JP4515456B2 - 酵素基質としての新規フェノキサジノン(phenoxazinone)誘導体、及び、ペプチダーゼ活性を有する微生物の検出における指標としてのその使用 - Google Patents
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Description
−例えば非特許文献1中に記載されるように、酸−塩基指示薬として、又は、
−非特許文献2中に記載されるように、例えばタンパク質のコンホメーション変化を追従するための、蛍光標識として使用可能である。
式(I):
式中、
−R1及びR2は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6のアルキル基、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
−R3及びR4は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し
(但し、
(i)R1/R2及びR3/R4の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
(ii)R1及びR2が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、R3及びR4は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない)、
−R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基又はC1〜C6のアルキル基を表し(但し、R1/R2及びR3/R4がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、R6はハロゲン原子を表す)、
−R7及びR8は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、R7及びR8は、自身が結合している2つの炭素原子と共にC4〜C6環を形成し、
−R9は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−CO2H基又は−SO3H基を表し(但し、R9が水素原子ではない場合にはR5が水素原子である)、
−R’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表し、
−R’’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表すか、
−そうでなければ、R’及びR’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を1つ以上含む複素環を形成し、
−Aは少なくとも1つのアミノ酸を表し、かつ、
−Xは、ブロック基を表す又は何も表さない。
式中、
−R1及びR2は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6のアルキル基、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
−R3及びR4は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
(但し:
(i)R1/R2及びR3/R4の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
(ii)R1及びR2が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、R3及びR4は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない)、
−R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基又はC1〜C6アルキル基を表し、
(但し:
(i)R1及びR2が自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環又はクマリン環を形成する場合、R6は水素原子を表し、かつ、
(ii)R1/R2及びR3/R4が自身が結合しているフェニル環と共にベンゼン環を形成する場合、R6はハロゲン原子を表す)、
−R7及びR8は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、R7及びR8は、自身が結合している2つの炭素原子と共にC4〜C6環を形成し、
−R9は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−CO2H基又は−SO3H基を表し(但し、R9が水素原子ではない場合にはR5が水素原子である)、
−R’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表し、
−R’’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表すか、
−そうでなければ、R’及びR’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を1つ以上含む複素環を形成し、
−Aは少なくとも1つのアミノ酸を表し、かつ、
−Xは、ブロック基を表す又は何も表さない。
式中、
−R1及びR2は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6のアルキル基、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
−R3及びR4は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し(但し:R1/R2及びR3/R4のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に上記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する)、
