CN102124123B - 新型硝基还原酶底物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物：其中：X为S、NX1、O或NX1-CO；R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；R2不存在或者为选自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2-CO2H的取代基；R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；X1选自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。
Description
本发明涉及用于检测硝基还原酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。
当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物，所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此，在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。硝基还原酶活性可以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。还可以用于监控微生物的还原新陈代谢，例如与其生长或抑制该生长相关的还原新陈代谢。
某些细菌还原硝基芳族化合物的能力为人所知已经许多年。Asnis(1957)报导了由大肠杆菌萃取物中分离能够还原对硝基苯甲酸的黄素蛋白。自从该报导之后，在多种生物体中已经鉴别出硝基芳基还原酶活性。这包括严格的需氧微生物，例如假单胞菌(Won等，1974)和诺卡氏菌(Villanueva，1964)，严格的厌氧微生物，例如梭菌(Ancermaier和Simon，1983)和韦荣氏球菌(McCormick等，1976)，或者真菌类(Masuda和Ozaki，1993)以及真核寄生虫(Douch，1975)。存在着据认为能够通过细菌硝基芳基还原酶而被还原的大范围的底物。它们尤其为硝基芳族化合物，例如对硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。
通常而言，硝基还原酶的酶活性的检测是通过间接的方法，例如通过监控底物或辅助因子的消失而进行。例如，Kitamura等(1983)研究了对硝基苯甲酸甲酯及一系列其他的硝基芳族化合物与大肠杆菌萃取物的还原。然而，该方法并不非常灵敏且不适合用于在多相介质中进行检测。还可以提及申请WO 00/28073，其描述了基于硝基香豆素的荧光底物用于直接检测硝基芳基还原酶的活性。该类硝基芳族化合物能够在还原后形成高度荧光的化合物，因而易于被检测。然而，该底物并不适合用于在多相介质中的检测。
因而，本发明建议改进用于检测微生物的硝基还原酶底物。与现有的底物相比，这些新型的底物易于合成且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于在胶体介质中以检测微生物。
在对本发明进行描述之前，给出如下定义以便于本发明的公开。
术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞或细胞器的直接或间接检测的底物。在硝基还原酶底物的情况下，该底物尤其包含硝酸盐官能团，其通过待发现的酶活性而被部分或全部还原，该硝基官能团的还原改变使分子的某些物理化学性质，使该还原反应得以跟踪。
本发明的底物尤其适用于流式细胞术(flow cytometry)，这是因为还原产物主要保留在表达酶活性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或甚至将其与其他样品分开。
本发明的底物还适用于组织酶学，这是因为还原产物主要保留在还原点上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。
由于其具有低毒性，本发明的底物适于检测细胞培养硝基还原酶活性。
本发明的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为他们形成在反应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”包括可见光谱中的颜色，其吸收可见光谱中的光或荧光，其在一个波长(λex)吸收且在较高的波长(λem)发光。
本发明的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐的形式。
术语“硝基还原酶”用于指可以完全或部分还原NO2基团的酶。
术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链，尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基。
术语“芳基”用于指由芳环衍生的官能团(或取代基)，例如C6-C10芳环，尤其为苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。
术语“羧基”用于尤其指由经由一个双键而与第一个氧原子连接且经由一个单键而与第二个氧原子相连的碳原子组成的官能团，其中所述第二个氧原子为电负性或者与氢原子相连接。取决于分子的pKa以及介质的pH，所述羧基可以呈离子化的形式，即第二个氧原子未连接H，则其为电负性。
术语“反应介质”用于指包含表达细胞或细胞器的新陈代谢和/或微生物生长所需所有成分的介质。该反应介质可以用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或者用作微生物检测和/或识别介质。
所述反应介质可以为固体、半固体或液体。术语“固体介质”用于例如指凝胶化的介质。琼脂在微生物学中为用于培养微生物的常规凝胶剂，但是可以使用明胶或琼脂糖。有些制品是可商购获得的，例如哥伦比亚琼脂、胰酪蛋白胨大豆琼脂、麦康基琼脂、沙鲍洛琼脂，或者更通常而言描述于Microbiological Media(CRC Press)手册中的那些。
反应介质可以包含一种成分或多种组合成分，例如氨基酸类、蛋白胨、烃、核苷酸、矿物质、维生素、抗体、表面活性剂、缓冲溶液、磷酸盐、铵盐、钠盐或金属盐类。
所述介质还可以包含着色剂。例如作为着色剂可以提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂例如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。
