CN102016061A - 新型肽酶底物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有下式(I)的用于检测微生物中肽酶活性的酶底物，其中：□X为S、NX1、O或NX1-CO；□R1不存在或者为如下取代基之一：Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；□R2不存在或为如下取代基之一：Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2-CO2Hα；□X1选自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基；□R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；P为肽；

Description

新型肽酶底物
本发明涉及用于检测肽酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及含有该底物的反应介质、该底物或该介质在检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌中的用途、以及使用方法。
当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物，所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此，在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。肽酶活性可以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。因此，例如丙胺酸氨基肽酶可以区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
用于检测肽酶活性的发色的酶底物由现有技术已知。尤其可以提及Manafi发表的论文(Manafi等，Microbiol Rev 55(3)：335-348，1991)，这是一篇关于用于微生物学的酶底物的综述。然而，所述的氨基肽酶底物通过水解会释放在介质中扩散的化合物(β-萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。结果导致在多相反应介质(培养皿上的菌落、组织部分等)中，无法准确定位水解的位置。还可以提及在由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO99/38995中描述的底物。然而，虽然这些底物不在培养介质中大量扩散，但是它们也具有一些缺点：它们难以合成，纯度低，产率低且它们对某些微生物有毒。
为此，本发明提出了用于检测微生物的新型肽酶底物。与现有的底物相比，这些新型的底物易于合成，且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于胶体介质中以检测微生物。由此，可以从不显示肽酶活性的菌落或细胞器中，辨别显示肽酶活性的菌落或细胞器。
在对本发明进行描述之前，给出如下定义以方便本发明的公开。
术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞或细胞器的直接或间接检测的底物。该底物尤其包含对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签的第二部分。
本发明的底物尤其适用于流式细胞术，这是因为水解产物主要保留在表达酶活性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或者甚至将其与其他样品分开。
本发明的底物还高度适用于组织酶学，这是因为水解产物主要保留在水解点上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。
由于其具有低毒性，本发明的底物高度适于监测细胞培养肽酶的活性。
本发明的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为它们形成在反应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”用于指颜色，其吸收可见光谱中的光或荧光，其在一个波长(λex)吸收且在较高的波长(λem，λem＞λex)发光。
本发明的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐的形式。
术语“肽酶”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在肽酶的酰基残基和伯胺之间形成。术语“氨基肽酶”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在氨基酸酰基和伯胺之间形成。在本申请中，术语“肽酶”在适当情况下可以指上述的肽酶以及氨基肽酶。
术语“肽”用于指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽键链。优选，所述肽为二-丙胺酸或三-丙胺酸。术语“氨基酸”用于指任何为本领域技术人员熟知的天然或非天然氨基酸。根据本发明的一个具体实施方案，氨基酸为β-丙胺酸或L-丙胺酸，或者为甘氨酸、焦谷氨酰等。
所述肽可以包含在其N末端上的封端剂。本发明的封端剂包含任何为本领域技术人员已知的能够保护胺的封端剂。例如可以提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)、9-芴基氧羰基、助溶剂如琥珀酰，或者不可代谢的氨基酸，即非天然的氨基酸如哌可酸，或者氨基酸的D形式如D-苯基丙胺酸。所述封端剂并不系统地存在于本发明的化合物中。
术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链，尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基。
术语“芳基”用于指由芳环衍生的官能团(或取代基)，例如C6-C10芳环，尤其为苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。
术语“羧基”尤其指由经由一个双键而与第一个氧原子连接且经由一个单键而与第二个氧原子相连的碳原子组成的官能团，其中所述第二个氧原子为电负性或者与氢原子相连接。取决于分子的pKa以及介质的pH，所述羧基可以呈离子化的形式，即第二个氧原子未连接H，则其为电负性。
术语“反应介质”用于指包含表达细胞或细胞器的新陈代谢和/或微生物生长所需的所有成分的介质。该反应介质可以用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或者用作微生物检测和/或识别介质。
所述反应介质可以包含一种成分或多种组合成分，例如氨基酸类、蛋白胨、烃、核苷酸、矿物质、维生素、抗体、表面活性剂、缓冲溶液、磷酸盐、铵盐、钠盐或金属盐类。
所述介质还可以包含着色剂。例如作为着色剂可以提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂例如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。
所述反应介质可以为固体、半固体或液体。术语“固体介质”用于例如指凝胶化的介质。琼脂在微生物学中为用于培养微生物的常规凝胶剂，但是可以使用明胶或琼脂糖。有些制品是可商购获得的，例如哥伦比亚琼脂、胰酪蛋白胨大豆琼脂、麦康基琼脂、沙鲍洛琼脂，或者更通常而言描述于Microbiological Media(CRC Press)手册中的那些。
所述反应介质可以为“检测和/或识别介质”，即显影介质或培养及显影介质。在第一种情况下，在接种之前培养微生物，并且在第二种情况下，检测和/或识别介质还构成培养介质。
术语“生物样品”用于指由生物流体试样衍生的临床样品，或者由任何类型食品衍生的食品样品。该样品因此可以为液体或者固体，而且可以没有限制性地提及血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，或者来自鼻子、喉咙、皮肤、伤口或脑脊髓液的试样，来自水或诸如奶或果汁的饮料、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食品样品，或者由动物饲料例如尤其由动物饮食而衍生的食品样品。所述样品还可以为来自临床环境的试样、家畜试样、来自食品、化妆品或医药产品的试样。术语“环境试样”用于尤其指由表面、液体、原料或由产物提取的试样。
在本发明中，术语“微生物”涵盖细菌、酵母，且更通常而言涵盖通常为单细胞、人眼看不见且可以在实验室复制且操作的生物体。
作为革兰氏阴性菌，可以提及如下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根(氏)菌属(Morganella)、弧菌(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌(Erwinia)、泛生菌属(Pantoea)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、狭长平胞菌(Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性菌，可以提及如下属的细菌：气球菌属(Aerococcus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯塔氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳菌属(Gardnerella)、考克斯菌属(Kocuria)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌(Micrococcus)、Falkamia、兼性双球菌属(Gemella)、小球菌属(Pediococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。
作为酵母，可以提及如下属的酵母：假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)。
本发明涉及下式(I)的用于检测肽酶活性的酶底物：
其中：
X为S、NX1、O或NX1-CO；
R1不存在或者为如下取代基之一：Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；
R2不存在或为如下取代基之一：Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2或者
X1选自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基
R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；
P为肽。
在杂环上的1位氮与2位碳之间的键可以为单键(1，2-二氢)或双键，优选双键。
当然，本发明的底物可以包含几个取代基，即在环的多个位置上具有几个R1和R2基团。当R1和/或R2为烷基或芳基时，还可以用一个或多个诸如OH、羧基、Br、Cl、F或I的取代基将其取代。当R2为O-CH2-O时，R2为与氨基苯基稠合的环，其中两个环原子是共用的。
根据本发明的第一种实施方式，当X为NX1-CO时，包含X的环为6元环，其在所述6元环的3位上包含O，而在所述6元环的4位上包含NX1。
