CN100558738C - 酶的荧光底物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有改进渗透性的水解酶荧光底物、其制备方法和测定水解酶活性的方法，尤其是在基于细胞的测定中。本发明底物容易扩散到细胞中，在细胞中它们被酶处理产生可发光的荧光产物，尤其适合在基于细胞的测定中显现酶衍生活性。
Description
技术领域
本发明涉及提高细胞通透性的水解酶荧光底物、其制备方法和测定水解酶活性的方法，尤其是基于细胞的测定。这种底物能轻易地扩散进入细胞，在细胞内经酶加工产生耐光的荧光产物，并且尤其适用于在基于细胞的测定中显现酶衍生活性。
发明背景
为了研究细胞生物学，有许多技术用于探测、测量并且追踪细胞中几乎任何选定的分子。光学显微镜技术已广泛的用于观察细胞。已固定且染色的细胞可在常规光学显微镜下得到研究，而应用荧光显微镜，抗体偶联荧光染料可用于定位细胞内的特异性分子。共焦扫描显微镜提供了薄的光学切面，可用于重构三维图像。通过扫描电子显微镜可以获得细胞和组织表面的三维图像，而通过冷冻断裂和冷冻蚀刻电子显微镜可以分别显现膜和细胞的内部结构。
经典显微方法很好的观察了细胞的结构，但它们几乎不能提供细胞化学的信息。在细胞生物学中，测定特殊分子的量、了解它们在细胞中的位置以及了解它们的水平或位置对于胞内或胞外信号的反应通常是很重要的。目标分子从小的无机离子如Ca2+或H+，到大分子如特殊的蛋白、各种RNA或DNA。现已发展了多种测试每种分子的敏感方法，以及在活细胞中追踪各种分子动力学行为的方法。一种具体方法是将探针引入到活细胞中，以监控细胞内部的化学环境。
有趣的是，包含荧光染料的某些探针偶联到封闭基团上，形成酶底物。这种探针能被酶分解，产生荧光染料沉淀物，这种沉淀物能在高敏感方式下被荧光显微镜检测到。
在不同的酶底物中，水解酶底物即水解酶所识别的底物已经方便地用于细胞生物学测定。水解酶是广泛发现于有机体中的酶，包括细菌、酵母、高等动物和植物。它们催化水解反应。因此，水解酶通过在化合物(即底物)中断开共价键并且在键间插入水分子而分解化合物。水解酶包括作用于以下键的酶：酯键、肽键、除肽键外的C-N键、糖苷键、醚键、酸酐等。酯酶、脂肪酶、肽酶、糖基化酶如糖苷酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、核酸酶、核酸外切酶和核酸内切酶都是这类酶的代表。
水解酶可用于酶标记的荧光测定，其中荧光机制用于检测酶活。酶标记的荧光测定是基于酶将特异性底物转化为相应的荧光沉淀物。这种底物被称为荧光底物，因为它们在酶的作用下能够被裂解并产生荧光沉淀物。
同样的，某些β-D-葡糖醛酸酶或β-D-半乳糖苷酶的荧光底物是已知的。例如，β-D-半乳糖苷酶(GAL)及其荧光底物4-甲基伞形基β-半乳糖苷(4-methylumbelliferylβ-D-galactoside)的应用已经在文献中作为实例被引用(Ishikawa E.，Imagawa M.，&Hashids S.，″UltrasensitiveEnzyme Immunoassay Using Fluorogenic，Lumenogenic，Radioactive andRelated Substrates and Factors to Limit Sensitivity″：J.Biochem 73，1319-1321，1973)。同样，β-D-葡糖醛酸酶(GUS)及其荧光底物4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸的应用已得到详述(Jefferson R.A.″AssayingChimeric Genes in Plants：The GUS Gene Fusion System″，Plant Mol.Biol.Rep.5，387-405，1987；Jefferson R.A.″The GUS Reporter GeneSystem″，Nature，342，837-838，1989)。
同样，制备自一类荧光团的荧光底物已经得到详述，荧光团通常包括喹唑酮(喹唑啉酮)、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噁唑、喹啉、二氢吲哚和菲啶。这种底物能被酶转化为可检测的酚，如形成可溶性色素或荧光物质或沉淀。例如美国专利No.5,316,906和美国专利No.5,433,986描述了这类底物，它们包含偶联了磷酸、硫酸或糖基的物质，与适当的酶反应可形成高度荧光的沉淀物。这两个美国专利都提到了利用荧光底物来检测和研究酶活。这类底物的具体实例包括
β-D-半乳糖苷酶底物(
β-D-吡喃半乳糖苷)(1)和
β-D-葡糖醛酸酶底物(
β-D-葡糖苷酸)(2)，它们已被开发并可获得商品。
这些
β-D-半乳糖苷酶和
β-D-葡糖醛酸酶的底物本身没有荧光，但是它们可以分别与GAL或GUS反应而形成荧光沉淀物和没有荧光的裂解产物。
然而，荧光底物一个众所周知的缺点就是它们不能透过细胞膜。因而，GUS和GAL测定通常对细胞都具有破坏性，即检测胞内分析物先要透化细胞膜，因此不适合用于生物体内或要求细胞完整的体外环境。与之相比，许多其它的底物例如荧光素并不十分耐光，其在几分钟之后褪色，并失去检测所必须的荧光。
在现有技术中已有各种方法可将不能透过膜的物质引入细胞。其中一种方法为通过微量移液器将分子显微注射入细胞。其它方法包括利用强大的电击或者化学方法(例如低浓度去污剂)而部分破坏细胞质膜的结构。第三种将大分子引入细胞的方法是使包含这些分子的膜泡同细胞质膜融合。
因而，本发明目的是提供新的方法，将不能透过膜的荧光底物引入细胞。具体地说，本发明的目标是提供新型水解酶荧光底物，这种底物增加了对细胞膜的通透性而没有损害其耐光性，并且能够为具体的酶识别。
另外，提供制备题述水解酶荧光底物的方法也是本发明的目的，该底物基本上没有杂质。
本发明的目的还包括提供水解酶荧光底物，其可以用于各种测定。具体地说，这类题述酶荧光底物可以用于不同的应用，例如研究和检测涉及到酶活、基因表达或启动子活性和特异性的各种特征。
附图
图1.在生物体内测试底物(化合物27)。本图展示了转基因烟草植物毛根细胞的共聚焦显微图。用亲脂性GUS底物(化合物27)而不透化细胞可显示细胞核中GUS报道酶的存在。
图2.(a)最大荧光时化合物21的发射光谱；
(b)最大荧光时化合物21的激发光谱。
图3.化合物27存在下发荧光(＝GUS转染的)和不发荧光的293T细胞。
发明详述
本发明涉及用于酶标记荧光测定的新型水解酶底物及其荧光沉淀物。更具体地讲，本发明涉及取代的水解酶荧光底物。
与其它已知的荧光底物相比，这种新型取代的水解酶荧光底物表现出改进的细胞膜渗透能力。这个独特的特征使本发明的酶底物可进入各种细胞的细胞质，有助于其被所有类型的细胞摄取。令人惊讶的是，本发明取代的酶底物的改进渗透性涉及用非极性侧链在荧光团部分进行的亲脂性取代，尽管与现有技术相比，这种取代导致合成更大的分子，并且要使用不同的合成途径。
例如，用一个戊基或两个丁基或两个戊基在其荧光团部分(即不考虑封闭基团的化合物)取代本发明底物，使整个分子，即荧光团加上封闭基团，可通过简单扩散进入细胞。另外，这种单戊基、双丁基或双戊基化的化合物仍然是酶(例如GUS酶)的良好底物，加入纯化的酶之后可观察到快速荧光发射。例如，应用GUS报道基因的瞬时转染实验可表明，这类底物的确具有膜渗透性，适合用于检测GUS过量表达的细胞。
此外，本发明的底物能产生耐光的荧光产物而不需要添加显色剂或沉淀剂。这些可溶性酶底物在酶水解下产生荧光沉淀物而不损害酶活。而且，本发明的新型酶底物经裂解和沉淀形成细小的晶体，因而适合详细地图像分析和造影。
本发明也涉及题述取代水解酶荧光底物的制备方法。更具体地讲，本发明涉及制备高纯度取代酶荧光底物的特殊方法。
本发明也包括基于细胞分析中测量酶活的方法。酶底物的一种具体应用是在基于细胞的分析中显示基因的表达或启动子的活性和特异性。本发明应用的其它范围根据下面的详述是显而易见的。但是应理解的是，虽然给出了本发明的优选实施方案，下列详述和实施例只是以说明的方式给出，这是由于根据下列详述，本发明的精神和范围之内的变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在一个实施方案中，本发明涉及通式(I)的新型取代的水解酶荧光底物和其生物可接受的盐、前报告分子(例如酯、低级烷基酯前体，如乙酸酯和甲酯形式)；
其中Y为n为1或0；
W为
＝CH-、-S-、-O-或-N(R3)-；
M为氧、氮或硫；
R1和R2或相同或不同，各自独立为氢、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基(sulfeno)、亚磺基、磺基、氰基、氨基、R4-、R4O-、R4(C＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4-C(＝Z)-X-、R4X-C(＝Z)-Q-、R4S-、R4-S(＝O)-、R4-S(＝O)-O-、R4-S(＝O)2-O-、R4O-S-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、R4R5N-、[R4-C(＝Z)][R5]N-、[R4-C(＝Z)][R5C(＝X)]N-、R4R5N-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-X-、[R4R5N-C(＝Z)]R6N-、[R4R5N-C(＝Z)][R6-C(＝X)]N-、[R4S(＝O)][R5]N-、[R4-S(＝O)2][R5]N-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-O-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-S-、[(R4X)(R5Q)P(＝Z)][R6]N-、[(R4R5N)(R6X)P(＝Z)][R7]N-、[(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)][R8]N-、(R4)(R5X)P(＝Z)-O-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-O-、(R4)(R5X)P(＝Z)-S-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-S-、[(R4)(R5X)P(＝Z)][R6]N-、[(R4)(R5R6N)P(＝Z)][R7]N-；