所述反应介质可以为“检测和/或识别介质”，即显影介质或培养及显影介质。在第一种情况下，在接种之前培养微生物，并且在第二种情况下，检测和/或识别介质还构成培养介质。
术语“生物样品”用于指由生物流体试样衍生的临床样品，或者由任何类型食品衍生的食品样品。该样品因此可以为液体或者固体，而且可以没有限制性地提及血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，或者来自鼻子、喉咙、皮肤、伤口或脑脊髓液的试样，来自水或诸如奶或果汁的饮料、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食品样品，或者由动物饲料例如尤其由动物饮食而衍生的食品样品。所述样品还可以为来自临床环境的试样、家畜试样、来自食品、化妆品或医药产品的试样。术语“环境试样”用于尤其指由表面、液体、原料或由产物提取的试样。
在本发明中，术语“微生物”涵盖细菌、尤其为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母、寄生虫、真菌，并且更通常而言为通常为单细胞、人眼看不见且可以在实验室复制且操作的生物体。
作为革兰氏阴性菌，可以提及如下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根(氏)菌属(Morganella)、弧菌(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌(Erwinia)、泛生菌属(Pantoea)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、狭长平胞菌(Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性菌，可以提及如下属的细菌：气球菌属(Aerococcus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯塔氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳菌属(Gardnerella)、考克斯菌属(Kocuria)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌(Micrococcus)、Falkamia、兼性双球菌属(Gemella)、小球菌属(Pediococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。
作为酵母，可以提及如下属的酵母：假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)。
对此，本发明涉及下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物：
其中：
●X为S、NX1、O或NX1-CO；
●R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；
●R2不存在或者为选自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；
●R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；
●X1选自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。
在杂环上的1位氮与2位碳之间的键可以为单键(1，2-二氢)或双键，优选双键。
当然，本发明的底物可以包含几个取代基，即在环的多个位置上具有几个基团R1、R2。当R2为O-CH2-O时，R2为与硝基苯酚稠合的环，其中两个环原子是共用的。当R1和/或R2为烷基或芳基时，还可以用一个或多个诸如OH、羧基、Br、Cl、F或I的取代基将其取代。
当X为NX1-CO时，包含X的环优选为6元环，其在所述6元环的3位上包含NX1，并且一个C经由双键与所述6元环4位上的O连接。
根据本发明的一个优选实施方案，X为S。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为NX1。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为O。
根据本发明的另一个优选实施方案，X为NX1-CO。
根据本发明的一个优选实施方案，R1在5位上。
根据本发明的一个优选实施方案，R2在4’位上。
根据本发明的另一个优选实施方案，R2在5’位上。
根据本发明的另一个优选实施方案，R2在4’位和5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O，
●R1和R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1为Cl，优选在5位上；
●R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1为CH3，优选在5位上；
●R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为Cl，优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为O-CH2-O，优选与4’和5’位上的硝基苯酚稠合。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为O-CH3，优选在4’和5’位。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为F，优选在5’位。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为二亚乙基二胺-CH3，优选5’位。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为CH3，优选在3位；
●R1不存在；
●R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为CH3；
●R1不存在；
●R2为Cl，优选在5’位。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为CH3；
●R1不存在；
●R2为O-CH2-O，优选与4’位和5’位上的硝基苯酚稠合。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为C2H4Ph；
●R1不存在；