根据本发明的第二种实施方式，当X为NX1-CO时，包含X的环为6元环，其在所述6元环3位上包含NX1，并且一个C经由双键与所述6元环4位上的O连接。
根据本发明的一个优选实施方案，X为S。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为NX1。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为O。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为NX1-CO。
根据本发明的一个具体实施方案，R1在5位上。
根据本发明的一个具体实施方案，R2在4’位上。
根据本发明的另一个具体实施方案，R2在5’位上。
根据本发明的另一个具体实施方案，R2在4’位和5’位上。
根据本发明的一个具体的实施方案，P在其N末端上包含封端剂。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O，
·R1和R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选选自β-丙胺酸、L-丙胺酸和甘氨酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1和R2不存在，P为β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1和R2不存在，P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1和R2不存在，P为甘氨酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1为Cl；
·R2不存在；
·P为肽。
优选P为氨基酸，优选为L-丙胺酸。优选R1在5位上。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1为5位上的Cl，R2不存在且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1为CH3；
·R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1为5位上的CH3，R2不存在且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1不存在；
·R2为Cl；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸或β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为5’位上的Cl，且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为5’位上的Cl，且P为β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1不存在；
·R2为O-CH2-O；
·P为肽，优选氨基酸，优选选自L-丙胺酸和β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为与4’和5’位上的氨基环稠合的O-CH2-O，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为与4’和5’位上的氨基环稠合的O-CH2-O，并且P为β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1不存在；
·R2为O-CH3；
·P为肽。
优选P为氨基酸，优选L-丙胺酸或β-丙胺酸。优选R2在4’位和5’位上。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为在4’和5’位上的O-CH3，并且P为β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为在4’和5’位上的O-CH3，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为O；
·R1不存在；
·R2为F；
·P为肽。
优选P为氨基酸，优选为β-丙胺酸。优选R2在5’位上。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为O，R1不存在，R2为在5’位上的F，并且P为β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1；
·X1为CH3；
·R1和R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1，X1为CH3，R1和R2不存在，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1；
·X1为C2H4Ph；
·R1和R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1，X1为C2H4Ph，R1和R2不存在，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1；
·X1为C2H4Ph；
·R1不存在；
·R2为Cl；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1，X1为C2H4Ph，R1不存在，R2为5’位上的Cl，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1；
·X1为C2H4Ph；
·R1不存在；
·R2为O-CH2-O；
·P为肽，优选氨基酸，优选选自L-丙胺酸和β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1，X1为C2H4Ph，R1不存在，R2为与4’位和5’位上的氨基环稠合的O-CH2-O，且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1，X1为C2H4Ph，R1不存在，R2为与4’位和5’位上的氨基环稠合的O-CH2-O，且P为β-丙胺酸。
根据本发明的另一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为S；
·R1不存在；
·R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选选自L-丙胺酸和β-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为S，R1和R2不存在，且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为S，R1和R2不存在，并且P为β-丙胺酸。
根据本发明的另一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为S；
·R1不存在；
·R2为Cl；
·P为肽。
优选P为氨基酸，优选L-丙胺酸。优选R2在5’位上。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为S，R1不存在，R2为在5’位上的Cl，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为S；
·R1为CH3；
·R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为S，R1为在5’位上的CH3，R2不存在，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1-CO；
·X1为H；
·R1不存在；
·R2为Cl；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1-CO，X1为H，R1不存在，R2为在5’位上的Cl，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1-CO；
·X1为H；
·R1不存在；
·R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1-CO，X1为H，R1不存在，R2不存在，并且P为L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应上述式(I)，其中：
·X为NX1-CO；
·X1为CH3；
·R1不存在；
·R2不存在；
·P为肽，优选氨基酸，优选L-丙胺酸。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，X为NX1-CO，X1为CH3，R1不存在，R2不存在，并且P为L-丙胺酸。
优选，本发明的底物选自表1中所述的底物。
表1-本发明底物的实例
  底物   编号   X   X1   R1   R2   P
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-苯并噁唑   底物1VLS206，27 O - - - L-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基苯基)苯并噁唑 底物2 OF22A O - - - β-丙胺酸
  2-(氨基乙酰基-2′-氨基苯基)-苯并噁唑 底物3 OF30B O - - - 甘氨酸
  2-(2′-L-丙氨酰基氨基苯基)-5-氯苯并噁唑   底物435 O - Cl - L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-5-甲基苯并噁唑 底物5 O - CH3 - L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)苯并噁唑   底物6VLS283 O - - Cl L-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯-苯基)苯并噁唑   底物7OF23A O - - Cl β-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-环亚甲基二氧苯基)苯并噁唑 底物8 O - -   O-CH2-O L-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-环亚甲基二氧苯基)苯并噁唑 底物9 O - -   O-CH2-O β-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-二甲氧基苯基)苯并噁唑 底物10 VLS284 O - -   O-CH3，O-CH3 L-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-二甲氧基苯基)苯并噁唑 底物11 OF24A O - -   O-CH3，O-CH3 β-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氟苯基)苯并噁唑 底物12 OF28A O - - F β-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-3-甲基1苯并咪唑   底物1343 NX1 CH3 - - L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-3-苯基乙基1苯并咪唑   底物1457 NX1 C2H4Ph - - L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯-苯基)-3-苯基乙基苯并咪唑   底物1559 NX1 C2H4Ph - Cl L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-亚甲基二氧苯基)-3-苯基乙基苯并咪唑 底物1660 NX1 C2H4Ph - O-CH2-O L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-苯并噻唑 底物17 OF38A S - - - L-丙胺酸