−R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基又はC1〜C6アルキル基を表し、
−R7及びR8は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、R7及びR8は、自身が結合している2つの炭素原子と共にC4〜C6環を形成し、
−R9は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−CO2H基又は−SO3H基を表し(但し、R9が水素原子ではない場合にはR5が水素原子である)、
−R’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表し、
−R’’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表すか、
−そうでなければ、R’及びR’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を1つ以上含む複素環を形成し、
−Aは少なくとも1つのアミノ酸を表し、かつ、
−Xは、ブロック基を表す又は何も表さない。
少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び/又は定量するための方法であって、
・上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
にも関する。
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Aがアラニンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
からなる。
Candida albicans種の酵母とCandida tropicalis種及びCandida glabrata種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Aがプロリンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・インキュベートしておき、Candida albicans種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法
に関する。
1.1<2−ニトロソ−5−アセトアミドフェノールの調製>
3−アセトアミドフェノール(アルドリッチ社)9gを、水酸化ナトリウム2.8gを含む水溶液(100ml)中に溶解させた。この溶液を氷塩浴を使用して−3℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム5gを水(12ml)中に溶解させた溶液を添加した。
撹拌及び70℃に加熱しながら、上記1.1項で得られた粗生成物1.8g及び1,3−ジヒドロキシナフタレン(アルドリッチ社)1.60gをブタン−1−オール50ml中に溶解させた。この加熱した溶液中に濃硫酸1gを滴下し、90℃になるまで加熱を続けた。30分後、この混合物を冷却した。固体相を吸引ろ過によって除去し、少量のエタノールで洗浄した。乾燥させた後、表題の化合物が収率76%で得られた。
撹拌及び100℃に加熱しながら、上記1.2項で得られた化合物1.5gを最少量の硫酸及び水(1:1)の中に溶解させて水中に希釈し、続いて酢酸エチル中に抽出したところ、出発物質は薄層クロマトグラフィーによって全く検出されなかった。こうして得られた濃色溶液を撹拌し、数分間加熱して温度を沸点まで上昇させた後、冷却して氷水浴(300ml)中に添加した。沈殿した塩基を微細に砕いて40℃に加熱し、一晩静置した。上清液を沈殿により分離させ、生成物の懸濁液をろ過して水で洗浄した。乾燥させた後、所望の物質が収率78%で得られた。
加熱しながら、実施例1中で得られた関連のあるアミノ化合物0.52g(2mmol)をジメチルホルムアミド(高速液体クロマトグラフィー級品)15ml中に溶解させ、その後テトラヒドロフラン10ml中に溶解させた。この溶液を、(ナトリウムホウ素水和物(sodium borohydrate)/酢酸から得られた)水素、及び、触媒として10%パラジウム−炭素0.1gを使用して三口フラスコ中で水素化した。外観が濃紫色から蛍光性の緑色に変化した。この水素化は30分間継続して実施し、フラスコを閉じて一晩静置した。
3.1<エチル1,3−ジヒドロキシナフトエートの調製>
マロン酸ジエチル及び塩化フェニルアセチルからMeyer及びBlochの方法(Org.Synth.Coll.,Vol 3,p132)によってこの化合物を製造した。
加熱及び70℃で撹拌しながら、2−ニトロソ−5−アセトアミドフェノール1.8g(10mmol)及びエチル1,3−ジヒドロキシナフトエート2.08g(9mmol)をブタノール60ml中に溶解させた。濃硫酸をゆっくりと滴下し、得られた溶液を約90℃に徐々に加熱した。30分後、反応混合物を冷却し、5℃で一晩維持した。
上記3.2項で得られた9−アセトアミド−6−カルボエトキシベンゾ[a]フェノキサジン−5−オンを硫酸(3ml)及びエタノール(3ml)の混合物中に溶解させた。徐々に水(1ml)を添加しながら、この混合物を80℃に加熱した。アミン特有の紫色が迅速に現われた。この試料を水で希釈して酢酸エチル中に抽出したものについて薄層クロマトグラフィーにより9−アセトアミド−6−カルボエトキシベンゾ[a]フェノキサジン−5−オンが完全に検出されなくなるまで、加水分解を続けた。
実施例3中で得られた生成物を使用し、また、N−t−Bocで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例2中に記載する工程を実施した。
5.1<9−ニトロ−6−クロロベンゾ[a]フェノキサジン−5−オンの調製>
