JP5977355B2 - ペプチダーゼの蛍光発生基質 - Google Patents

Description

本発明は、酵素活性を検出するプローブの技術分野に関する。特に、本発明は、触媒活性を有するペプチダーゼの存在を検出するための新規蛍光発生基質及びその基質を用いた検出方法に関する。

生物学的又は化学的サンプルの分析において、ペプチダーゼ（又はプロテアーゼ）活性の検出は非常に有用である場合がある（非特許文献１）。ペプチダーゼ活性を検出することが可能な生物学的又は化学的サンプルの例として、全ての生物、細胞又は細胞抽出物、生体液又は化学物質混合物が挙げられる。エキソ型又はエンド型プロテアーゼは、膨大な数の酵素からなる酵素群であり、各種病状の多くのバイオマーカーが含まれる。また、上記酵素は多くの良性細胞プロセスに関与しているため、細胞生物学者としては数えきれないほど多くの研究のテーマとなっている。従って、上記酵素を検出することで、例えば特定の代謝又は罹患症状に関する情報が得られる場合がある。

それ故に、ペプチダーゼ活性を検出可能なプローブは非常に有用である。その活性を蛍光を捉えることによって検出することは、単にプローブによって吸光させる際に残りの白色光を回収することに比べてはるかに感度の高い方法である。すなわち、検出閾値ははるかに低い。蛍光発光の検出は非常に適用しやすいため、蛍光プロ―ブは生命科学において非常に魅力的な道具である。例えば、ＥＳＩＰＴ（Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｔｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）と呼ばれる励起状態分子内プロトン移動を生じさせるフルオロフォアの一種が非特許文献２及び３に記載されている。特定のフェノール化合物においてＥＳＩＰＴ現象として見出された強い蛍光を初めて解説したのは、Ｗｅｌｌｅｒ（サリチル酸メチルの場合：非特許文献４）並びにＨｅｌｌｅｒ及びＷｉｌｌｉａｍｓ（ヒドロキシフェニルベンゾオキサゾールの場合：非特許文献５）であるかもしれない。

上記種類のＥＳＩＰＴフルオロフォアは、従来のフルオロフォアと比べて並外れた特性を有するため、生命科学の研究者にとって特に魅力的である。ＥＳＩＰＴフルオロフォアの並外れた特性は以下の通りである。

（ａ）１３０ｎｍを超えることが多く、２５０ｎｍの値にまで達することが可能な大きなストークスシフトを示し、これにより機器を選択することができ、検出感度を最大限にできる。

（ｂ）光退色に対する耐性に優れ、その度合いはフルオレセインのようなフルオロフォアモデルよりも数桁大きい場合もある。

（ｃ）全ての公知のフルオロフォアにおいてまれな特性である固体状態で明るい蛍光を発するというフルオロフォアを設計することが可能である。この性能により、拡散による希釈を最小限にしつつ、プローブの活性化部位において強度の高いシグナルを生成できる。

（ｄ）組織の透明度が最も高くなる赤色光又は近赤外光（６００〜８５０ｎｍ）を発するＥＳＩＰＴフェノール系フルオロフォアを設計することが可能である。対応のプローブは、生きている動物のイメージングに特に適しているだろう。

このようなフルオロフォアをプローブに組み込んだ場合、上記特性の大部分は従来の市販プローブと比べて著しく貢献するであろう。従来の市販プローブでは、小さなストークスシフト及び中〜高度の光退色によって性能が妨げられている他、一切例外なく溶液状態のフルオロフォアとなる。

本発明の範囲内において、本発明者らは、酵素により切断できる単位であって、上述したＥＳＩＰＴフルオロフォアを含み、所望の部位及び組織に到達するための前提条件である完全な水溶性を有する完全なプローブを提供できる単位を好適に選択することに興味を抱いた。このようなプローブがあれば、検出感度は著しく高まり、それにより、毒性の問題を減少させながら用量を低減できるため、特にインビボイメージングの用途に適合させることができる。感度は、（ｉ）光退色度、（ｉｉ）蛍光シグナルの生成部位での蓄積度（従って、この部位からの拡散率、及び、フルオロフォアが沈殿しているか否かを知る問題）、（ｉｉｉ）プローブが作動するリアルオン／オフモード（プローブの自然加水分解による偽陽性シグナルが存在しないこと）、並びに、（ｉｖ）励起スペクトル及び発光スペクトルの重畳度（ベースラインで上記スペクトルが分離していることが最も好ましい構成である（上記項目（ａ）を参照））と密接な関係がある。項目（ｉｖ）はとりわけ特に重要であるが、これは、ベースラインで完全に分離していれば、（考えられるあらゆる波長で分子を励起させる）光源のフィルターに関して、より重要なことには（フルオロフォアにより発せられる全ての波長の光子を回収する）検出器のフィルターに関して広範な選択肢から選択できる機会が得られるためである。また、組織自己蛍光（小さなストークスシフトを有する天然フルオロフォアの特徴）は、同様にストークスシフトが小さい確立されたフルオロフォアにおいて繰り返し見られる問題であるが、項目（ｉｖ）によって、この組織自己蛍光による検出プロセスの撹乱を最小限にできる。

近年、トリガー／結合剤／フルオロフォアの３成分を用い、結合剤として自己犠牲スペーサーを使用した酵素基質の設計に対して関心が高まっている。重要な種類のＥＳＩＰＴフルオロフォアのなかでも、水性／生理的媒体に完全に不溶であり、且つ、固体状態で及び固体状態だけで強い蛍光性を有する点から、２−ヒドロキシフェニルキナゾリノン（ＨＰＱ）に特に関心が集まっている。しかしながら、アシルヒドロラーゼ（エステラーゼ又はペプチダーゼ）の活性に関する情報を提供する分子プローブの設計においてＨＰＱを使用するのは非常に困難である。また、既に設計（及び市販）されたＨＰＱ系プローブの対象とする主要な活性はホスファターゼ及びグリコシダーゼのものである。これは、アシル化されたフェノール性ヒドロキシルを有するＨＰＱ系プローブを安定した状態で生成できないためであって、得られる生成物が急速に自然に加水分解されやすく、言うまでもなく、不溶性の遊離ＨＰＱが放出され、それにより、誤った蛍光シグナル（偽陽性シグナル）が生成されるからである。なお、そのようなアシル化化合物（ＥＬＦ９７エステラーゼ基質（ＥＬＦ９７酢酸塩）及びＥＬＦ９７リパーゼ基質（ＥＬＦ９７パルミチン酸塩））のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓによる販売は２００５年に中断され、幾人かの研究者によるそれらの研究は見過ごされている（非特許文献６）。その理由は、フェノールエステル、特にＥＳＩＰＴフェノールエステルが加水分解に対して本質的に不安定であるからであり、この不安定性は、内部求核剤（イミンの窒素）が加水分解を抗キメラ型に進行させやすくすることでさらに悪化する。

この自己分解を取り除くため、別の解決策、すなわち、ヒドロキシ基の代わりにアミノ基を有するＨＰＱ由来ＥＳＩＰＴフルオロフォアに切り換えることが他のチームによって検討された。この解決策が検討されたのは、カルボン酸エステルの代わりにカルボキサミド結合を形成する対応のアシル化化合物がもはや自然な加水分解をあまり受けそうにないことが知られているためである（非特許文献７並びに特許文献１及び２）。

ところが、この手法には以下の欠点がある。

・（ＨＰＱに存在するような）フェノール単位の代わりにアニリン単位を有し、ＥＳＩＰＴ効果を発現可能なフルオロフォア類似化合物は、大きいストークスシフトが特徴のＥＳＩＰＴバンドをほとんど示さない。最良の事例では、上記フルオロフォアは、ストークスシフトの小さい、従って励起波長に近い発光波長を有する「通常の」フルオロフォアのようにふるまう。さらに、以下の著者は上記化合物が「非蛍光性である」又は「ＥＳＩＰＴ蛍光を示さない」と述べている（非特許文献８及び９）。ＨＰＱと比べて「アニリン」類似体がＥＳＩＰＴ蛍光を示さないこの現象は、本出願の発明者の１人によって「キナゾリノン」群でも確認された（非特許文献１０）。ベンゾ−チアゾール、−オキサゾール又は−イミダゾールの代わりにキナゾリノン（→ＨＰＱ）を用いて実施する利点は、キナゾリノンの優れた不溶性に基づいており、それにより、標的酵素により変換されてフルオロフォアが沈殿する代わりにシグナルが最大化する。この最大の不溶性は、沈殿生成物の結晶格子中のラクタム単位間の２つの分子間水素結合を介した二量化現象によるものである（非特許文献１１）。

・アミノ基がアシル化（非特許文献１２）又はスルホニル化（非特許文献１３）されているため、電子吸引基を有し、常に窒素原子上に水素原子を有するアニリン単位（２−アミノフェニル）を有し、ＥＳＩＰＴ効果を発現可能なフルオロフォア類似化合物は、非アシル化誘導体に比べて強度の高いＥＳＩＰＴ蛍光を示す。従って、上記基を有し、ペプチダーゼを標的とするプローブは、むしろ「オン→オフ」作動モードを示すはずであるが、このモードは、シグナルの強度の減少が初期プローブの変換によるものなのか、単なる拡散によるものなのかを決定しづらいため、あまり魅力的ではない。

また、２０１０年に本出願の発明者の１人は非特許文献１４に、ペプチド配列／スペーサー／ＨＰＱ（上記スペーサーは、ＨＰＱに結合したアシル化されたＯ，Ｏ−アセタール基を含む）の３成分を有する酵素基質を開示した。この試験プローブは生理的条件で比較的安定であるものの、依然として、細胞イメージングの用途で偽陽性蛍光シグナルをもたらす分解率を有している。

インビトロ用途及びインビボ用途で使用する場合の基本的な前提条件である、プローブの自然分解、結果として誤ったシグナルの生成がより顕著に、さらには完全に起こらないことを可能にする解決策が、フェノール系フルオロフォアにグラフト化されたパラ−アミノベンジルスペーサーを使用して提案されている（特許文献３及び非特許文献１５）。上記パラ−アミノベンジルスペーサーは、８０年代の始めからプロドラッグの設計において既に使用されているものの（非特許文献１６、１７及び１８並びに特許文献４）、人工酵素基質においてパラ−アミノベンジルスペーサー（又はその酸素化類似体）を使用すると、タンパク質が、多くの場合触媒部位付近又はその部位内において、持続的にアルキル化されるという大きな欠点があることが知られている。その後、このマイナスの特性は、下記スキーム１に示されるように、酵素を不活性化する基質、すなわち、さらに基質分子を変換することがもはやできない酵素にする基質を提案した多くの文献において活用された。

スキーム１

オルト−又はパラ−アミノ−（又はヒドロキシ−）ベンジル系酵素基質を用いた酵素標識に関する様々な研究から、キノンイミンメチリドは反応性が高く、求核剤をアルキル化し、すぐ近くにある生体巨大分子の分子特性を無作為に変化させる危険性があることが示されている。言うまでもなく、標的酵素の触媒活性化又は触媒能の低下は、酵素増幅作用が失われることから、上記蛍光発生プローブを使用したイメージング実験の感度に非常に悪影響をもたらす。標的酵素を直接不活性化する場合を除き、上記タンパク質又は隣接する他のタンパク質の表面の無作為アルキル化には免疫応答の危険性もある。いずれの場合でも、それぞれの生物体における耐性は限られており、従ってそれら生物体に対して高い毒性を示す。

このような状況に鑑み、本出願人は、１）ＥＳＩＰＴフルオロフォアを含む安定したプローブを、従って未変換のプローブのバックグラウンド蛍光を最小限にしつつ、作製することができ、２）毒性に関して、当該技術分野で公知のアミノベンジルスペーサーと同様な危険性を持たない他のスペーサーを提供することを提案した。本出願人はジアミンスペーサーに興味を持った。第３級フェノール系カルバメートの一部であるジアミンスペーサーは、特異的標的酵素によって変換された後に活性薬剤に変換され得るプロドラッグを作製するために既に使用されている。フェノール系アミノエチルカルバメートは、下記スキーム２に示されるように、２つのアミンが２級アミンである場合、すなわち、それぞれが２つアルキル化されている場合にのみ、生理的条件下でかなり量が犠牲にされることが、プロドラッグ設計分野において周知である（非特許文献１９）。

スキーム２

特許文献５に記載のプロドラッグの設計に関する実験結果から、遠位のアミンが１級（１つのみがアルキル置換基）であって、２級アミンではない場合、スペーサーの犠牲量に悪影響が及ぼされることが明確に示されている。得られた変換率を下記スキーム３に示す。

スキーム３

２つの２級アミンを有する構造では、生理的媒体中、２４時間で９０％の遊離フェノールが犠牲になっているが、１級アミンと２級アミン（第３級カルバメートの一部）を有する構造では、上記条件下で１０％しか変換されていない。

特許文献６で強調されている重要な点は、ほとんどのペプチダーゼ（又はアミダーゼ）が第３級ペプチド結合を認識しないため、２つの２級アミンを有するスペーサー（生理的条件下では変換率９０％）はペプチダーゼを標的とするプロドラッグ中に組み込むのに有用でないことである。長い間確立されてきたこの事実は、ごく最近の研究において、前蛍光性（ｐｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）ペプチダーゼを標的とするプローブによるフェノール系フルオロフォアの放出に関して確かめられている（非特許文献２０）。

