JP5281079B2 - 新規ペプチダーゼ基質 - Google Patents
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Description
「酵素基質」なる用語は、酵素によって加水分解され、微生物の、細胞の、またはオルガネラの、直接的または間接的な検出を可能にする生成物を提供し得る基質を意味することを目的とする。この基質は、特に、明らかにされる酵素活性に特異的な第1の部分と、標識として働く第2の部分を含む。
本発明に係る基質は、加水分解の生成物が酵素活性を発現している細胞に主に局在したままであるので、この活性を発現している細胞を特に計数することに、又はサンプルの残りからそれらを分離することさえ可能であるので、フローサイトメトリーでの使用に特に適している。
低い毒性のおかげで、本発明に係る基質は、細胞培養ペプチダーゼ活性を観察することに非常に適している。
本発明の基質は、塩を形成してもよく、すなわち塩化物、臭化物またはトリフルオロ酢酸塩のような塩の形態でもよい。
上記ペプチドは、そのN末端終端に遮断剤を含んでもよい。本発明に係る遮断剤は、アミンを保護することができる当業者に知られている任意の遮断剤を含む。例えば、t-ブトキシカルボニル(N-tBOC)、9-フルオレニルオキシカルボニル、サクシニルのような可溶化剤、または非代謝性アミノ酸、すなわち、ピペコリン酸のような非天然アミノ酸またはD-フェニルアラニンようなD型のアミノ酸を挙げることができる。遮断剤は、本発明の化合物に体系的に存在しない。
反応培地は、例えばアミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ソーダ塩、金属塩のような一つ以上の成分を組合せて含んでもよい。
グラム陰性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる:シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、霊菌属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、エーロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロホモナス属、キサントモナス属及びレジオネラ属。
グラム陽性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる:エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、乳酸桿菌属、リステリア属、クロストリジウム属、ガルドネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属(Falkamia)、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリア属及びコリネバクテリウム属。
酵母について、以下の属の酵母を挙げることができる:カンジダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
[式中、
・XはS;NX1;O;またはNX1-COであり;
・R1は無し、あるいはCl、Br、F、I、OHまたはアルキル、アリールまたはカルボキシル基の置換基の一つであり;
・R2は無し、あるいはCl;O-CH2-O;O-CH3;F、ジエチレンジアミン-CH3、NR3R4、Br、I、OH、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、NO2、または
の置換基の一つであり;
・X1は、H、C2H4Ph、OH、アルキル基及びアリール基から選択され;
・R3及びR4は、独立にH又は1から4の炭素原子を有するアルキル基であり;
・Pはペプチドである]
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
ヘテロ環の1位の窒素と2位の炭素との間の結合は一重(1,2-ジヒドロ)あるいは二重でもよく、好ましくはニ重である。
第1の変形例によれば、XがNX1-COであるとき、Xを含む環は6員環であって、当該6員環の3位のOと4位のNX1を含む。
第2の変形例によれば、XがNX1-COであるとき、Xを含む環は6員環であって、当該6員環の3位のNX1と4位のOに二重結合を介して結合するCを含む。
本発明のある好ましい実施形態によれば、XはSである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、XはN-X1である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、XはOである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、XはNX1-COである。
本発明のある特定の実施形態によれば、R2は4’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、R2は5’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、R2は4’位及び5’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、PはそのN末端終端に遮断剤を含む。
・ XはOであり;
・ R1とR2は無し;
・ Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはβ-アラニン、L-アラニン及びグリシンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1とR2は無し、及びPはβ-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1とR2は無し、及びPはL-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1とR2は無し、及びPはグリシンである。
・XはOであり;
・R1はClであり;
・R2は無し;
・Pはペプチドである。
好ましくは、Pはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。好ましくは、R1は5位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、且つ式中:
・XはOであり;
・R1はCH3であり;
・R2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は5位でCH3であり、R2は無し、及びPはL-アラニンである。
・XはOであり;
・R1は無し;
・R2はClであり;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は5’位でClであり、及びPはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は5’位でClであり、及びPはβ-アラニンである。
・XはOであり;
・R1は無し;
・R2はO-CH2-Oであり;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は4’位と5’位でアミノ環に結合されたO-CH2-Oであり、PはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は4’位と5’位でアミノ環に結合されたO-CH2-Oであり、Pはβ-アラニンである。
・XはOであり;
・R1は無し;
・R2はO-CH3であり;
・Pはペプチドである。
Pはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンまたはL-アラニンであることが望ましい。好ましくは、R2は4’位と5’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は4’位と5’位におけるO-CH3であり、Pはβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は4’位と5’位におけるO-CH3であり、PはL-アラニンである。
・XはOであり;
・R1は無し;
・R2はFであり;
・Pはペプチドである。
好ましくは、Pはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンである。好ましくは、R2は5’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはOであり、R1は無し、R2は5’位におけるFであり、Pはβ-アラニンである。
・XはNX1であり;
・X1はCH3であり;
・R1とR2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1であり、X1はCH3であり、R1とR2は無し、PはL-アラニンである。
・XはNX1であり;
・X1はC2H4Phであり;
・R1とR2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1であり、X1はC2H4Phであり、R1とR2は無し、PはL-アラニンである。
・XはNX1であり;
・X1はC2H4Phであり;
・R1は無し;
・R2はClである;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1であり、X1はC2H4Phであり、R1は無し、R2は5’位におけるClであり、PはL-アラニンである。
・XはNX1であり;
・X1はC2H4Phであり;
・R1は無し;