●R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为C2H4Ph；
●R1不存在；
●R2为Cl，优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为C2H4Ph；
●R1不存在；
●R2为O-CH2-O，优选与4’位和5’位上的硝基苯酚稠合。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为S；
●R1不存在；
●R2为F，优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1-CO；
●X1为H；
●R1和R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1-CO；
●X1为CH3；
●R1和R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1-CO；
●X1为CH3；
●R1不存在；
●R2为Cl，优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1；
●X1为H；
●R1和R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为NX1-CO；
●X1为H；
●R1不存在；
●R2为在5’位上的Cl。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为S；
●R1不存在；
●R2为二亚乙基二胺-CH3，优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为S；
●R1不存在；
●R2为优选在5’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为O；
●R1不存在；
●R2为NO2，优选在4’位上。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为S；
●R1不存在；
●R2不存在。
根据本发明的一个具体实施方案，所述酶底物相应于上式(I)，其中：
●X为S；
●R1不存在；
●R2为F，优选在5’位上；
●在杂环上的1位上的氮与2位上的碳之间的键为单键(1，2-二氢)。
优选，本发明的底物选自表1中所述的底物。
表1-本发明底物的实例
本发明还涉及包含至少一种上述酶底物的反应介质。
本发明还涉及包含至少一种上述酶底物的微生物检测和/或识别介质。优选所述底物的浓度为1-1000mg/l，优选为10-500mg/l。
根据本发明的一个具体实施方案，所述介质还包含至少一种其他的酶底物，其对与通过本发明底物检测到的酶活性不同的酶活性具有特异性。
所述其他底物的酶水解产生可检测的信号，其与通过本发明底物而检测的信号不同，例如不同颜色或荧光的产物，以允许诸如证实一种或多种微生物的检测和/或识别和/或定量。对于其他特定的底物，可以使用常用于检测微生物的其他底物。其他的特定酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员将可以容易地根据所用的底物而决定该浓度。作为示例，可以将本发明的底物与肽酶、Osidase、酯酶或还原酶底物结合使用。具体而言，可以将本发明底物与Osidase底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-配糖体或茜素-β-半乳糖苷，或者与酯酶底物，例如辛酸5-溴-6-氯-3-吲哚基酯或磷酸5-溴-3-吲哚基酯而结合使用。
根据本发明的一个具体实施方案，所述介质还包含至少一种对通过本发明底物所检测到的酶活性具有特异性的其他酶底物。
通过对底物的具体选择，可以识别表示相同酶活性的微生物组。其他具体酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员应可以根据所用的底物来决定该浓度。具体而言，可以将本发明底物与如申请WO 00/28073所述的基于硝基香豆素的荧光底物结合使用。
本发明还涉及上述酶底物或者上述检测和/或识别介质用于检测微生物中至少一种硝基还原酶活性的用途。
本发明还涉及检测微生物中至少一种硝基还原酶活性的方法，其特征在于其包含如下步骤或者由如下步骤组成：
a)提供上述检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种硝基还原酶活性的存在。
所述微生物的接种可以通过任何一种为本领域技术人员所知的接种技术而进行。温育步骤可以在使需要检测的酶活性的表达为最佳且本领域技术人员可以根据酶活性及待检测的微生物而易于选择的温度下而进行。步骤d)可以通过视觉检测、通过比色计或荧光计而进行。在步骤d)中，硝基还原酶活性的存在可以单独显露，或者与其他酶活性一起显露。
为了说明而给出以下没有限制性的实施例。通过它们可以更加清楚地理解本发明。
实施例
1-合成底物
●X为S
底物22：2-(2′-硝基苯基)苯并噻唑
使用油浴，将1eq的2-氨基苯酚、乙醇和1eq的2-硝基苯甲醛的混合物在110℃下回流1小时。
将该混合物冷却至室温并且通过过滤而得到沉淀。为了回收最大量的产物，将圆底烧瓶用滤液洗涤以通过蒸馏回收大部分。
在减压下将固体在干燥器中干燥以得到中间产物。
将以上得到的固体溶解于100ml二氯甲烷中，然后将1eq的2，3-二氰基-5，6-二氯-对苯醌在室温下以小份加入。使反应过夜，在过滤后，由于产物溶解于DCM而将玻璃器皿用DCM洗涤以回收最大量的产物。
在减压下将溶剂蒸出以得到产物。
底物15：2-(2′-硝基-5′-氟苯基)苯并噻唑
将3.00g(0.024mol)的2-氨基苯硫酚和4.05g(0.024mol)的5-硝基-3-氟苯甲醛在乙醇(150ml)中的混合物回流2小时。在冷却至室温之后，将溶液在减压下浓缩。将剩余固体稀释于水和乙酸乙酯的混合物(500ml)中，将水相用乙酸乙酯(2×50ml)再萃取两次。将合并的有机相干燥(MgSO4)、过滤并浓缩以得到粗产物，将其由乙醇中重结晶。得到质量为1.28g的小红色结晶OF54A2，产率47％，并且所测的熔点为156-158℃。
由NMR所得的数据如下所示：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝6.87(1H，t，J＝4Hz，Ar-H)，6.89(1H，s，Ar-H)，7.05(1H，t，J＝4Hz，Ar-H)，7.11(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.13(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.69(1H，dd，J＝9Hz，Ar-H)，8.17(1H，dd，J＝9Hz，Ar-H)。