国際公開第２００８／１５２３０５号（Ｆａｂｒｅｇａ，Ｏ．；Ｊａｍｅｓ，Ａ．；Ｓａｌｗａｔｕｒａ，Ｖ．Ｌ．；Ｏｒｅｎｇａ，Ｓ．；Ｓｔａｎｆｏｒｔｈ，Ｓ．Ｐ．） 国際公開第２００８／１５２３０６号（Ｆａｂｒｅｇａ，Ｏ．；Ｊａｍｅｓ，Ａ．；Ｓａｌｗａｔｕｒａ，Ｖ．Ｌ．；Ｏｒｅｎｇａ，Ｓ．；Ｓｔａｎｆｏｒｔｈ，Ｓ．Ｐ．） 国際公開第２００８／１４５８３０号 米国特許出願公開第２００３０９６７４３号明細書（Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．） 国際公開第２００７／１４０２７２号 国際公開第２００７／１４２１７２号

Ｂｏｏｎａｃｋｅｒ Ｅ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ Ｃ．Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（２００１）４９，１４７３−１４８６ Ｏｒｍｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ（１９９４）１９，４５−９１ Ｌｅｇｏｕｒｒｉｅｒｅｃ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ（１９９４），１９，２１１−２７５ Ｗｅｌｌｅｒ，Ａ．（１９６１）．Ｆａｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ １，１８７ Ｈｅｌｌｅｒ Ａ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７０）７４，４４７３−４４８０ Ｃ．Ｋｒａｇｅｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．／ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙ ５４（２００５）１１１−１２２ Ｍａｒｉｅ Ｃｅｌｌｉｅｒ，Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｊ．Ｆａｂｒｅｇａ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｆａｚａｃｋｅｒｌｅｙ，Ａｒｔｈｕｒ Ｌ．Ｊａｍｅｓ，Ｓｙｌｖａｉｎ Ｏｒｅｎｇａ，Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｐｅｒｒｙ，Ｖｉｎｄｈｙａ Ｌ．Ｓａｌｗａｔｕｒａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ．Ｓｔａｎｆｏｒｔｈ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９（２０１１）２９０３−２９１０，ｔｉｔｌｅ："２−Ａｒｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ，ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ａｎｄ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ" Ｊ．Ｋ．Ｄｅｙ；Ｓ．Ｋ．Ｄｏｇｒａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．１９９１，６４，３１４２−３１５２ Ｋ．Ｋｕｌｄｏｖ，Ｙ．Ｅｉｃｈｅｎ，Ｐ．Ｅｍｅｌｅ，Ｈ．Ｐ．Ｔｒｏｍｍｓｄｏｒｆｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ７２−７４（１９９７）５１３−５１４ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗａｉｂｅｌ，Ｊｅｎｓ Ｈａｓｓｅｒｏｄｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５０（２００９）２７６７−２７６９ Ｄｉｗｕ，Ｚ．；Ｋｌａｕｂｅｒｔ，Ｄ．Ｈ．；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＳＰＩＥ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＶ（１９９９），３６０２，２６５−２７４ Ｓ．Ｓａｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ ２０００，１０４，４７６−４８２ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｊ．Ｆａｈｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ ２００２，１０６，７６５５−７６６３ Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２０１０），１６，７９２−７９５ Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１９，１７０７−１７１８ Ｗａｋｓｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８３），７，４３９−４４７ Ｃａｒｌ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）２４，４７９−４８０ Ｔｏｋｉ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）６７，１８６６−１８７２ Ｓａａｒｉ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９０）３３，９７−１０１ Ｍｅｙｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．ＯｒｇＢｉｏｍｏｌＣｈｅｍ（２０１０）８，１７７７−１７８０

このような状況に鑑み、本発明の目的は、水性媒体で安定であり、放出されたフルオロフォア自体が蛍光性を有する波長と全く異なる波長では非蛍光性又は蛍光性が弱いままであるが、ペプチダーゼと反応してＨＰＱ等のＥＳＩＰＴに基づく蛍光低分子を生成する新規ペプチダーゼ基質を提供することである。本発明によれば、以下の特性を有するペプチダーゼ基質を提供することが検討される。
・特定のペプチダーゼに対する特異性
・プローブの自然分解により生成される偽陽性シグナルが、特にＯ，Ｏアセタールスペーサーを有するプローブと比較して全く存在しないこと
・良好な犠牲反応速度
・アミノベンジルスペーサーの使用に伴う毒性が認められない生体適合性

すなわち、本発明は、光学異性体若しくはジアステレオ異性体の任意の割合の混合物、又は、光学異性体若しくはジアステレオ異性体が濃縮された形態である、下記式（Ｉ）で表されるペプチダーゼ基質に関する。

（式中、
・Ｒ_０は、カルボキシ末端を介してＮＨ基に結合したペプチジル又はアミノ酸基であり、
・ｎは０又は１であり、
・Ｒ_１は、水素原子又はアミノ酸の側鎖であり、
・Ｒ_５は、対応するフェノール誘導体がＥＳＩＰＴ型フルオロフォアに属するフェノキシ誘導体であり、
・Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は以下の通り：
●Ｒ_２が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基又は水素原子、Ｒ_３が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、且つ、Ｒ_４が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基であるか、又は、
●Ｒ_２が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基又は水素原子、且つ、Ｒ_３及びＲ_４が互いに結合してそれらが結合する炭素原子及び窒素原子と共に脂肪族複素環を形成し、上記複素環は、上記基質の水溶性を高めることができるアンモニウム型、カルボン酸型又はスルホン酸型の基で置換されていてもよいか、又は、
●Ｒ_４が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、且つ、Ｒ_２及びＲ_３が互いに結合してそれらが結合する炭素原子と共に脂肪族炭素環を形成する。）

本発明に係る基質は、蛍光を検出することで特異的酵素活性の有無を明らかにすることが可能な分子プローブのように作用する。具体的には、上記プローブは、標的酵素と出会うまでは目に見えないが（すなわち、「ステルスプローブ」）、上記酵素によって化学修飾されるとカスケード反応によって断片化されて強い蛍光を生じる。上記プローブは、以下の３つの分子成分：ｉ）一方の側に保持されたスマートスペーサー、ｉｉ）もう一方の側の標的酵素の基質、ｉｉｉ）上記断片化により放出されると、対応のフェノール誘導体を形成することでＥＳＩＰＴ型フルオロフォアに属するフェノキシ誘導体からなる。第３級カルバメート基に対して遠位の１級アミン基を有するアミノエチルカルバメートスペーサーに関連する好ましくない犠牲反応速度を克服するために、本発明は、環状尿素へと環化されるよう事前組織化するように置換した新規ジアミンスペーサー群を提案する。この事前組織化によって、酵素による変換時の犠牲プロセスが促進される。さらに、本発明の範囲内で使用されるスペーサーが環化されると、安定性が高く、一般的に生体適合性を有することが知られている尿素が形成される。

この技術革新によって、対応の分子プローブの以下の２つの基本的特性（ａ）及び（ｂ）を得ることが可能となる。（ａ）自然分解、従って、偽陽性蛍光シグナルの生成について影響されなくなること、及び、（ｂ）標的酵素による変換時の断片化反応速度が速くなって生命科学分野での用途に適した性能となること。Ｒ_０基は、標的ペプチダーゼの作用によって基質の残部から切断することが可能であり、これにより中間体が生成され、この中間体が自然に急速に犠牲にされて蛍光シグナルが生成される。

ペプチダーゼ基質のＮＨとＲ_０の共有結合の切断後、スペーサーが環化されて−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_５結合が切断されることで得られる沈殿物によって、蛍光シグナルが生成される。特定の実施形態では、この沈殿物は強い蛍光性を示すが、元のペプチダーゼ基質の蛍光性はあまり高くないか、又は、全く蛍光性を示さない。従って、無傷のプローブはオフ／オンモードで作動する。

別の態様によれば、本発明は、本発明に係る基質によって、触媒活性を有するペプチダーゼの存在を検出する方法に関する。具体的には、本発明は、触媒活性を有するペプチダーゼの存在を検出する方法であって、
・上記ペプチダーゼを含んでいる疑いがあるサンプルを本発明に係る基質と接触させる工程と、
・蛍光沈殿物を形成するのに適した条件を適用する工程と、
・上記蛍光沈殿物を定量又は定性分析する工程とを含む方法に関する。特に、上記検出方法は、生理的条件下、特にｐＨ７．４程度に緩衝された水性媒体中で行ってもよい。

本発明の一実施形態では、上記蛍光沈殿物の分析は、
・上記蛍光沈殿物の吸収波長の光を発生可能な光源に上記蛍光沈殿物を暴露する工程と、
・得られる沈殿物の蛍光を検出する工程とを含む。

走査モードで得た典型的なイメージを示し、６列（１〜６）、４行（Ａ〜Ｄ）の格子で表されるマルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェル中の、インキュベーション４０時間後の酵素により引き起こされた蛍光の強度の空間図を示す。 プローブＩ．１に行った別の実験の高分解能の走査モードで得たイメージを示し、酵素により活性化されたプローブ（ウェルＡ２及びＡ３）がウェルの中心だけでなく端にも沈殿する傾向を示す。 ＰＬＡ酵素の存在下の濃度１８μＭのプローブＩ．２の場合、及び、酵素の非存在下の濃度１００μＭのプローブＩ．２の場合のウェルで測定された蛍光に相当するシグナルＧ（ｔ）を示す。 上記方法で得た、時間に対して示した蛍光シグナルＦ（ｔ）の経時変化であって、ＰＬＡ酵素の非存在下、ｐＨ〜７．６に緩衝された水溶液中の１０μＭ及び１００μＭの化合物Ｉ．１並びに１０μＭ及び１００μＭの化合物Ｉ．２（これら２つのシグナルはほとんど全て重なっている）の蛍光シグナルＦ（ｔ）の経時変化を示す。 上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下の化合物Ｉ．１（３７８μＭ、１００μＭ及び５９μＭ）及び化合物Ｉ．２（１００μＭ及び５９μＭ）、並びに、ＰＬＡの非存在下のそれぞれ１００μＭの両化合物（コントロール）のシグナルＦ（ｔ）を線形スケールで示す。 上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下及び非存在下、各種濃度１０〜１００μＭとなるよう新たに溶解させた化合物Ｉ．１、並びに、ＰＬＡを新たに添加した水溶液中で３週間保管した３７８μＭ（希釈時に元の濃度に従って計算した）の同化合物（≪３週間≫）のシグナルＦ（ｔ）を対数スケールで示す。 上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下及び非存在下、各種濃度１０〜１００μＭとなるよう新たに溶解させた化合物Ｉ．２の場合のシグナルＦ（ｔ）を対数スケールで示す。 上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下の濃度１００、３２及び１０μＭの化合物Ｉ．１及びＩ．２のシグナルＦ（ｔ）を比較しながら対数スケールで示す。

本発明をより詳細に説明する。まず、基質（Ｉ）を定義するのに用いる特定の用語を定義する。

「アルキル」とは、直鎖状又は分枝状であってもよい飽和炭化水素鎖を意味する。（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル（炭素数１〜４のアルキル）基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。

「アリール」とは、フェニル、ナフチル又はシンナミル基を意味する。

「ペプチジル」とは、ペプチド結合を介して互いに結合した２以上のアミノ酸からなる配列を意味する。本発明の範囲内において、Ｒ_０中に存在するアミノ酸は天然アミノ酸であってもそうでなくてもよいが、塩化又は保護された形態であってもよい２０個の天然アミノ酸（＝タンパク質を構成するアミノ酸）から選択されるのが好ましい。末端アミノ酸のＮ末端官能基は、所望により塩化又は官能化されていてもよい。塩化された形態の例としては、塩酸塩、トシレート又はトリフルオロ酢酸塩の形態が挙げられる。

「アミノ酸の側鎖」とは、１級アミノ酸の側鎖を意味する。そのような側鎖の例としては、メチル（アラニンの側鎖）、イソプロピル（バリンの側鎖）、イソブチル（ロイシンの側鎖）、ベンジル（フェニルアラニンの側鎖）基が挙げられる。

「蛍光」とは、所定の波長を有する光で励起される分子がより大きい波長の光を発する特性である。蛍光は、フルオロフォアと入射光子との相互作用により生じる現象である。この過程を励起という。光子が吸収されると、フルオロフォア中の電子がその基底状態を通過して、より高いエネルギー準位に達する。続いて、電子は光子を放出して元の準位に戻る。この過程を蛍光発光という。そして、フルオロフォアは、吸収した光子よりも大きい波長の光を発する。これは、単に、励起状態で存在する間にエネルギーが散逸するため、放出された光子のエネルギーは吸収された光子よりも低いからである。この定義は、国際公開第２００４／０５８７８７号に記載されている。

本発明に係る化合物（Ｉ）は、ペプチダーゼにより触媒される化学反応中に別の基質へと変換されるため、「ペプチダーゼ基質」と呼ぶ。この反応中、化合物（Ｉ）（「プローブ」ともいう）は、特異的ペプチダーゼの作用によって切断されて蛍光沈殿物及び非蛍光生成物となる。

Ｒ_５は、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい１又は複数の不飽和炭素環によってフェニル基が置換及び／又は縮合されたＯ−フェニル基で構成される。−Ｏ−Ｐｈで表されるこのフェノキシ誘導体は、基質に結合していない場合、ＥＳＩＰＴ型フルオロフォアに属するフェノール誘導体ＨＯ−Ｐｈに相当する。Ｒ_５は、このように配列：−ＣＯ−Ｏ−Ｐｈに従ってオキソ橋を介して基質に結合したフルオロフォアＨＯ−Ｐｈに相当する。

基質に結合していなければＥＳＩＰＴフルオロフォアに相当する、−Ｏ−Ｐｈで表されるフェノキシ誘導体Ｒ_５は、例えば以下の好ましい構造（Ａ）又は（Ｂ）に相当するものであってもよい。