其中X、Z、Q相同或不同，各自独立为氧或硫；
其中R3为R4、R4-C(＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)；
其中R4、R5、R6、R7和R8相同或不同，各自独立为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基、芳基、Het1、Het2；
其中每个q相同或不同，各自独立为0、1、2、3或4；
其中，任何C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基或氨基可被以下基团进一步单取代、二取代或三取代(如果化合价允许)：C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷硫基、C1-4烷基次磺酰基(C1- 4alkylsulfenyl)、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氨基、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、芳基、Het1或Het2取代基；
前提条件是R1、R2和R3中至少一个是至少4个碳的部分。
在另外一实施方案中，本发明涉及通式(I)的新型取代的水解酶荧光底物和其生物可接受的盐、前报告分子；
其中，Y为
n为1或0；
W为＝CH-、-S-、-O-或-N(R3)-；
M为氧、氮或硫；
R1和R2各自独立为氢、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、R4-、R4O-、R4(C＝Z)-、R4X-C-(＝Z)-、R4-C(＝Z)-X-、R4X-C(＝Z)-Q-、R4S-、R4-S(＝O)-、R4-S(＝O)-O-、R4-S(＝O)2-O-、R4O-S-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、R4R5N-、[R4-C(＝Z)][R5]N-、[R4-C(＝Z)][R5C(＝X)]N-、R4R5N-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-X-、[R4R5N-C(＝Z)]R6N-、[R4R5N-C(＝Z)][R6-C(＝X)]N-、[R4S(＝O)][R5]N-、[R4-S(＝O)2][R5]N-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-O-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-S-、[(R4X)(R5Q)P(＝Z)][R6]N-、[(R4R5N)(R6X)P(＝Z)][R7]N-、[(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)[R8]N-、(R4)(R5X)P(＝Z)-O-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-O-、(R4)(R5X)P(＝Z)-S-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-S-、[(R4)(R5X)P(＝Z)][R6]N-、[(R4)(R5R6N)P(＝Z)][R7]N-；
其中X、Z、Q各自独立为氧或硫；
R3为R4、R4-C(＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)；
其中R4、R5、R6、R7和R8各自独立为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基、芳基、Het1、Het2；
每个q独立为0、1、2、3或4；
其中任何C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基或氨基可被以下基团进一步单取代、二取代或三取代(如果化合价允许)：C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷硫基、C1-4烷基次磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氨基、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、芳基、Het1或Het2取代基；
其中封闭基团为单糖或多糖衍生物、磷酸衍生物或硫酸衍生物；
前提条件是R1、R2和R3中至少一个是至少4个碳的部分。
在一个实施方案中，本发明涉及通式(I)的新型水解酶荧光底物和其生物可接受的盐；
其中
Y为
n为1或0；
W为＝CH-、-S-、-O-和-N(R3)-；
M为-O-、-N(R3)-和-S-；
式(I)中的每个R1和R2独立为氢、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、R4-、R4O-、R4(C＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4-C(＝Z)-X-、R4X-C(＝Z)-Q-、R4S-、R4-S(＝O)-、R4-S(＝O)2-、R4-S(＝O)-O-、R4-S(＝O)2-O-、R4O-S-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、R4R5N-、[R4-C(＝Z)][R5]N-、[R4-C(＝Z)][R5-C(＝X)]N-、[R4X-C(＝Z)][R5]N-、[R4X-C(＝Z)][R5-C(＝Q)]N-、R4R5N-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-X-、[R4R5N-C(＝Z)]R6N-、[R4R5N-C(＝Z)][R6-C(＝X)]N-、[R4S(＝O)][R5]N-、[R4-S(＝O)2][R5]N-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-O-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-S-、[(R4X)(R5Q)P(＝Z)][R6]N-、[(R4R5N)(R6X)P(＝Z)][R7]N-、[(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)[R8]N-、(R4)(R5X)P(＝Z)-O-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-O-、(R4)(R5X)P(＝Z)-S-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-S-、[((R4)(R5X)P(＝Z)][R6]N-、[(R4)(R5R6N)P(＝Z)][R7]N-；
其中X、Z、Q各自独立为氧或硫；
R3为R4、R4-C(＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)；
其中R4、R5、R6、R7和R8各自独立为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基、芳基、Het1、Het2；
通式(I)中的每个q独立为0、1、2、3或4；
其中任何C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基或氨基可被以下基团进一步单取代、二取代或三取代(如果化合价允许)：C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷硫基、C1-4烷基次磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氨基、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、芳基、Het1或Her2取代基；
其中封闭基团为单糖或多糖衍生物、磷酸衍生物、硫酸衍生物、羧酸衍生物或寡肽衍生物；
前提条件是R1、R2和R3中至少一个为C4-8烷基、C4-8烯基或C4-8炔基。
有趣的是，本发明涉及取代的水解酶荧光底物和其生物可接受的盐、前报告分子，其中W为-N-(R3)-，Y为-C(＝O)，n为1，具有式(II)；
其中M、R1、R2、R3、q和封闭基团如式(I)中的定义。
同样有趣的是，本发明的酶底物具有式(III)和其生物可接受的盐、前报告分子；
其中R1、R2、R3和封闭基团如式(I)中的定义。
优选本发明取代的水解酶荧光底物具有式(III)，其中R1、R2和R3中至少一个独立选自直链或支链的丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
更优选本发明取代的水解酶荧光底物具有式(III)，其中R1和R2都是丁基取代基。同样优选本发明的酶底物具有式(III)，其中R1和R2都是戊基取代基。同样优选本发明取代的水解酶荧光底物具有式(III)，其中R1和R2中只有一个是丁基取代基或戊基取代基。
尤其本发明涉及荧光沉淀物，其可在特异酶的作用下通过从式(I)裂解封闭基团而得到，产生具有式(IV)的荧光沉淀物：
其中Y、n、W、M、R1、R2和q如式(I)中的定义。