底物23：2-(2′-硝基5′-(N-甲基哌嗪基)苯基)苯并噻唑(OF80A)
将0.31g(0.0030mol)N-甲基哌嗪加入0.41g(0.015mol)2-(2’-硝基-5’-氟苯基)苯并噻唑和0.32g(0.0023mol)K2CO3在5ml二甲亚砜的混合物中。将反应进行磁力搅拌且加热至90℃，通过TLC验证其进度。
在反应结束后(至少8小时)，将反应混合物用乙酸乙酯(77ml)进行稀释，并且将由此得到的有机相用2×65ml水仔细洗涤，然后用65ml盐水洗涤，并使用硫酸钠干燥以得到0.36g高度静电的橙-黄色固体OF80A，产率68％。若需要的话，可以通过柱色谱进行纯化，但我们这里不需要。
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝2.35(3H，s，CH3)，2.45(2H，t，J＝7Hz，CH2-CH2)，3.49(2H，t，J＝7Hz，CH2-CH2)，6.85(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，6.90(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.41(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.43(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.85(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，8.05(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)。
LC-MS-DI m/z实测质量：355.57(C18H18N4O2S)(M+H)：M计算值：354.43。
底物21；2-(2′-硝基-5′-氯苯基)苯并噻唑
底物21以与合成2-(2′-硝基-5′-氟苯基)苯并噻唑(底物15)的类似方式来合成。
●X为O
底物1-2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑
将8.73g(0.0800mol)2-氨基苯酚、20ml乙醇和12.09g(0.0800mol)2-硝基苯甲醛的混合物使用油浴在110℃下回流一小时。
将该混合物冷却至室温并且通过过滤而得到沉淀。为了回收最大量的产物，将圆底烧瓶用滤液洗涤以通过蒸馏而得到大部分。
在减压下将固体在干燥器中干燥以得到13.25g 2-(2’-硝基苯亚甲基氨基)苯酚，产率为69％。
将以上得到的固体溶解于100ml二氯甲烷中，然后将12.43g(0.0547mol)2，3-二氰基-5，6-二氯-对苯醌在室温下以小份加入。使反应过夜，在过滤后，由于产物溶解于DCM而将玻璃器皿用DCM洗涤以回收最大量的产物。
在减压下将溶剂蒸除以得到8.39g 2-(2-硝基苯基)苯并噁唑，浅褐色固体，产率64％。
由NMR所得的数据如下所示：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝7.40(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.42(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.50(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.72(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.73(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.80(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.89(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，8.15(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
底物2-2-(2′-硝基苯基)-5-氯苯并噁唑-VLS259
底物2以与合成2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑(底物1)的类似方式来合成。
底物6-2-(2′-硝基-4′，5′-二甲氧基苯基)苯并噁唑-VLS261
1.合成2-((3’-氯-6’-硝基苯亚甲基)氨基)苯酚(VLS 263)
将2.18g(0.02mol)2-羟基苯胺和3.73g(0.02mol)2-硝基-5-氯苯甲醛在乙醇中的混合物回流3-4小时。收集由此所得的晶体沉淀并将其在减压下在干燥器中干燥。得到质量为1.98g的细小晶体，产率为80％，测量的熔点为144-146℃。
通过NMR得到的数据如下所示：
1H-NMR(CDCl3)：δ6.95(1H，t，J＝8Hz，Ph-H)，7.05(1H，dd，J＝8Hz，J＝1.2Hz，Ph-H)，7.10(1H，s(宽峰)，OH)，7.28(1H，t，J＝8Hz，Ph-H)，7.33(1H，dd，J＝8Hz，J＝1.4Hz，Ph-H)，7.60(1H，dd，J＝8.66Hz，J＝2.2Hz，4’H)，8.05(1H，d，J＝8.66Hz，5’H)，8.23(1H，d，J＝2.4Hz，2’H)，9.27(1H，s，＝CH-)。
υmax cm-1 3442(OH)，1558(NO2)，1376(NO2)，1521(C＝N)，1341(OH)，1301(OH)，1143(C-N)，1176(C-O)，1461(Ar-H)，756(C-Cl)。
2.合成2-(2’-硝基-5’-氯苯基)苯并噁唑(VLS269)
在室温下，将1.14g(0.005mol)的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)在5分钟之内加入在二氯甲烷中搅拌的2-((3’-氯-6’-硝基苯亚甲基)氨基)苯酚中。将该混合物搅拌2天，过滤并蒸发以得到产物。得到质量为0.97g的绿-褐色粉末，产率为70％，测量的熔点为130-132℃。
由NMR所得的数据如下所示：
C13H7ClN2O3的高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量为274.0140(M+H)+，实测质量：274.0141.