・R2はO-CH2-Oであり;
・Pは、ペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1であり、X1はC2H4Phであり、R1は無し、R2は4’位と5’位でアミノ環に結合されたO-CH2-Oであり、PはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1であり、X1はC2H4Phであり、R1は無し、R2は4’位と5’位でアミノ環に結合されたO-CH2-Oであり、Pはβ-アラニンである。
・XはSであり;
・R1は無し;
・R2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニン及びβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはSであり、R1とR2は無し、PはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはSであり、R1とR2は無し、Pはβ-アラニンである。
・XはSであり;
・R1は無し;
・R2はClであり;
・Pはペプチドである。
好ましくは、Pはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。好ましくは、R2は5’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはSであり、R1は無し、R2は5’位におけるClであり、PはL-アラニンである。
・XはSであり;
・R1はCH3であり;
・R2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはSであり、R1は5’位におけるCH3であり、R2は無し、PはL-アラニンである。
・XはNX1-COであり;
・X1はHであり;
・R1は無し;
・R2はClであり;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1-COであり、X1はHであり、R1は無し、R2は5’位におけるClであり、PはL-アラニンである。
・XはNX1-COであり;
・X1はHであり;
・R1は無し;
・R2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1-COであり、X1はHであり、R1は無し、R2は無し、PはL-アラニンである。
・XはNX1-COであり;
・X1はCH3であり;
・R1は無し;
・R2は無し;
・Pはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはL-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、XはNX1-COであり、X1はCH3であり、R1は無し、R2は無し、PはL-アラニンである。
好ましくは、上記反応培地は微生物検出および/または同定培地であり、上記培地が上記の通り少なくとも一つの酵素基質を含む。
好ましくは、上記基質は1と1000mg/lとの間の濃度、好ましくは10と500mg/lとの間の濃度である。
本発明のある特定の実施形態によれば、本発明に係る上記検出および/または同定培地は、本発明に係る基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な、少なくとも一つの他の酵素基質を含む。
他の基質の酵素加水分解は検出可能なシグナルであって、本発明の基質を介して検出されるシグナルとは異なるシグナル、例えば異なる着色性あるいは蛍光性生成物を生じ、それにより一つ以上の微生物の検出および/または同定および/または定量のような実証を可能にする。他の特異的な基質について、微生物の検出において従来使用されている他の任意の基質を使用してもよい。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常0.01と1g/lとの間にある。当業者は、使用する基質の関数として、容易にこのような濃度を決定することが可能である。例として、本発明に係る基質は、ペプチダーゼ、オシダーゼ、エステラーゼまたはレダクターゼ酵素基質と組合わせることが可能である。特に、本発明に係る基質であってPがβ-アラニンであるものは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコシドまたはアリザリン-β-ガラクトシドのようなオシダーゼと組合わせることが可能である。また、本発明に係る基質であってPがL-アラニンであるものは、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル・オクタノエートまたは5-ブロモ-3-インドキシル・ホスフェートのようなエステラーゼ基質と組合わせることが可能である。
また、本発明は、グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および/または同定培地の使用にも関する。
a)上記の検出及び/又は同定培地を用意すること、
b)培地に試験される生物試料を接種すること、
c)これをインキュベートすること、及び
d)少なくとも1のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。
工程d)は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程d)の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独で、または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
a)上記の検出及び/又は同定培地を用意すること、
b)培地に試験される生物試料を接種すること、
c)これをインキュベートすること、
d)少なくとも1のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
上記のように、微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。工程d)は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程d)の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
・「XはSである 」
1 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾールの合成
1.1 2-(2'-ニトロフェニル)ベンゾチアゾール
1eqの2-アミノフェノールとエタノールと1eqの2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、油浴を用いて、温度110℃で1時間、還流した。
発明者は混合物を周囲温度に冷却するまで置き、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより中間生成物を得た。
上で得られた固体を100mlのジクロロメタンに溶解し、次に1eqの2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応はオーバーナイトで実行され、次に濾過後、DCMに可溶性の生成物を最大で回収するために、ガラス製品をDCMでリンスした。
次に、生成物を得るために、溶媒を減圧下で蒸発させた。
15g(0.15モル)のポリリン酸を250mlのビーカーに入れ、次に4.56g(0.036モル)の2-アミノチオフェノールと5.00g(0.036モル)のアントラニル酸を加えた。混合物は、砂浴でブンゼンバーナにより、3時間、200−220℃に熱され、ガラス撹拌器で一定の間隔で撹拌された。混合物は60℃までゆっくり冷却され、クラッシュアイスを加えた。
次に、60mlの水を加え、得られた溶液は、水酸化ナトリウム(NaOH)溶液でpH9−10に達するまでアルカリ化された。ブフナー漏斗による濾過によって回収されたオレンジ色の沈殿物をこのように得た。得られた固体を乾燥し、次に50mlのジクロロメタンに溶解し、次に水で3回洗った。有機相を回収し、次にMgSO4で乾燥および濾過し、次に溶媒は粗生成物を得るために蒸発させた。質量3.01gの黄/緑色の固体を、カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、64%の収率で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.40 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 6.78 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.23 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.35 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.71 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.97 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
2.1 混合酸無水物法