  2-(β-丙氨酰基-2′-氨基苯基)苯并噻唑 底物18 OF33A S - - - β-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)苯并噻唑 底物19 S - - Cl L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-5-甲基苯并噻唑 底物20 S - CH3 - L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯-苯基)-4-喹唑酮 底物21 VLS289 NX1-CO H - Cl L-丙胺酸
  底物   编号   X   X1   R1   R2   P
  2-(L-丙氨酰基-2’-氨基苯基)-3-氢-4-喹唑酮   底物22VLS298 NX1-CO H L-丙胺酸
  2-(L-丙氨酰基-2’-氨基苯基)-3-甲基-4-喹唑酮   底物23VLS297 NX1-CO CH3 L-丙胺酸
本发明还涉及包含至少一种上述酶底物的反应介质。
优选所述反应介质为微生物检测和/或识别介质，所述介质包含至少一种上述酶底物。
优选所述底物的浓度为1-1000mg/l，优选为10-500mg/l。
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明的所述检测和/或识别介质还包含至少一种其他的酶底物，其对与通过本发明底物检测到的酶活性不同的酶活性具有特异性。
所述其他底物的酶水解产生可检测的信号，其与经由本发明底物检测到的信号不同，例如不同颜色或荧光的产物，以允许诸如证实一种或多种微生物的检测和/或识别和/或定量。对于其他特定的底物，可以使用常用于检测微生物的其他底物。其他特定酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员将可以容易地根据所用的底物而决定该浓度。作为示例，可以将本发明的底物与肽酶、Osidase、酯酶或还原酶底物结合使用。具体而言，可以将本发明底物(P为β-丙胺酸)与Osidase底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-配糖体或茜素-β-半乳糖苷结合使用。还可以将本发明底物(P为L-丙胺酸)与酯酶底物，例如辛酸5-溴-6-氯-3-吲哚基酯或磷酸5-溴-3-吲哚基酯结合使用。
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明的所述检测和/或识别介质还包含至少一种对通过本发明底物所检测到的酶活性具有特异性的其他酶底物。通过对底物的具体选择，可以识别表达相同酶活性的微生物组。其他具体酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员应可以根据所用的底物而决定该浓度。具体而言，可以将本发明底物(P为L-丙胺酸)与如申请WO2006030119中所述的用于L-丙胺酸氨基肽酶的底物，例如L-alaninepentylresorufamine结合使用。
本发明还涉及上述酶底物或者上述检测和/或识别介质用于检测微生物中至少一种肽酶活性的用途。
本发明还涉及上述酶底物或者上述检测和/或识别介质用于分离革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的用途。
本发明还涉及检测微生物中至少一种肽酶活性的方法，其特征在于其包含如下步骤或者由如下步骤组成：
a)提供上述检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种肽酶活性的存在。
所述微生物的接种可以通过任何一种为本领域技术人员所知的接种技术而进行。温育步骤可以在使需要检测的酶活性的表达为最佳且本领域技术人员可以根据待检测的酶活性而易于选择的温度下而进行。步骤d)可以通过视觉检测、通过比色计或荧光计而进行。在步骤d)中，肽酶活性的存在可以单独发现，或者与至少一种其他酶活性一起发现。
本发明还涉及区分细菌是否属于革兰氏阳性菌或术语革兰氏阴性菌的方法，其特征在于其包含如下步骤或者由如下步骤组成：
a)提供上述检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种肽酶活性的存在。
如上所述，所述微生物的接种可以通过任何一种为本领域技术人员所知的接种技术而进行。温育步骤可以在使需要检测的酶活性的表达为最佳且本领域技术人员可以根据待检测的酶活性而易于选择的温度下而进行。步骤d)可以通过视觉检测、通过比色计或荧光计而进行。在步骤d)中，肽酶活性的存在可以单独显露，或者与至少一种其他酶活性一起显露。
为了说明而给出以下没有限制性的实施例。通过它们可以更加清楚地理解本发明。
实施例1-合成底物
·X为S
1.合成2-(2′-氨基苯基)苯并噻唑
1.1 2-(2′-硝基苯基)苯并噻唑
使用油浴，将1eq的2-氨基苯酚、乙醇和1eq的2-硝基苯甲醛的混合物在110℃下回流1小时。
发明人将该混合物冷却至室温并且通过过滤回收沉淀。为了回收最大量的产物，将圆底烧瓶用滤液洗涤以蒸馏出大部分。
在减压下将固体在干燥器中干燥以得到中间产物。
将以上得到的固体溶解于100ml二氯甲烷中，然后将1eq的2，3-二氰基-5，6-二氯-对苯醌在室温下以小份加入。使反应过夜，在过滤后，将玻璃器皿用DCM洗涤以回收最大量的溶解于DCM的产物。
在减压下将溶剂蒸出以得到产物。
1.2 2-(2′-氨基苯基)苯并噻唑
将15g(0.15mol)多聚磷酸至于250ml的烧杯中，然后加入4.56g(0.036mol)2-氨基苯硫酚和5.00g(0.036mol)邻氨基苯甲酸。将该混合物在沙浴中用煤气灯加热在200-220℃下加热3小时，并用玻璃搅拌器以规则的间隔进行搅拌。将该混合物缓慢冷却至60℃并加入碾碎的冰。
然后，加入60ml水，并将所得的溶液用氢氧化钠(NaOH)溶液碱化至达到9-10的pH。由此得到橙色沉淀，通过Buchner漏斗过滤而回收。将所得的固体干燥，然后溶解于50ml二氯甲烷，然后用水洗涤3次。收集有机相，然后用MgSO4干燥并过滤，然后蒸除溶剂以得到粗产物。通过柱色谱进行纯化后得到3.01g黄色/绿色固体，产率为64％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝6.40(2H，宽峰s，Ar-NH2)，6.75(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，6.78(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.23(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.35(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.46(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.71(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，7.87(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，7.97(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
2.合成2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)苯并噻唑(底物17)
2.1混和酸酐法
将质量1.51g(0.008mol)的Boc-Ala-OH溶解于10ml干燥的四氢呋喃中并将CaCl2阱加到圆底烧瓶的颈处以使其不渗透。对所述混合物进行磁力搅拌，并使用与NaCl盐混和的冰而将温度降至-15℃。
一旦达到该温度，将混合物再搅拌5分钟。然后加入1.01g(0.010mol)N-甲基吗啉，注意确保在进行下一个步骤之前使温度再次降至-15℃。然后小心地滴入1.09g(0.008mol)甲酸异氯丁酯；在加入每一滴时，如预期该混合物变成云雾状。
然后将1.36g(0.006mol)2-(2’-氨基苯基)苯并噻唑溶解于最少量的干燥THF，并将其加入混合物中。在2小时后移开冰浴并将混合物搅拌过夜。
将溶液过滤，将圆底烧瓶用通常的THF洗涤并保留滤液。
然后用巴斯德滴管将溶液转移到400ml的含有冰、水以及碳酸钠(Na2CO3)的烧杯中。然后将该溶液搅拌2小时直至得到澄清的溶液。然后将该溶液用一个小的Buchner漏斗过滤，然后将沉淀溶解于乙醇中以重结晶。
得到质量为0.87g的OF37A，浅褐色/褐色粉末，产率37％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝1.42(9H，s，C-CH3x3)，1.57(3H，d，J＝7.92Hz，CH3-CH-)，3.50(1H，s，NH-Ar)，4.52(1H，qt，NH-CH-CH3)，4.51(21H，d，NH-CH)，7.18(1H，t，J＝7.42Hz，Ar-H)，7.44(1H，t，J＝7.42Hz，Ar-H)，7.48(1H，t，J＝7.42Hz，Ar-H)，7.49(1H，t，J＝7.42Hz，Ar-H)，7.87(1H，d，J＝7.92Hz，Ar-H)，7.92(1H，d，J＝7.92Hz，Ar-H)，8.14(1H，d，J＝7.92Hz，Ar-H)，8.82(1H，d，J＝7.92Hz，Ar-H)。
2.2去保护
将质量0.30g(0.00075mol)的要去保护的化合物置于配有CaCl2阱的圆底烧瓶中，然后加入7ml三氟乙酸。将该化合物磁力搅拌过夜。
将TFA(三氟乙酸)蒸除以得到0.35g的三氟乙酸盐形式的OF38A，浅褐色/褐色粉末，产率88％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，DMSO)：δ＝1.62(3H，d，J＝7.42Hz，CH3-CH-)，4.35(1H，sx，NH2-CH-CH3)，5.31(2H，宽峰s，NH2)，7.37(1H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.53(1H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.61(1H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.62(1H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，8.02(1H，d，J＝7.42Hz，Ar-H)，8.12(1H，d，J＝7.42Hz，Ar-H)，8.20(1H，d，J＝7.42Hz，Ar-H)，8.31(2H，Ar-H+NH)。
m.p：150-154℃。
3.合成2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)苯并噻唑(底物19)
3.1 2-(2’-硝基-5’-氯苯基)苯并噻唑