1H-NMR：(CDCl3)δ7.40-7.45(2H，m，Ph-H)，7.56-7.61(1H，m，Ph-H)，7.65(1H，dd，J＝8.66Hz，J＝2.23Hz，4’H)，7.80-7.85(1H，m，Ph-H)，7.87(1H，d，J＝8.66Hz，5’H)，8.16(1H，d，J＝2.23Hz，2’H)。υmaxcm-1 1534(NO2)，1371(NO2)，1572(C＝N)，1616(C＝N)，1182(C-O)，1236(C-O)，1153(C-N)，1461(Ar-H)，743(C-Cl)。
3.合成2-(3’，4’-二甲氧基-6’-苯亚甲基)氨基)苯酚(VLS 260)
将3.27g(0.03mol)2-羟基苯胺和6.33g(0.03mol)6-硝基藜芦醛在乙醇中的混合物回流3-4小时。收集由此得到的晶体沉淀并在减压下在干燥器中进行干燥。得到质量为8.20g的细小橙色晶体，产率为90％，测量的熔点为196-198℃。
由NMR得到的数据如下所示：
1H-NMR(CDCl3)：δ4.00(3H，s，CH3O)，6.92(1H，t，J＝7Hz，Ph-H)，7.01(1H，dd，J＝7Hz，J＝1.4Hz，Ph-H)，7.12(1H，s(宽峰)，OH)，7.22(1H，t，J＝7Hz，Ph-H)，7.32(1H，dd，J＝7Hz，J＝1.4Hz，Ph-H)，7.62(1H，s，5’H)，7.69(1H，s，3’H)，9.25(1H，s，＝CH-)。υmaxcm-1 3416(OH)，1566(NO2)，1384(NO2)，1589(C＝N)，1344(OH)，1317(OH)，1181(C-N)，1149(C-O)，1461(Ar-H)，2838(OMe)。
4.合成2-(2’-硝基-4’，5’-二甲氧基苯基)苯并噁唑(VLS 261)
室温下，将2.27g(0.01mol)的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)在5分钟之内加入在二氯甲烷中搅拌的3.04g(0.01mol)2-((3’，4’-二甲氧基-6’-苯亚甲基)氨基)苯酚中。将该混合物搅拌2天，过滤并蒸发以得到产物。得到质量为2.76g的橙-褐色粉末，产率为90％，测量的熔点为148-146℃。
由NMR所得的数据如下所示：
C15H12N2O5的高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量为301.0819(M+H)+，实测质量：301.0819。
1H-NMR：(CDCl3)δ4.00(6H，d，J＝2.7Hz，(OCH3)2)，7.37-7.41(2H，m，Ph-H)，7.43(1H，s，5’H)，7.52(1H，s，2’H)，7.53-7.57(1H，m，Ph-H)，7.78-7.82(1H，m，Ph-H)。υmaxcm-1 1519(NO2)，1378(NO2)，1582(C＝N)，1189(C-N)，1177(C-O)，1448(Ar-H)，2850(OMe)。
底物7-2-(2′-硝基-5′-氟苯基)苯并噁唑-OF20B
使用油浴将10.91g(0.100mol)的2-氨基苯酚、200ml乙醇和16.91g(0.100mol)2-硝基-5-氟苯甲醛的混合物在110℃下回流1小时。
将该混合物冷却至室温并且通过过滤而得到沉淀。为了回收最大量的产物，将圆底烧瓶用滤液洗涤以通过蒸馏而得到大量产物。
在减压下将固体在干燥器中干燥以得到24.09g的OF20A，产率为93％。
将以上得到的固体溶解于100ml二氯甲烷中，然后将21.04g(0.0927mol)2，3-二氰基-5，6-二氯-对苯醌在室温下以小份加入。使反应过夜，在过滤后，由于产物溶解于DCM而将玻璃器皿用DCM洗涤以回收最大量的产物。
在减压下将溶剂蒸除以得到14.49g的OF20B，浅褐色固体，产率61％。
由NMR所得的数据如下所示：
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝7.37(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.43(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.45(1H，s，Ar-H)，7.59(1H，t，J＝5Hz，Ar-H)，7.82(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.85(1H，d，J＝3Hz，Ar-H)，7.96(1H，dd，J＝9Hz，Ar-H)，8.15(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
底物3：2-(2′-硝基苯基)-5-甲基苯并噁唑
底物3以与合成2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑(底物1)的类似方式来合成。
底物4：2-(2′-硝基-5′-氯苯基)苯并噁唑
底物4以与合成2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑(底物1)的类似方式来合成。
底物5：2-(2’-硝基-4’，5’-二亚甲基二氧苯基)苯并噁唑
底物5以与合成2-(2′-硝基苯基)苯并噁唑(底物1)的类似方式来合成。
底物8：2-(2′-硝基-5′-(N-甲基哌嗪基)苯基)苯并噁唑(OF29A)
将1.01g(0.010mol)的N-甲基哌嗪加入1.29g(0.005mol)的2-(2’-硝基-5’-氟苯基)苯并噁唑和1.04g(0.0075mol)的K2CO3在9ml的二甲亚砜中的混合物中。对反应混合物进行磁力搅拌，并加热至90℃，通过TLC验证反应进度。