質量1.51g(0.008モル)のBoc-Ala-OHを10mlのドライテトラヒドロフラン中に溶解し、CaCl2トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、温度を下げた。NaCl塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−15℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に5分間撹拌した。次の工程を実施する前に、温度が−15℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、次に1.01g(0.010)モルのN-メチルモルホリンを加えた。
1.09g(0.008モル)のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた;混合物は、加えられる滴下ごとに、予想通りに濁った。
1.36g(0.006モル)の 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾールは、次に極少量のドライTHFに溶解し、混合物に加えた。2時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のTHFでリンスし、ろ液を保存した。
次に、溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム(Na2CO3)を含む400mlビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで2時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量0.87gのOF37A(ベージュ/褐色の粉末)は、37%の収率で得られた。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (9H, s, C-CH3x3), 1.57 (3H, d, J = 7.92 Hz, CH3-CH-), 3.50 (1H, s, NH-Ar), 4.52 (1H, qt, NH-CH-CH3), 4.51 (21H, d, NH-CH), 7.18 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.44 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.48 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.49 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 7.92 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 8.14 (1H, d, J=7.92 Hz, Ar-H), 8.82 (1H, d, J= 7.92 Hz, Ar-H).
脱保護される化合物の質量0.30g(0.00075モル)を、CaCl2トラップを付けた丸底フラスコに入れ、7mlのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
TFAを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の0.35gのOF38Aを88%の収率で、ベージュ/褐色の粉末を得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.62 (3H, d, J = 7.42 Hz, CH3-CH-), 4.35 (1H, sx, NH2-CH-CH3), 5.31 (2H, broad s, NH2), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.53 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.62 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 8.02 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.12 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.31 (2H, Ar-H + NH).
m. p.: 150-154°C.
3.1 2-(2'-ニトロ-5'-クロロフェニル)ベンゾチアゾール
1.18g(0.0094モル)の2-アミノチオフェノールと1.74g(0.0094モル)の5-ニトロ-3-クロロベンズアルデヒドのエタノール(150ml)溶液の混合物を、2時間還流した。周囲温度に冷却した後に、溶液を減圧下で濃縮した。残りの固体は水と酢酸エチルの混合物(500ml)に希釈され、酢酸エチル(2×500ml)を使用して更に2回抽出した。合わせた有機相を乾燥し(MgSO4)、濾過し、エタノールから再結晶化して、粗生成物を得るために濃縮した。質量0.66gのOF31A(茶色の固体)を、収率25%で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.55 (4H, m, Ar-H), 7.79 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, s, Ar-H), 8.10 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
0.65g(0.00223モル)の2-(2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル)ベンゾチアゾールOF31Aと2.52g(0.01118モル)のSnCl2.2H2Oの100mlエタノール溶液の混合物は、2時間70℃に加熱した。薄層クロマトグラフィを用いた確認工程は、混合物が出発反応物をもはや含まないことを示した。
混合物を周囲温度に冷却した後に、溶液は氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、pHは重炭酸ナトリウムNaHCO3水溶液(5%)の添加によって、わずかに塩基性のpH(pH7−8)に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン(飽和NaCl水溶液)で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより0.31gのOF53A(茶黄色の固体)を収率53%で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.41 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.74 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.42 (3H, m, Ar-H), 7.67 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
3.3.1. 混合酸無水物法
質量0.29g(0.00153モル)のBoc-L-Alaを、10mlのドライテトラヒドロフランに溶解した。CaCl2トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、NaCl塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−15℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に5分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−15℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、0.19g(0.00191モル)のN-メチルモルホリンを次に加えた。0.21g(0.00153モル)のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた;混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後、質量0.30g(0.00115モル)の 2-(2'-アミノ-5'-クロロフェニル)ベンゾチアゾールを極少量のドライTHFに溶解し、混合物に加えた。2時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のTHFでリンスし、ろ液を保存した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と更に炭酸ナトリウム(Na2CO3)を含む400mlビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで2時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量0.18gのOF55A(薄緑色の固体)を収率36%で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.41 (9H, s, 3xCH3), 1.56 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.58 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 6.45 (1H, broad s, NH), 6.74 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.45 (3H, m, Ar-H), 7.66 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, m, Ar-H).