将1.18g(0.0094mol)2-氨基苯硫酚和1.74g(0.0094mol)5-硝基-3-氯苯甲醛在乙醇(150ml)中的混合物回流2小时。在冷却至室温之后，将溶液在减压下浓缩。将剩余固体稀释于水和乙酸乙酯的混合物(500ml)中，将水相用乙酸乙酯(2×500ml)再萃取两次。将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以得到粗产物，从乙醇中进行重结晶。得到质量为0.66g的褐色固体OF31A，产率25％。
由NMR所得的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝7.55(4H，m，Ar-H)，7.79(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，7.90(1H，s，Ar-H)，8.10(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)。
3.2 2-(2’-氨基-5’-氯苯基)苯并噻唑
将0.65g(0.00223mol)的2-(2’-硝基-5’-氯苯基)苯并噻唑OF31A和2.52g(0.01118mol)的SnCl2·2H2O在100ml乙醇中的混合物在70℃下加热2小时。使用薄层色谱的验证步骤显示该混合物中不再含有任何起始反应物。
在将混合物冷却至室温之后，将该溶液倒入含有冰的烧杯中。在将水相用乙酸乙酯萃取之前将pH通过加入碳酸氢钠NaHCO3水溶液(5％)而调节至微碱性的pH(pH 7-8)。
将由此得到的水相用盐水(NaCl的饱和水溶液)洗涤，然后用硫酸钠干燥以得到0.31g OF53A，黄褐色固体，产率为53％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝6.41(2H，宽峰s，Ar-NH2)，6.74(1H，d，J＝9Hz，Ar-H)，7.42(3H，m，Ar-H)，7.67(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，7.90(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，7.98(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
3.3 2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)苯并噻唑
3.3.1混和酸酐法
将质量0.29g(0.00153mol)的Boc-L-Ala溶解于10ml干燥的四氢呋喃。将CaCl2阱加到圆底烧瓶的颈处以使其不渗透。对所述混合物进行磁力搅拌，并使用与NaCl盐混和的冰而将混合物的温度降至-15℃。
一旦达到该温度，将混合物再搅拌5分钟。然后加入0.19g(0.00191mol)N-甲基吗啉，注意确保在进行下一个步骤之前使温度再次降至-15℃。然后小心地滴入0.21g(0.00153mol)甲酸异氯丁酯；在加入每一滴时，如预期该混合物变成云雾状。
数分钟之后，将0.30g(0.00115mol)2-(2’-氯苯基)苯并噻唑溶解于最少量的干燥THF中，并将其加入混合物中。在2小时后移开冰浴并将混合物搅拌过夜。
将溶液过滤，将圆底烧瓶用通常的THF洗涤并保留滤液。用巴斯德滴管将溶液转移到400ml的含有冰、水以及碳酸钠(Na2CO3)的烧杯中。然后将该混合物搅拌2小时直至得到澄清的溶液。将该溶液用一个小的Buchner漏斗过滤，然后将沉淀溶解于甲醇中以重结晶。
得到质量为0.18g的OF55A，浅绿色固体，产率36％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝1.41(9H，s，3xCH3)，1.56(1H，d，J＝7Hz，CH-CH3)，1.58(3H，d，J＝4Hz，CH3-CH)，6.45(1H，宽峰s，NH)，6.74(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.45(3H，m，Ar-H)，7.66(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.92(2H，m，Ar-H)。
3.3.2去保护
将质量0.18g(0.00042mol)的要去保护的化合物置于配有CaCl2阱的圆底烧瓶中，然后加入5ml三氟乙酸。将该化合物磁力搅拌过夜。
将TFA蒸除以得到0.22g的三氟乙酸盐形式的OF57A，为粘状的褐色固体，产率94％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，DMSO)：δ＝1.50(1H，d，J＝7Hz，CH-CH3)，1.55(3H，d，J＝4Hz，CH3-CH)，4.80(3H，宽峰s，NH3)，6.87(1H，d，J＝9Hz，Ar-H)，7.21(1H，d，J＝9Hz，Ar-H)，7.52(1H，m，Ar-H)，8.10(4H，m，Ar-H)。
m.p.：124-128℃。
·X为O
1.合成2-(2′-氨基苯基)苯并噁唑
1.1 2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑
使用油浴将8.73g(0.0800mol)的2-氨基苯酚、20ml乙醇和12.09g(0.0800mol)2-硝基苯甲醛的混合物在110℃下回流一小时。
将该混合物冷却至室温并且通过过滤而回收沉淀。为了回收最大量的产物，将圆底烧瓶用滤液洗涤以蒸出大部分。
在减压下将固体在干燥器中干燥以得到13.25g的2-(2’-硝基苯亚甲基氨基)苯酚，产率为69％。
将以上得到的固体溶解于100ml二氯甲烷中，然后将12.43g(0.0547mol)2，3-二氰基-5，6-二氯-对苯醌在室温下以小份加入。使反应过夜，在过滤后，将玻璃器皿用DCM洗涤以回收最大量的产物。
然后在减压下将溶剂蒸除以得到8.39g 2-(2-硝基苯基)苯并噁唑，褐色-浅褐色固体，产率64％。
由NMR所得的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝7.40(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.42(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.50(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.72(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.73(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.80(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.89(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，8.15(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
m.p.：104-107℃。
1.2 2-(2′-氨基苯基)-苯并噁唑
将8g(0.033mol)2-(2’-硝基-5’-氯苯基)苯并噁唑和37.58g(0.167mol)SnCl2·2H2O在200ml的乙醇中的混合物在70℃下直至反应完全结束。
在将混合物冷却至室温之后，将该溶液倒入含有冰的烧杯中。在将水相用乙酸乙酯萃取之前将pH通过加入碳酸氢钠NaHCO3水溶液(5％)而调节至微碱性的pH(pH 7-8)。
将由此得到的水相用盐水(NaCl的饱和水溶液)仔细洗涤，并且用硫酸钠干燥以得到4.72g OF10C，黄褐色固体，产率为67％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝6.20(2H，宽峰s，Ar-NH2)，6.78(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，6.81(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.31(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.32(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.34(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.58(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.72(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，8.08(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
m.p.：100-104℃。
2.合成2-(氨基乙酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑(底物3)
2.1混和酸酐法
将质量1.40g(0.008mol)的N-t-Boc-Gly溶解于10ml干燥的四氢呋喃中并将CaCl2阱加到圆底烧瓶的颈处以使其不渗透。对所述混合物进行磁力搅拌，并使用与NaCl盐混和的冰而将混合物的温度降至-15℃。
一旦达到该温度，将混合物再搅拌5分钟。然后加入1.01g(0.010mol)N-甲基吗啉，注意确保在进行下一个步骤之前使温度再次降至-15℃。然后小心地滴入1.09g(0.008mol)甲酸异氯丁酯；在加入每一滴时，如预期该混合物变成云雾状。
数分钟之后，将1.26g(0.006mol)2-(2’-氨基苯基)苯并噁唑溶解于最少量的干燥THF中，并将其加入混合物中。在2小时后移开冰浴并将混合物搅拌过夜。
将溶液过滤，将圆底烧瓶用通常的THF洗涤并保留滤液。出现少许沉淀。用巴斯德滴管将该溶液转移到400ml的含有冰、水以及碳酸钠(Na2CO3)的烧杯中。然后将该混合物搅拌2小时直至得到澄清的溶液。将该溶液静止2小时直至得到清澈溶液。用一个小的Buchner漏斗过滤，然后将沉淀溶解于甲醇中以重结晶。
得到质量为0.98g的OF27A，白色粉末，产率45％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝1.47(9H，s，C-CH3x3)，4.05(1H，d，J＝8Hz，-NH-CH2)，4.17(2H，d，J＝8Hz，CO-CH2-NH)，5.38(1H，宽峰s，Ar-NH-)，7.20(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.40(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.50(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.60(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.80(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，7.85(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，8.25(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，8.85(1H，d，J＝8Hz，Ar-H).