在另外一实施方案中，本发明涉及通式(V)的新型化合物和其生物可接受的盐、前报告分子，该化合物为取代的水解酶荧光底物；
其中
Y为
n为1或0；
W为＝CH-、-S-、-O-或-N(R3)-；
M为-O-、-N(R3)-或-S-；
式(V)中各个R1和R2独立为氢、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、R4-、R4O-、R4-C(＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4-C(＝Z)-X-、R4X-C(＝Z)-Q-、R4S-、R4-S(＝O)-、R4-S(＝O)2-、R4-S(＝O)-O-、R4-S(＝O)2-O-、R4O-S-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、R4R5N-、[R4-C(＝Z)][R5]N-、[R4-C(＝Z)][R5-C(＝X)]N-、[R4X-C(＝Z)][R5]N-、[R4X-C(＝Z)][R5-C(＝Q)]N-、R4R5N-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-X-、[R4R5N-C(＝Z)]R6N-、[R4R5N-C(＝Z)][R6-C(＝X)]N-、[R4-S(＝O)][R5]N-、[R4-S(＝O)2][R5]N-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-O-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-O-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-S-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-S-、[(R4X)(R5Q)P(＝Z)][R6]N-、[(R4R5N)(R6X)P(＝Z)][R7]N-、[(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)[R8]N-、(R4)(R5X)P(＝Z)-O-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-O-、(R4)(R5X)P(＝Z)-S-、(R4)(R5R6N)P(＝Z)-S-、[(R4)(R5X)P(＝Z)][R6]N-、[(R4)(R5R6N)P(＝Z)][R7]N-；
其中R2取代基可置换萘基任何碳原子上的一个或者多个氢，例如碳原子C1、C4、C5、C6、C7和C8，前提条件是没有超过碳的化合价；
其中X、Z和Q各自独立为氧或硫；
R3为R4、R4-C(＝Z)-、R4X-C(＝Z)-、R4R5N-C(＝Z)-、R4O-S(＝O)-、R4O-S(＝O)2-、R4R5N-S(＝O)-、R4R5N-S(＝O)2-、(R4X)(R5Q)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6X)P(＝Z)-、(R4R5N)(R6R7N)P(＝Z)-；
其中R4、R5、R6、R7和R8各自独立为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基、芳基、Het1、Het2；
式(V)中各个q独立为0、1、2、3或4；
其中任何C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基或氨基可被以下基团进一步单取代、二取代或三取代(如果化合价允许)：C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷硫基、C1-4烷基次磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氨基、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、芳基、Het1或Het2取代基；其中封闭基团为单糖或多糖衍生物、磷酸衍生物、硫酸衍生物、羧酸衍生物或寡肽衍生物；
前提条件是R1、R2和R3中至少一个为C4-8烷基、C4-8烯基或C4-8炔基。
本发明也涉及荧光沉淀物，其通过在特异酶的作用下从式(V)裂解封闭基团而获得，产生式(VI)的荧光沉淀物：
其中Y、n、W、M、R1、R2和q如式(V)中的定义。
通常，当W为-N-(R3)且Y为-C(＝O)-时，该化合物为喹唑酮，也可称为喹唑啉酮。当W为-N-(R3)-且n为0时，产物为苯并咪唑，当W为-O-且n为0时，产物为苯并噁唑，当W为-S-且n为0时，产物为苯并噻唑。当W为＝CH-且Y为-C(R1)＝时，产物为喹啉。当W为＝CH-且n为0时，产物为吲哚。喹唑酮、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、喹啉和吲哚都是本发明的优选实施方案。
当术语“取代”用于定义式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)化合物时，都意味在使用“取代”的表达中所指原子上一个或多个氢被选自所指基团的基团置换，前提条件是没有超过所指原子的正常化合价，并且取代导致化学稳定的化合物，即该化合物足够稳定，可从反应混合物中分离到有用的纯度。
本文使用的术语“卤素”作为基团或基团的部分，通常是指氟、氯、溴或碘。
术语“C1-4烷基”作为基团或基团的部分，定义具有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、2-甲基-丙基等。
术语“C1-8烷基”作为基团或基团的部分，定义具有1-8个碳原子的直链或支链饱和烃基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、2-甲基-丙基、戊基、异戊基、己基、庚基、辛基等。
术语“C4-8烷基”作为基团或基团的部分，定义具有4-8个碳原子的直链或支链饱和烃基，例如丁基、2-甲基-丙基、戊基、异戊基、己基、庚基、辛基等。
术语“C2-8烯基”作为基团或基团的部分，定义具有2-8个碳原子、含有至少一个双键的直链或支链烃基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
术语“C4-8烯基”作为基团或基团的部分，定义具有4到8个碳原子、含有至少一个双键的直链或支链烃基，例如丁烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
术语“C2-8炔基”作为基团或基团的部分，定义具有2到8个碳原子、含有至少一个叁键的直链或支链烃基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
术语“C4-8炔基”作为基团或基团的部分，定义具有4到8个碳原子、含有至少一个叁键的直链或支链烃基，例如丁炔基、丁二炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。术语“C4-8炔基”同样包括具有4-8个碳原子、含有至少一个叁键和至少一个双键的直链或支链烃基，例如3-己烯-1-炔基、2-庚烯-4-炔基等。
术语“C3-7环烷基”作为基团或基团的部分，通常是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
术语“芳基”作为基团或基团的部分，包括单环、双环或三环芳族碳环，例如苯基和萘基。
术语“Het1”作为基团或基团的部分，定义饱和的或部分不饱和的单环、双环或三环的杂环基，优选具有3-14个环原子，更优选具有5-10个环原子，更优选具有5-8个环原子，该杂环基中含有一个或多个选自氮、氧或硫的杂原子环成员。
术语“Het2”作为基团或基团的部分，定义芳族单环、双环或三环杂环基，优选具有5-14个环原子，更优选具有5-10个环原子，更优选具有5-6个环原子，该杂环基中有一个或多个选自氮、氧或硫的杂原子环成员。
取代基R1和R2可以连接在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的环中任何碳原子上，只要它们的化合价允许。
尽管任何变量(例如卤素、C1-8烷基、C4-8烷基)在任何成分中出现超过一次时，每个定义是独立的。
本文使用的术语“前报告分子”是指那些衍生物，例如酯、酰氨和磷酸衍生物，该衍生物在生物体内或体外产生的生物转化产物是式(I)、(II)、(III)或(V)中定义的取代的水解酶荧光底物。通过修饰化合物上的官能团来制备本发明的前报告分子，修饰的方式是通过生物体内或体外的常规操作该修饰物可被裂解为式(I)、(II)、(III)或(V)的化合物。术语“前报告分子”不能同封闭基团混淆。前报告分子被裂解产生式(I)、(II)、(III)或(V)的化合物，其中包含封闭基团和底物分子的剩余部分，式(I)、(II)、(III)或(V)分子随后可被加入的目标酶所裂解，产生可见的沉淀物，对应于底物分子的剩余部分，即式(IV)和(VI)的化合物。
在一个实施方案中，本发明取代的水解酶荧光底物具有式(I)，其中R1、R2、R3中至少一个独立选自直链或支链的丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
在另一个实施方案中，本发明取代的水解酶荧光底物具有式(I)，其中R1和R2都是丁基取代基。在又一个实施方案中，本发明取代的水解酶荧光底物具有式(I)，其中R1和R2都是戊基取代基。在另一个实施方案中，本发明取代的水解荧光酶底物具有式(I)，其中R1和R2中只有一个是丁基取代基或戊基取代基。
在一个实施方案中，本发明取代的水解酶荧光底物具有式(V)，其中R1、R2、R3中至少一个独立选自直链或支链的丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