純度95%の2−アミノニトロフェノール(アルドリッチ社)1.54g(10mmol)を、予め温度を沸点まで加熱した後25℃に冷却した2,3−ジクロロ−1,4−ナフトキノン(Fluka社)2.26g(10mmol)のエタノール懸濁液中に添加した。この混合物を撹拌し、無水酢酸ナトリウム1gを添加した。数時間後、オレンジ色がかった褐色の沈殿が形成された。24時間撹拌し続けた後、固体を吸引ろ過によって分離して乾燥させ、加熱した酢酸から再結晶させた(収率65%)。
エタノール10ml中に懸濁した銅IIアセチルアセトナート130mg(1mmol)を水素化ホウ素ナトリウム0.18g(5mmol)と共に室温で撹拌し、この物質の触媒作用により褐色の化合物が形成された。(約10分間)。上記5.1項で得られた化合物1.29g(4mmol)をプロパン−1−オール10ml中に懸濁した懸濁液をこの混合物に添加し、その後水素化ホウ素ナトリウム0.37g(10mmol)を添加した。この混合物を30℃において3時間撹拌した。
実施例5中で得られた生成物を使用し、また、N−t−Bocで保護された適切なアミノ酸を使用して、実施例2中に記載する工程を実施した。
7.1<ナフトフェノキサゾンの調製>
上記Fisher及びHeppの方法とほぼ同様の方法により、縮合剤として塩化亜鉛を使用することによって、4−ニトロソフェノール及び2−ナフトールの縮合を氷酢酸中で実施した。
上記Kehrmann及びGottrauの方法によって、上記7.1項で得られたナフトフェノキサゾン3.0g及びヒドロキシルアミン塩酸塩3.0gを無水エタノール200mlと混合し、この混合物を沸点まで徐々に加熱した。ナフトフェノキサゾンの赤色は徐々にオレンジ色に変化し、塩基の塩酸塩の沈澱が生じた。沈殿をろ過により除去して少量のエタノールで洗浄した後乾燥させることによって、塩酸塩が収率63%で得られた。
8.1<5,7−ジヒドロキシ−3,4−シクロペンテノクマリンの調製>
フロログルシノール3.02g(24mmol)及びエチル2−オキソシクロペンタンカルボキシレート3.12g(20mmol)を小型フラスコ中で少量のエタノールを使用して混合した。この混合物を冷却した後で撹拌している中に、硫酸/水の75質量%の混合物30mlを添加した。室温で48時間撹拌を継続した。得られた半固形の物質を、氷/水の混合物を入念に撹拌している中に添加してろ過した。残渣を水で入念に洗浄し、吸引により排水させて風乾させた。
上記8.1項で得られた5,7−ジヒドロキシ−3,4−シクロペンテノクマリン2.18g(10mmol)を加熱したエタノール40ml中に溶解させ、これを撹拌している中に1,4−ジクロロ−p−ベンゾキノンジイミン1.74g(10mmol)を添加した。この反応混合物を水浴上で数分間ゆっくりと還流させると、その間に液体の色が濃紫色になった。更に20分間還流させた後、酢酸塩2gを含む氷/水の混合物250ml中に反応混合物を添加した。染料は、紺青色の沈殿として分離された。こうして得られた沈殿を吸引ろ過によって除去し、水で洗浄した。酢酸及びブタン−1−オールから再結晶させることにより、乾燥した生成物(1.5g)を取得することができた。
9.1<5,7−ジヒドロキシ−4−メチルクマリンの調製>
フロログルシノール2.77g(22mmol)とアセト酢酸エチル2.6g(20mmol)の混合物を溶解させて冷却し、半固形の塊に硫酸/水(75%(w/w))の混合物40mlを迅速に添加した。この混合物を24時間撹拌している間に、半固形の塊が形成された。酢酸ナトリウム5gを含む氷/水の混合物(300ml)の中にこれを添加し、沈殿を吸引ろ過によって回収した。
5,7−ジヒドロキシ−4−メチルクマリン1.92g(10mmol)を、無水メタノール50ml中に溶解させた。発熱を緩和して生成物の塩素化を低減するため、この溶液を加熱して撹拌している中に尿素7.5g(0.125mol)を添加した。反応混合物を撹拌しながら2時間還流させ、その中に1,4−ジクロロベンゾキノンジイミン1.74g(10mmol)を添加した。
10.1<5,7−ジヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−プロピオン酸エチルの調製>
フロログルシノール2.77g(22mmol)及びアセチルグルタル酸ジエチル4.60g(20mmol)を混合して冷却し、硫酸/水の75質量%混合物35mlと共に撹拌した。48時間撹拌を継続した。こうして得られた物質を氷/水の混合物を撹拌している中に添加することによって分離し、吸引ろ過を実施した。残渣を水で入念に洗浄して風乾させた。
この化合物を、1,4−ジクロロ−p−ベンゾキノンジイミン及び上記10.1項で得られた酸(等モル)を使用して、実施例8.1と同様に調製した。この反応混合物を氷/水の混合物中に添加し、塩酸を添加してpH2にすることによって、遊離のカルボン酸の状態の染料を完全に沈澱させた。得られた乾燥物質は2.2gであった。
11.1<検出用の媒体の調製>
biogelytone(ビオメリュー社)1.4g、肉抽出物(ビオメリュー社)0.84g、NaCl(メルク社)2.24g、IPTG(イソプロピルチオ−β−D−ガラクトピラノシド、BIOSYNTH社)水溶液280μl(濃度10g/l)及びEuropean agar(ビオメリュー社)4.2gを混合することにより、検出用の媒体を調製した。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株10株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの着色、拡散及びこの着色の濃さについて記録した。
結果は、着色の濃さを0〜4の任意のスケールを基準として、また、拡散を0〜4の任意のスケールを基準として表した。この結果を下記表2中に示す。表中、
−Taはインキュベート時間、Cbは増殖直径(mm)、Icは着色の濃さ、Codはコロニーの色、また、Deは拡散に相当し、
−Bは蛍光性青色、また、Rはピンク色に相当する。
12.1<検出用の媒体の調製>