2.2去保护
将质量0.25g(0.00068mol)的要去保护的化合物置于配有CaCl2阱的圆底烧瓶中，然后加入7ml三氟乙酸。将该化合物磁力搅拌过夜。
将TFA蒸除以得到0.29g的三氟乙酸盐形式的OF30B，为浅褐色粉末，产率86％。
由NMR得到的数据如下：
1H NMR(270MHz，DMSO)：δ＝4.05(2H，d，J＝8Hz，CH2-NH3)，4.90(3H，宽峰s，NH3)，7.40(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.46(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.50(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，7.70(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.85(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，8.20(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)8.25(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)，8.40(1H，d，J＝8Hz，Ar-H)。
ESI-MS：C15H15N3O2 +m/z 269.77[M+H]+，226.96[M+H]-，C15H15N3O2 +的高分辨M.S.E.I.，分子离子的计算质量：268.1081[M+H]+，实测质量：268.1083[M+H]+。
m.p.：219-222℃。
·X为NX1-CO
1合成2-(2′-氨基-5′-氯苯基)-4-喹唑酮
1.1合成1，2-二氢-2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮(编号：VLS 276)
将质量为2.31g(0.017mol)2-氨基苯甲酰胺和3.14g(0.017mol)3-氯-6-硝基苯甲醛在乙醇中回流1小时。然后将该混合物冷却，收集所得的橙色晶体并在减压下在干燥器中干燥。得到质量为3.97g的浅橙色晶体，产率为76％，测量的熔点为234-236℃。
由NMR所得的数据如下：
1H-NMR(DMSO)：δ6.35(1H，t，J＝2Hz，CH)，6.70(1H，d，J＝1Hz，Ph-H(8H))，6.80(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(6H))，7.05(1H，s(宽峰)，NH)，7.25(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(7H))，7.65(1H，d，d，J＝6Hz，J＝1.5Hz，Ph-H(5H))，7.75(1H，d，d，J＝9Hz，J＝3Hz，Ph-H(4’H))，7.85(1H，d，J＝3Hz，Ph-H(6’H))，8.15(1H，d，J＝9Hz，Ph-H(3’H))，8.30(1H，d(宽峰)，NH-CO)，C14H10ClN3O3的高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量304.0483(M+H)+，实测质量：304.0482。
υmax cm-1 1661(C＝ONH)，1564(NO2)，1358(NO2)，1602(C＝N)，774(C-C1)。
1.2 2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮的氧化(编号：VLS 278)
将质量为9.10g(0.03mol)2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮溶解于40ml无水丙酮中并且用4.74g(0.03mol)的高锰酸钾在无水丙酮中的溶液进行处理。在室温下将该溶液在2-3小时内滴入混合物中。然后将反应搅拌过夜。通过加入过量的固体重亚硫酸钠而除去过剩的KMnO4。然后将溶液过滤并蒸发。得到质量为2.26g的灰白色粉末，产率为25％，测量的熔点为276-278℃。
由NMR得到的数据如下所示：
C14H8ClN3O3的高分辨M.S.E.I，分子离子的计算质量：302.0327(M+H)+。实测质量：304.0327。1H-NMR(DMSO)：δ7.55(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(7H))，7.65(1H，d，J＝8Hz，Ph-H(4’H))，7.85(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(6H))，7.90(1H，d，d，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H(5H))，8.05(1H，d，J＝2Hz，Ph-H(6’H)，8.25(1H，d，J＝8Hz，Ph-H(3’H)。υmax cm-1 3132(NH2)，3070(NH2)，1578(NO2)，1368(NO2)，1603(NH)，1660(CONH)，1531(C＝N)，772(C-Cl)。
1.3合成2-(2’-氨基-5’-氯苯基)-4-喹唑酮-化合物VLS 278的还原(VLS285)
将质量为4.96g(0.028mol)SnCl2·2H2O溶解于40ml HCl和5ml冰乙酸的混合物中。将该溶液在120℃下回流并将1.34g(0.0044mol)化合物VLS 278以小份加入。将该混合物在120℃下保持半小时，然后降至100℃保持2-3小时。得到黄色固体并经由过滤回收，将该固体溶解于水，通过加入4M的NaOH溶液使其具有碱性。收集该浅黄色沉淀并在减压下用干燥器干燥。得到质量为1.17g的黄色粉末，产率为98％，测量熔点为286-288℃。
由NMR得到的数据如下：
1H-NMR：(DMSO)δ6.80(1H，d，J＝8.6Hz，Ph-H(3’H))，7.20(1H，d，d，J＝8.6Hz，J＝1Hz，Ph-H)，7.30(1H，s(宽峰)，NH)，7.45(1H，t，J＝8Hz Ph-H)，7.70(1H，d J＝7Hz，Ph-H)，7.75(1H，t，J＝7Hz，Ph-H)，7.90(1H，d J＝2Hz，Ph-H(6’H)，8.10(1H，d，d，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)。
υmax cm-1 3465(NH2)，3278(NH2)，1674(CO)，1582(NH)，1560(C＝N)，1159(C-N)，766(C-Cl)。
2.合成2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)-4-喹唑酮(底物21)
2.1混和酸酐法(VLS 286 rep)
将质量0.50g(0.002mol)的t-Boc-L-Ala溶解于10ml无水四氢呋喃中。将温度降至-15℃并且在1分钟内加入0.34g(0.0032mol)NMM(N-甲基吗啉)，然后在相同温度下加入0.36g(0.00266mol)IBCF(氯甲酸异丁酯)。在添加后，将该混合物搅拌5-10分钟，然后在相同温度下在2分钟内滴加0.55g(0.002mol)2-(2’-氨基-5’-氯苯基)-4-喹唑酮溶解于最少量的无水THF，即5ml中的溶液。将该混合物用冰浴保持2-3小时，然后在室温下过夜。然后将该混合物过滤以除去NMM盐，将滤液的量减少以便将其倒入含有水和碳酸钠的烧杯中。回收黄色固体并用乙醇进行重结晶。得到质量为0.43g黄色粉末，产率为50％，测量的熔点为268-270℃。
由NMR得到的数据如下：
1H-NMR：(DMSO)δ1.20(9H，s，(CH3)3C)，1.18(1H，s(宽峰)，NHCO)，1.40(1H，d，J＝7Hz，CH3)，1.37(1H，d，J＝2Hz，NH)，4.05(1H，四重峰，J＝7Hz，alaH)，7.25(1H，t，J＝7Hz，NH-CO(CH3)3)，7.3-7.42(2H，m，Ph-H)，7.55(1H，t，J＝7Hz，Ph-H)，7.65(1H，d，Ph-H(3’H))，8.00(1H，d，J＝7Hz，Ph-H(4’H))，8.60(1H，d，J＝2Hz，Ph-H)，8.65(1H，s，Ph-H(6’H))。υmax cm-1 1668(CONH)，1608(NH)，1560(C＝N)，1169(C-N)，722(C-Cl)。