脱保護される化合物の質量0.18g(0.00042モル)を、CaCl2トラップを付けた丸底フラスコに入れ、5mlのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
TFAを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の0.22gのOF57Aを94%の収率で、粘性の茶色固体を得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.50 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.55 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 4.80 (3H, broad s, NH3), 6.87 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.52 (1H, m, Ar-H), 8.10 (4H, m, Ar-H).
m. p.: 124-128°C.
1 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾオキサゾールの合成
1.1 2-(2'-ニトロフェニル)ベンゾオキサゾール
8.73g(0.0800モル)の2-アミノフェノールと20mlのエタノールと12.09g(0.0800モル)の2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、温度110℃で1時間、油浴を用いて還流した。
混合物を周囲温度にし、沈殿物は濾過によって回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより13.25gの2-(2'-ニトロベンジリジンアミノ)フェノールを収率69%で得た。
上で得られた固体を100mlのジクロロメタンに溶解し、次に12.43g(0.0547モル)の2,3-ジシアノ-5,6 -ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けにして加えた。反応はオーバーナイトで実行し、次に濾過後、生成物を最大で回収するために、ガラス製品をDCMでリンスした。
溶媒は、次に減圧下で蒸発させ、それにより8.39gの2-(2-ニトロフェニル)ベンゾオキサゾール(茶−ベージュ色の固体)を収率64%で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 104-107°C.
8g(0.033モル)の2-(2'-ニトロフェニル)ベンゾオキサゾールと37.58g(0.167モル)のSnCl2.2H2Oの混合物の200mlエタノール溶液を、反応が完全に終わるまで70℃に加熱した。
混合物を周囲温度に冷却した後、溶液を氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、pHは重炭酸ナトリウムNaHCO3水溶液(5%)の添加によって、わずかに塩基性のpH(pH7−8)に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン(飽和NaCl水溶液)で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより4.72gのOF10C(茶黄色の固体)を収率67%で得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.20 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.78 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 6.81 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.31 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.32 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.34 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.58 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.08 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 100-104°C.
2.1 混合酸無水物法
質量1.40g(0.008モル)のN-t-Boc-Glyを10mlのドライ・テトラヒドロフランに溶解し、CaCl2トラップを丸底フラスコの首に、それを不透過性にするために付けた。混合物を磁気的に撹拌し、NaCl塩を混ぜた冷凍アイスの槽を使用して−15℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に5分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−15℃に降下したことを確認するために十分な注意を払いながら、1.01g(0.010モル)のN-メチルモルホリンを次に加えた。
次に、1.09g(0.008モル)のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下で加えた; 混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後に、質量1.26g(0.006モル)の 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾオキサゾールを極少量のドライTHFに溶解し、混合物に加えた。2時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のTHFでリンスし、ろ液を保存した。ほんのわずかな沈殿物が存在した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム(Na2CO3)を含む400mlビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで2時間撹拌した。溶液は小さいブフナー漏斗でろ過し、次にそれを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量0.98gのOF27A(白色の粉末)は、45%の収率で得られた。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.47 (9H, s, C-CH3x3), 4.05 (1H, d, J = 8 Hz, -NH-CH2), 4.17 (2H, d, J = 8 Hz, CO-CH2-NH), 5.38 (1H, broad s, Ar-NH-), 7.20 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.60 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
脱保護される化合物の質量0.25g(0.00068モル)を、CaCl2トラップを付けた丸底フラスコに入れ、7mlのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
TFAを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の0.29gのOF30Bを86%の収率で、ベージュ色の粉末を得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 4.05 (2H, d, J = 8 Hz, CH2-NH3), 4.90 (3H, broad s, NH3), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.70 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H) 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.40 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
ESI-MS: C15H15N3O2 + requires m/z 269.77 [M + H]+, 226.96 [M + H]- High-resolution M.S.E.I. for C15H15N3O2 +. Calculated mass of molecular ion 268.1081 [M + H]+. Measured mass: 268.1083 [M + H]+.
m. p.: 219-222°C.
1 2-(2'-アミノ-5'-クロロフェニル)キノキサゾル-4-ワンの合成
1.1 1,2-ジヒドロ-2-(2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル)キノキサゾリン-4-ワン(参照:VLS 276)の合成
質量2.31g(0.017モル)の2-アミノベンズアミドと3.14g(0.017モル)の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドをエタノール中で1時間還流した。次に混合物を冷却し、得られたオレンジ色の結晶は集めて、減圧下のデシケータで乾燥した。質量3.97gの薄オレンジ色の結晶が収率76%で得られ、測定された融点は234−236℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR:(DMSO) δ 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6’H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3’H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 304.0482
υmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl).