（式中、
・Ｔは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールであり、
・Ｒａは、水素、又は、電子吸引基である炭素含有置換基（−ＣＮ若しくは−ＣＯＯＲｄ（Ｒｄは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）等）であるか、又は、Ｒａは−ＣＯＮＲｅＲｆ（Ｒｅ及びＲｆは同一又は異なって水素又は（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）であるか、又は、Ｒａは、−ＣＦ_３、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、（ベンゾ縮合した若しくはしていない）２−イミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イル、又は、キナゾリノン−２−イル基であり、
・Ｒｂは、水素、塩素原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲｇＲｈ又は−ＯＲｇ（Ｒｇ及びＲｈは同一又は異なって（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）であるか、又は、
・Ｒａ及びＲｂは互いに結合して飽和又は不飽和の置換又は非置換四員〜五員炭化水素鎖を形成しており、上記炭化水素鎖には、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子が介在していてもよく、
・Ｒｃは、水素、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ又はＦである。）

（式中、
・Ｔ’は、ＮＨ_２、ＯＨ、アリール基、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、ＳＨ、ＮＨＲ、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＳＲ（Ｒ及びＲ’は（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル又はアリール）であり、
・Ｒａは、水素、又は、電子吸引基である炭素含有置換基（−ＣＮ若しくは−ＣＯＯＲｄ（Ｒｄは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）等）であるか、又は、Ｒａは−ＣＯＮＲｅＲｆ（Ｒｅ及びＲｆは同一又は異なって水素又は（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）であるか、又は、Ｒａは、−ＣＦ_３、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、（ベンゾ縮合した若しくはしていない）２−イミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イル、又は、キナゾリノン−２−イルであり、
・Ｒｂは、水素、塩素原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲｇＲｈ又は−ＯＲｇ（Ｒｇ及びＲｈは同一又は異なって（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基）であるか、又は、
・Ｒａ及びＲｂは互いに結合して飽和又は不飽和の置換又は非置換四員〜五員炭化水素鎖を形成しており、上記炭化水素鎖には、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子が介在していてもよい。）

スペーサーのカルバミル基とは反対側の遊離１級アミノ基が標的ペプチダーゼによって放出されると、スペーサーは自然に環化し、それによりフェノールが放出されるため、蛍光性が強くなる。

特定の実施形態では、本発明に係るペプチダーゼ基質は下記式（ＩＡ）で表される。

（式中、ｎ、Ｒ_０、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、上記（Ｉ）及び（Ａ）の記載と同義。）
特定の実施形態によれば、本発明は、式（Ｉ）（Ｒ_５は（Ａ）又は（Ｂ）基）の化合物及び式（ＩＡ）（Ｒａ＝Ｒｂ＝Ｒｃ＝Ｈ、又は、Ｒａ＝Ｈ、Ｒｂ＝Ｒｃ＝Ｃｌ（Ｒｃは好ましくは窒素原子の位置に対してパラ位）の化合物に関する。他の特定の実施形態によれば、Ｒａ及びＲｂが互いに結合して、本発明に係る基質は下記式（ＩＡ’）又は（ＩＢ’）となる。

（式中、ｎ、Ｒ_０、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲｃは、上記（Ｉ）及び（Ａ）の記載と同義であり、Ｒ’ｃは、水素原子又は−ＣＯＯ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基を表す。）
窒素原子に対してパラ位のＲｃ＝Ｈ又はＣｌの化合物が好ましい。

本発明に係る基質（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＡ’）及び（ＩＢ’）の一実施形態において、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３及びＲ_４は互いに結合して配列：−（ＣＨ_２）_ｍ−（ｍ＝３、４又は５）を形成する。

本発明に係る基質（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＡ’）及び（ＩＢ’）の別の実施形態において、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は同一又は異なって（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、例えばメチル又はエチル等、例えばＲ_２＝Ｒ_３＝Ｒ_４＝−ＣＨ_３等である。

環状尿素へと環化されるようエチレンジアミンスペーサーを事前組織化するこれら２つの方法は、カルバメート基のα炭素上に２つのアルキル置換基を導入するか、又は、カルバメート基の窒素とそのα炭素との結合を複素環中に含ませることからなるものであり、これらの方法により犠牲プロセスが促進される。カルバメート基の窒素とそのα炭素との結合は、例えば、ピロリジン（五員）型又はピペリジン（六員）型に属する複素環に導入される。

これら各種実施形態においては、ｎは０又は１であってもよい。ｎ＝１の場合、Ｒ_１はメチル、イソプロピル、イソブチル又はベンジル基であるのが好ましい。

下記スキーム４に、ｎ＝０の場合の２つの蛍光発生基質例（実施例Ｉ．１及びＩ．２）と、標的ペプチダーゼによる切断により開始されてから上記基質が断片化される一連の反応を示す。

スキーム４

以下の基質Ｉ．３、Ｉ．４及びＩ．５は、ｎ＝０の場合の本発明における他の３つの例である。

ｎ＝１も可能である。この場合、Ｒ_１は水素とは異なることが好ましく、例えばメチル基であってもよい。下記基質Ｉ．６は、ｎ＝１のスペーサー基が、切断しやすいペプチド結合（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒの変換における「Ｐ１」位（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ（１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７（２）：１５７−１６２））のＣ末端のそばの第一アミノ酸残基の側部を模倣したものとなっている本発明における一例である。ｎ＝１の本発明に係るスペーサーを用いて実施する利点は、標的ペプチダーゼの好ましいペプチド配列の第一の「後切断しやすい」側部（アラニンではメチル）も有するプローブのエンドプロテアーゼ（ＰＳＡ等）による分子認識が向上することであり（Ｃｏｏｍｂｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９８，５，４７５）、これにより、変換率が高まり、さらにはある種のエンドプロテアーゼでは何らかの変形が観察される。この部分が存在するとスペーサーの犠牲反応速度に有利であり、それにより、五員（ｎ＝０）スペーサーから六員スペーサー（ｎ＝１）になることによる速度の損失を少なくとも部分的に補える場合があることが強調されよう。さらに、基質Ｉ．６は、生理的媒体中でその沈殿物が有利な粒度を有しているためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社によってＥＬＦ９７技術において使用されているＨＰＱのジクロロ誘導体を構成する。

実施例Ｉ．１及びＩ．２は、通常のＥＳＩＰＴフルオロフォアヒドロキシフェニル−キナゾリノン（「ＨＰＱ」）（米国特許第３１６９１２９号明細書）を構成し、実施例Ｉ．３、Ｉ．５及びＩ．６は、置換様式に応じて最大発光波長が５００〜５５０ｎｍとなるジクロロ−ＨＰＱを構成する。しかしながら、本発明は、実施例Ｉ．４の場合のようにＥＳＩＰＴ現象を生じさせることができる全てのフェノールに適用可能である。これは、ＥＳＩＰＴ蛍光を消す化学作用が同一であり且つ単純であるからである。すなわち、カルバメート基にフェノール性ヒドロキシルを組み込むことによって内部水素結合の形成が妨げられるからである。本発明では、Ｒａ＝Ｒｂ＝Ｈの最も単純なフルオロフォア（Ａ）も使用できる。各種置換を施したより複雑なフルオロフォアを使用することもできる。それらの調製については、例えば欧州特許出願公開第０６４１３５１号明細書や国際公開第２００４／０５８７８７号を参照できる。

以下に、文献に記載されているもので、本発明の範囲内で使用できるＥＳＩＰＴフェノール系フルオロフォアの幾つかの例、それらの励起及び発光の最大値、並びに、それらの量子収率（「ＱＹ」）を列挙する。

１：Ｓｔｅｆａｎｉ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ（１９９２）２０，９７−１０７
２：Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９），１９７−１９８
３ａ：Ｎａｇａｏｋａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）１２２，１５１−１５９
３ｂ：Ｄｏｕｈａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）２１７，６１９−６２５
４：Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）４６，１８０４−１８０７
５：Ｍｏｒｄｚｉｎｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）９０，１４５５−１４５８
６：Ｌｉｎｓ，ｇ．Ｏ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ（２０１０）８４，１１４−１２０
７：Ｓｅｏ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）１９１，５１−５８
８：Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）３２，１５４１−１５５５
９：Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７０）７４，４４７３−４４８０
１０：特開２００４−１４２１３１号公報

従って、Ｒ_５基は、上記ペプチダーゼ基質が、標的ペプチダーゼにより切断された後、ＥＳＩＰＴフェノール系フルオロフォア１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９及び１０から選択されるフルオロフォアＰｈ−ＯＨを放出するように選択できる。

式（Ｉ）、（ＩＡ）又は（ＩＡ’）の化合物中のＲ_０では、ペプチダーゼの基質を構成するありとあらゆるペプチジル又はアミノ酸基を使用できる。アミノ酸は、特にＲ_０のＮ末端において官能化されていてもいなくてもよい。本発明の一実施形態によれば、ペプチジル残基は、同一又は異なっていてもよいアミノ酸を１０以下有する。特定の実施形態によれば、基質のコストの観点から、ペプチジル残基は、同一の又は異なるアミノ酸を６以下有する。ペプチジル残基のアミノ酸は、天然アミノ酸から選択されるのが好ましい。しかしながら、アミノ酸又はペプチジル基のＮ末端は、アシル基−ＣＯＲ”（Ｒ”は（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基又はＯ−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基）で官能化されていてもよい。アシル基（Ｒ”ＣＯ−）による所定プローブのＮ末端の官能化が考慮されるのは、ある種のエンドプロテアーゼが末端に遊離アミノ酸を有する基質と相互作用しないことによる。また、このＮ末端官能化はＲ_０がペプチジル基の場合に好ましく、Ｒ_０がアミノ酸の場合にはそのＮ末端官能基は遊離しているか、又は、好ましくはアンモニウム形態で塩化されている。カルバメートの保護基（本明細書では「アシル」基も構成する）を用いたペプチドの固相合成（ＳＰＰＳ）によって、多くの場合、上記Ｎ末端にカルバメートを有するプローブの合成がより簡単になる。アミノペプチダーゼの場合には、アミノ酸であるＲ_０基を使用することが好ましく、エンドペプチダーゼの場合には、ペプチジル基であるＲ_０基を使用することが好ましい。ｎ＝１であり、Ｒ_１がアミノ酸の側鎖（メチル、イソプロピル、イソブチル又はベンジル基等）を表す実施形態は、Ｒ_０がペプチジル基であり、単一のアミノ酸ではない場合に特に有利である。

例として、以下のペプチジル基が挙げられる。Ｌｅｕ（ロイシンアミノペプチダーゼの場合）、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＨＩＶ−１のペプチダーゼの好ましい切断配列のＮ末端部分）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（カスパーゼ３の場合）、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（前立腺「ＰＳＡ」特異抗原の場合）。あるいは、Ｎ末端は遊離していても、アシル基「−ＣＯＲ”」（Ｒ”は（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基又はＯ−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基）（−ＣＯＭｅ基等）で置換されていてもよい。

ペプチジル又はアミノ酸基は、その適合性に加えて、それを認識する標的ペプチダーゼの公知の配列選択性に基づいて選択される。ペプチジル又はアミノ酸基は、特に表１に示されるように、特定の疾患に関与するペプチダーゼがその疾患に対して示す好ましい作用に基づいて選択されてもよい。

実施例Ｉ．１〜Ｉ．６は、２つの異なる種類に属する各ペプチダーゼ：エキソペプチダーゼ、具体的にはアミノペプチダーゼ（Ｉ．１〜Ｉ．４ではロイシンアミノペプチダーゼＥＣ３．４．１１．１）、及び、２種のエンドペプチダーゼ（ａ）カスパーゼ−３（Ｉ．５ではＥＣ３．４．２２．５６）；（ｂ）ＰＳＡ＝≪カリクレインＩＩＩ≫（Ｉ．６ではＥＣ３．４．２１．３５）を標的とする。エキソペプチダーゼがペプチド鎖の末端からアミノ酸残基を１つしか切断できないのに対し、大部分のエンドペプチダーゼはペプチド主鎖内のペプチド結合を切断する真性プロテアーゼであるため、配列の特異性がより大きい又は小さい。カスパーゼ−３の好ましい切断配列は、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−−−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−である。蛍光発生プローブを形成するには、好ましい配列のＮ末端部分（切断しやすいペプチド結合の左側）、すなわち、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（又は、１語コードではＤＥＶＤ）のみペプチダーゼに供すれば充分であるが、この場合、触媒的変換率が徐々に損なわれることになる。しかしながら、カスパーゼによりＤＥＶＤを認識させるには、Ｎ末端はアセチル化するのが望ましい。遊離アミノ末端は酵素による認識を無効にし得るからである。

本発明に係る基質（Ｉ）は、下記式（ＩＩ）のアミン：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は、式（Ｉ）の基質の記載と同義であり、Ｒ’_０は、式（Ｉ）の基質の記載と同義のＲ_０基、又は、最も多くの場合、含まれるアミン又は酸官能基が保護されている上記Ｒ_０基を表す。）
を下記式（ＩＩＩ）の塩素化誘導体：

（式中、Ｒ_５は、式（Ｉ）の基質の記載と同義。）
でカップリングし、場合によってはその後、置換基Ｒ’_０のアミン又は酸官能基を脱保護してＲ_０とすることによって得ることができる。

このようなカップリングは特にトリエチルアミン等の塩基の存在下で行ってもよい。

保護反応及び脱保護反応は当業者に周知の方法に従って行う。アミン及び酸官能基の保護は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ Ｐ．Ｇ．Ｍ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００６、及び、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ，Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ Ｐ．Ｊ．，１９９４，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇに記載のもの等、当業者に周知の、アミン又はカルボン酸を一時的に保護する基によって実施されることとなる。

アミン、特にアミノ酸鎖又はペプチジル残基の末端に位置するアミンを保護する基の例としてはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基が挙げられ、酸官能基を保護する基の例としては、中間体としてエステルを形成するｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。

後述の実施例において化合物（ＩＩ）の合成例を幾つか詳細に説明するが、この実施例によって当業者は類推して実施することができよう。化合物（ＩＩＩ）の調製においては、文献に既に記載された対応のフェノール、さらには市販のフェノールから例えばトリホスゲンの作用などによって上記化合物を得ることもできる。