一旦反应完成(至少8小时)，将反应混合物用乙酸乙酯(77ml)进行稀释，并将由此得到的有机相用2×65ml水仔细洗涤，然后用65ml盐水洗涤，并使用硫酸钠干燥以得到1.23g黄色/金色的OF29A瓣，产率为73％。
若需要的话，可以通过柱色谱进行纯化，但我们这里不需要。
1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝2.35(3H，s，CH3)，2.57(2H，t，J＝7Hz，CH2-CH)，3.48(2H，t，J＝7Hz，CH2-CH)，6.95(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，6.98(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.21(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)，7.28(1H，s，Ar-H)，7.39(1H，t，J＝9Hz，Ar-H)，7.41(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.55(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.61(1H，t，J＝7Hz，Ar-H)，8.1(1H，d，J＝7Hz，Ar-H)。
m.p.：122-126
LC-MS-DI m/z实测质量：339.54(C18H18N4O3)(M+H)：M计算值338.37。
●X为NX1-CO
底物20-2-(2′-硝基-5′-氯苯基)-4-喹唑酮
1.合成1，2-二氢-2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮(VLS 276)
将质量为2.31g(0.017mol)的2-氨基苯甲酰胺和3.14g(0.017mol)3-氯-6-硝基苯甲醛在乙醇中回流1小时。然后将该混合物冷却，收集所得的橙色晶体并在减压下在干燥器中干燥。得到质量为3.97g的浅橙色晶体，产率为76％，测量的熔点为234-236℃。
由NMR所得的数据如下所示：
1H-NMR(DMSO)：δ6.35(1H，t，J＝2Hz，CH)，6.70(1H，d，J＝1Hz，Ph-H(8H))，6.80(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(6H))，7.05(1H，s(宽峰)，NH)，7.25(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(7H))，7.65(1H，d，d，J＝6Hz，J＝1.5Hz，Ph-H(5H))，7.75(1H，d，d，J＝9Hz，J＝3Hz，Ph-H(4’H))，7.85(1H，d，J＝3Hz，Ph-H(6’H))，8.15(1H，d，J＝9Hz，Ph-H(3’H))，8.30(1H，d(宽峰)，NH-CO)，
C14H10ClN3O3的高分辨M.S.E.I：分子离子的计算质量304.0483(M+H)+，实测质量：304.0482。
υmax cm-11661(C＝ONH)，1564(NO2)，1358(NO2)，1602(C＝N)，774(C-Cl)。
2.2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮的氧化(VLS 278)
将质量为9.10g(0.03mol)的2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮溶解于40ml丙酮中，并用4.74g(0.03mol)的高锰酸钾在无水丙酮中的溶液进行处理。在室温下将该溶液在2-3小时内滴入混合物中。然后将反应搅拌过夜。通过加入过量的固体重亚硫酸钠而除去过剩的KMnO4。然后将溶液过滤并蒸发。得到质量为2.26g的灰白色粉末，产率为25％，测量的熔点为276-278℃。
由NMR得到的数据如下所示：
C14H8ClN3O3的高分辨M.S.E.I，分子离子的计算质量：302.0327(M+H)+。实测质量：304.0327。1H-NMR(DMSO)：δ7.55(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(7H))，7.65(1H，d，J＝8Hz，Ph-H(4’H))，7.85(1H，t，J＝7Hz，Ph-H(6H))，7.90(1H，d，d，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H(5H))，8.05(1H，d，J＝2Hz，Ph-H(6’H)，8.25(1H，d，J＝8Hz，Ph-H(3’H)。
υmax cm-1 3132(NH2)，3070(NH2)，1578(NO2)，1368(NO2)，1603(NH)，1660(CONH)，1531(C＝N)，772(C-Cl)。
底物17-2-(2′硝基苯基)-3-甲基-4-喹唑酮
1.合成2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(VLS 291)
在控制释放CO2的同时，将25ml 40％甲胺在搅拌下以小份加入16.20g(0.099mol)的靛红酸酐(isotoic anhydride)中。使该混合物在室温下保持1小时。然后将混合物用2M的HCl溶液中和，在减压下用Buchi漏斗过滤，用水洗涤数次，并在减压下使用干燥器进行干燥。得到质量为11.61g的灰色粉末，产率为78％。