酵母抽出物(ビオメリュー社)1.68g、biocase(ビオメリュー社)1.4g、麦芽抽出物(ビオメリュー社)1.26g、グルコース(メルク社)0.08g及び寒天(ビオメリュー社)3.92gを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株9株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
段落11.3中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表3中に示す。
13.1<検出用の媒体の調製>
biogelytone(ビオメリュー社)3.6g、肉抽出物(ビオメリュー社)2.16g、麦芽抽出物(ビオメリュー社)1.26g、NaCl(メルク社)5.76g及び寒天(ビオメリュー社)10.8gを混合することによって、検出用の媒体を調製した。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株25株を生理食塩水中に懸濁し、各媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの大きさ、着色及びこの着色の濃さについて記録した。
段落11.3中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表4中に示す。
14.1<検出用の媒体の調製>
Columbia媒体300mlを水浴中で100℃において溶解させ、121℃で15分間オートクレーブした。その後、生成物を水浴中で50℃まで冷却した。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株9株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記14.1項中で調製した媒体上に、多点接種法により100000cfu/点の割合で播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニー(菌株1つあたりコロニー1つ)の外観を調べた。
段落11.3中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表6中に示す。表中、RPは淡いピンク色を示す。
15.1<検出用の媒体の調製>
Columbia媒体1000mlを水浴中で100℃において溶解させ、121℃で15分間オートクレーブした。その後、これを水浴中で50℃まで冷却した。
−媒体1;L−アラニン(L−アラニン−9−アミノベンゾ[a]フェノキサジン−5−オン(A−ABP))、
−媒体2;L−アラニン−L−アラニン(L−アラニン−L−アラニン−9−アミノベンゾ−[a]フェノキサジン−5−オン(AA−ABP))、
−媒体3;L−アラニン−L−アラニン−L−アラニン(L−アラニン−L−アラニン−L−アラニン−9−アミノベンゾ[a]フェノキサジン−5−オン(AAA−ABP))、
−媒体4;L−アラニン−グリシン(L−アラニン−グリシン−9−アミノベンゾ[a]フェノキサジン−5−オン(AG−ABP))、また、
−媒体5;グリシン−L−アラニン(グリシン−L−アラニン−9−アミノベンゾ[a]フェノキサジン−5−オン(GA−ABP)。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株9株を生理食塩水中に懸濁したものを、上記15.1項中で調製した媒体上のコロニー中に、多点接種法により15000cfu/点の割合で播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
段落11.3中に記載する規則及び学名に従って、結果を以下の表7及び表8中に示す。表中、Rはピンク色、RPは淡いピンク色、また、Iは無色を示す。
16.1<検出用の媒体の調製>
酵母抽出物3.3g、Biocase2.75g、麦芽抽出物2.475g、グルコース0.165g及び寒天7.7gを混合し、浸透水550mlを添加した。
本出願人が保存している株に由来する微生物菌株12株を生理食塩水中に懸濁し、上記16.1項中で調製した媒体上のコロニー中に播種した。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。24時間及び48時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
下記の表9中に示す結果は、増殖の大きさ(mm)、活性及び色を示し、Taはインキュベート時間、Rはピンク色、Oはオレンジ色、Vは緑色、Tは青緑色、Mは褐色、GOはオレンジがかった灰色、また、GVは灰色がかった緑色を示す。
−プロリンペプチダーゼ活性のみを有する菌株(Escherichia coli、Morganella morganii、Acinetobacter baumanii、Hafnia alvei、Edwardsiella tarda及びCandida albicans)の場合は、本発明の基質の加水分解によってピンク色からオレンジ色に着色し、
−β−グルコシダーゼ活性のみを有する菌株(Staphylococcus sciuri、Enterococcus faecalis)の場合は、従来技術の基質の加水分解によって青緑色に着色し、また、
−二種の酵素活性を有する菌株(Serratia marcescens、Serratia liquefaciens、Klebsellia pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びListeria innocua)の場合は、ピンク色/オレンジ色及び青緑色の二種の着色に由来して緑色から褐色に着色する。
Claims (16)
- 発色性酵素基質であって、
下記式(I):
式中、
−R1及びR2は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6のアルキル基、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