本発明に係る各種化合物は、特に明記しない限り、考えられるあらゆる光学異性体又はジアステレオ異性体の形態であってもよく、場合によっては任意の割合の混合物であってもよい。特定の実施形態においては、不斉炭素を含む本発明に係る化合物はラセミ体であり、Ｒ体及びＳ体はほぼ等しい比率である。別の実施形態によれば、本発明の式（Ｉ）の化合物は、ジアステレオ異性体過剰率又は鏡像体過剰率が８０％超、さらには９５％超、さらには純粋な異性体の形態、すなわちジアステレオ異性体又は鏡像体過剰率が９９％超である、ジアステレオ異性体又は鏡像体が濃縮された形態であってもよい。

化合物（Ｉ）は、従来の分離法によって、ジアステレオ異性体又は鏡像体が濃縮された形態で単離される。例えば、光学活性な酸又は塩基を使用してラセミ塩の分別再結晶化を行ってもよく、この原理は周知である。あるいは、最も多くの場合、キラル相又は非キラル相での従来のクロマトグラフ法を行ってもよい。

本発明によれば、例えばＨＰＱ型（又はＨＰＱ類似体）等のＥＳＩＰＴフルオロフォアを使用して蛍光イメージングによってペプチダーゼ活性を知ることができる。自然分解（すなわち、生理的媒体中、標的ペプチダーゼの非存在下）による偽陽性シグナルは観察されない。プローブ自体は、特に、検出／イメージング機器が調整される遊離ＥＳＩＰＴフルオロフォアの発光波長において蛍光性があまり高くないか、又は、全く蛍光性がない（本質的に蛍光性がない）。従って、プローブはオフ／オンモードで作動するため、このプローブを使用して最大感度の分析法を開発することができる。本発明では、エキソ−（アミノ−）ペプチダーゼだけでなく、特定のアミノ酸配列に対して高い選択性を有するエンドペプチダーゼも標的とすることができる。これは、スマートスペーサーの末端に特定のエンドプロテアーゼの特異的ペプチド配列をカップリングすることにより可能である。

さらに、本発明は、本発明のプローブは生理的条件下で自然分解が全く見られないため、偽陽性蛍光シグナルをほとんど全く生成しないという特徴を有する点で、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．−Ｂ．，Ｗａｉｂｅｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｓｓｅｒｏｄｔ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２０１０），１６，７９２−７９５と比べて改善されている。Ｒ_０を担持する窒素原子が、アルキル基ではなく水素を担持する場合（ほとんど例外（プロリダーゼ）なく２級ペプチド結合のみを切断し、３級ペプチド結合は切断しないペプチダーゼを標的とするのに必要である）、ジアミンスペーサーの遅い犠牲反応という技術的障害を克服できる。結果として生じる環化速度の損失（Ｓａａｒｉ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（上記参照）によれば、１０倍）は、環状尿素を形成するようジアミンスペーサーを事前組織化すること（ＥＳＩＰＴフルオロフォアの放出をもたらすプロセス）によって相殺される。スペーサーの事前組織化による環化速度の大きな増加は、２つの独立した分子系において本出願人によって既に確認されている（Ｗａｉｂｅｌ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．−Ｂ．，ａｎｄ Ｈａｓｓｅｒｏｄｔ，Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２００８）３１８−３２４、及び、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．，Ｗａｉｂｅｌ Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｓｓｅｒｏｄｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１０）１６，７９２−７９５）。最初の文献では、生理的条件下の断片化は瞬間的であり、次の文献では非常に早かった。しかしながら、２つの系とも、フェノールに第３級カルバメートが結合していることによる恩恵を受けておらず、依然として生理的条件下で分解する。

本発明の基質は、他の公知の蛍光発生酵素基質と比べて細胞膜への浸透性が良好であることによる恩恵を受けており、容易に細胞内に進入することができ（Ｄｕｈａｍｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７５（２００８）２６９−２７８と比較）、その結果、本基質は非常に様々な細胞において各種用途に使用することができる。さらには、本発明に係る基質は、通常可溶性であるが、水に溶解した状態では蛍光性があまり高くないものの（本質的に蛍光性）、上記基質と対応のペプチダーゼとを含む水溶液中では蛍光性の高いシグナルを発する。ＨＰＱの場合、ＨＰＱはほとんどの溶媒、特に水性媒体に高度に難溶性であるため、この蛍光シグナルは、ペプチダーゼの作用により形成される沈殿物から固体状態で発せられる。他のＥＳＩＰＴフルオロフォアも水性媒体中の溶解性はあまり高くないが、そのほとんどは沈殿したとしても蛍光発光能を保持している。ペプチダーゼによる加水分解時に蛍光沈殿物を形成するのに適した条件は、緩衝媒体や生理的媒体等の純粋な水性媒体である。重要な点は、ペプチダーゼによる加水分解時に、ペプチダーゼ活性を損なうことなく沈殿物が形成されることである。そうすれば、生物学的サンプルでの局在研究や、非変性ＰＡＧＥ法及びウエスタンブロットトランスファー法での分離バンドの検出において使用できる。使用できる検出条件及び検出方法に関する詳細は、国際公開第２００４／０５８７８７号及び欧州特許出願公開第０６４１３５１号明細書に記載されており、そのまま本発明に適用することができる。

本発明に係るプローブは、生命科学分野の高感度を要する多くの用途、特に以下の用途にとって魅力的である。（１）ゲロースプレートの細菌コロニーにより発現されるペプチダーゼ活性の高収率スクリーニング（コロニーの分析）；（２）生体液中のペプチダーゼのインビトロ検出（血液学的検出等）；（３）フローサイトメトリーにおける単一細胞としてのペプチダーゼ活性の観察；（４）培養細胞中の細胞内ペプチダーゼの検出（共焦点蛍光顕微鏡観察）；（５）（組織レベルでの）ペプチダーゼの組織化学的検出；最後に、（６）動物の全身のインビボイメージング。本発明に係るプローブは、既存のものよりロバスト性の高いプローブを作製する分野の当業者が求める要件を満たすものである（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００６）Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ）。特に、急成長するインビボ分子イメージング分野では、充分なロバスト性を有するとともに、分子的複雑性が抑えられているためコストを抑えて製造できるスマートなステルスプローブが乏しい（Ｂａｋｅｒ，Ｍ．（２０１０）．Ｗｈｏｌｅ−ａｎｉｍａｌ ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｐｉｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４６３，９７７−９８０）。

従って、本発明に係るペプチダーゼ基質には多くの用途が考えられる。そのような用途の例として以下のものが挙げられる。

（ａ）細菌コロニーの分析設計。ここでは、マルチウエルプレートのウェル等の分離された区画中に積極的に分離することなく最大３０００コロニーを識別できるゲロースプレート（ペトリ皿）で行う。従って、（１）一連の細菌細胞株から所望の病原性細胞株を同定可能な臨床サンプルの試験を設計すること、（２）通常の細菌宿主（多くの場合、市販の宿主）により発現される固有の一連のタンパク質の大量の平行試験を行うことが可能である。このタンパク質群には、言うまでもなく、所望の特定のタンパク質、例えば特定のアミノ酸配列に対して選択性を有するプロテアーゼ、又は、非天然カルボキサミド結合を加水分解するプロテアーゼ等が含まれてもよい。一般的にはタンパク質、特に酵素を指示通り開発する分野では、１０^６を超えがちな非常に多くのタンパク質変異体をスクリーニングするために効率的で感度の高い分析を行うことが強く望まれている。本発明に係るプローブは、ゲロース溶液に溶解してから、ゲル化させるプレートに注ぐことによってより簡単に適用することができる。別の方法としては、フィルターを浸漬してからコロニーに押し付けることによって、基質をコロニーとともにインキュベーションする。そのようなコロニーの分析に対して本発明に係るプローブが貢献する主な利点は、フルオロフォアのその場沈殿であり、従って、拡散による蛍光シグナルの希釈が大いに減少するため、より長い間インキュベーションすることができ、その結果、分析の感度が高くなる。ＨＰＱ（約１４０ｎｍ）又はＨＰＱ類似体の非常に大きいストークス変位を充分に評価しないままにすべきではない。このストークス変位もまた優れた感度に貢献し、生物学的サンプルに由来する天然の蛍光と区別しやすくするからである。

（ｂ）インビトロ（組織学）及びインビボイメージング。遊離ＨＰＱ及びＨＰＱ類似体の非常に低い溶解性を考慮すれば、複雑な生物学的環境でこれらが放出された場合、いかなる場合でも、高度に空間的に制御しつつ蛍光イメージングを行うことができる。蛍光イメージングは、細胞内構造を識別するために広く用いられている技術である。本発明に係るプローブを使用して特異的ペプチダーゼ活性を高分解能で探知（位置決定）することが可能である。

一方、受動的蛍光プローブ（酵素により変換されないもの）は、細胞受容体の特異的リガンドに取り付けられて、非共有相互作用によって上記受容体に結合する。その結果、シグナルに希釈の影響が全く及ぼされることがないということはない。とりわけ、最良の受容体は蛍光マーカーに等しい。このようなプローブを用いた分析の感度は、シグナルの触媒的増幅の恩恵を受ける活性プローブよりも必然的にはるかに低い。

また、本発明に係るプローブは、巨視的な蛍光イメージング、すなわち生物体全体の蛍光イメージングに使用することもできる。プローブが細胞壁を貫通して所望のペプチダーゼ活性が得られれば、遊離フルオロフォアの放出において、細胞外空間に存在することでシグナルが急速に希釈されるといったことがなくなる。これにより、通常は、イメージング前により長くインキュベーションすることができるため、発現される触媒活性が弱い場合には特に有用である。

本発明に係るペプチダーゼ基質は、以下の実施例に詳述する公知の方法で調製することができる。例えば、保護されていてもよいペプチジル又はアミノ酸基をスペーサー基にグラフト化してもよい。フルオロフォアをそのフェノール性ヒドロキシルを介して導入するカップリング工程後、ペプチジル又はアミノ酸基を脱保護してもよい。その結果得られる完全なプローブを従来の方法で精製してから使用してもよい。

以下の実施例によって本発明を説明するが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。

基本
６０メッシュシリカゲル（４０〜６３μｍ）を使用してカラムでのクロマトグラフィーを行った。^１Ｈ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、特に明記しない限り、重水素化クロロホルム中、それぞれ２００．１３ＭＨｚ及び５０．１３ＭＨｚで記録した。化学シフト（δ）は、ｐｐｍで表し、テトラメチルシランを参照物質として又は溶媒の残留シグナルに従って記載した。以下の略号を使用した。ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード。ＮＭＲ結合定数（Ｊ）はヘルツで表した。蛍光分析は、黒色ポリプロピレン製９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）又は３８４ウェル（ＮＵＮＣＬＯＮＥ、Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．）プレート中で行い、マイクロプレートを備えた蛍光光度計（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で記録した。明記しない限り、薬品は分析試薬品質のものを購入し、さらに特に精製することなく使用した。

市販の無水ＴＨＦ及びＤＣＭを、アルゴン下、活性アルミナのカラム（ＧＴ Ｓ１００ Ｓｏｌｖａｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に通液して脱水及び精製した。水素化カルシウムを使用してトリエチルアミンを蒸留し、ＫＯＨタブレット上に保持した。無水試薬と記載した他の試薬は分子篩によって脱水した。特に明記しない限り、全ての反応は、市販の溶媒及び試薬をさらに特に脱水又は精製することなく使用して空気雰囲気中で行った。精製装置Ｅｌｇａ Ｐｕｒｅｌａｂから得たＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水を全ての実験で使用した。

以下の略号を使用する。
Ｍｅ＝メチル
Ｅｔ＝エチル
ｃｂｚ＝カルボベンゾキシ
ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＤＣＣ＝ジサイクロヘキシルカルボジイミド
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ｐＴｓＯＨ＝パラトルエンスルホン酸
ＥＡ＝酢酸エチル
Ｃｙ＝シクロヘキサン
ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヘドロキシベンゾトリアゾール
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
Ｌｅｕ＝Ｌ−ロイシル
ＢｏｃＬｅｕ＝Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシル
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３，５−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＤＱ＝２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン
ＤＣＵ＝ジ−サイクロヘキシル尿素
ＰＬＡ＝ミクロソームロイシンアミノペプチダーゼ

実施例Ｉ．１
以下のスキーム５に記載されるように基質Ｉ．１を調製する。

スキーム５：実施例Ｉ．１の化学合成

ａ）ＢｏｃＬｅｕＯＨ，ＤＣＣ；ｂ）トリホスゲン；ｃ）トリエチルアミン；ｄ）ｐＴｓＯＨ

化合物ＩＩ．１の調製：
ＢｏｃＬｅｕＯＨ（４．３８５ｇ，１９．０ｍｍｏｌ；市販；Ｆｌｕｋａ，１５４５０，≧９９．０％）を無水雰囲気下、無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に完全に溶解した後、氷浴により混合液の温度を０℃まで下げる。幾らかＤＣＣ（３．９５ｇ，１９．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を５分間撹拌した後、アミノメチルピペリジン（２．１１ｇ，１８．５ｍｍｏｌ；市販；Ａｌｄｒｉｃｈ ６５６５１８，９７％）を添加する。混合液を氷浴から外して室温に戻す。２４時間撹拌した後、白色固体として沈殿したＤＣＵを多孔度３のフリットで濾別し、固体をＤＣＭでゆすぐ。得られた黄色溶液を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３で洗浄してから、０．５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ＞１０）で洗浄し、その後、塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、Ｎａ_２ＳＯ_４を濾別し、蒸発させて、黄色油状物（６．６ｇ）を得る。この油状物を一晩４℃に保持すると、ＤＣＵが沈殿し、これを上記と同様にして分離する。未精製物のＮＭＲスペクトルから、ＤＣＣカップリングの通常の寄生物質、すなわちアミノ酸でアシル化されたＤＣＵによってほんの少しだけ汚染されているものの、ほとんど純粋な所望の生成物の存在が示される。ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ勾配（１：１：０→１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ））でシリカカラムにより精製すると、無色固体として純粋な生成物ＩＩ．１（２．７０３ｇ；４２％）が得られる。ＮＭＲスペクトルから、（ａ）ピペリジン環に不斉中心があるためにモル比１：１で２つのジアステレオ異性体の存在が示され、（ｂ）上記スペクトルは、環の各種構造異性体が存在するため複雑化しているように思われる。