2.合成2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-3-甲基-4-喹唑烷酮(VLS 292)
将质量为7.5g(0.05mol)的2-氨基-N-甲基苯甲酰胺和9.30g(0.05mol)3-氯-6-硝基苯甲醛进行磁力搅拌，并且回流2-3小时。在减压下用Buchi漏斗过滤由此得到的橙色晶体，并在减压下用干燥器进行干燥。得到质量10.38g针状的细小橙色晶体，产率为66％。
3.VLS 292的氧化(VLS 295b)
将质量为3.17g(0.01mol)的VLS292b溶解于无水丙酮中。将6.32g(0.04mol)KMnO4溶解于无水丙酮中，并在1-2小时内滴入前述混合物中。然后将反应搅拌过夜。此后，将混合物用焦亚硫酸钠中和，过滤并蒸发以除去过量丙酮。得到质量为2.60g的白色粉末，产率为80％。
●X为NX1
底物14-2-(2’-硝基-4′，5′-环亚甲而氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-硝基-4′，5′-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
1.N-苯乙基-2-硝基苯胺(VLS 209)
在室温下，将质量为4.8g(0.04mol)的2-苯乙基胺滴入5.6g(0.04mol)的2-氟硝基苯和11.06g(0.08mol)无水碳酸钠在30ml DMSO中的混合物中。将该混合物在100℃下加热3小时。然后将该混合物冷却至室温并加入100ml水中，得到浅橙色化合物的沉淀。通过过滤回收固体并在减压下用干燥器进行干燥。得到质量为9.4g的橙色晶体，产率98％。测量的熔点与理论值相符，即64-66℃。
由NMR所得的数据如下所示：
1H-NMR(CDCl3)：δ3.00(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ3.55(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ6.65(1H，m，Ph-H)，δ6.85(1H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)，δ7.20-7.50(6H，m，Ph-H)，δ8.10(1H，s(宽峰)，NH)，δ8.20(1H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)。
2.N-苯乙基-1，2-二氨基苯(VLS 210)
室温下，在氮气下将0.38g(0.01mol)硼氢化钠溶液在磁力搅拌下加入0.52g(0.002mol)乙酰丙酮化铜在乙醇中的悬浮液中。将在乙醇中的2.42g(0.01mol)的硝基化合物VLS209加入该溶液中，然后加入在乙醇中的0.76g(0.02mol)硼氢化钠。在室温下，将该混合物在氮气下搅拌过夜。然后，将混合物浓缩以除去过剩的乙醇并加入水。然后用2×20ml DCM进行萃取，并将有机相用水洗涤数次，用碳酸钾干燥并在旋转蒸发仪上浓缩。得到质量为1.69g的黑色油状液体，然后将其固化，产率为80％。测得的熔点与理论值相符，即42-44℃。
由NMR得到的数据如下所示：
1H-NMR(CDCl3)：δ2.95(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ3.27(2H，s(宽峰)，NH2)，δ3.38(2H，t，J＝7Hz，-CH2)，δ6.69(3H，m，Ph-H)，δ6.82(1H，m，Ph-H)，δ7.10-7.40(5H，m，Ph-H)。
3.2-(2’-硝基-4′，5′-环亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(VLS 213)(或2-(2’-硝基-4′，5′-亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)
在室温下，将8.60g(0.014mol)过硫酸氢钾(过一硫酸钾)在15分钟内及磁力搅拌下加入5.08g(0.024mol)的N-苯乙基-1，2-二氨基苯、4.8g(0.024mol)的6-硝基胡椒醛在25ml DMF和1ml水中的溶液中。由于反应为放热反应，将混合物用水浴冷却并搅拌过夜。然后将水加入混合物中，并用DCM连续进行两次萃取。将合并的有机相用水洗涤数次，干燥(MgSO4)并浓缩以形成黄色/褐色的粗产物。用乙醇进行重结晶以纯化该化合物。得到质量为6.19g的褐色晶体，产率为67％，测量的熔点为162-164℃。
由NMR得到的数据如下所示：
C22H17N3O4的高分辨M.S.E.I，分子离子的计算质量：388.1292(M+H)+。实测质量：388.1297。
1H-NMR：(CDCl3)δ3.10(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ4.20(2H，t，J＝7Hz，-CH2-)，δ6.02(1H，s，Ph-H)，δ6.18(2H，s，O-CH2-O)，δ6.80(2H，dd，J＝8Hz，J＝2Hz，Ph-H)，δ7.10-7.40(5H，m，Ph-H)，δ7.48(1H，m，Ph-H)，δ7.65(1H，s，Ph-H)，δ7.80(1H，m，Ph-H)。
υmax cm-11364(NO2)，1523(NO2)，1610(C＝N)，1152(C-N)，1207(C-N)，1089(C-O)，1473(C-H)，728(-CH2)。
底物12-2-(2′-硝基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑-54