−R3及びR4は、自身が結合しているフェニル環と共に式:
−そうでなければ、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基、−SO3H基又はスルホンアミド基を表し、
(但し、
(i)R1/R2及びR3/R4の少なくとも一方は、自身が結合しているフェニル環と共に前記の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成し、かつ、
(ii)R1及びR2が自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたクマリン環を形成する場合には、R3及びR4は自身が結合しているフェニル環と共に任意に置換されたナフタレン環を形成しない)、
−R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−C(O)OR’基、C(O)NR’R’’基又はC1〜C6のアルキル基を表し(但し、R1/R2及びR3/R4がそれぞれ自身が結合しているフェニル環と共にナフタレン環を形成する場合、R6はハロゲン原子を表す)、
−R7及びR8は、それぞれ独立して、水素原子、C1〜C6アルキル基、アラルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基を表すか、
−そうでなければ、R7及びR8は、自身が結合している2つの炭素原子と共にC4〜C6環を形成し、
−R9は水素原子、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、−CO2H基又は−SO3H基を表し(但し、R9が水素原子ではない場合にはR5が水素原子である)、
−R’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表し、
−R’’は、水素原子又はC1〜C6アルキル基を表すか、
−そうでなければ、R’及びR’’は、自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を1つ以上含む複素環を形成し、
−Aは少なくとも1つのアミノ酸を表し、かつ、
−Xは、ブロック基を表す又は何も表さない
ことを特徴とする発色性酵素基質。 - R1/R2及びR3/R4のうち一方のみが自身が結合しているフェニル環と共に請求項1に記載の任意に置換されたナフタレン環又はクマリン環を形成する
ことを特徴とする請求項1に記載の発色性酵素基質。 - R5は水素原子を表し、R6は水素原子又はハロゲン原子を表し、Aはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Xはt−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項3に記載の発色性酵素基質。 - R5は水素原子であり、R7及びR8はそれぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、アラルキル基、アリール基又はカルボキシアルキル基を表すか、そうでなければR7及びR8は自身が結合している2つの炭素原子と共にC4〜C6環を形成し、Aはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Xはt−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項5に記載の発色性酵素基質。 - R5、R6及びR9基はそれぞれ水素原子を表し、Aはロイシン、プロリン及びアラニンから選択されるアミノ酸であり、かつ、Xはt−ブトキシカルボニルブロック基であるか又は存在しない
ことを特徴とする請求項7に記載の発色性酵素基質。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の発色性酵素基質の少なくとも一種を、単独で使用した、又は、請求項1の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した反応媒体。
- 培養基である
ことを特徴とする請求項10に記載の媒体。 - ゲル状である
ことを特徴とする請求項10又は11に記載の媒体。 - 少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び/又は定量するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の発色性酵素基質又は請求項10〜12のいずれか1項に記載の反応媒体の使用。
- 少なくとも一種のペプチダーゼ活性を示す微生物を検出、識別及び/又は定量するための方法であって、
・請求項10〜12のいずれか1項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の他の酵素活性と共に顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。 - 細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Aがアラニンである請求項10〜12のいずれか1項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。 - Candida albicans種の酵母とCandida tropicalis種及びCandida glabrata種の酵母とを識別する方法であって、
・発色性基質の置換基Aがプロリンである請求項10〜12のいずれか1項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・インキュベートしておくこと、及び、
・Candida albicans種の酵母の存在を示す少なくとも一種の着色の存在を顕現させることを含む
ことを特徴とする方法。
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