在另一个实施方案中，本发明的水解酶荧光底物具有式(V)，其中R1和R2都是丁基取代基。在又一个实施方案中，本发明的酶底物具有式(V)，其中R1和R2都是戊基取代基。在另一个实施方案中，本发明取代的水解酶荧光底物具有式(I)，其中R1和R2中只有一个是丁基取代基或戊基取代基。
具体的说，本发明涉及的酶底物能够被酶裂解，具有式(I)、(II)、(III)和(V)。
优选本发明取代的水解荧光酶底物具有式(III)，其中R1、R2和R3中至少一个独立选自直链或支链的丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
更优选本发明的水解酶荧光底物具有式(III)，其中R1和R2都是丁基取代基。同样优选本发明的酶底物具有式(III)，其中R1和R2都是戊基取代基。同样优选本发明取代的水解荧光酶底物具有式(III)，其中R1和R2中只有一个是丁基取代基或戊基取代基。
“荧光性”是一种性质，具有这种性质的分子被特定波长的光激发，发出波长更长的光。荧光是荧光团与入射光子相互作用导致的现象。这个过程称为激发。光子的吸收导致了荧光团中的一个电子从基态跃迁到更高的能量水平。然后，这个电子回归到它原有的能量水平，释放出光子。这个过程称为荧光发射。然后荧光团发出比吸收的光子波长更长的光。这仅仅是因为发射光子的能量比吸收光子的能量低，原因在于在激发态时期中消耗了能量。
“荧光团”是发荧光的分子，其能吸收入射光并相应的发出不同波长的光。
“底物”被定义为在酶或催化剂所催化的化学反应过程中被转化为其它物质的化合物或物质。
在本发明的上下文中，“荧光底物”是指可在特异酶的作用下被裂解为荧光沉淀物和非荧光产物的底物。
“封闭基团”定义为改变了荧光团激发和发射性质(即吸收性和荧光性)的基团。在特异性水解酶作用下，M部分与封闭基团之间的键断裂，封闭基团从底物分子的剩余物上裂解下来，这时发生上述光活性的变化。当封闭基团分离时，底物分子的所得基团或剩余物形成可见的沉淀物。封闭基团的实例包括：优选单糖或多糖衍生物、磷酸或硫酸衍生物；更优选α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、β-D-半乳糖、α-D-甘露糖、β-D-甘露糖、β-D-N-乙酰葡萄糖氨、β-D-葡糖醛酸、β-D-岩藻糖、α-L-岩藻糖、α-L-艾杜糖醛酸、β-D-纤维二糖、α-L-阿拉伯糖、β-D-木糖、α-D-N-乙酰-神经氨酸(唾液酸)、对胍基苯甲酸芳基酯、磷酸单芳基酯或磷酸单烷基酯、硫酸单芳基酯、磷酸芳基酯；更优选β-D-葡萄糖和β-D-葡糖醛酸衍生物。选择式(I)、(II)、(III)和(V)的封闭基团部分，使其对目标酶具有特异性。封闭基团尤其为通过从单糖或多糖除去端基异购羟基形成的单价部分。封闭基团的其它实例包括羧酸衍生物(如脂肪酸和其它具有羧基的基团)和寡肽衍生物。
在封闭基团的上下文中，术语“衍生物”指从封闭基团除去羟基形成的单价部分。
“可见的沉淀物”是指可通过目测或光敏机理检测的沉淀物，光敏机理例如为光谱(激发/发射)性质的变化。
与其它已知的酶荧光底物相比，本发明底物的细胞膜通透性具有相当大的改善。这就允许本发明的荧光底物容易进入细胞，因而这种底物可广泛用于各种细胞。例如，美国专利No.5,316,906描述的底物显出很差的膜通特性。在该专利的实施例15中，用100μM的半乳糖苷酶底物处理完好的成纤维细胞。一旦使用允许形成荧光沉淀物的条件，只能在6小时后观察最大荧光强度。这些数据表明，与经典的可浸透荧光化合物如钙荧光素、罗丹明和噻唑橙相比，这些荧光化合物的渗透性很低，前者在大约30分钟后就达到了稳定水平。与之相比，本发明的取代底物在几分钟或稍长之后就可以在活细胞中产生荧光信号。
除了渗透性的特征得到改善之外，与其它荧光试剂如荧光标记的次级试剂相比，本发明荧光底物的沉淀物还有其它改善的特征。本发明的荧光底物通常溶于水但是没有荧光性，然而，在含有底物和相应酶的水溶液中，它们释放出具有很强荧光的沉淀物。这些底物在合适的酶的作用下沉淀，形成清楚明亮的荧光化合物。
本发明的底物表现出在酶的作用下快速释放固体产物的沉淀，因为在酶测试中，它们能有效地被适当的酶识别。重要地是酶水解产生沉淀物而不会损害酶活。后者就允许其例如用于生物样品中的定位研究，或在非变性PAGE和蛋白质印迹中检测分散条带。
此外，本发明的底物可以用各种封闭基团制备，例如β-D-半乳糖和β-D-葡糖醛酸衍生物，它们对识别这种衍生物的相应β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡糖醛酸酶有足够的特异性。同样，磷酸或硫酸封闭基团也对识别这种衍生物的相应磷酸酶和硫酸酶具有足够特异性。有趣的是，底物产生的着色足够耐光，允许足够的时间在高放大倍数下对荧光情况进行检查、聚焦和照相。
另外一个特征为本发明取代的水解酶荧光底物沉淀物展现出常常超过50nm的Stokes位移，通常超过60、80、100、120nm，该特征增强了荧光信号对于背景的分辨率，在细胞或组织中沉淀物分子浓度相对很低、自身荧光很少或没有时进行敏感的检测，同样克服了在自身荧光背景下区分信号和背景的问题。这个产物巨大的Stokes位移使得底物能理想的用于多色应用。
在另外一个实施方案中，本发明涉及制备本发明荧光底物的方法，包括以下步骤：
-合成一个封闭基团，由此所述封闭基团可以任选被保护；
-合成取代的荧光团；
-将所述取代的荧光团与任选保护的封闭基团偶联；
-任选去保护所述封闭基团；
-纯化所得取代的底物。
通过本领域已知的步骤制备单糖或多糖衍生物(K.D.Lariso等，J.Histochem.Cytochem.，1995，43，77；J.C.Jaquinet，Carbohydr.Res.，1990，199，153；A.Nudelman等，Carbohydr.Res.，1987，162，145)。
可通过本领域内常见的方法制备喹唑酮(喹唑啉酮)、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噁唑、喹啉、二氢吲哚衍生物，该方法已在文献中详细说明(R.Pater，J.Heterocycl.Chem，1971，8，699；J.J.Naleway等，Tetrahedron Lett.，1994，35，8569；T.G Deligeorgiev，Dyes and Pigments，1990，12，243)。
为制备取代荧光团，可通过Still偶联后纯化去除杂质，将侧链直接引入到分子的芳环上(J.K.Stille，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，1986，25，508)。可以同时在两个芳环上引入侧链。另一个制备双取代化合物的优选方法包括：首先合成两个单取代部分，然后将两个部分结合而形成所需双取代化合物(R.A.Coburn等，J.Med.Chem.，1981，1245；E.Vedejs，Org.Reactions，1974，401；G.Hahn，DeutschesPatentschrift，869639，1953；T.Tamura等，European Patent Appl.，1.081.138A1，2000)。这种方法可以得到更高的产率，同时避免终产物中存在单取代杂质。
可将活性形式的封闭基团与取代荧光基团上未结合形式存在的羟基、氨基或巯基反应，使封闭基团结合到取代荧光团上。这就得到了没有荧光的中间体。偶联的封闭基团部分具有一些保护基，可使用合适保护基的方法将其去除。尤其是如果封闭基团部分包含葡糖醛酸或半乳糖衍生物，偶联可以通过Schmidt偶联完成(R.R.Schmidt等，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，1980，19，731)。封闭基团还可以为硫酸或磷酸基团。将二乙基磷酰氯作为磷酸化试剂(Qing Zhu等，Tetrahedron Lett.，2003，44，2671)，然后水解(A.K.Szardenings，Tetrahedron Lett.，1996，37，3638)，磷酸基团可以与未结合形式的取代荧光基团偶联。
最后，纯化形成的底物，特别是醚中的甲醇双(三丁基锡)用在封闭基团的去保护步骤中时。在这种情况下需要纯化步骤以除去含锡杂质，该杂质会使终产物有细胞毒性。
运用这种制备方法可获得高纯度的酶底物，其几乎不含其它化合物或杂质的污染。另一个重要方面在于这种制备方法是特异性的，能快速、高效和低成本的制备底物。
在另外一个实施方案中，本发明所涉及研究酶活的方法，包括以下步骤：
-将含有所述酶的样品与本发明的酶底物接触；
-采用合适条件以形成本发明的荧光沉淀物；
-定量和定性分析所述荧光沉淀物。
“样品”指任何含有膜区室的液体、固体、凝胶、乳液、淤浆或其混合物。样品优选为水溶液，其中含有细胞例如真核细胞、哺乳动物细胞或人细胞。
在适合形成沉淀物的条件下，底物与样品混合。底物的浓度必须足以产生可检测到的反应产物。典型在酶与底物相互作用后的几分钟之内形成沉淀物。通常在大约5分钟到2小时之间获得最佳的沉淀作用，最优选在大约15分钟到1小时之间。
本发明可以用于定量和定性检测任何酶的活性，这种酶能使分子的剩余部分与封闭基团裂解，产生可以检测的荧光产物。
荧光沉淀物的分析可包括以下步骤：(a)将荧光沉淀物暴露在能产生荧光沉淀物吸收波长光的光源下；(b)检测所得的沉淀物荧光。为了便于检测可见的沉淀物，利用沉淀物激发和发射的性质。例如，荧光沉淀物被光源激发，这种光源能产生波长为或接近荧光沉淀物最大吸收波长的光，如紫外灯或可见光灯、弧光灯、激光甚至太阳光。优选在波长大于或等于约250nm时激发荧光沉淀物，更优选为大于或等于约300nm，更优选大于或等于约350、370、390、400、430、450nm。通过检测最终发射的光检测沉淀物的荧光，该发射光波长大于约300nm，到约480、500、520、540、560、580、600nm。可通过以下方法检测发射光，包括使用仪器如荧光计、量子计数器、读板器、显微镜和流式细胞仪，或通过放大信号如使用光电倍增管的方法。优选使用FACS系统或专用高通量筛选系统，例如96孔或更多孔的微量滴定板或多孔平台。或者，分析沉淀物包括通过目测或光散射技术来检测沉淀物。