底物12以与合成2-(2’-硝基-4′，5′-环亚甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(底物14)类似的方式进行合成。
2-本发明底物在检测硝基还原酶活性中的用途(底物1；2；3；4；5；6；7；8；15；12；21；23)
a)制备介质
将质量为40mg的各种底物溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将该溶液整个倒入400ml预先高压处理过的哥伦比亚琼脂中并在50℃下保持融化。各底物的最终浓度为100mg/l。
将各介质分配到直径为90mm的培养皿中，每个培养皿为20ml。
b)接种和温育
将18种来自各个收集(collections)和属于不同种的细菌和酵母的微生物菌种通过半定量分离10μl稀释至1/20的0.5McFarland的悬浮液而接种到这些介质上。将该介质在37℃下温育24小时，然后将所形成的菌落在360-365nm的UV辐照下目测。
c)读出结果
所得结果在表2-5中给出。
表2：在本发明的底物存在下由不同微生物菌种形成的荧光的强度和颜色
1：荧光强度，-＝未检测到荧光，+/-＝弱荧光，+＝中等荧光，++＝强荧光
表3：在本发明底物存在下由不同微生物菌种形成的生长、颜色和荧光
G：生长-F：荧光
表4-在本发明底物存在下由不同微生物菌种形成的荧光的强度和颜色
| 底物15 | 底物23 | |
| 埃希杆菌NCTC 10418 | ++青绿色 | - |
| 粘质沙雷氏菌NCTC 10211 | ++青绿色 | +绿色 |
| 铜绿假单胞菌NCTC 10662 | +青绿色 | +黄色 |
| 鲍曼不动杆菌ATCC 19606 | +青绿色 | - |
| 耶尔森杆菌NCTC 11176 | - | - |
| 沙门氏杆菌NCTC 74 | ++青绿色 | +黄色 |
| 弗氏柠檬酸杆菌46262(野生) | ++青绿色 | +黄色 |
| 摩尔根氏菌462403(野生) | ++青绿色 | +黄色 |
| 阴沟肠杆菌NCTC 11936 | ++青绿色 | +黄色 |
| 雷氏普罗威登斯菌NCTC 7475 | ++青绿色 | +黄色 |
| 枯草芽孢杆菌NCTC 9372 | - | - |
| 粪肠球菌NCTC 775 | - | - |
| 屎肠球菌NCTC 7171 | - | - |
| 表皮葡萄球菌NCTC 11047 | - | - |
| 金黄色酿脓葡萄球菌NCTC6571 | ++青绿色 | V.黄色 |
| MRSANCTC 11939 | ++青绿色 | +/-黄色 |
| 酿脓链球菌NCTC 8306 | - | - |
| 单核李斯特菌NCTC 11994 | - | - |
| 白色念珠菌ATCC 90028 | - | - |
| 光滑念珠菌NCPF 3943 | - | - |
1：荧光强度，-＝为检测到荧光，+/-＝弱荧光，+＝中等荧光，++＝强荧光
与使用基于7-硝基香豆素(AMC)的底物所观测到的相反，对于所有测试的本发明底物，荧光仅出现在菌落中或在邻近处，其中所述基于7-硝基香豆素(AMC)的底物例如未7-硝基香豆素-3-羧酸。
这些结果表明底物2、3、4、6、7、8、15和21可以区分或识别金黄色酿脓葡萄球(Staphylococcus aureus)菌种，尤其是MRSA(抗甲氧西林的金黄色酿脓葡萄球菌)菌种与大多数其他的革兰氏阳性菌菌种。由于该菌种的医药重要性，这可以特别用于在临床试样以及食品试样中快速而特异地检测金黄色酿脓葡萄球。
此外，取决于芳环上的取代基，本发明底物对于革兰氏阴性菌的特异性是可变的。例如，底物2、7和15可以区分铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)；沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)对底物7和15是呈强阳性的，而对底物2、6和12是呈阴性的。底物12对摩氏摩根菌(Morganella morganii)具有特异性。
d)结论
借助本发明底物可以将许多反应介质用于微生物学中。这些介质对于医药、工业或环境领域中有意义的微生物的检测、计数和/或识别非常有用。
Claims (6)
1.一种包含至少一种具有下式(I)的用于检测硝基还原酶活性的酶底物的微生物检测和/或识别介质：
其中：
·X为S；
·R1不存在或者为选自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；
·R2不存在或者为选自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；
·R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基。
2.权利要求1所述的介质，其中：
·X为S；
·R1不存在；
·R2为F。
3.权利要求1所述的检测介质，其还包含至少一种对与通过第一底物所检测到的酶活性不同的酶活性具有特异性的其他酶底物。
4.权利要求1所述的检测介质，其还包含至少一种对相同酶活性具有特异性的其他酶底物。
5.权利要求1-4任一所述的检测和/或识别介质用于检测微生物中的至少一种硝基还原酶活性的用途。
6.一种用于在微生物中检测至少一种硝基还原酶活性的方法，其特种在于其包含如下步骤：
a)提供一种权利要求1-4中任一所述的检测和/或识别介质，
b)以待测试的生物样品接种所述介质，
c)对其进行温育，并且
d)发现至少一种硝基还原酶活性的存在。
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