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．０９−６．８１（（ｓ，ｂｒ＋ｓ，ｂｒ），１Ｈ），５．７０−５．３４（（ｓ，ｂｒ＋ｄ，ｂｒ，７．６Ｈｚ），１Ｈ），４．０８−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．３１−３．１５（ｍ，１Ｈ），３．１１−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．４４（ｍ，２Ｈ），２．１４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，溶媒及び濃度感受性シフト，ＮＨ），１．７６−１．４１（ｍ，６Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．３２−１．００（ｍ，３Ｈ），０．８８（ｄ，２．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｄ．２．４Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：ジアステレオ異性体１：１７３．０；１５５．７；７９．６；５５．８；５３．２；４６．５；４５．０；４１．３；３０．１；２８．３（×３）；２６．３；２４．７；２４．２；２２．９；２２．０；ジアステレオ異性体２：１７３．１；１５５．８；７９．７；５５．５；５３．２；４６．５；４５．１；４１．２；３０．２；２８．３（×３）；２６．２；２４．７；２４．２；２２．９；２２．０ｐｐｍ．ＨＳＱＣ，ＣＯＳＹ及びｊｍｏｄスペクトルによりシグナルの帰属が完成する。
ＨＲＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）［Ｃ_１７Ｈ_３４Ｎ_３Ｏ_３］^＋＝［ＭＨ］^＋からの計算値：ｍ／ｚ＝３２８．２５９５，実測値３２８．２５８９．

化合物Ｉ．７の調製：
無水アルゴン雰囲気下、ＨＰＱ（７６ｍｇ；０．３２ｍｍｏｌ）を入れた二つ口フラスコ中に、無水ＴＥＡ（５７ｍｇ；０．５６ｍｍｏｌ；１．８当量）及び無水ＤＣＭ（１．２ｍＬ）を投入し、混合液を０℃に冷却する。撹拌下、トリホスゲン（１２４ｍｇ；０．４２ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（１．２ｍＬ）溶液を迅速に注入する。混合液を０℃で４０分間撹拌してから２５℃で２０分間撹拌した後、２つの液体窒素トラップで保護したベーンポンプによって蒸発乾固する。得られたベージュ色固体を、化合物ＩＩ．１（１９ｍｇ；０．０５８ｍｍｏｌ；０．２当量）を無水ＴＥＡ（１０１ｍｇ；１ｍｍｏｌ；３当量）及び無水ＤＣＭ（１．２ｍＬ）に溶かして得た溶液で室温下、処理する。オリーブ様緑色の溶液を２時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ_３に注ぐ。水相をＣＨＣｌ_３で抽出し、有機相を回収し、飽和ＮａＨＣＯ_３と塩水とで洗浄した後、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、Ｎａ_２ＳＯ_４を濾別し、蒸発乾固する。残渣をＣＨＣｌ_３に溶かし、Ｃｅｌｉｔｅで２回濾過して、ＨＰＱの残部を除去し、濾液を蒸発させて、緑色をおびたペースト状固体（７０ｍｇ）を得る。シリカカラムにより精製（ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ勾配、２：２：０→２：２：１（ｖ：ｖ：ｖ））すると、純粋な化合物Ｉ．７（１５ｍｇ；０．０２５ｍｍｏｌ；４４％）が得られる。ＮＭＲスペクトルから、（ａ）ピペリジン環に不斉中心があるためにモル比１：１で２つのジアステレオ異性体の存在が示され、（ｂ）上記スペクトルは、環の各種構造異性体（１核当たり最大４つの共鳴が生じる）が存在するため複雑化しているように思われる。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．６０（ｓ，ｂｒ；０．５Ｈ）；８．３６−７．９２（ｍ，２Ｈ）；７．８９−７．７８（ｍ；２．５Ｈ）；７．５８−７．４７（ｍ；２Ｈ）；７．３９−７．３５（ｍ；１Ｈ）；７．３１−７．１５（ｍ；１Ｈ）；６．８６−６．８１（ｍ；０．１Ｈ）；５．６６−５．６０（ｍ；０．１Ｈ）；５．０５−４．８８（ｄ，ｂｒ＋ｄ，ｂｒ；８．５＆６．５Ｈｚ；１Ｈ；ＮＨ_{カルバメート}）；４．７１−４．６６（ｍ；０．８Ｈ）；４．４６−４．３４（ｍ；１Ｈ）；４．２０−３．９４（ｍ；１Ｈ）；３．８７−３．５１（ｍ；１Ｈ）；３．４３−２．８９（ｍ；２Ｈ）；１．７７−１．４３（ｍ；９Ｈ）；１．０９−０．８４（ｍ，１５Ｈ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７４．６；１７４．０；１７１．３；１６３．４；１６２．９；１５６．１；１５５．７；１５３．５；１５２．８；１５１．５；１５１．２；１４９．９；１４９．７；１４９．６；１４９．４；１３４．９；１３４．９；１３４．８；１３２．１；１３１．９；１３０．７；１２９．８；１２８．３；１２８．０；１２７．１；１２６．８；１２６．６；１２６．３；１２６．１；１２４．６；１２３．１；１２１．１；１２０．９；７９．８；５４．４；５３．１；５２．６；５０．８；４３．６；４１．６；４１．３；４１．２；３９．９；３９．８；３９．７；３８．８；２９．４；２８．３；２８．２；２８．０；２７．１；２６．９；２５．６；２５．３；２４．９；２３．０；２２．３；１９．６；１９．３ｐｐｍ．

ＨＲＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ^＋）［Ｃ_３２Ｈ_４２Ｎ_５Ｏ_６］＋＝［ＭＨ^＋］からの計算値：ｍ／ｚ ５９２．３１３０；実測値５９２．３１２３．

化合物Ｉ．１の調製：
ｐＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ（６１ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を添加した無水エタノール（１０ｍＬ）に化合物Ｉ．７（１７４ｍｇ；０．２９４ｍｍｏｌ）を溶解し、アルゴン雰囲気下に置き、８時間８０℃に加熱する。反応後にＴＬＣ（ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ＝１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）；ＵＶ及びニンヒドリン）を行う。微量のＨＰＱスポットが現れる場合もある。未精製溶液をシリカカラムで精製し、微量のＨＰＱ（ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ＝１：１：０（ｖ：ｖ：ｖ））、残留した微量のＩ．７（ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ＝１：１：０．１５（ｖ：ｖ：ｖ））及び固体（１４９ｍｇ）状の未精製生成物Ｉ．１（ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ＝１：１：０．３（ｖ：ｖ：ｖ））を連続して得る。この生成物はＵＶランプ下でわずかに青色の蛍光を発する。水を用いて摩砕して過剰量のＴｓＯＨをできる限り除去し、固体残差（１０７ｍｇ）から得た^１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、Ｉ．１：トシレートがモル比１：１で示される。この固体の水溶性はあまり高くないが、ＭｅＯＨ（０．６ｍＬ）に容易に溶解させた後、沈殿の恐れなく水で希釈することができる。ＮＭＲスペクトルから、（ａ）ピペリジン環に不斉中心があるためにモル比１：１で２つのジアステレオ異性体の存在が示され、（ｂ）上記スペクトルは、上記環の各種構造異性体（１核当たり最大４つの共鳴が生じる）が存在するため複雑化しているように思われる。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２０（ｄ；８．１Ｈｚ；１Ｈ）；７．９４（明白なｔ；７．９Ｈｚ；１Ｈ）；７．７７−７．７０（ｍ；３Ｈ）；７．６８−７．６５（ｍ；１Ｈ）；７．５１−７．４７（ｍ；１Ｈ）；７．３６−７．３２（ｍ；１Ｈ）；４．５２−２．７７（ｍ；６Ｈ）；１．６５−１．２２（ｍ；９Ｈ）；０．８１−０．７０（ｍ；６Ｈ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：δ＝１７０．５；１７０．３；１６２．３；１６２．２；１５４．１；１５３．９；１５３．８；１４８．２；１４８．１；１４１．７；１４１．３；１３７．１；１３７．１；１３５．１；１３４．８；１３０．２；１３０．２；１２９．６；１２７．０；１２３．６；１２３．４；１２３．３；１２２．４；１２２．３；１２２．１；１２２．０；１１９．２；５２．０；５１．９；５１．６；５１．４；５０．９；４０．５；４０．０；４０．０；３９．９；３８．２；２５．８；２５．０；２５．０；２４．５；２３．９；２３．９；２１．８；２０．９；２０．８；１８．２；１８．０ｐｐｍ．

ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ ４９２．３：［ＭＨ］^＋．ＭＳ（ＥＳＩ，ネガティブモード）：ｍ／ｚ ４９０．２：［Ｍ−Ｈ］⁻．

ＮＭＲスペクトルは同じだが、化合物Ｉ．２の調製とほぼ同様にして調製（ここでは、化合物Ｉ．８の代わりに化合物Ｉ．７を使用）したサンプルに対して、カチオンのＨＲＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ^＋）分析を行った。この際の［Ｃ_２７Ｈ_３４Ｎ_５Ｏ_４］^＋＝［ＭＨ^＋］からの計算値：ｍ／ｚ ４９２．２６０５，実測値４９２．２５９２．

実施例Ｉ．２
アミノメチル−ピペリジン（市販化合物）の代わりに、まずＮ^２−２−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（１３）を文献の好適な方法に従って３工程で合成しなければならないことを除き、上記基質Ｉ．１と同様にして基質Ｉ．２を合成する。

スキーム６：実施例Ｉ．２の化学合成

ａ）Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５，Ｈ_２Ｏ；ｂ）ＣＨ_３ＮＨ_２；ｃ）ＬｉＡｌＨ_４；ｄ）ＢｏｃＬｅｕＯＨ，ＤＣＣ；ｅ）トリホスゲン；ｆ）ＴＥＡ；ｇ）ＴＦＡ

化合物（１１）の調製：（アセトンシアンヒドリン；Ｆａｇｈｉｈｉ，Ｋ．；Ｚａｍａｎｉ，Ｋ．；Ｍｉｒｓａｍｉｅ，Ａ．；ＲｅｚａＳａｎｇｉ，Ｍ．，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．２００３，３９（２），２４７−２５４の応用）
メタ重亜硫酸ナトリウム（１１ｇ，５８ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）を穏やかに攪拌しながらアセトン（５．８ｇ，１００ｍｍｏｌ）で処理する。シアン化カリウム（６ｇ，９２ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）を添加すると、第二相（上相）に所望のアセトンシアンヒドリンが分離される。この反応が完了したら、両相を分離し、上相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して純粋なアセトンシアンヒドリン（１１）を透明液体（５．４０２ｇ，６９％）として得る。

化合物（１２）の調製：（２−メチルアミノ−２−メチル−プロピオニトリル；Ｅｘｎｅｒ，Ｌ．Ｊ．；Ｌｕｓｋｉｎ，Ｌ．Ｓ．；ｄｅ Ｂｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｐ．Ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５３，７５（１９），４８４１−４８４２の応用）
氷浴中のフラスコに入れたアセトンシアンヒドリン（１１）（１ｇ，１２ｍｍｏｌ）にメチルアミン（２．８ｇ，３６ｍｍｏｌ）の水溶液（４０質量％）をゆっくりと添加する。添加は、混合液の温度が１５℃を超えないようにゆっくりと行う。添加が完了したら、反応混合液を１時間半攪拌する。得られた溶液をＥｔ_２Ｏ（３×１０ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせて、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後、Ｎａ_２ＳＯ_４を濾別する。溶媒を減圧下で除去して生成物（１２）を無色液体（０．７００ｇ，５９％）として得る。

化合物（１３）の調製：（Ｎ^２−２−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン；米国特許出願公開第２００５／００３８０７８号明細書の応用）
アルゴン雰囲気下、水素化アルミニウムリチウム（１．５２０ｇ，４０ｍｍｏｌ）のＥｔ_２Ｏ（２ｍＬ）懸濁液に２−メチルアミノ−２−メチル−プロピオニトリル（１２）（１．９６０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を滴下する。混合液を室温で３時間攪拌した後、Ｅｔ_２Ｏ（３０ｍＬ）で希釈する。氷浴中に置いたら、飽和Ｋ_２ＣＯ_３水溶液を水素の放出がもはや観察されなくなるまで添加する。その後、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を反応混合液に添加し、１０分間攪拌する。Ｃｅｌｉｔｅで濾過して塩を除去した後、大量のＥｔ_２Ｏで洗浄する。その後、得られた濾液を減圧下で濃縮してＮ^２−２−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（１３）を透明液体（２．００１ｇ，９８％）として得る。^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝２．４０（ｓ，２Ｈ），２．１４（ｓ，〜３Ｈ，ＮＨＭｅ），１．８（ｓ，ｂｒ，３Ｈ，ＮＨ＋ＮＨ_２），０．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）ｐｐｍ；^１３Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝５３．０（ＣＭｅ_２），５０．２（ＣＨ_２），２８．３（ＮＨＭｅ），２３．０（２×Ｍｅ）ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ １０３．１：［ＭＨ］^＋．