用于研究酶活的样品可以是生物细胞。生物细胞可以来源于动物、植物、细菌或酵母。细胞可以是活的也可以是死的。细胞可以分离出来，也可以在组织内、生物体内或生物体外。优选本发明检测酶活的方法涉及将本发明的酶底物引入到植物细胞或哺乳动物细胞。许多细胞可以用来监测酶活。这类细胞包括但不限于幼仓鼠肾脏(BHK)细胞、小鼠L细胞、Jurkats和153DG44细胞(参见Chasin(1986)Cell.Molec.Genet.12：555)、人胚肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、PC12细胞、COS-7细胞和酵母、血单核细胞(PBMC)、CD4+T细胞系，优选MT4细胞系或HeLa CD4+细胞系，以及癌细胞。癌细胞可来源于人体中任何内部或外部器官的任何癌症。
测定系统的应用是通用的。这种测定可用于筛选细胞或组织任何目标酶的基线活性。这种测定可以同样轻易地用于筛选可活化或抑制酶的化合物。那就意味着，这种测定可以用于筛选抗退化性疾病药、抗癌药、抗病毒药、抗菌药和抗真菌药。
这种测定可以用来筛选任何活细胞、死细胞或细胞系中的酶活化或酶抑制，所述细胞或细胞系可来源于体内的任何器官系统，包括但不限于头发、大脑、外周神经系统、眼、耳、鼻、口、扁桃体、牙齿、食道、肺、心脏、血液、血管、骨髓、淋巴结、胸腺、脾、免疫系统、肝、胃、肠道、胰腺、内分泌腺和组织、肾、膀胱、生殖器官和腺体、关节、骨骼和皮肤。这种测定也可以用来筛选具有潜在用途的药物，该药物可以用于体内任何器官系统的任何涉及适当酶功能障碍的疾病。
这种测定能用来筛选直接或间接调节酶的药物，即通过调节酶自身或通过调节影响酶及其级联的细胞受体或辅因子。
测定可用来确定酶或级联调节子作用的活性位点。也就是说，这种测定有助于证实新型酶或其级联调节药物的分子作用机理。
本发明也涉及运用题述荧光底物寻找新化合物或已知化合物的新用途，以减轻、预防或治疗疾病，该疾病中(程序性)细胞死亡、细胞增殖或任何异常细胞行为是病因或结果。本发明的应用实例包括筛选病灶局部缺血或全局缺血后可保护神经系统的化合物；筛选可治疗神经变性疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、朊病毒疾病、帕金森综合症、多发性硬化、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、共济失调、毛细管扩张和脊髓延髓萎缩的化合物；筛选治疗包括心肌梗死、充血性心力衰竭和心肌病在内的心脏疾病的化合物；筛选可治疗视网膜紊乱的化合物；筛选治疗包括红斑狼疮、风湿性关节炎、I型糖尿病、斯耶格伦综合症和肾小球肾炎在内的自身免疫紊乱的化合物；筛选治疗多囊肾疾病和贫血/红细胞生成的化合物；筛选治疗免疫系统紊乱的化合物；筛选治疗感染疾病的化合物，包括AIDS、SCIDS、肝炎和其它肠胃感染、肺结核和其它呼吸道感染、除HIV/AIDS以外的性传播传染病；筛选移植中减少或预防细胞、组织和器官损害(如骨髓移植中移植物抗宿主疾病)的化合物；筛选工业生物技术中减少或阻止细胞系死亡的化合物；筛选减轻或阻止秃头(脱发)的化合物；筛选减轻皮肤细胞过早死亡的化合物。
同样的，本发明也涉及筛选方法中题述荧光底物的应用，其中筛选已知药物或组合的库或其它化合物库以得到例如具有抗病毒、抗肿瘤或抗癌活性的化合物。
本发明还涉及酶底物在诊断过程中的应用，以确定来自动物或人类的癌细胞对化疗药物的化学敏感性和抗性。癌细胞可源于体内任何内部或外部器官系统的任何癌症。此外，本发明涉及在一个或多个细胞中涉及凋亡级联的酶的检测方法；测量在一个或多个细胞中涉及凋亡级联的酶的活性；确定受试物质是否对在一个或多个细胞中涉及凋亡级联的酶起作用；确定患癌症的动物对一种或多种化疗药物治疗的敏感性；监测用一种或多种化疗药物对动物的治疗；确定受试物质是否在一个或多个细胞中抑制或阻止细胞死亡，受试物质是否在一个或多个细胞中导致或促进细胞死亡。所述方法可通过以下步骤进行：使所述一个或多个细胞与本发明底物接触，由此底物被摄入一个或多个细胞，记录所述一个或多个细胞的荧光，其中，与未接触底物或接触了底物和已知酶竞争性抑制剂的对照细胞相比，所述一个或多个细胞内荧光量(即增大)或波长的变化都能指示酶的存在、受试物质的活性或癌细胞对一种或多种药物的化学敏感性。
本发明的另一个应用是酶底物在检测细胞内复制型病毒致细胞病变效应中的应用，包括以下步骤：(a)使一个或多个病毒感染细胞与酶底物接触，由此底物被摄入一个或多个病毒感染细胞；(b)记录所述一个或多个细胞的荧光，其中与没有受感染的对照细胞相比，所述一个或多个病毒感染细胞内荧光的变化能衡量病毒酶活和它们的杀细胞效应。在该间接测定方法中，转化本发明底物的酶并不必须是病毒酶，而可为细胞酶。同样，本发明涉及在影响病毒的受试物质存在下检测细胞内复制型病毒任何效应的方法；确定含有HIV病毒的动物细胞对一种或多种抗病毒药物的敏感性；监测用一种或多种抗病毒药物对动物的治疗；确定一个或多个测试细胞中受试物质是否抑制或阻止病毒复制。
在研究酶活时，评价的酶可能存在于细胞中，是内源基因表达的结果，或是通过病毒转染或遗传操作引入的外源基因表达的结果。更具体地说，酶活性分析可以被转为基因表达分析或启动子研究。受评估的酶可由编码报道基因。报道基因编码的酶能催化特异性底物转化为相应的荧光沉淀物。通常，报道基因是核苷酸序列，编码易于测定的蛋白。或者，报道基因可以用来置换其它的编码区，这种区域编码难以测定的蛋白。报道基因的实例包括在动物和酵母中编码β-D-半乳糖苷酶(GAL)的大肠埃希氏菌(Escherichia Coli)lacZ基因，在植物中编码β-D-葡糖醛酸酶(GUS)的大肠埃希氏菌gusA(uidA)报道基因。
报道基因可以“报道”许多不同的性质和事件，包括酶的表达水平；基因表达；启动子的特异性和强度，启动子是天然还是经过修饰的，以用于反向遗传学研究；基因送递系统的效率；可为蛋白运输结果的基因产物胞内命运；双杂合系统中两种蛋白或单杂合系统中蛋白与核苷酸的相互作用；翻译起始信号的效率；代谢状态；疾病状态；微生物的同一性或存在；毒素的量；成功的遗传操作和分子克隆的效果。
报道基因常和染色体调控元件融合，例如启动子。然后，所得DNA构建物被引入目标细胞中，测定酶表达以保证合适的基因表达。运用这种技术，人们可以研究编码基因的表达效率，该效率受启动子和/或阻遏蛋白处理的影响。这种技术同样也可以用于评估目标启动子的表达模式。
本发明底物也可以用于探查表达目标酶细胞的细胞种群或惰性样品。例如，因为GUS和GAL都来源于大肠杆菌，它们在某些样品中的存在表明这些生物样品已被细菌污染。
荧光底物也可以设计为同时测量超过一种酶，例如在“多重”测定中，设计能被同一代谢途径中超过一种酶识别和裂解的底物。利用本文详述的测定过程，被超过一种酶作用的“混乱”荧光底物可以用来测量仍然未知的酶的活性。同样，在同一测定中，可用具有相同吸收波长和不同发射波长的不同荧光底物来同时测量不同酶的活性。
实际上，测试细胞与受试物质的接触可先于、后于或基本同时与本发明荧光底物的接触。这种方法可以检测受试物质是刺激还是抑制酶活。本发明还涉及在第一种受试物质存在下，进一步将第二种受试物质或受试物质混合物与测试细胞接触。
可使用合适的增溶剂，将本发明的荧光底物给予组织、细胞和细胞系中。合适的增溶剂包括水溶型底物的水溶液，例如水溶性盐和缓冲溶液。另外，作为适当的油状悬浮物，化合物的乳状液和悬浮液可被给予细胞和组织。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或人造脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯、聚乙二醇400(化合物可溶于PEG-400)、二甲亚砜(DMSO)或其它合适的增溶剂。乳状液、悬浮液、溶液还任选包含稳定剂。任选将报道分子电穿孔到或置于脂质体中或使用去污剂，增强细胞对荧光报道分子的通透性。
本发明中所用的多孔平台可有约6到约5000孔，优选为约96到约4000孔，最优选为96的倍数。
本文通过举例说明反应来描述优选底物的制备。这些描述是举例说明，并不限制用于制备必需荧光底物的反应物和反应条件的选择。通过选择合适的取代基，就可以具体地改良膜通透性、溶解性、荧光强度和荧光波长、以及产物的耐光性。
实施例
实施例1：酶识别GUS底物的快速测定
测定二丁基GUS底物(化合物27)。首先，配制2mg产物(化合物27)的2ml pH 8缓冲溶液(Merck Titrisol 9888)中溶液。保存1ml，在另外1ml溶液中加入5μl(500单位)盖罩大蜗牛(Helix Pommatia)型HP-2的β-D-葡糖醛酸酶(Sigma G7017)。室温下振荡15分钟后，两种溶液在TLC板(Macherey-Nagel SIL G-25UV254)上点样。板用异辛烷/丙酮60∶40显色。含有GUS酶的溶液在TLC板上显示出明显的荧光斑点(Rf＝0.53)，空白溶液没有荧光斑点。这表明所用的GUS酶能将没有荧光的底物(化合物27)转化为荧光产物(化合物28)。
实施例2：制备活化的保护糖部分(保护的封闭基团)
(1，2，3，4-四-O-乙酰基-β-D-葡糖醛酸)甲酯(化合物7)。将D-葡糖醛酸-6，3-内脂(19.0g，108mmole)悬浮在250ml甲醇中，并在氩气下室温搅拌。缓慢加入100mg NaOH的100ml甲醇溶液(1小时)。再搅拌1小时之后，混合物被减压浓缩，并置于冰浴中。加入吡啶(45ml，562mmole)和乙酸酐(54ml，652mmole)，并保持温度低于10℃。残渣溶解之后，室温搅拌3小时，然后减压浓缩直到几乎成固体。加入二氯甲烷(300ml)，溶解残渣，用100ml水洗涤3次，MgSO4干燥。除去MgSO4，加入200ml甲醇，过滤沉淀物并干燥。获得白色晶体(25.0g，收率65％)。产物100％为β型。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(pppm)：5.75(d，8.0Hz，1H)，5.31(ddap.t，9.3 Hz，1H)，5.24(dd ap.t，9.3Hz，1H)，5.14(dd，9.3/8.0Hz，1H)，4.18(d，9.3Hz，1H)，3.34(s，3H)，2.12(s，3H)，2.03(m，9H)。