2.2去保护(编号：VLS 289)
通过加入三氟乙酸而将2-(2’-氨基-5-氯苯基)-4-喹唑烷酮的t-Boc-L-Ala衍生物去保护。将0.30g(0.0007mol)的2-(t-Boc-L-Ala-氨基-5-氯苯基)-4-喹唑烷酮和5ml三氟乙酸在室温下混和过夜。将剩余的TFA蒸除，并将由此得到的褐色固体在减压下在干燥器中干燥。得到质量为0.26g(0.00057mol)的橙褐色固体，产率为81％且测量熔点为268-270℃。
由NMR得到的数据如下：
1H-NMR：(DMSO)δ1.40(3H，d，CH3)，3.40(1H，四重峰，H-ala)，7.55(1H，t，J＝7Hz，Ph-H)，7.67(1H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)，7.71(1H，d，J＝8Hz，Ph-H)，7.83(1H，m，Ph-H)，7.90(1H，d，J＝8Hz，Ph-H)，8.20(1H，d，d，J＝8Hz，J＝1Hz，Ph-H)，8.30(2H，s(宽峰)，NH2)，10.92(1H，s(宽峰)，NHCO)。υmaxcm-1 1667(CONH)，1605(NH)，1560(C＝N)，1435(CH3)，1181(C-N)，770(C-Cl)。
·X为NX1
1.合成2-(2’-氨基-4′，5′-环亚甲基二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-氨基-4′，5′-亚甲基二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
1.1合成2-(2’-硝基-4’，5’-环亚甲基二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-硝基-4’，5’-亚甲基二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
1.1.1 N-苯乙基-2-硝基苯胺(编号：VLS 209)
在室温下，将质量为4.8g(0.04mol)2-苯乙基胺滴入5.6g(0.04mol)2-氟硝基苯和11.06g(0.08mol)无水碳酸钠在30ml DMSO中的混合物中。将该混合物在100℃下加热3小时。然后将该混合物冷却至室温并加入100ml水中，得到浅橙色化合物的沉淀。通过过滤回收固体并在减压下用干燥器进行干燥。得到质量为9.4g的橙色晶体，产率98％。测量的熔点与理论值相符，即64-66℃。
由NMR所得的数据如下：
1H-NMR：(CDCl3)δ3.00(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ3.55(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ6.65(1H，m，Ph-H)，δ6.85(1H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)，δ7.20-7.50(6H，m，Ph-H)，δ8.10(1H，s(宽峰)，NH)，δ8.20(1H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)。
1.1.2 N-苯乙基-1，2-二氨基苯(编号：VLS 210)
室温下，在氮气下将0.38g(0.01mol)硼氢化钠溶液在磁力搅拌下加入0.52g(0.002mol)乙酰丙酮化铜在乙醇中的悬浮液中。将在乙醇中的2.42g(0.01mol)VLS209的硝基化合物加入该溶液中，然后加入在乙醇中的0.76g(0.02mol)硼氢化钠。在室温下，将该混合物在氮气下搅拌过夜。然后将混合物浓缩以除去过剩的乙醇并加入水。然后用2×20ml DCM进行萃取，并将有机相用水洗涤数次，用碳酸钾干燥并在旋转蒸发仪上浓缩。得到质量为1.69g的黑色油状液体，然后将其固化，产率为80％。测得的熔点与理论值相符，即42-44℃。
由NMR得到的数据如下：：
1H-NMR：(CDCl3)δ2.95(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ3.27(2H，s(宽峰)，NH2)，δ3.38(2H，t，J＝7Hz，-CH2)，δ6.69(3H，m，Ph-H)，δ6.82(1H，m，Ph-H)，δ7.10-7.40(5H，m，Ph-H)。
1.1.3 2-(2’-硝基-4′，5′-环亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(编号：VLS213)(或2-(2’-硝基-4′，5′-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
在室温下，将8.60g(0.014mol)过硫酸氢钾(过一硫酸钾)在15分钟内及磁力搅拌下加入5.08g(0.024mol)N-苯乙基-1，2-二氨基苯、4.8g(0.024mol)6-硝基胡椒醛在25ml DMF和1ml水中的溶液中。由于该反应为放热反应，将混合物用水浴冷却并搅拌过夜。然后将水加入混合物中，并用DCM连续进行两次萃取。将合并的有机相用水洗涤数次，干燥(MgSO4)并浓缩以形成黄色/褐色的粗产物。用乙醇进行重结晶以纯化该化合物。得到质量为6.19g的褐色晶体，产率为67％，测量的熔点为162-164℃。
由NMR得到的数据如下所示：
C22H17N3O4的高分辨M.S.E.I，分子离子的计算质量：388.1292(M+H)+。实测质量：388.1297。1H-NMR：(CDCl3)δ3.10(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ4.20(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ6.02(1H，s，Ph-H)，δ6.18(2H，s，O-CH2-O)，δ6.80(2H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)，δ7.10-7.40(5H，m，Ph-H)，δ7.48(1H，m，Ph-H)，δ7.65(1H，s，Ph-H)，δ7.80(1H，m，Ph-H)。
υmax cm-1 1364(NO2)，1523(NO2)，1610(C＝N)，1152(C-N)，1207(C-N)，1089(C-O)，1473(C-H)，728(-CH2)。
1.2.合成2-(2’-氨基-4’，5’-环亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-氨基-4’，5’-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
室温下，在氮气下将0.11g(0.003mol)硼氢化钠溶液在磁力搅拌下加入0.16g(0.0006mol)乙酰丙酮化铜在乙醇中的悬浮液中。将在乙醇中的1.07g(0.003mol)的硝基化合物VLS213加入该溶液中，然后加入在乙醇中的0.23g(0.006mol)硼氢化钠。在室温下，将该混合物在氮气下搅拌过夜。然后将混合物浓缩以除去过剩的乙醇并加入水。然后用2×20ml DCM进行萃取，并将有机相用水洗涤数次，干燥(K2CO3)并在旋转蒸发仪上浓缩。得到质量为0.92g的褐色粉末，产率为87％。测得的熔点为170-172℃。
由NMR得到的数据如下：
C22H19N3O2的高分辨M.S.E.I：分子质量的计算值：358.1550(M+H)+。实测质量：358.1550。
1H-NMR：(CDCl3)δ3.00(2H，t，J＝7Hz-CH2-)，δ4.40(2H，t，J＝7Hz，-CH2)，δ6.00(2H，s，O-CH2-O)，δ6.35(1H，s，Ph-H(6’H)，δ6.50(1H，s，Ph-H(3’H))，δ7.00(2H，m，Ph-H)，δ7.20-7.40(5H，m，Ph-H)，δ7.55(1H，m，Ph-H)，δ7.85(1H，m，Ph-H)。