化合物ＩＩ．２の調製：
ＢｏｃＬｅｕＯＨ（１．３７ｇ；５．９２ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液を−５℃でＤＣＣ（１．２２７ｇ；１当量）で処理し、５分間撹拌する。Ｎ^２−２−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（１３）（４７質量％Ｅｔ_２Ｏ溶液の１．５０ｇ；＞１当量）を添加した後、混合液の温度を室温まで昇温し、混合液を４８時間撹拌しながら放置する。沈殿したＤＣＵ（無色）を多孔度３のガラスフリットで濾別する。ほとんど無色の濾液を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３で洗浄して、残留したＢｏｃＬｅｕＯＨを除去する。その後、ＤＣＭ溶液をＨＣｌ（２Ｍ，３×３０ｍＬ）で洗浄して、アミン成分を全て除去する。そして、得られたＤＣＭ溶液には副産物である尿素がアミノ酸でアシル化されたもののみが含まれている。その後、酸水溶液をＫＯＨ（５Ｍ，４０ｍＬ）で直ちに塩基性化して、ｐＨを＞１２に調整し、その後、両相が透明になるまでＤＣＭ（６×２０ｍＬ）で洗浄する。再び合わせた有機相を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させる。濾過し、蒸発させた後、化合物ＩＩ．２（４３ｍｏｌ％，５２ｗｔ％，２８０ｍｇ；０．８８ｍｍｏｌ）と、そのＢｏｃ基を失った誘導体（Ｈ_２ＮＬｅｕ−ＮＨ−ＣＨ_２−Ｃ（Ｍｅ）_２−ＮＨＭｅ，ＭＷ＝２１５．３Ｄａ，５７ｍｏｌ％，４８ｗｔ％，２６０ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）とを含む透明油状物０．５４ｇを得る。ＥＡ：Ｃｙ：ＭｅＯＨ勾配（１０：７：０→１０：７：３（ｖ：ｖ：ｖ））を使用してシリカカラムでこの混合液を濾過して、生成物ＩＩ．２のみを無色油状物として得る。この油状物は時間がたつと固化する（２３５ｍｇ；０．７４ｍｍｏｌ，１３％）。化合物ＩＩ．１のＮＭＲスペクトルと違い、化合物ＩＩ．２では予想通りジアステレオ異性体が存在しないことが確かめられる。ＮＭＲ共鳴数を表す数字は、合成スキーム６に示された化合物Ｉ．８の対応する原子の番号を指す。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝６．８０（ｓ，ｂｒ；１Ｈ；ＮＨ_アミド）；５．０４（〜ｄ，ｂｒ；７．７Ｈｚ；０．８Ｈ；ＮＨ_Ｂｏｃ）；４．１２−４．０８（ｍ；１Ｈ；Ｈ−２）；３．２６（ｄｄ；１４．０＆５．９Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−９）；３．１７（ｄｄ；１３．３＆４．９Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−９’）；２．３４（ｓ；３Ｈ；３×Ｈ−１２）；２．１４（ｓ，ｂｒ；１Ｈ；ＮＨ_脂肪族）；１．７２−１．６５（ｍ；２Ｈ；Ｈ−４＋Ｈ−３）；１．５４−１．４９（ｍ；１Ｈ；Ｈ−３’）；１．４６（ｓ；９Ｈ；９×Ｈ−８）；１．１１（ｓ；６Ｈ；６×Ｈ−１１）；０．９６（ｄ；３．７Ｈｚ；３Ｈ；３×Ｈ−５）；０．９５（ｄ；３．６Ｈｚ；３Ｈ；３×Ｈ−５’）ｐｐｍ．

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７２．９（Ｃ１）；１５５．８（Ｃ６）；８０．０（Ｃ７）；５３．７（Ｃ１０）；５３．５（Ｃ２）；４６．６（Ｃ９）；４１．４（Ｃ３）；２８．４（３×Ｃ８）；２８．３（Ｃ１２）；２４．９（Ｃ４）；２４．６（２×Ｃ１１）；２３．０（Ｃ５）；２２．２（Ｃ５’）ｐｐｍ．ＨＳＱＣ、ＣＯＳＹ及びｊｍｏｄスペクトルを測定してシグナルの帰属を確かめた。

ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ ３１６．３：［ＭＨ］^＋．

化合物Ｉ．８の調製：
化合物Ｉ．７の調製とほぼ同様にして、ＨＰＱ（１４９ｍｇ；０．６２８ｍｍｏｌ）及び化合物ＩＩ．２（１９８ｍｇ；０．６２７ｍｍｏｌ）を投入して、化合物Ｉ．８を調製する。無水ピリジン中のピペラジンで未精製反応生成物を処理して、アミンと反応しなかったクロロギ酸ＨＰＱを捕集する。上述した水処理によって未精製の黄色油状物（２９９ｍｇ）を得る。この油状物には、化合物Ｉ．８と、幾らかのＨＰＱと、微量のピペラジンとの反応生成物とが含まれている。未精製物（２００ｍｇ）の一部を以下のようにして精製する。固体をＤＣＭ（２×１ｍＬ）で処理し、溶解分をデカンテーションで分離する。その後、シリカカラムクロマトグラフィー（Ｃｙ：ＥＡ勾配３：１→１：１（ｖ：ｖ））で溶解分を精製して、非常に強い青色蛍光を有する稠密な無色粉体（１３４ｍｇ；０．２３１ｍｍｏｌ；ここでの全収率は５５％）として化合物Ｉ．８を得る。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．２９（ｄ；７．８Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−２３）；７．９１（ｄ；７．３Ｈｚ；０．８Ｈ；Ｈ−１８）；７．８０−７．７８（ｍ；２．２Ｈ；Ｈ−２５＋Ｈ−１６）；７．５５−７．４８（ｍ；２Ｈ；Ｈ−２４＋Ｈ−２６）；７．３９−７．３５（ｍ；１Ｈ；Ｈ−１７）；７．２４（ｄ；８．３Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−１５）；６．８４（ｓ，ｂｒ；０．８Ｈ；Ｈ_アミド）；６．１８（ｓ，ｂｒ；０．１Ｈ；Ｈ_アミド）；５．６０（ｄ；ｂｒ；６．８Ｈｚ；０．７Ｈ；ＮＨ_{カルバメート}）；４．２３−４．０３（ｍ；１Ｈ；Ｈ−２）；３．８１−３．３７（ｍ；２Ｈ；２×Ｈ−９）；３．０５（ｓ；３Ｈ；３×Ｈ−１２）；１．８０−１．４９（ｍ；３Ｈ；Ｈ−４＋２×Ｈ−３）；１．３４（ｓ；６Ｈ；６×Ｈ−１１）；１．２３（ｓ；９Ｈ；９×Ｈ−８）；０．９５（ｄ；６．６Ｈｚ；３Ｈ；３×Ｈ−５）；０．９３（ｄ；６．５Ｈｚ；３Ｈ；３×Ｈ−５’）ｐｐｍ．

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７３．８（Ｃ１）；１６２．５（Ｃ２１）；１５５．８（Ｃ６）；１５４．８（Ｃ１３）；１５０．７（Ｃ２０）；１４９．４（Ｃ２７）；１４９．２（Ｃ１４）；１３４．９（Ｃ２５）；１３２．３（Ｃ１６）；１３０．７（Ｃ１８）；１２７．９（Ｃ２４）；１２７．６（Ｃ２３）；１２７．２（Ｃ２６）；１２６．６（Ｃ２２）；１２６．４（Ｃ１７）；１２３．８（Ｃ１５）；１２１．１（Ｃ１９）；７９．５（Ｃ７）；６０．９（Ｃ１０）；５３．６（Ｃ２）；４６．５（Ｃ９）；４１．２（Ｃ３）；３２．７（Ｃ１２）；２８．３（３×Ｃ８）；２５．３（Ｃ４）；２５．０（Ｃ１１）；２４．９（Ｃ１１’）；２３．２（Ｃ５）；２２．０（Ｃ５’）ｐｐｍ．

ＨＳＯＱＣ及びＣＯＳＹスペクトルを測定してシグナルの帰属を確かめた。ＮＭＲ共鳴数を表す数字は、合成スキーム６に示された番号を指す。

ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ ５８０．３：［ＭＨ］^＋．ＭＳ（ＥＳＩ，ネガティブモード）：ｍ／ｚ ５７８．３：［Ｍ−Ｈ］⁻．

化合物Ｉ．２の調製：
５６ｍｇのＩ．８（０．０９７ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１．５ｍＬ）とＴＦＡ（１．５ｍＬ）とで処理し、得られた溶液を室温で１時間撹拌した後、減圧下で揮発成分を全て除去する。未精製物のＴＬＣ分析（Ｃｙ：ＥＡ：ＭｅＯＨ＝１：１：１；ＵＶ分析，ニンヒドリン及びＫＭｎＯ_４により検出）から、化合物Ｉ．８が全で消費され、ＨＰＱが存在しないことがわかる。しかしながら、シリカカラムクロマトグラフィー（Ｃｙ：ＥＡ：ＭｅＯＨ勾配１：１：０→１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ））を行って、化合物Ｉ．２（稠密な無色粉体；４８ｍｇ；０．０８１ｍｍｏｌ；８４％）を得る。ＮＭＲ共鳴数を表す数字は、合成スキーム６に示された番号を指す。

ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ ４８０．２：［ＭＨ］^＋．ＭＳ（ＥＳＩ，ネガティブモード）：ｍ／ｚ ４７８．３：［Ｍ−Ｈ］⁻．

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ＝８．０２（ｄ；８．２Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−２３）；７．８１−７．７７（ｍ；１Ｈ；Ｈ−２５）；７．６４（ｄｄ；７．４＆１．７Ｈｚ；Ｈ−１８）；７．６０−７．５６（ｍ；２Ｈ；Ｈ−１６＋Ｈ−２６）；７．５０−７．４７（ｍ；１Ｈ；Ｈ−２４）；７．４０−７．３７（ｍ；１Ｈ；Ｈ−１７）；７．２４（ｄ；８．２Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−１５）；３．８１（ｔ；７．４Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−２）；３．４１（ｄ，ｂｒ；１３．４Ｈｚ；１Ｈ；Ｈ−９）；３．０８−３．００（ｍ；１Ｈ；Ｈ−９’）；２．９３（ｓ；３Ｈ；３×Ｈ−１２）；１．５４−１．４１（ｍ；３Ｈ；Ｈ−４＋２×Ｈ−３）；１．０２−０．８３（ｍ；６Ｈ；６×Ｈ−１１）；０．８１（ｄ，４．９Ｈｚ＋ｄ，４．９Ｈｚ；３Ｈ＋３Ｈ；６×Ｈ−５）ｐｐｍ．

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ＝１７０．４（Ｃ１）；１６４．４（^＊Ｃ２１）；１５４．５（^＊Ｃ１３）；１５１．６（^＊Ｃ２７）；１４８．３（Ｃ１４）；１４７．８（^＊Ｃ２０）；１３６．０（Ｃ２５）；１３２．９（Ｃ１６）；１２９．７（Ｃ１８）；１２８．１（Ｃ２４）；１２６．５（Ｃ２３）；１２６．２（Ｃ２６）；１２６．０（^＊Ｃ２２）；１２６．０（Ｃ１７）；１２３．３（Ｃ１５）；１１９．７（Ｃ１９）；５９．４（Ｃ１０）；５２．０（Ｃ２）；４５．９（Ｃ９）；４０．０（Ｃ３）；３２．１（Ｃ１２）；２４．０（Ｃ４），２３．８（２×Ｃ１１），２１．６（Ｃ５），２１．２（Ｃ５’）ｐｐｍ．ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ及びｕｄｅｆｔスペクトル（このスペクトルは、非常にゆっくりと緩和して、シグナルをほとんど示さない５つの星印のついた４級炭素用；Ｐｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．２００６（４４），９４３−９４７を参照）を測定してシグナルの帰属を確かめた。

ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブモード）：ｍ／ｚ ４８０．２：［ＭＨ］^＋．ＭＳ（ＥＳＩ，ネガティブモード）：ｍ／ｚ ４７８．３：［Ｍ−Ｈ］⁻．

実施例Ｉ．３
下記スキーム７において合成中間体ＩＩ．１の代わりに化合物ＩＩ．３を使用して、上記基質Ｉ．１と同様にして基質Ｉ．３を合成する。ＴＨＦ還流下、市販ｃｂｚにより保護されたプロリン−アミドをボランＢＨ_３により還元することで、ｃｂｚ保護基により保護されたジアミン（１４）を文献に記載の収率７４％（Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２００６）１２，４３２１−４３３２）で調製する。

スキーム７

ａ）ＢＨ_３，ＴＨＦ還流，７ｈ；ｂ）ＢｏｃＬｅｕＯＨ，ＤＣＣ；ｃ）Ｈ_２，Ｐｄ／Ｃ（１０％），ＭｅＯＨ，１ｈ；ｄ）トリホスゲン；ｅ）ＴＥＡ；（ｆ）ＴＦＡ

実施例Ｉ．４
ＨＰＱの代わりに生成物６を使用して、プローブＩ．１と同様にしてプローブＩ．４を合成する。

実施例Ｉ．５
下記スキーム８に示されるようにプローブＩ．５を調製する。

スキーム８：実施例Ｉ．５の化学合成

ａ）ＥＤＣ／ＨＯＢｔ，実施例３のジアミン；ｂ）Ｈ_２，Ｐｄ／Ｃ（１０％），ＭｅＯＨ，１ｈ；ｃ）塩基；ｄ）ＴＦＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２

実施例Ｉ．６
市販の保護ペプチド配列Ａｃ−ＤＥＶＤの代わりに市販の保護ペプチド配列Ａｃ−ＨＳＳＫＬＱを使用して、化合物Ｉ．５と同様にしてプローブＩ．６を合成する。

酵素試験
前文：
本発明の範囲内においては、酵素試験を行う際、結晶核形成を引き起こす最低濃度に達すると、固体状フルオロフォアはまず容器（マルチウェルプレートのウェル）の壁に堆積した後に容器の底に堆積し始め得る。示した図の反応速度曲線において、核形成を引き起こす際に遅れ（≧１０分）を伴うことがよく見てとれる。実施した酵素試験を添付の図に示す。