13C-NMR：(50MHz，CDCl3)：v(ppm)：169.9，169.4，169.2，168.8，166.9，91.4，73.0，71.8，70.2，69.0，53.0，20.8，20.6，20.5。
IR(膜)：v.(cm-1)：2959(w)，1757(s)，1447(w)，1370(m)，1217(s)，1091(m)，1041(m)，978(w)，911(w)，895(w)，772(w)，692(w)，600(w)，558(w)。
(2，3，4-三-O-乙酰基-α/β-D-葡糖醛酸)甲酯(化合物8)。向化合物7(36.1g，96mmole)的600ml无水THF溶液中，加入28.8ml甲醇三丁基锡(100mmole)。烧瓶中充氩，混合物加热回流5小时。减压去除溶剂。加入20ml 0.5M HCl，用300ml二氯甲烷萃取混合物2次。合并有机相，用MgSO4干燥，减压除去溶剂。残余物-20℃过夜。形成了两相。去除上相。用异辛烷/乙酸乙酯50∶50快速色谱法(AcrosSilicagel 0.060-0.200mm)纯化下相。获得白色固体(26.0g，收率80％)，由78％α型和22％β型组成。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3+dr D2O)：δ(ppm)：5.58(dd ap.t，9.8Hz，1Hα)，5.55(d，3.6Hz，1Hα)，5.31(dd ap.t，9.6Hz，1Hβ)，5.23(dd ap.t，9.6Hz，1Hβ)，5.18(dd ap.t，9.8Hz，1Hα)，4.91(m，1H.+1Hβ)4.79(d，7.7Hz，1Hβ)，4.59(d，9.8Hz，1Hα)，4.10(d，9.6Hz，1Hβ)，3.76(s，3Hβ)，3.75(s，3Hα)，2.09(s，3Hβ)，2.08(s，3Hα)，2.03(m，6Hα6Hβ)。
13C-NMR：(50MHz，CDCl3)：δ(ppm)：170.4，170.2，169.9，169.8，168.7，167.8，95.3，90.2，72.7，72.4，71.8，70.9，69.6，69.5，69.2，67.9，53.0，52.9，20.7，20.5。
IR(膜)：v(cm-1)：3441(s，宽峰)，2958(w)，1754(s)，1437(m)，1374(m)，1228(s)，1157(m)，1071(s)，936(w)，898(w)，841(w)，798(w)。
(1-脱氧-2，3，4-三-O-乙酰基-1-三氯亚氨代乙酰基-α-D-葡糖醛酸)甲酯(化合物9)。13.1g化合物8(39.2mmole)溶于80ml无水二氯甲烷中。加入20.0ml三氯乙腈(195.9mmole)和0.6ml DBU(3.9mmole)。混合物在氩气下室温搅拌24小时。向溶液中加入3g细硅胶，混合物搅拌5分钟，过滤。滤液减压浓缩，用戊烷/乙酸乙酯75∶25快速色谱法(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化。获得白色固体(15.0g，收率75％)，由100％α型组成。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：8.73(s，1H)，6.64(d，3.6Hz，1H)，5.63(dd ap.t，10.1Hz，1H)，5.27(dd ap.t，10.1Hz，1H)，5.15(dd，10.1/3.6Hz，1H)，4.50(d，10.1Hz，1H)，3.75(s，3H)，2.05(m，6H)，2.01(s，3H)。
13C-NMR：(50MHz，CDCl3)：δ(ppm)：169.8，169.7，169.5，167.2，160.5，92.6，90.5，70.5，69.4，69.1，68.9，53.1，20.7，20.5，20.4。
IR(膜)：v(cm-1)：3320(w)，2957(w)，1756(s)，1679(m)，1439(w)，1370(m)，1287(w)，1218(s)，1150(w)，1043(s)，971(m)，914(w)，835(w)，797(m)，734(w)，697(w)，645(w)，600(w)，552(w)。
2，3，4，5-四-O-乙酰基-α/β-D-半乳糖(化合物10)。将商业可获得的β-D-半乳糖五乙酸酯(12.0g，31mmole)溶于500ml无水THF中，加入9.3ml甲醇三丁基锡(32mmole)。烧瓶中充氩，加热回流5小时。减压除去溶剂。加入200ml 0.5M HCl，用300ml二氯甲烷萃取2次。合并有机相，用MgSO4干燥，减压除去溶剂。加入150ml乙腈，用150ml正己烷洗涤6次以除去锡残留物。蒸发溶剂，用异辛烷/乙酸乙酯70∶30快速色谱法(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化残渣。获得白色固体(7.0g，收率65％)，由70％α型和30％β型产物组成。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：5.52(d，3.5Hz，1Hα)，5.48(map.d，1Hα)，5.41(m，1Hα+1Hβ)，5.17(dd，3.5/10.8Hz，1Hα)，5.07(m，2Hβ)，4.69(m，1Hβ)，4.47(t，6.5Hz，1Hα)，4.10(m，2Hα+2Hβ)，3.96(t，6.5Hz，1Hβ)，2.16(s，3Hβ)，2.15(s，6Hα)，2.11(s，3Hβ)，2.10(s，3Hα)，2.05(m，3Hα+3Hβ)，2.00(s，3Hβ)，1.99(s，3Hα)。
IR(膜)：v(cm-1)：3464(m，宽峰)，2971(w)，1747(s)，1434(w)，1372(m)，1231(s)，1154(w)，1126(w)，1052(s)，956(w)，913(w)，774(w)，736(w)，703(w)，601(w)。
1-脱氧-2，3，4，5-四-O-乙酰基-1-三氯亚氨代乙酰基-α-D-半乳糖(化合物11)。6.4g化合物10(20.0mmole)溶于60ml无水二氯甲烷中，加入10.0ml三氯乙腈(100.0ml)和0.3ml DBU(2.0mmole)。混合物在氩气下室温搅拌24小时。蒸发溶剂，所得残渣用异辛烷/丙酮85∶15快速色谱法(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化。获得白色固体(5.4g，收率55％)，化合物11由100％α型组成。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：8.67(s，1H)，6.60(d，3.5Hz，1H)，5.56(m，1H)，5.42(dd，3.3/10.8Hz，1H)，5.36(dd，3.4/10.8Hz，1H)，4.44(t，7.0Hz，1H)，4.13(m，2H)，2.17(s，3H)，2.02(m，9H)。
IR(膜)：v(cm-1)：1751(s)，1677(w)，1431(w)，1371(m)，1225(s)，1149(w)，1073(m)，971(w)，951(w)，933(w)，903(w)，836(w)，797(w)，642(w)，526(w)，471(w)。
实施例3：用Still偶联制备二丁基喹唑酮荧光团(化合物13)
1.00g二溴化物化合物12(2.5mmole)溶于10mlHMPA，随后加入4.20ml四丁基锡(12.8mmole)和80mg Pd(PPh3)4(0.07mmole)。反应混合物加热至80℃，持续5天，随后过滤。用环己烷/丙酮95∶5作为洗脱液，滤液直接用快速色谱法纯化。收集含有所需产物的部分，蒸发，并再次用环己烷/乙酸乙酯90∶10进行纯化。获得的残渣用3ml甲醇洗涤一次，干燥，获得155mg(收率14％)化合物13的浅绿色晶体。
ES-MS(+)方式：351.2(M+H+)，373.2(M+Na+)。
1H-HMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：8.14(s，1H)，8.02(d ap.m，1H)，7.64(m，2H)，7.29(dd，2.0/8.4Hz，1H)，7.02(d，8.4Hz，1H)，2.76(m，4H)，1.70(m，4H)，1.40(m，4H)，0.95(m，6H)。
IR(膜)：v.(cm-1)：2926(w)，2834(w)，1666(s)，1616(w)，1576(w)，1505(w)，1392(w)，1339(w)，973(w)，810(w)。
实施例4：制备二戊基化喹唑酮荧光团(化合物21)
其它通过Stille偶联的二烷基化是分别合成单烷基化的结构单元，然后将它们结合为亲脂性的双烷基化荧光团。例如所示双戊基化荧光团(化合物21)的合成：
5-正戊基靛红(化合物15)的合成。将28.5g水合三氯乙醛(172mmole)和170g硫酸钠溶于600ml水中(溶液1)。将27.8ml 4-正戊基-苯胺(157mmole)和15ml浓盐酸溶于475ml水中(溶液2)。29.6ml50％羟胺水溶液和42ml浓盐酸溶于80ml水中(溶液3)。溶液1边搅拌边加热到60℃，然后依次滴加溶液2和溶液3。反应物升温至回流，持续15分钟。然后将反应物冷却到室温。滤出固体物，溶于500ml乙酸乙酯，并用200ml水洗涤3次。经过蒸发，将主要为化合物14的残留物缓慢加入到含有100ml浓硫酸的冰浴烧杯中，同时搅拌。当加完全部化合物14后，反应物升至室温，然后加热到80℃，持续15分钟。加入1000g冰，形成的固体滤出后重新溶于300ml乙酸乙酯。用200ml水洗涤3次，蒸发。所得残留物用异辛烷/丙酮65∶35进行快速色谱纯化(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)，得到化合物15的橙色固体(11.4g，收率40％)。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：9.35(s，1H)，7.38(d ap.s，1H)，7.35(dd，1.7/8.0Hz，1H)，6.92(d，8.0Hz，1H)，2.54(t，7.6Hz，2H)，1.57(m，2H)，1.30(m，4H)，0.88(t，6.9Hz，3H)。