υmax cm-1 3434(N-H)，3350(N-H)，1618(C＝N)，1219(C-O)，1037(C-N)，1157(C-N)，1495(Ar)，1473(Ar)，1521(Ar)，728(-CH2-)。
2.合成2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-环亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(底物16)(或2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
将质量0.50g(0.0026mol)的t-Boc-L-丙氨酰基溶解于10ml无水DCM中，将0.54g(0.0026mol)二环己基碳二亚胺在搅拌下加入该溶液中，然后加入0.35g(0.0026mol)羟基苯并三唑。将该混合物在室温下搅拌45分钟，然后在使反应过夜之前加入0.65g(0.0019mol)2-(2’-氨基-4’，5’-亚甲二氧二-1，4-环氧丁基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-氨基-4’，5’-亚甲基二氧苯基)-苯乙基苯并咪唑)。第二天，将该混合物通过硅藻土过滤并将溶剂蒸除，然后将所得液体倒入水/冰混合物中。将由此得到的油状沉淀收集起来，溶解于乙酸乙酯中并用10％NaHCO3溶液洗涤数次，然后用水洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并浓缩。通过加入在乙酸乙酯中的HCl饱和溶液而将由此得到的褐色固体去保护。将沉淀用饱和的Na2CO3水溶液和10mlDCM搅拌。将有机相分开并干燥(MgSO4)然后浓缩。得到质量为0.37g的褐色固体，产率38％，测量的熔点为80-82℃。
将该化合物用柱色谱(硅胶)进行纯化，得到黄色/褐色固体。
由NMR得到的数据如下：
1H-NMR：(CDCl3)δ1.30(3H，d，J＝6Hz，ala CH3)，1.50(2H，s(宽峰)，NH2)，3.07(2H，t，J＝7Hz，CH2)，3.40(1H，四重峰，ala H)，4.45(2H，t，J＝7Hz，CH2)，6.04(2H，s，CH2O2)，6.58(1H，s，Ph-H(6’H))，6.85(2H，m，Ph-H(6H，7H))，7.15(3H，m，Ph-H)，7.35(2H，d，d，Ph-H(5H，8H))，8.10(1H，s，Ph-H(3’H))，υmax cm-1 1667(C＝O)，1622(C＝N)，1239(C-O)，1152(C-N)，728(-CH2-)。
3.合成2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(底物14＝VLS237)
2-(2’-硝基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑：该底物以与2-(2’-硝基-4’，5’-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑类似的方式合成。得到白色晶体，产率：78％，测量的熔点为128-130℃。
由NMR得到的数据如下：
C21H17N3O2高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量344.1394(M+H)+。实测质量：344.1394。1H-NMR：(CDCl3)δ3.07(2H，t，J＝6.93Hz，-CH2-)，4.20(2H，t，J＝6.93Hz，-CH2-N)，6.79(2H，dd，J＝7.67和1.24Hz，Ph-H)，6.85(1H，dd，J＝7.42 and 1.73Hz，Ph-H)，7.17(3H，m，Ph-H)，7.36(2H，m，Ph-H)，7.47(1H，m，Ph-H)，7.53(1H，t，J＝7.42Hz，Ph-H)，7.63(1H，t，J＝7.92Hz，Ph-H)，7.81(1H，m，Ph-H)，8.17(1H，dd，J＝8.16and 1.48Hz，Ph-H)。IR：υmax cm-11520(NO2)，1358(NO2)，1454(C＝N)，1155(C-N)，746(-CH2-)。
2-(2’-氨基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑：该底物以与2-(2’-氨基-4’，5’-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(23页，18行)类似的方式合成。得到产率为77％的褐色粉末，测量熔点为130-132℃。由NMR得到的数据如下：
C21H19N3高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量：314.1652(M+H)+。实测质量：314.1652。1H-NMR：(CDCl3)δ3.10(2H，t，J＝7.92Hz，-CH2-)，δ4.40(2H，t，J＝7.92Hz，-CH2-)，δ4.65(2H，s(宽峰)，NH2)，δ6.80-7.90(13H，m，Ph-H)。IR：υmax cm-1 3417(-NH2)，3400(NH2)，1616(C＝N)，1484(C-H)，1454(C-H)，1155(C-N)，733(CH2)，698(CH2)，1591(Ph)，1484(Ph)。
2-(L-丙氨酰基-2’-氨基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑：该底物以与2-(L-丙氨酰基-2’-氨基-4’，5’-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(25页，26行)类似的方式合成。得到产率为58％的褐色/褐色粉末，测量的熔点为80-82℃。由NMR得到的数据如下：
C25H24N4O3高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量：429.1921(M+H)+。实测质量：429.1926。1H-NMR：(CDCl3)δ1.30(3H，d，J＝6Hz，ala CH3)，1.50(2H，s(宽峰)，NH2)，3.07(2H，t，J＝7Hz，CH2)，3.40(1H，q，J＝6Hz，ala-H)，4.45(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，6.04(2H，s，-CH2O2-)，6.58(1H，s，C6′-H)，6.85(2H，m，C6-H，和C7-H)，7.15(3H，m，Ph-H)，7.35(2H，dd，J＝7Hz，J＝2Hz，C5-H，C8-H)，8.10(1H，s，N-H)，IR υmax cm-1 2918(-CH2-)，2850(CH3)，1675(C＝O)，1625(NH2)，1622(C＝N)，1152(C-N)，749(-CH2-)，1476(Ar)，1455(Ar)，1034(C-N)，1365(CH3)。
实施例2-本发明式I的底物在检测肽酶活性中的用途
a)底物的合成
·底物1：2-(L-丙氨酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑-VLS206
·底物2：2-(β-丙氨酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑-OF22A
Figure G2008800181353D00282
·底物3：2-(甘氨酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑-OF30B
Figure G2008800181353D00283
·底物4：2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-5-氯苯并噁唑-35
Figure G2008800181353D00284
·底物11：2-(β-丙氨酰基-2′-氨基-4′，5′-二甲氧基苯基)苯并噁唑-OF24A
Figure G2008800181353D00291
·底物17：2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)苯并噻唑-OF38A
