5}, R_{6}, R_{9}, A y X son como se han definido en la reivindicación 1.

8. Sustrato enigmático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque R_{5}, R_{6} y R_{9} representan cada uno un átomo de hidrógeno, A es un aminoácido seleccionado entre leucina, prolina y alanina, y X es el agente de bloqueo t-butoxicarbonilo o nada.

9. Sustrato enzimático cromogénico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque responde a la siguiente fórmula (Id):

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en la que R_{5}, R_{6}, A y X son como se han definido en la reivindicación 1.

10. Medio de cultivo y/o de revelado que utiliza al menos un sustrato cromogénico enzimático, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en solitario o en combinación con al menos otro sustrato enzimático específico de una actividad enzimática diferente de la detectada por el sustrato de acuerdo con la invención.

11. Medio de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque es un medio de cultivo.

12. Medio de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque está en forma gelificada.

13. Utilización de un sustrato enzimático cromogénico tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o de un medio de cultivo y/o de revelado tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa.

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14. Procedimiento para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación de microorganismos que expresan al menos una actividad peptidasa, caracterizado porque consiste en:

\bullet disponer de un medio de cultivo y/o de revelado tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12,

\bullet sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

\bullet dejar incubar, y

\bullet revelar la presencia de al menos una actividad peptidasa en solitario o en combinación con al menos otra actividad enzimática diferente de esta misma actividad peptidasa.

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15. Procedimiento para la diferenciación en bacterias de su pertenencia a los gérmenes Gram positivos o a los gérmenes Gram negativos, caracterizado porque consiste en:

\bullet disponer de un medio de cultivo y/o de revelado tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 y en el que sustituyente A del sustrato cromogénico es alanina,

\bullet sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

\bullet dejar incubar, y

\bullet revelar la presencia de al menos una coloración sinónima de la presencia de germen(es) Gram negativo(s).

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16. Procedimiento para la diferenciación de la levadura de la especie Candida albicans de las de las especies Candida tropicalis y Candida glabrata, caracterizado porque consiste en:

\bullet disponer de un medio de cultivo y/o de revelado tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 y en el que sustituyente A del sustrato cromogénico es prolina,

\bullet sembrar el medio con una muestra biológica a ensayar,

\bullet dejar incubar, y

\bullet revelar la presencia de al menos una coloración sinónima de la presencia de la levadura de la especie Candida albicans.