IR(膜)：v(cm-1)：3279(w)，2955(w)，2856(w)，1745(s)，1624(s)，1490(s)，1197(w)，657(w)。
5-正戊基靛红酸酐(化合物16)的合成。将8.13g化合物15(37.5mmole)溶于145ml的THF。将此溶液滴加到含有12.9g间氯-过苯甲酸的55ml THF溶液中，搅拌过夜。向反应液中加入150ml饱和碳酸氢钠溶液和500ml水。所得悬液用250ml乙酸乙酯萃取3次。蒸发后，获得了化合物16的白色固体(7.4g，收率84％)。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：9.95(s，1H)，7.87(d ap.s，1H)，7.51(dd，1.6/8.2Hz，1H)，7.08(d，8.2Hz，1H)，2.63(t，7.6Hz，2H)，1.61(m，2H) 1.30(m，4H)，0.88(t，6.9Hz，3H)。
IR(膜)：v(cm-1)：3246(w)，2955(w)，2927(w)，2856(w)，1789(m)，1758(s)，1697(m)，1518(w)，1350(w)，1278(w)，1140(w)，1043(w)，1004(w)，847(w)，765(w)，750(w)，679(w)，580(w)，556(w)。
5-正戊酰基水杨酸甲酯(化合物17)的合成。将167g三氯化铝(1250mmole)溶于430ml二硫化碳，冷却到5℃。在机械搅拌下滴加54ml水杨酸甲酯(418mmole)和101ml戊酰氯(835mmole)的145ml二硫化碳溶液，室温下搅拌20小时。然后，反应液中倒入2kg含有100ml浓盐酸的冰。待冰融化之后，加入50g氯化钠，混合物用500ml二氯甲烷萃取2次。收集有机相，用300ml盐水洗涤3次，蒸发后得到澄清液体(98g，收率99％)。不再需要进一步纯化。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：8.49(d，2.3Hz，1H)，8.09(dd，2.3/8.8Hz，1H)，7.03(d，8.8Hz，1H)，4.0(s，3H)，2.92(t，7.4Hz，2H)，1.72(m，2H)，1.41(m，2H)，0.96(t，7.3Hz，3H)。
IR(膜)：v(cm-1)：2958(m)，2872(w)，1674(s)，1590(m)，1444(m)，1298(w)，1266(w)，1214(s)，1088(m)，961(w)，843(w)，796(w)，731(w)，688(w)，584(w)。
5-戊酰基水杨酸(化合物18)的合成。将97.5g化合物17(412mmole)溶于530ml乙醇和1050ml水中。加入87g NaOH(2.19mmole)，混合物回流5小时。然后混合物用浓盐酸酸化到pH 1。形成的沉淀物过滤并减压干燥。获得了82g产物(收率90％)。
1H-NMR：(500MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)：8.38(d，2.3Hz，1H)，8.10(dd，2.3/8.7Hz，1H)，7.06(d，8.7Hz，1H)，2.95(t，7.3Hz，2H)，1.58(m，2H)，1.34(m，2H)，0.90(t，7.3Hz，3H)。
ES-MS(+)方式：223.0(M+H+)，245.0(M+Na+)。
IR(膜)：v(cm-1)：3500(w)，3072(m，宽峰)，2955(w)，2933(w)，2869(w)，1668(s)，1588(w)，1490(w)，1428(w)，1348(w)，1301(w)，1272(w)，1198(s)，1087(w)，843(w)，796(w)，765(w)，619(w)。
5-戊基水杨酸(化合物19)的合成。将113g苔状锌和12.2g HgCl2在4.6ml浓盐酸和190ml水中振荡过夜。倒出澄清液体，加入105ml水、56ml浓盐酸和50g化合物18。混合物回流5天。冷却后混合物用1000ml乙酸乙酯萃取。获得的有机相用盐水洗涤2次，硫酸镁干燥，蒸发。所得残留物用二氯甲烷/乙酸99∶1进行快速色谱(AcrosSilicagel 0.060-0.200mm)纯化，获得化合物19的白色粉末(19.6g，收率40％)。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：9.90(s，1H)，7.88(d，1.6Hz，1H)，7.51(dd，1.6/8.3Hz，1H)，7.07(d，8.3Hz，1H)，2.64(t，7.6Hz，2H)，1.61(m，2H)，1.32(m，4H)，0.88(t，6.9Hz，3H)。
ES-MS(-)方式：207.1(M-H+)。
IR(膜)：v.(cm-1)：3248(w，宽峰)，2924(w)，1667(s)，1614(w)，1584(w)，1487(w)，1446(s)，1334(w)，1294(w)，1216(m)，902(w)，794(w)，675(m)，581(w)，471(w)。
5-正戊基水杨酰胺(化合物20)的合成。将18g化合物19(86mmole)、20.8g ureum(346mmole)和5滴多磷酸加热到150℃，持续18小时。冷却后，加入500ml乙酸乙酯，所得溶液用盐水洗涤2次。蒸发有机相，所得残渣用环己烷/异丙醇95∶5进行快速色谱(AcrosSilicagel 0.060-0.200mm)纯化，获得化合物20的白色粉末(9.17g，收率51％)。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：7.25(dd，2.0/8.5Hz，1H)，7.15(d，2.0Hz，1H)，6.92(d，8.5Hz，1H)，2.53(t，7.6Hz，2H)，1.56(m，2H)，1.30(m，4H)，0.88(t，6.9Hz，3H)。
IR(膜)：v(cm-1)：3408(s，宽峰)，3196(w)，2953(w)，2854(w)，1660(s)，1634(s)，1497(m)，1436(w)，1356(w)，1249(m)，1138(w)，1081(w)，822(w)，795(w)，744(w)，695(w)，580(w)。
(2-羟基-5-正戊基苯基)-6-正戊基-3H-喹唑啉-4-酮(化合物21)的合成。2.81g化合物16(12.1mmole)和2.50g(12.1mmole)化合物20在10ml DMF中加热到150℃，持续3.5小时。混合物缓慢冷却到室温，过滤分离形成的晶体，晶体用3ml甲醇洗涤。干燥后，获得2g化合物21的浅绿色晶体(收率43％)。
1H-NMR：(500MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)：8.08(s，1H)，7.95(s，1H)，7.69(dd，1.6/8.3Hz，1H)，7.66(d，8.3Hz，1H)，7.26(dd，1.6/8.3Hz，1H)，6.90(d，8.3Hz，1H)，2.74(t，7.5Hz，2H)，2.55(t，7.5Hz，2H)，1.63(m，4H)，1.32(m，8H)，0.89(m，6H)。
IR(膜)：v.(cm-1)：2924(w)，1666(s)，1615(w)，1592(w)，1578(w)，1505(m)，1396(w)，1336(w)，1254(w)，1226(w)，1204(w)，1150(w)，1131(w)，886(w)，825(w)。
熔点：244℃
实施例5：活化保护的葡糖醛酸(化合物9与二戊基化喹唑酮荧光团
偶联，随后将糖部分去保护
2，3，4-三-O-乙酰基-1-O-(2-(4-氧代-6-正戊基-3H-喹唑啉基)-4-正戊苯基)-β-D-葡糖醛酸甲酯(化合物22)的合成。将0.378g化合物21(0.99mmole)和0.574g化合物9(1.20mmole)减压充分干燥，溶于11ml无水氯仿。加入13μl醚合三氟化硼(099mmole)，反应物在30℃下搅拌2天。蒸发反应混合物，所得残渣用环己烷/丙酮90∶10进行快速色谱(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化，得到化合物22的浅绿色粉末(457mg，收率66％)。
1H-NMR：(500MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)：8.32(d，2.2Hz，1H)，8.00(d，8.6Hz，1H)，7.91(dd，1.9/8.6Hz，1H)，7.80(d，1.4Hz，1H)，7.26(dd，2.2/8.3Hz，1H)，6.91(d，8.3Hz，1H)，6.88(d，7.9Hz，1H)，5.84(dd ap.t，9.34Hz，1H)，5.41(dd，7.9/9.4Hz，1H)，5.19(dd ap.t，9.4Hz，1H)，4.98(d，9.4Hz，1H)，3.57(s，3H)，2.80(m，2H)，2.63(m，2H)2.06(s，3H)，2.05(s，3H)，1.96(s，3H)，1.67(m，4H)，1.32(m，8H)，0.88(m，6H)。
IR(膜)：v(cm-1)：3371(w)，2925(w)，2855(w)，1749(s)，1694(s)，1614(w)，1580(w)，1504(w)，1454(w)，1428(w)，1355(w)，1232(s)，1098(m)，1061(w)，834(m)，753(w)，650(w)，605(w)。