図１は、走査モードで得た典型的なイメージを示し、６列（１〜６）、４行（Ａ〜Ｄ）の格子で表されるマルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェル中の、インキュベーション４０時間後の酵素により引き起こされた蛍光の強度の空間図を示す。ウェルＡ１、Ａ６、Ｂ２、Ｃ３及びＤ４には、ＰＬＡ酵素が初期濃度２０９μＭのプローブＩ．１とともに含まれ、ウェルＢ１、Ａ２、Ｃ４及びＤ５には、ＰＬＡ酵素が初期濃度８０μＭのプローブＩ．１とともに含まれ、ウェルＡ３、Ｂ４、Ｃ５及びＤ６には、ＰＬＡ酵素が初期濃度２１．２μＭのプローブＩ．１とともに含まれ、その他のウェルには、ＰＬＡは全く含まれていないが、２０９μＭのプローブＩ．１（Ａ４、Ｂ５、Ｃ６、Ｄ１、Ｄ３）又は８０μＭのプローブＩ．１（Ａ５、Ｂ６、Ｃ１、Ｄ２）が含まれるか、又は、プローブＩ．１も含まれていない（Ｂ３、Ｃ２）。シグナルはグレースケールで表示し、黒色は最大強度に相当する。

図２は、プローブＩ．１に行った別の実験の高分解能の走査モードで得たイメージを示し、酵素により活性化されたプローブ（ウェルＡ２及びＡ３）がウェルの中心だけでなく端にも沈殿する傾向を示す。ウェルＡ１にはバッファのみが含まれている。シグナルはグレースケールで表示し、黒色は最大強度である。

図３は、ＰＬＡ酵素の存在下の濃度１８μＭのプローブＩ．２の場合、及び、酵素の非存在下の濃度１００μＭのプローブＩ．２の場合のウェルで測定された蛍光に相当するシグナルＧ（ｔ）を示す。[Ｉ．２、１８μＭ、酵素有り]組の場合、太線は、元のシグナル（結合していない三角形）の５つの一貫性のない（ｅｒｒａｔｉｃ）値（矢印）を削除するよう構成したアルゴリズムを適用した後に保持されたデータを示す。

図４は、上記方法で得た、時間に対して示した蛍光シグナルＦ（ｔ）の経時変化であって、ＰＬＡ酵素の非存在下、ｐＨ〜７．６に緩衝された水溶液中の１０μＭ及び１００μＭの化合物Ｉ．１並びに１０μＭ及び１００μＭの化合物Ｉ．２（これら２つのシグナルはほとんど全て重なっている）の蛍光シグナルＦ（ｔ）の経時変化を示す。

図５は、上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下の化合物Ｉ．１（３７８μＭ、１００μＭ及び５９μＭ）及び化合物Ｉ．２（１００μＭ及び５９μＭ）、並びに、ＰＬＡの非存在下のそれぞれ１００μＭの両化合物（コントロール）のシグナルＦ（ｔ）を線形スケールで示す。

図６は、上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下及び非存在下、各種濃度１０〜１００μＭとなるよう新たに溶解させた化合物Ｉ．１、並びに、ＰＬＡを新たに添加した水溶液中で３週間保管した３７８μＭ（希釈時に元の濃度に従って計算した）の同化合物（≪３週間≫）のシグナルＦ（ｔ）を対数スケールで示す。

図７は、上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下及び非存在下、各種濃度１０〜１００μＭとなるよう新たに溶解させた化合物Ｉ．２の場合のシグナルＦ（ｔ）を対数スケールで示す。

図８は、上記方法で得たシグナルＦ（ｔ）であって、ＰＬＡ酵素の存在下の濃度１００、３２及び１０μＭの化合物Ｉ．１及びＩ．２のシグナルＦ（ｔ）を比較しながら対数スケールで示す。

蛍光読み取り装置用マルチウェルマイクロプレートに入れたインビトロ媒体中で標的酵素であるミクロソームロイシンアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２；「ＰＬＡ」；市販）とともにインキュベーションしてプローブＩ．１及びＩ．２を評価した。プローブは以下の基準に従って評価した。

・通常、酵素活性の存在によって高い蛍光強度（「オン」）を検出。

・標的酵素を含まないサンプルにおいて蛍光が全く存在しないこと（「消光」又は「オフ」）を検出（本質的に蛍光性なし）。

・時間がたってもプローブが全く加水分解しないことを検出（偽陽性シグナルなし）。これは水性媒体中、ｐＨ７でのプローブのロバスト性を表す。

・酵素活性の存在に対する迅速な応答を検出。酵素活性が存在すれば最大シグナルを迅速に得ることができる。

・測定シグナルとプローブ濃度との相互関係を検出。

・広範囲照射した場合の固体状フルオロフォアの高い光安定性を蛍光読み取り装置により検出。

ｐＨ７．４（生理的ｐＨ）に緩衝された溶液中、２５℃で主な試験を行った。３７℃で試験を行った場合、例えばフィルムで覆うなどして、早期蒸発しないようウェルを保護しなければならなかっただろうが、これにより、蛍光測定の感度がひどく減少したであろう。従って、２５℃の温度が好ましい。

使用試薬：
酵素試験の最終溶液は全て、１１ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ（全濃度）Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファによって（室温に応じて）ｐＨ７．４〜７．６の範囲に緩衝された。ＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）を含む硫酸アンモニウム（３．５Ｍ）中の懸濁液（タンパク質含量３．５ｍｇ／ｍＬ、１０〜４０Ｕ／ｍｇタンパク質、ロイシン−パラ−ニトロアニリドを標準基質として測定）としてブタ肝臓のミクロソームロイシンアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２）をＳｉｇｍａ（カタログ番号０６９Ｋ７３５６）から購入し、最長４０日間４℃で冷蔵保管して使用した。この酵素懸濁液を最初に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ・ＨＣｌバッファで１００〜２００倍に希釈し、均質化し、室温で１時間放置してから使用した。これは、文献（例えばＢｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８７）２４２，２８１−２８３）の記載通り、ＭｇＣｌ_２又はＭｎＣｌ_２の存在下又は非存在下、３７℃で酵素をインキュベーションすると、結果として優れた反応性が示されなかったためである。活性ウェル中の酵素の最終濃度の値を３．５μｇ／ｍＬに調整した。プローブＩ．１及びＩ．２は、常に、密封した丸薬容器に保管した固体の状態からＭｅＯＨ（〜５ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた後、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ・ＨＣｌを添加してから、酵素試験に用いる最終濃度まで希釈した。

実施した分析：
ＲＦＵとして測定した蛍光値を時間に対して読み取って分析を行った。分析は、９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）又は３８４ウェル（Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．）の黒色ポリプロピレン製プレートで行い、マイクロプレート蛍光光度計（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で記録した。この蛍光光度計は、ここでは３秒／ウェルとなるよう選択した読み取りを行って蛍光を測定するいわゆる反復モードで使用し、直径４ｍｍの励起ビームをウェルの中心に向けた。フルオロフォアが放出されると、まずウェルの壁に堆積し、ウェルの底及び中央に直ちには落下しない傾向（図２参照）にも関わらず、反復モードの分析（ウェルの中心の蛍光のみを考慮）は意義深いことが示された。なお、このモードでの使用は、上記種類のプローブに想定される用途の１つである蛍光によるハイスループット光学スクリーニングの操作に近い。図１及び図２のイメージは、励起ビーム及び読み取り装置が段階的に移動して各ウェル、特にその端までカバーするいわゆる走査モードで取得した。走査モードでは、ウェルを読み出し正方格子に分割し、典型的には８×８画素〜１５×１５画素の分解能のウェルとし、各画素を０．１〜０．３秒で読み取った。この走査モードによって、反復モードで処理したウェルの全蛍光の誤差と読み出しノイズ（フルオロフォアが放出されるとまず壁に堆積する傾向に由来）を一部除くことができる。また、ここで実施される走査モードはよりゆっくりしたものであり、反応速度の定性的観察への適性は低い。なお、このモードでの使用は、上記種類のプローブに想定される別の用途である細胞数測定の操作に近い。

図１において、観察された蛍光が各ウェル中の初期濃度によって異なる（プローブＩ．１の初期濃度が２０９μＭ、８０μＭ及び２１μＭである３つのウェル群を容易に探知できる）こと、並びに、他のウェルに同等な蛍光が見られない（酵素の非存在下で２０９μＭ及び８０μＭのプローブを含むウェルは、プローブを全く含まないウェルと同様に目に見えるものがない）こと、すなわち、４０時間インキュベーションした後でも、プローブの（オフ）−オン機能が消光しており、プローブの本質的な蛍光が全く見られず、プローブの自然加水分解による偽陽性シグナルが全く見られないことが注目される。

バンドパスフィルターを備える蛍光計を使用して、励起ビームでは１４ｎｍ、発光ビームでは１０ｎｍのバンド幅の波長を選択したため、プローブＩ．１及びＩ．２（ＨＰＱ系）の励起波長を３５５ｎｍに設定し、探知される発光波長を５１０ｎｍに設定した。

取得の手順：
調製したウェルに最終的に酵素を添加した。酵素を添加した後、ウェルの内容物をピペットで２回吸い上げて放出して、出来るだけ混合液を均質化した。これにより、一回目の取得の前に、取得毎のウェル数に応じて５〜２０分の遅れが生じたが、第一ウェルが蛍光を呈し始めた時点でこの遅れにより取得が妨げられることはなかった。ウェル間の読み取りの遅れを観察して、各ウェルに酵素を添加した。その結果、プレートを読み出す際は毎回各ウェルの反応時間を同一にして、異なるウェルで取得したデータを比較することができた（本実験では、隣接するウェルを読み出す間に３秒〜２０秒の遅れが生じたが、これに、時間ｔで取得して読み取られる最大７７ウェルを乗じる）。特に明記しない限り、活性条件（基質の濃度及び性質、酵素濃度など）の各群Ｘについて５ウェル以上（繰り返しＩ）、並びに、コントロール条件（例えば、酵素なし及び／又は基質なし）の各群について３以上の繰り返しの蛍光値Ａ_ｘ，ｉ（ｔ）を各処置において測定した。読み出しと読み出しの間にプレートレットを約１０秒間撹拌した。

データの前処理
反復モードによって、ＲＦＵとして測定した各ウェルの蛍光値の時間に対する関数を取得できるが、この未加工値の関数はＡ_ｘ，ｉ（ｔ）（Ｘ群の繰り返しを表す指数）として記載する。緩衝溶液と、活性ウェルで使用したのと同じ量の酵素とを含むが、基質は含まない（３以上の）コントロールウェルからなる群で得られた未加工蛍光値（単位：ＲＦＵ）の平均Ｂ（ｔ）を計算する。そして、関数Ｇ^＊ _Ｘ，ｉ（ｔ）＝Ａ_Ｘ，ｉ（ｔ）−Ｂ（ｔ）を計算して、とりわけプレートレット、酵素及び緩衝媒体による光の分散、空気中及びウェル表面上の埃による光の分散が原因となって生じる、測定シグナルに重なった環境シグナルを除いた。次に、Ｇ^＊ _Ｘ，ｉ（ｔ）を正規化して、各ウェルについて関数Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）＝Ｇ^＊ _Ｘ，ｉ（ｔ）×Ｂ（ｔ＝０）／Ｂ（ｔ）を得た。この正規化により、検出器の校正のずれ（「検出器ドリフト」）や、２４時間を超えて続く場合もある取得工程時のＵＶランプによる強度の起こり得る差異などの影響を少し補うことで蛍光値を経時的に比較できる。

図３は、プローブＩ．２が高濃度でも酵素の非存在下では分解しない（偽陽性シグナルが全く存在しない）が、酵素の存在下でははるかに低い濃度でも非常に強いシグナルを実際に生成できることを示す。

一貫性のないデータ：
ある点（図３の矢印が示す点）がその隣と非常に異なる、例えば隣接値の算術平均よりもＲＦＵが最大３００％大きい又は小さいことがあったため、各ウェルの未加工データを調べてそれらの一貫性を検討した。この場合、これらは、取得したシグナルの自然な差異ではなく、例えば、光を分散させる分析板上にやって来たり、読み取り装置の近くで気流により吹き飛ばされたりした埃粒子の存在などに由来する一貫性のない値であると考慮した。従って、関係するウェルで得られた全曲線を保持しつつ、一貫性がないと考慮した上記点を捨てることに決めた。ある点を一貫性がないとするかどうかを決定するために試験を構成した。点Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）について、隣接値の量に反比例して重みを付けた期待値を計算して、μ_Ｘ，ｉ（ｔ）＝［（３Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ−３）＋２Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ−２）＋２Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ＋２）＋３Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ＋３））／１０］を得た。そして、Δ_Ｘ，ｉ（ｔ）＝［Ｇ_ｘ，ｉ（ｔ）−μ_Ｘ，ｉ（ｔ）］^２／（｜μ_Ｘ，ｉ（ｔ）｜＋｜Ｇ_ｘ，ｉ（ｔ）｜）の値を計算した。Δ_Ｘ，ｉ（ｔ）の最大値に相当する点Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）は、大きいものから順に拒否することができ、拒否する点が各組の得られた点の５％（例えば、図３の矢印の付いた５つの点）となるまで隣接点の新しいμ_Ｘ，ｉ（ｔ’）の値を再計算した。この方法は取得の終了時頃（蛍光のプラトー領域とすることが必要）の値に適しているが、プローブの活性化に相当するシグナルの急速な増加を隠してしまう恐れがあるため初期データの３点には適用しなかった。この方法は、非線形の急速な増加に相当する蛍光値のデータ域にも適用しなかった。図３には、この方法で得た曲線（曲線Ｇ（ｔ）に適用）もデータ点を三角形として太字で表し、除いた点（矢印付き）も示す。