質量9.10g(0.03モル)の2-(2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル)キノキサゾリン-4-ワンを40mlの無水アセトンに溶解し、4.74g(0.03モル)の過マンガン酸カリウムの無水アセトン溶液で処理した。この溶液は、周囲温度で2−3時間にわたって混合物に滴下された。次に、反応はオーバーナイトで撹拌したままにした。過剰なKMnO4は、固体の亜硫酸水素ナトリウムを過剰に加えることによって除去した。次に、溶液をろ過し、蒸発させた。質量2.26gのペールホワイト色の粉末が、収率25%で得られ、測定された融点は276−278℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C14H8ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) δ 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3’H). υmax cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl).
質量4.96g(0.028モル)のSnCl2.2H2Oを、40mlのHClと5mlの氷酢酸の混合物に溶解した。溶液は120℃で還流され、1.34g(0.0044モル)の化合物VL278を小分けにして加えた。混合物は30分間120℃に保たれ、次に2−3時間100℃に下げた。黄色の固体を得て、ろ過により回収し、水に溶解し、4MのNaOH溶液を加えることによってアルカリ化した。淡黄色の沈殿物を収集して、減圧下のデシケータで乾燥させた。質量1.17gの黄色の粉末が、収率98%で得られ、測定された融点は286−288℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR:(DMSO) δ 6.80 (1H, d, J= 8.6 Hz, Ph-H (3’H)), 7.20 (1H, d,d, J=8.6 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 7.30 (1H, s (broad), NH), 7.45 (1H, t, J=8 Hz Ph-H), 7.70 (1H, d J=7 Hz, Ph-H), 7.75 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.90 (1H, d J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.10 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
υmax cm-1 3465 (NH2), 3278 (NH2), 1674 (CO), 1582 (NH), 1560 (C=N), 1159 (C-N), 766 (C-Cl).
2.1 混合酸無水物法(VLS 286 rep)
質量0.50g(0.002モル)のt-Boc-L-Alaは、10mlの無水THF中に溶解された。温度を15℃にし、0.34g(0.0032モル)のNMM(N-メチルモルホリン)を1分間にわたって加え、つづいて0.36g(0.00266モル)のIBCF(イソブチルクロロホルメート)を更に同じ温度で加えた。この添加後、混合物を5−10分間撹拌し、次に極少量(すなわち5ml)の無水THFに溶解した0.55g(0.002モル)の2-(2' -アミノ-5'-クロロフェニル)キノキサゾル-4-ワンを同じ温度で2分間にわたって滴下で加えた。混合物は、2−3時間の氷浴に供され、次にオーバーナイトで周囲温度に置かれた。混合物は、次にNMM塩を除去するためにろ過され、ろ液の体積は、水と炭酸ナトリウムとを含むビーカーに注ぐために減らされた。黄色の固体を回収し、エタノールで再結晶化した。質量0.43gの黄色の粉末を収率50%で得て、測定された融点は268−270℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR:(DMSO) δ 1.20 (9H, s, (CH3)3C), 1.18 (1H, s (broad), NHCO), 1.40 (1H, d, J=7 Hz, CH3), 1.37 (1H, d, J=2 Hz, NH), 4.05 (1H, quartet, J=7 Hz, alaH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, NH-CO(CH3)3), 7.3-7.42 (2H, m, Ph-H), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.65 (1H, d, Ph-H (3’ H)), 8.00 (1H, d, J=7 Hz, Ph-H (4’H)), 8.60 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H), 8.65 (1H, s, Ph-H (6’H)). υmax cm-1 1668 (CONH), 1608 (NH), 1560 (C=N), 1169 (C-N), 722 (C-Cl).
2-(2'-アミノ-5-クロロフェニル)キノキサゾル-4-ワンのt-Boc-L-Ala誘導体は、トリフルオロ酢酸を加えることによって脱保護した。質量0.30g(0.0007モル)の2-(t-Boc-L-Ala-2'-アミド-5-クロロフェニル)キノキサゾル-4-ワンと5mlのトリフルオロ酢酸の混合物を、周囲温度でオーバーナイトで混合した。過剰なTFAを蒸発させ、したがって得られた茶色の固体は減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量0.26g(0.00057モル)のオレンジ茶色の固体が、収率81%で得られ、測定された融点は268−270℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR:(DMSO) δ 1.40 (3H, d, CH3), 3.40 (1H, quartet, H-ala), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.67 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), 7.71 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 7.83 (1H, m, Ph-H), 7.90 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 8.20 (1H, d,d, J=8 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 8.30 (2H, s (broad), NH2), 10.92 (1H, s (broad), NHCO). υma cm-1 1667 (CONH), 1605 (NH), 1560 (C=N), 1435 (CH3), 1181 (C-N), 770 (C-Cl).