ES-MS(+)方式：695.3(M+H+)。
合成1-O-(2-(4-氧代-6-正戊基-3H-喹唑啉基)-4-正戊基苯基)β-D-葡糖醛酸甲酯(化合物23)。457mg化合物22(0.66mmole)溶于66ml二氯甲烷。加入86ml氰化钾的甲醇溶液(0.25g/ml)。混合物室温下搅拌40小时。蒸发反应混合物浓缩，所得残渣用环己烷/丙酮77∶23进行快速色谱(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化，得到化合物23的浅绿色黏性固体(61mg，收率16％)。
1H-NMR：(500MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)：8.25(d，2.2Hz，1H)，8.05(d，1.2Hz，1H)，7.97(d，8.6Hz，1H)，7.91(dd，1.9/8.6Hz，1H)，7.27(dd，2.2/8.3Hz，1H)，6.91(d，8.3Hz，1H)，6.24(d，8.0Hz，1H)，5.70(d，5.3Hz，1H)，5.59(d，5.4Hz，1H)，5.45(d，4.9Hz，1H)，4.19(d，9.3Hz，1H)，3.64(s，3H)，3.55(m，2H)，2.82(m，2H)，2.63(m，2H)，1.65(m，4H)，1.33(m，8H)，0.88(m，6H)。
1-O-(2-(4-氧代-6-正戊基-3H-喹唑啉基)-4-正戊基苯基)-β-D-葡糖醛酸的合成(化合物24)。15mg化合物23(0.027mmole)溶于6ml无水THF。加入35μl氧化二(三丁基锡)(0.069mmole)，反应室温下搅拌20天。加入5ml乙腈，混合物用5ml正己烷洗涤10次。蒸发溶剂，所得残渣用Phenomenex Luna C18(2)22×250mm 5μl HPLC柱纯化。10分钟内洗脱梯度从100％水(5mM醋酸铵)到100％乙腈。紫外检测器波长设为270nm。分离收集第一个洗脱峰，冷冻干燥。得到8mg白色固体(收率54％)。电喷雾质谱显示了正确的分子质量。
ES-MS(-)方式：553.2(M-H+)，1107.6(2M-H+)。
测试GUS底物(化合物24)，30分钟后显示了清晰的阳性反应。
实施例6：磷酸基团与二戊基化喹唑酮荧光团的偶联
2-(2-二乙基磷酰氧基-5-正戊基苯基)-6-正戊基-3-H-喹唑啉-4-酮(化合物25)的合成。1.00g化合物21(2.64mmole)溶于30ml无水THF，立刻加入95mg氢化钠(3.97mmole，矿物油中60％)。反应在氩气下，室温搅拌0.5小时。之后，加入570μl二乙基磷酰氯，继续搅拌15小时。蒸发反应混合物，所得残渣用二氯甲烷/乙酸乙酯93∶7进行快速色谱(Acros Silicagel 0.060-0.200mm)纯化，得到化合物25的淡黄色油状物(914mg，收率67％)。
1H-NMR：(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)：10.69(s，1H)，8.11(d，2.0Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.72(d，8.3Hz，1H)，7.61(dd，2.1/8.3Hz，1H)，7.36(d，8.3Hz，1H)，7.31(dd，2.1/8.3Hz，1H)，4.26(m，4H)，2.75(t，7.6Hz，2H)，2.66(t，7.6Hz，2H)，1.65(m，4H)，1.34(m，14H)，0.89(m，6H)。
IR(膜)：v(cm-1)：3389(w，宽峰)，3188(w)，2956(w)，2929(m)，2857(w)，1688(s)，1601(m)，1493(m)，1295(m)，1217(w)，1031(s)，966(w)，934(w)，833(w)。
ES-MS(+)方式：515.2(M+H+)。
2-(3H-4-氧代-6-正戊基-2-喹唑啉基)-4-正戊基苯基磷酸(化合物26)的合成。358mg化合物25(694μmole)溶于18ml二氯甲烷。加入1.86ml二(三甲基甲硅烷基)三氟乙酸(6.94mmole)，反应物在氩气下室温搅拌半小时。反应物然后冷却到0℃，滴加795μl三甲基甲硅烷基碘。反应物在氩气中0℃下搅拌1小时。然后加入63ml乙腈/水/三氟乙酸(10∶5∶3)的混合液，反应物室温搅拌1小时。蒸发反应混合物，所得残渣用二氯甲烷/甲醇/甲酸90∶10∶2进行快速色谱(AcrosSilicagel 0.060-0.200mm)纯化。加入100ml甲苯后，浓缩含有产物的部分，得到化合物26的橙色晶体(238mg，收率58％)。
1H-NMR：(500MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)：7.94(d，1.9Hz，1H)，7.72(dd，1.9/8.4Hz，1H)，7.63(d，8.3Hz，1H)，7.55(d，1.9Hz，1H)，7.36(dd，2.1/8.3Hz，1H)，7.31(d，8.4Hz，1H)，2.74(t，7.5Hz，2H)，2.61(t，7.6Hz，2H)，1.62(m，4H)，1.32(m，8H)，0.87(m，6H)。
IR(膜)：v.(cm-1)：2930(s，宽峰)，2857(w)，1658(s)，1495(m)，1466(w)，1329(w)，1299(w)，1201(m)，947(m)，841(w)，719(w)，624(w)，526(m)。
ES-MS(+)方式：457.4(M+H+)。
施例7：在哺乳动物和植物细胞中测试酶
在10μg pLNCGUS存在下对细胞进行电穿孔，24小时后，将化合物27(10mM DMSO贮备液)加入至最终浓度为10μg/ml。少于5％的细胞摄入了pLNCGUS质粒。在图中，与没有荧光的细胞相比较，未加入10μg pLNCGUS的电穿孔细胞只显示出微弱的背景荧光，如图3所示。
化合物27
实施例8：萘酚-喹唑酮荧光团30的制备
萘酚多芳性烷基化荧光团可以按照如下方法制备：假如用2-羟基-1-萘甲酸(2-hydroxy-1-naphtoic acid)而不是化合物18(见实施例4)，就可以用实施例4描述的合成化合物21的方法来合成化合物30。
Claims (9)
1.一种式(I)的酶底物或其生物可接受的盐、酯、酰氨和磷酸衍生物：
其中
Y为-C(O)-；
n为1；
W为-N(R3)-；
M为-O-、-N(R3)-或-S-；
R1和R2各自独立为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基；
R3为氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-7环烷基、芳基、Het1或Het2；
每个q独立为0或1；
Het1作为基团或基团的部分，为饱和的或部分不饱和的单环、双环或三环的杂环基，具有5-8个环原子，该杂环基中含有一个或多个选自氮、氧或硫的杂原子环成员；
Het2作为基团或基团的部分，为芳族单环、双环或三环杂环基，具有5-6个环原子，该杂环基中有一个或多个选自氮、氧或硫的杂原子环成员；
其中任何C1-8烷基、C2-8烯基或C2-8炔基可被以下基团进一步单取代、二取代或如果化合价允许的话，三取代：C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷硫基、C1-4烷基次磺酰基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、C14烷氨基、卤素、硝基、叠氮基、巯基、次磺基、亚磺基、磺基、氰基、氨基、芳基、Het1或Het2取代基；
其中，封闭基团为α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、β-D-半乳糖、α-D-甘露糖、β-D-甘露糖、β-D-N-乙酰葡萄糖氨、β-D-葡糖醛酸、β-D-岩藻糖、α-L-岩藻糖、α-L-艾杜糖醛酸、α-L-阿拉伯糖、β-D-木糖、α-D-N-乙酰-神经氨酸；
前提条件是R1、R2和R3中至少一个为至少4个碳的部分。
2.权利要求1的底物，其中R1、R2和R3中至少一个独立选自直链或支链的丁基、戊基、己基、庚基和辛基。
3.权利要求1或2的底物，其中W为-N(R3)-，Y为-C(＝O)-，n为1，且具有式(II)的结构：
其中M、R1、R2、R3、q和封闭基团如权利要求1或2中的定义。
4.权利要求1或2的底物，具有式(III)的结构：
其中R1、R2、R3和封闭基团如权利要求1或2中的定义。
5.权利要求1-4任一项的底物的用途，所述底物用于渗透过生物细胞的膜。
6.权利要求1-4任一项的底物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
-合成根据权利要求1所定义的封闭基团，由此所述封闭基团可任选被保护；
-合成取代的荧光团，该荧光团对应于连接所述封闭基团的式(I)部分；
-将任选保护的封闭基团与所述取代荧光团偶联；
-任选将所述封闭基团去保护；
-纯化所得取代底物。
7.一种荧光沉淀物，所述沉淀物可通过从权利要求1-4任一项的式(I)、式(II)和式(III)底物裂解封闭基团部分而获得，具有式(IV)：
其中Y、n、W、M、R1、R2和q如权利要求1-4任一项中的定义。
8.一种检测酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：
-将包含所述酶的样品与权利要求1-4任一项的底物接触；
-应用合适的条件以形成权利要求7的荧光沉淀物；
-定性或定量分析所述荧光沉淀物。
9.权利要求8的方法，其中分析所述荧光沉淀物包括以下步骤：
-将荧光沉淀物暴露于光源下，所述光源可产生荧光沉淀物吸收波长的光；
-检测沉淀物产生的荧光。
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