·底物18：2-(β-丙氨酰基-2′-氨基苯基)苯并噻唑-OF33A
Figure G2008800181353D00293
·底物19：2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5′-氯苯基)苯并噻唑
Figure G2008800181353D00294
·底物16：2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4’，5’-亚甲基-二-1，4-环氧丁基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-4’，5’-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
Figure G2008800181353D00301
·底物14：2-(L-丙氨酰基-2′-氨基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(＝VLS237)
Figure G2008800181353D00302
底物1、2、4和11以与合成实施例1中的2-(甘氨酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑(底物3)类似的方式合成。
类似地，底物17和18以与合成实施例1中的2-(L-丙氨酰基-2′-氨基-5’-氯苯基)苯并噻唑(底物19)类似的方式合成。
b)制备介质
将40mg的各种底物溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将该溶液整个倒入400ml预先高压处理过的哥伦比亚琼脂中并在50℃下保持融化。各底物的最终浓度因而为100mg/l。
将各介质分配到直径为90mm的培养皿中，每个培养皿为20ml。
c)接种和温育
将18种来自各个收集(collections)和属于不同种的细菌和酵母的微生物菌种通过半定量分离10μl稀释至1/20的0.5McFarland的悬浮液而接种到这些介质上。将该介质在37℃下温育24小时，然后将所形成的菌落在360-365nm的UV辐照下目测。
d)读出结果
所得结果在表2和表3中给出。
表2：在本发明底物存在下由多种微生物菌种形成的荧光的强度和颜色
Figure G2008800181353D00311
1：荧光强度，-＝未检测到荧光，e＝极少荧光，+/-＝弱荧光，+＝中等荧光，++＝强荧光
2：NG＝没有增长
表3：在本发明底物存在下由多种微生物菌种形成的生长、颜色和荧光
Figure G2008800181353D00321
G：生长-Co：颜色-F：荧光
与使用基于7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的底物(例如L-丙氨酰基-7-AMC)所观测到的相反，对于所有测试的本发明底物，荧光仅出现在菌落中或在邻近处。
对于底物1、2和3，它们仅P不同(分别为L-丙胺酸、β-丙胺酸和甘氨酸)，由相同菌种产生的荧光的强度和/或颜色不同。对于底物1，所用革兰氏阴性菌种(除伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)以外)产生强的蓝色荧光。两个肠球菌菌种产生弱的蓝色荧光，并且两个金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌种产生中等的绿色荧光。而伯克霍尔德氏菌菌种与底物3产生中等的蓝色荧光并与底物2产生绿色荧光。
这些结果还表明当P不变但X和/或R2变化时，荧光的颜色、强度和毒性变化。底物1、4、17和19即属于这种情况。因此，用底物4，铜绿假单胞菌菌种产生弱的紫色荧光，并且对于金黄色酿脓葡萄球菌，未检测到荧光。底物17抑制所有的革兰氏阳性菌菌种和酵母，而用底物19，铜绿假单胞菌为阴性。
类似地，在P为β-丙胺酸的底物2、11和18之间，荧光的颜色、强度以及毒性存在很大差别。
e)结论
取决于所需应用，应该限定P、X、R2或R1。
例如，底物1(2-(L-丙氨酰基-2’-氨基苯基)苯并噁唑)可以区分革兰氏阴性菌(强蓝色荧光)、酵母和革兰氏阴性菌，并且在后者中可以将肠球菌(弱的蓝色荧光)和金黄色酿脓葡萄球菌(中等绿色荧光)与其他区分开来。底物3也可以将革兰氏阴性菌(蓝色荧光)与其他微生物区分开来。
底物19可以将肠杆菌(大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、肠杆菌(Enterobacter)、摩氏摩根菌(Morganella)和Providencia)与其他微生物区分开来。
使用其他取代基，尤其是其他肽酶可以分开其他组的微生物。取决于X、R1和R2基团，荧光的颜色和强度、微生物组检测的灵敏性或针对性、或者甚至毒性均可以变化。这些变化尤其在与其他酶底物结合使用的情况下非常有用。

Claims (13)

1.一种具有下式(I)的用于检测肽酶活性的酶底物：
Figure F2008800181353C00011
其中：
Figure F2008800181353C00012
X为S、NX1、O或NX1-CO；
Figure F2008800181353C00013
R1不存在或者为如下取代基之一：Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；
Figure F2008800181353C00014
R2不存在或为如下取代基之一：Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2或者
Figure F2008800181353C00015
Figure F2008800181353C00016
X1选自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基
Figure F2008800181353C00017
R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；
P为肽。
2.权利要求1所述的酶底物，其中：
·X为O；
·R1和R2不存在；
·P为肽。
3.权利要求1所述的酶底物，其中：
·X为O；
·R1为Cl；
·R2不存在；
·P为肽。
4.权利要求1所述的酶底物，其中：
·X为S；
·R1不存在；
·R2不存在；
·P为肽。
5.权利要求1所述的酶底物，其中：
·X为S；
·R1不存在；
·R2为Cl；
·P为肽。
6.一种包含至少一种权利要求1-5中任一所述的酶底物的反应介质。
7.一种包含至少一种权利要求1-5中任一所述的酶底物的微生物检测和/或识别介质。
8.权利要求7所述的检测介质，其还包含至少一种对与通过权利要求1-5任一所述的底物所检测到的酶活性不同的酶活性具有特异性的其他酶底物。
9.权利要求7或8所述的检测介质，其还包含至少一种对通过权利要求1-5任一的底物所检测到的酶活性具有特异性的其他酶底物。
10.权利要求1-5中任一所述的酶底物或者权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质用于检测微生物中的至少一种肽酶活性的用途。
11.权利要求1-5中任一所述的酶底物或者权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质用于分离革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的用途。
12.一种检测微生物中的至少一种肽酶活性的方法，其特征在于其包含如下步骤：
a)提供权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种肽酶活性的存在。
13.一种区分细菌属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的方法，其特征在于其包含如下步骤：
a)提供权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种肽酶活性的存在。
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