保持データ及び平均蛍光値Ｆ_ｘ（ｔ）の取得：
最も一貫性のあるデータを分析するために、（１）各群について常に３以上の繰り返しが保持され、（２）拒否したウェルのシグナルが、その値と群の総平均値Ｍ_Ｘ（ｔ）との任意の偏差閾値を超えた場合、各群Ｘの最大２の繰り返しｉの、一貫性のない点が全くないデータ曲線Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）は拒否した。拒否を評価するため、関数｜（Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）−Ｍ_Ｘ（ｔ））^２／Ｍ_Ｘ（ｔ）｜の全値の平均Ｑ_Ｘ，ｉをまず計算した。この際、繰り返しｉを拒否するには、比Ｒ_ｉ＝［Ｑ_Ｘ，ｉ／（Ｍ（ｔ）の最後の５つの点の平均値）］は０．０２５よりも大きくなくてはならない。このように各群Ｘについて最大Ｑ_Ｘ，ｉを有するウェルｉを拒否した後、Ｍ_Ｘ（ｔ）及びＱ_Ｘ，ｉを再計算して残りのＱ_Ｘ，ｉを再評価し、上記方法を再適用した。なお、この工程は、隣接値Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）とＧ_Ｘ，ｉ（ｔ’）との起こり得る差異（この差はシグナル対ノイズ比と同等）に本質的に反対するものではない。保持された繰り返しを「許容可能」とし、保持された点群Ｘそれぞれについて、保持された関数の値Ｇ_Ｘ，ｉ（ｔ）を平均して、各条件のＸ群の一連の蛍光値Ｆ_Ｘ（ｔ）を得た。

取得データ：
反復モードで１１時間取得を行って、（１）プローブＩ．１及びＩ．２の安定性を確認し、（２）それらの最少バックグラウンド蛍光値を示し、（３）様々な濃度範囲で、酵素活性により引き起こされる顕著なシグナルを示し、（４）プローブのおおよその作用速度を得、（５）酵素活性により得られたシグナルがこの急速な取得モードでは定量的とみなされるかどうかを経過時間に対して評価した。各プローブを１０μＭ〜１００μＭの濃度範囲で試験したが、各プローブについて、２組の安定性コントロール（１つは１００μＭ、１つは１０μＭ）を測定して、偽陽性シグナルが全く見られないことを確認した。プローブの非存在下の標準バッファ中に幾らか酵素を含むウェルを使用して、バックグラウンド蛍光のコントロール測定を行った。最後に、３週間前に調製したプローブＩ．１溶液（「３週間」）を使用して測定を行って、さらに自然加水分解に対するこのプローブのロバスト性を実際に評価した。各読み出しはウェル毎に３秒間続けた。得られた結果を図４〜８に図式的に示す。

図４は、本発明に係る基質が自然分解に対して完全に安定であり、プローブＩ．１及びＩ．２では１１時間の取得中に偽陽性シグナルが全く見られないことを示す。それに比べて、本発明者の１人の先行文献（Ｚｈａｎｇ，Ｗａｉｂｅｌ ａｎｄ Ｈａｓｓｅｒｏｄｔ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０，１６，７９２）に記載のプローブは、３８μＭのプローブについて同様な条件下、酵素の非存在下のコントロールウェルのシグナルの増加が１５０分間で１０〜１５％程度（従って偽陽性シグナル）であった。本発明に係るプローブを使用すれば、濃度１００μＭで６６０分間の場合であっても、シグナルノイズに対するシグナルの増加は見られない。

プローブＩ．２（使用した対イオン：ＣＦ_３ＣＯ_２ ⁻）では本質的な蛍光値は、その溶液中濃度に影響されないように思われるが、一方、プローブＩ．１（使用した対イオン：ｐＴｓＯ⁻）では蛍光値はその濃度に対して幾らかの依存性を示す。

図５は、酵素の存在下、各種濃度の化合物Ｉ．１及びＩ．２を使用して強い蛍光シグナルが迅速に得られること、並びに、この蛍光値と比較して本質的蛍光値（酵素の非存在下のプローブで観察）が弱いことを示す。なお、シグナルの急激な増加を得る際の遅れは非常に少なく、前文で検討した理由から約１０分であるが、通常は１００分未満である。

図６は、酵素の存在下で化合物Ｉ．１を使用して強い蛍光シグナルが迅速に得られるが、酵素の非存在下では同プローブで非常に小さいバックグラウンド蛍光値しか観察されないことを示す。５００分以降では、最低濃度１０μＭの化合物Ｉ．１であっても、活性化酵素の非存在下で上記プローブ濃度の１０倍に相当する１００μＭで行われた測定でのバックグラウンド蛍光とさえも混動されないシグナルが得られることが強調されよう。また、プラトー領域に達すると、シグナルは時間がたっても減少せず、従って、機器の照射度は、探知可能な光分解を引き起こすほど高いものではない。

化合物Ｉ．２の場合の図７の曲線に示された結果は同等であり、従って同様に申し分のないものである。

図８は、プローブＩ．１及びＩ．２のシグナルを引き起こす速度の違いを濃度に対して示す。なお、ウェル中に存在するプローブが全て活性化することから予想される通り、同一濃度（１００μＭ及び３２μＭ）で比較した両プローブの蛍光プラトー値は同じである。

酵素とともにインキュベーションしたプローブＩ．１及びＩ．２について使用した方法で観察された時間ｔ_１／２であって、１１時間の取得中に観察された最大シグナルの半分に相当する時間ｔ_１／２を計算し、表２に示す。それらの値によって、使用した酵素濃度が低い場合のプローブの作用の迅速さを評価できる。

（２００〜４００分後から取得の終了時まで）プローブ濃度３７８μＭ〜３２μＭで測定した「プラトー領域の」蛍光値（最大値；時間がたっても変化しない）を使用して、各ウェル組についてシグナルプラトー値／濃度比を評価した。各測定で得られたそれぞれの比の値には２０％程度の差異しか見られなかったが、これにより、上記プローブのフルオロフォア部分が同じ場合、酵素を使用した試験で測定されたシグナルとプローブの初期濃度とが相関することがわかる。得られた比の平均値を使用して、活性ウェル中のプローブの初期濃度を評価した。得られた値を表３に示す。このように評価した値は、実際の値にかなり近い。濃度１８μＭ及び１０μＭの場合、プラトー領域に達することはなかったので、計算された濃度は予想通り低く評価されていることがわかる。

Claims (17)

1. 光学異性体若しくはジアステレオ異性体の任意の割合の混合物、又は、光学異性体若しくはジアステレオ異性体が濃縮された形態である、下記式（Ｉ）で表されるペプチダーゼ基質。
   （式中、Ｒ_０は、カルボキシ末端を介してＮＨ基に結合したペプチジル又はアミノ酸基であり、
   ｎは０又は１であり、
   Ｒ_１は、水素原子又はアミノ酸の側鎖であり、
   Ｒ_５は、対応するフェノール誘導体がＥＳＩＰＴ型フルオロフォアに属するフェノキシ誘導体であり、以下から選択され：
   （式中、Ｔは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールであり、
   Ｒａは、水素、又は、電子吸引基である炭素含有置換基、例えば−ＣＮ若しくは−ＣＯＯＲｄ（Ｒｄは（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）等であるか、又は、Ｒａは−ＣＯＮＲｅＲｆ（Ｒｅ及びＲｆは同一又は異なって水素又は（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）であるか、又は、Ｒａは、−ＣＦ _３ 、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、（ベンゾ縮合した若しくはしていない）２−イミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イル、又は、キナゾリノン−２−イルであり、
   Ｒｂは、水素、塩素原子、−ＯＨ、−ＮＨ _２ 、−ＮＲｇＲｈ又は−ＯＲｇ（Ｒｇ及びＲｈは同一又は異なって（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）であるか、又は、
   Ｒａ及びＲｂは互いに結合して飽和又は不飽和の置換又は非置換四員〜五員炭化水素鎖を形成しており、前記炭化水素鎖には、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子が介在していてもよく、
   Ｒｃは、水素、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ又はＦである。）；
   （式中、Ｔ’は、ＮＨ _２ 、ＯＨ、アリール、（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル、ＳＨ、ＮＨＲ、ＯＲ、ＮＲ _２ 、ＳＲ（Ｒは（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル又はアリール）であり、
   Ｒａは、水素、又は、電子吸引基である炭素含有置換基、例えば−ＣＮ若しくは−ＣＯＯＲｄ（Ｒｄは（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）等であるか、又は、Ｒａは−ＣＯＮＲｅＲｆ（Ｒｅ及びＲｆは同一又は異なって水素又は（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）であるか、又は、Ｒａは、−ＣＦ _３ 、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、（ベンゾ縮合した若しくはしていない）２−イミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イル、又は、キナゾリノン−２−イルであり、
   Ｒｂは、水素、塩素原子、−ＯＨ、−ＮＨ _２ 、−ＮＲｇＲｈ又は−ＯＲｇ（Ｒｇ及びＲｈは同一又は異なって（Ｃ _１ −Ｃ _４ ）アルキル基）であるか、又は、
   Ｒａ及びＲｂは互いに結合して飽和又は不飽和の置換又は非置換四員〜五員炭化水素鎖を形成しており、前記炭化水素鎖には、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子が介在していてもよい。）、
   Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は以下の通り：
   Ｒ_２が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基又は水素原子、Ｒ_３が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、且つ、Ｒ_４が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基であるか、又は、
   Ｒ_２が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基又は水素原子、且つ、Ｒ_３及びＲ_４が互いに結合してそれらが結合する炭素原子及び窒素原子と共に脂肪族複素環を形成し、前記複素環は、前記基質の水溶性を高めることができるアンモニウム型、カルボン酸型又はスルホン酸型の基で置換されていてもよいか、又は、
   Ｒ_４が（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基、且つ、Ｒ_２及びＲ_３が互いに結合してそれらが結合する炭素原子と共に脂肪族炭素環を形成する。）
2. Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３及びＲ_４は互いに結合して配列：−（ＣＨ_２）_ｍ−（ｍ＝３、４又は５）を形成することを特徴とする請求項１記載のペプチダーゼ基質。
3. Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は同一又は異なって、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基を表すことを特徴とする請求項１記載のペプチダーゼ基質。
4. Ｒ _２ 、Ｒ _３ 及びＲ _４ は同一又は異なって、メチル又はエチルを表すことを特徴とする請求項３記載のペプチダーゼ基質。
5. Ｒ_２＝Ｒ_３＝Ｒ_４＝−ＣＨ_３であることを特徴とする請求項４記載のペプチダーゼ基質。
6. 光学異性体若しくはジアステレオ異性体の任意の割合の混合物、又は、光学異性体若しくはジアステレオ異性体が濃縮された形態である、下記式（ＩＡ）で表される請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
   （式中、Ｒ_０、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、ｎ、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは請求項１〜５の記載と同義。）
7. Ｒａ＝Ｒｂ＝Ｒｃ＝Ｈ、又は、Ｒａ＝Ｈ、Ｒｂ＝Ｒｃ＝Ｃｌであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
8. Ｒａ及びＲｂが互いに結合して、本発明の基質が、光学異性体若しくはジアステレオ異性体の任意の割合の混合物、又は、光学異性体若しくはジアステレオ異性体が濃縮された形態である、下記式（ＩＡ’）又は（ＩＢ’）となることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
   （式中、ｎ、Ｒ_０、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４及びＲｃは請求項１〜５の記載と同義であり、Ｒ’ｃは、水素原子又は−ＣＯＯ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基を表す。）
9. Ｒ_０は、アミノ酸基を表すか、又は、同一若しくは異なる１０以下のアミノ酸からなるペプチジル基を表すことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
10. Ｒ _０ は、アミノ酸基を表すか、又は、同一若しくは異なる６以下のアミノ酸からなるペプチジル基を表すことを特徴とする請求項９記載のペプチダーゼ基質。
11. 前記アミノ酸基、又は前記ぺプチジル基を構成するアミノ酸は、天然アミノ酸から選択され、Ｎ末端は非置換であっても、アシル基：−ＣＯＲ”（Ｒ”は（Ｃ _１ −Ｃ _６ ）アルキル基又はＯ−（Ｃ _１ −Ｃ _６ ）アルキル基）で置換されていてもよいことを特徴とする請求項９又は１０記載のペプチダーゼ基質。
12. ｎ＝０であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
13. ｎ＝１であり、Ｒ_１は、アミノ酸の側鎖を表すことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
14. Ｒ _１ は、メチル、イソプロピル、イソブチル又はベンジル基を表すことを特徴とする請求項１３記載のペプチダーゼ基質。
15. 前記ペプチジル又はアミノ酸基Ｒ_０は、ロイシンアミノペプチダーゼ、カスパーゼ−３、ＨＩＶ−１ペプチダーゼ、レニン、トロンビン、トリプターゼ、カテプシンＫ、ＡＣＥプラスメプシンＩ若しくはＩＩ、β−セクレターゼ、又は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の基質であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載のペプチダーゼ基質。
16. 触媒活性を有するペプチダーゼの存在を検出する方法であって、
    前記ペプチダーゼを含んでいる疑いがあるサンプルを請求項１〜１５のいずれか１項記載の基質と接触させる工程と、
    ＮＨとＲ_０の共有結合を切断した後、スペーサーを環化して−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_５結合を切断することによって蛍光沈殿物を形成するのに適した条件を適用する工程と、
    前記蛍光沈殿物を定量又は定性分析する工程とを含む方法。
17. 前記蛍光沈殿物の分析は、
    前記蛍光沈殿物の吸収波長の光を発生可能な光源に前記蛍光沈殿物を暴露する工程と、
    得られる沈殿物の蛍光を検出する工程とを含む、請求項１６項記載の方法。