1 2-(2' -アミノ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル)-3- フェネチルベンズイミダゾール(または2-(2' -アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3- フェニルエチルベンズイミダゾール)の合成
1.1 2-(2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール(または2-(2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3 -フェニルエチルベンズイミダゾール)の合成
1.1.1 N-フェニルエチル-2-ニトロアニリン(参照:VLS 209)
質量4.8g(0.04モル)の2-フェニルエチルアミンを周囲温度で、5.6g(0.04モル)の2-フルオロニトロベンゼンと11.06g(0.08モル)の無水炭酸カリウムの30mlのDMSO溶液混合物に滴下した。混合物は、3時間100℃に加熱した。混合物は次に周囲温度に冷却して、100mlの水に加えられ、それにより薄オレンジ色の化合物の沈殿となった。固体を濾過によって回収し、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量9.4gのオレンジ色の結晶を収率98%で得た。求められた融点は理論値(すなわち64−66℃)と一致した。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 6.65 (1H, m, Ph-H), δ 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), δ 8.10 (1H, s (broad), NH), δ 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
0.38g(0.01モル)の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、0.52g(0.002モル)のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で磁気的に撹拌しながら加えた。2.42g(0.01モル)のニトロ化合物VLS209のエタノール溶液をこの溶液に加え、つづいて0.76g(0.02モル)の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を加えた。混合物は、周囲温度で窒素下でオーバーナイトで撹拌された。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮し、水を加えた。次に抽出工程を2×20mlのDCMで実施し、有機相は水で複数回洗い、炭酸カリウムを使用して乾燥し、回転蒸発装置で濃縮した。質量1.69gの黒ずんだ油状の液体であって、続いて固体化されたものを収率80%で得た。求められた融点は理論値(すなわち42−44℃)と一致した。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR: (CDCl3) δ 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.27 (2H, s (broad), NH2), δ 3.38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.69 (3H, m, Ph-H), δ 6.82 (1H, m, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H).
8.60g(0.014モル)のオキソン(モノ過硫酸カリウム)を、5.08g(0.024モル)のN-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼンと4.8g(0.024モル)の6-ニトロピペロナールの25mlDMF溶液と1mlの水の溶液に、周囲温度で15分間にわたって磁気的に撹拌しながら加えた。反応が発熱性だったので、混合物を水の槽で冷却し、オーバーナイトで撹拌しておいた。次に水を混合物に加え、DCMで2回連続した抽出を実行した。混合した有機相を複数回水によって洗い、乾燥し(MgSO4)、濃縮して、それにより黄/茶色の粗生成物を得た。エタノールによる再結晶化を、化合物を精製するために実行した。質量6.19gの茶色の結晶を収率67%で得て、測定された融点は162−164℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C22H17N3O4 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 4.20 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 6.02 (1H, s, Ph-H), δ 6.18 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.48 (1H, m, Ph-H), δ 7.65 (1H, s, Ph-H), δ 7.80 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2).
0.11g(0.003モル)の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、0.16g(0.0006モル)のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で加えた。1.07g(0.003モル)のニトロ化合物VLS213のエタノール溶液を加え、続いて0.23g(0.006モル)の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液に加えた。混合物は、周囲温度、窒素下、オーバーナイトで撹拌した。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮され、水を加えた。次に抽出を2×20mlのDCMで実施し、有機相は水で複数回洗い、乾燥し(K2CO3)、回転蒸発装置で濃縮した。質量0.92gの茶色の粉末が収率87%が得られ、測定された融点は170−172℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C22H19N3O2 Calculated mass of molecular ion 358.1550 (M+H)+. Measured mass: 358.1550
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.00 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.35 (1H, s, Ph-H (6’H), δ 6.50 (1H, s, Ph-H (3’ H)), δ 7.00 (2H, m, Ph-H), δ 7.20-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.55 (1H, m, Ph-H), δ 7.85 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 3434 (N-H), 3350 (N-H), 1618 (C=N), 1219 (C-O), 1037 (C-N), 1157 (C-N), 1495 (Ar), 1473 (Ar), 1521 (Ar), 728 (-CH2-).
質量0.50g(0.0026モル)のt-Boc-L-アラニンを10mlの無水DCMに溶解し、0.54g(0.0026モル)のジシクロヘキシルカルボジイミドをこの溶液に撹拌しながら加え、つづいて0.35g(0.0026モル)のヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。混合物は45分間、周囲温度で撹拌したままにし、次に0.65g(0.0019モル)の2-(2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキソランフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール(または2-(2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール)を加え、オーバーナイトで反応を続けた。次の日、混合物をセリットによりろ過し、溶媒を蒸発させ、次に結果として生じる液体を水/氷混合物に注入した。このようにして形成された油状の沈殿物を酢酸エチルに溶解し、NaHCO3の10%溶液で複数回洗い、次に水で洗った。有機相を乾燥し(MgSO4)、濃縮した。このように得られた茶色の固体は、酢酸エチルのHClの飽和溶液を加えることによって脱保護した。沈殿物は、Na2CO3の飽和水溶液と10mlのDCMにより撹拌した。有機相を分離し、乾燥し(MgSO4)、次に濃縮した。質量0.37gの茶色の固体を収率38%で得て、測定された融点は80−82℃であった。
化合物はカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)で精製し、黄/茶色の固体を得た。
NMRによって得られたデータを下に示す:
1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, quartet, ala H), 4.45 (2H, t , J=7 Hz, CH2), 6.04 (2H, s, CH2O2), 6.58 (1H, s, Ph-H (6’H)), 6.85 (2H, m, Ph-H (6H,7H)), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, d,d, Ph-H (5H, 8H)), 8.10 (1H, s, Ph-H (3’H)) , υmax cm-11667 (C=O), 1622 (C=N), 1239 (C-O), 1152 (C-N), 728 (-CH2-).
2-(2'-ニトロフェニル)-3- フェニルエチルベンズイミダゾール:この基質は、2-(2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3- フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成した。収率78%の白色の結晶が得られ、測定された融点は128−130℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C21H17N3O2. Calculated mass of molecular ion 344.1394 (M+H)+. Measured mass: 344.1394. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.07 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-), 4.20 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-N), 6.79 (2H, dd, J=7.67 and 1.24 Hz, Ph-H), 6.85 (1H, dd, J=7.42 and 1.73 Hz, Ph-H), 7.17 (3H, m, Ph-H), 7.36 (2H, m, Ph-H), 7.47 (1H, m, Ph-H), 7.53 (1H, t, J=7.42 Hz, Ph-H), 7.63 (1H, t, J=7.92 Hz, Ph-H), 7.81 (1H, m, Ph-H), 8.17 (1H, dd, J=8.16 and 1.48 Hz, Ph-H). IR: υmax cm-1 1520 (NO2), 1358 (NO2), 1454 (C=N), 1155 (C-N), 746 (-CH2-).
2-(2' -アミノフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール:この基質は、2-(2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された(26頁、28行目)。収率77%の茶色の粉末が得られ、測定された融点は130−132℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C21H19N3. Calculated mass of molecular ion 314.1652 (M+H)+. Measured mass: 314.1652. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.65 (2H, s (broad), NH2), δ 6.80-7.90 (13H, m, Ph-H) IR: υmax cm-1 3417 (-NH2), 3400 (NH2), 1616 (C=N), 1484 (C-H), 1454 (C-H), 1155 (C-N), 733 (CH2), 698 (CH2), 1591 (Ph), 1484 (Ph).
2-(L-アラニル-2' -アミドフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール:この基質は、2-(L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された(29頁、8行目)。収率58%の黄/茶色の粉末が得られ、測定された融点は80−82℃であった。
NMRによって得られたデータを下に示す:
High-resolution M.S.E.I for C25H24N4O3. Calculated mass of molecular ion 429.1921 (M+H)+.Measured mass: 429.1926. 1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, q, J=6 Hz, ala-H), 4.45 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 6.04 (2H, s, -CH2O2-), 6.58 (1H, s, C6'-H), 6.85 (2H, m, C6-H, and C7-H), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, dd, J=7 Hz, J=2 Hz, C5-H, C8-H), 8.10 (1H, s, N-H) , IR υmax cm-1 2918 (-CH2-), 2850 (CH3), 1675 (C=O),1625 (NH2), 1622 (C=N), 1152 (C-N), 749 (-CH2-), 1476 (Ar), 1455 (Ar), 1034 (C-N), 1365 (CH3).
a)基質の合成
・基質No.1−2-(L-アラニル-2'-アミドフェニル)ベンゾオキサゾール −VLS206
・基質No.2−2-(β-アラニル-2'-アミドフェニル)ベンゾオキサゾール −OF22A
・基質No.3−2-(グリシル-2'-アミドフェニル)ベンゾオキサゾール −OF30B
・基質No.4−2-(L-アラニル-2'-アミドフェニル)-5-クロロベンゾオキサゾール ― 35
・基質No.11−2-(β-アラニル-2'-アミド-4',5'-ジメトキシフェニル)ベンゾオキサゾール −OF24A
・基質No.12−2-(L-アラニル-2'-アミドフェニル)ベンゾチアゾール −OF38A
・基質No.18−2-(β-アラニル-2'-アミドフェニル)ベンゾチアゾール −OF33A
・基質No.19−2-(L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル)ベンゾチアゾール
・基質No.16−2-(L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキソラン)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール(または2(L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール
・基質No.14−2-(L-アラニル-2'-アミドフェニル)-3-フェニルエチルベンズイミダゾール(= VLS237)
・基質No.1、2、4及び11は、実施例1の2-(グリシル-2'-アミドフェニル)ベンゾオキサゾール(基質No.3)の合成に類似した方法で合成された。
同様に、基質No.17と18は、実施例1の2-(L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル)ベンゾチアゾール(基質No.19)の合成に類似した方法で合成された。
40mgの各基質は、4mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解する。この溶液は、前もってオートクレーブされた400mlのコロンビア寒天にすっかり混ぜられ、50℃に溶解して保たれる。従って、各基質の最終濃度は、100mg/lである。各々の培地を、90mmシャーレに、シャーレつき20mlの割合で分配する。
c)接種とインキュベーション
コレクションに由来する、バクテリアと酵母のさまざまな種類に属する18の微生物菌株は、10μlの1/20に希釈された0.5マクファーランドの懸濁液の半定量的隔離によって、これらの培地に接種される。培地は37℃で24時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは360−365nmのUV照射下で視覚的に調べられる。
d) 結果の記録
得られた結果を表2と表3に示す。
基質1、2及び3の場合、それらはPが異なるだけだが(それぞれL-アラニン、β-アラニンとグリシン)、同じ菌株によって生産される蛍光の強度および/または色は異なっていた。基質1では、全てのグラム陰性菌の菌株(ブルクホルデリア・セパシア 菌株を除いて)は、強い青色蛍光を生じた。2つのエンテロコッカス菌株は弱い青色蛍光を生じ、2つの黄色ブドウ球菌菌株は中程度の緑色蛍光を生じた。一方で、B. セパシア菌株は基質3では中程度の青色蛍光を生じ、基質2では緑色蛍光を生じた。
また、これらの結果は、Pが一定であるが、X及び/又はR2が変化する場合、蛍光の色、その強度及び毒性が変化したことを示した。これは、基質1、4、17及び19の間で事実であった。したがって、基質4では、緑膿菌(シュードモナス・アエルギノーサ)の菌株は弱い青紫色蛍光を生じ、S.アウレウス菌株では蛍光は検出されなかった。基質17は全てのグラム陽性の菌株と酵母を阻害し、基質19では緑膿菌の菌株は陰性だった。
同様に、Pがβ−アラニンである基質2、11及び18の間では、蛍光の色(放出波長で)、強度と毒性において、大きな違いがあった。
所望の適用に応じて、P、X、R2またはR1は決められるべきである。
例えば、基質1(2-(L-アラニル-2'-アミドフェニル)ベンゾオキサゾール)は、グラム陰性菌(強い青色蛍光)と酵母とグラム陰性菌との間、および後者2つの間で、他からエンテロコッカス属(弱い青色蛍光)とS.アウレウス(中程度の緑色蛍光)を区別できる。また、基質3は、他の微生物からグラム陰性菌(青色蛍光)を区別することを可能にする。
基質19は、他の微生物から特定の腸内細菌(大腸菌、サルモネラ属、エンテロバクター属、モルガネラ属とプロビデンシア属)を区別することを可能にする。
他の置換基、特に他のペプチドの使用は、微生物の他の群を分離することを可能にすることができる。X、R1及びR2基に応じて、蛍光の色と強度の両方、微生物群の検出の感受性または特異性、さらには毒性を変化させることが可能である。特に他の酵素基質と組合せる場合に、これらのバリエーションは非常に有用である。
Claims (13)
- 請求項1に記載の酵素基質であって、
式中
・ XはOであり;
・ R1とR2は無し;
・ Pはペプチドである、
酵素基質。 - 請求項1に記載の酵素基質であって、
式中
・XはOであり;
・R1はClであり;
・R2は無し;
・Pはペプチドである、
酵素基質。 - 請求項1に記載の酵素基質であって、
式中
・XはSであり;
・R1は無し;
・R2は無し;
・Pはペプチドである、
酵素基質。 - 請求項1に記載の酵素基質であって、
式中
・XはSであり;
・R1は無し;
・R2はClであり;
・Pはペプチドである、
酵素基質。 - 請求項1から5の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、反応培地。
- 請求項1から5の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、微生物検出および/または同定培地。
- 請求項7に記載の検出培地であって、更に請求項1から5の何れか一項に記載の基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
- 請求項7または8に記載の検出培地であって、更に請求項1から5の何れか一項に記載の基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
- 微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出するための、請求項1から5の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項7から9の何れか一項に記載の検出および/または同定培地の使用。
- グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、請求項1から5の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項7から9の何れか一項に記載の検出および/または同定培地の使用。
- 微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
a)請求項7から9の何れか一項に記載の検出及び/又は同定培地を用意すること、
b)培地に試験される生物試料を接種すること、
c)これをインキュベートすること、
d)少なくとも1つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。 - バクテリアをグラム陽性菌に属するか又はグラム陰性菌に属するかの点から区別する方法であって、
a)請求項7から9の何れか一項に記載の検出及び/又は同定培地を用意すること、
b)培地に試験される生物試料を接種すること、
c)これをインキュベートすること、
d)少なくとも1つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
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