DE4119956A1 - Verfahren zur identifizierung und differenzierung gramnegativer bakterien mittels l-prolinaminopeptidase - Google Patents

Verfahren zur identifizierung und differenzierung gramnegativer bakterien mittels l-prolinaminopeptidase

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Description

Als Alternative zu den klassischen Methoden der Identifi­ zierung und Differenzierung von Bakterien werden neuerdings verstärkt präformierte, im Bakterium nach dem Wachstum auf oder in geeigneten Nährmedien vorhandene Enzyme verwendet. Bakterienkulturen werden chromogene oder fluorogene Substrate zugesetzt, die durch die präformierten Enzyme gespalten wer­ den. Durch Freisetzung der chromogenen oder fluorogenen Gruppe und Farbänderung oder Fluoreszens wird die Enzymreaktion ange­ zeigt.
L-Prolinaminopeptidase wird von gramnegativen Bakterien quali­ tativ und quantitativ unterschiedlich gebildet und kann z. B. durch Hydrolyse entsprechender Substrate wie L-Prolin-4-nitro­ anilid oder L-Prolin-2-naphthylamid nachgewiesen werden. L-Prolinaminopeptidase wird für diese Zwecke bei der Differen­ zierung pathogener Neisserien eingesetzt (Eur. Pat. App. Publ. No. 01 22 023 vom 17. 10. 1984). Die Eignung der Prolinspezifi­ schen Endopeptidase EG Nr. 3.4.2.1. zum Nachweis von bakteriel­ len Infektionen in Liquor wird im WPC 12 Q/2 74 982.2 (DDR) vom 9. 4. 1985 beschrieben. L-Prolyl-and-L-Hydroxyprolyl-β-naph­ thylamid als chromogene Substrate werden von Serratia marces­ cens-Stämmen 30-100fach stärker hydrolysiert als von anderen Enterobacteriaceae (Godsey et al. 1981). Bei Pseudomonaden fan­ den Kämpfer und Dott (1988) nur bei P. diminuta und bei einem von 94 P. aeruginosa-Stämmen eine positive L-Prolinaminopepti­ dase-Aktivität.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Ermittlung der Substrat-, Zeit-, pH- und Temperaturoptima der L-Prolinamino­ peptidase das Anwendungsgebiet für die Identifizierung und Dif­ ferenzierung gramnegativer Bakterien zu erweitern, die Diag­ nostik zu beschleunigen und gleichzeitig neue Biochemotypi­ sierungsmethoden einzurichten.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem die Substrat-, Zeit-, pH- und Temperaturoptima für L-Prolinaminopeptidase bei der Reaktion mit L-Prolin-4-nitroanilid für Serratia spp. und Hafnia alvei bestimmt und die sich daraus ergebenden Para­ meter für Identifizierung und Differenzierung der angegebenen Genera angewendet werden. Weiterhin werden die gefundenen Para­ meter zum gleichen Zweck für Pseudomonaden und pathogene Neis­ serien angewendet.
Basierend auf diesen Werten wurden für die praktischen Arbeiten zwei unterschiedliche Konzentrationen an L-Prolin-4-nitroanilid festgelegt:
Identifizierungskonzentration IK: 5%ige Lösung von L-Prolin-4- nitroanilid in Tris-HCl-Puffer pH 7.5 oder gleiche Substratmenge auf Filterpapierblättchen aufgetrocknet.
Differenzierungskonzentration DK: 0.5%ige Lösung von L-Prolin- 4-nitroanilid in Tris-HCl-Puffer pH 7.5 oder gleiche Substrat­ menge auf Filterpapierblättchen aufgetrocknet.
Die zu prüfenden Bakterien werden von einem geeigneten festen Nährmedium abgeimpft und in Tris-HCl-Puffer pH 7.5 auf 109 CFU/ ml eingestellt. 100 µl dieser Suspension werden mit 100 µl Tris- HCl-Puffer pH 7.5 und 20 µl Identifizierungskonzentration oder Differenzierungskonzentration bzw. die entsprechenden getränkten Filterpapierblättchen versetzt. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wird eine grün-gelb-Färbung als positive L-Prolinaminopeptidase- Reaktion abgelesen.
Die Bakterien können auch in geeigneten flüssigen Nährmedien angezüchtet werden. Nach Erreichen der Mindest-Keimzahl kann bei hellen Nährmedien das Substrat direkt zugefügt und die Reaktion abgelesen werden, bei Verwendung gelb-brauner flüssi­ ger Nährmedien muß vorher zentrifugiert und in Tris-HCl-Puffer pH 7.5 resuspendiert werden.
Die sich aus den Optima für die Enzymreaktion ergebenden Para­ meter für Hafnia alvei (pH 8.0; 60°C, 1.58 mMol/l) erlauben hier einen L-Prolinaminopeptidase-Nachweis schon in 15 min. Die Beobachtung von Langzeitreaktionen (Ablesung nach 4 bzw. 24 Std.) ergibt bei E. coli, Klebsiella spp. und Enterobacter spp. unterschiedliche Reaktionsausfälle. Diese können für epidemiolo­ gische Untersuchungen als Biochemotypie-Methode verwendet werden. Günstig gegenüber L-Prolin-2-naphthylamid als weiteres chromo­ genes Substrat erweist sich L-Prolin-4-nitroanilid auch dadurch, daß keine zusätzlichen Reagenzien für die Azokupplung bereitge­ stellt werden müssen. 4-Methylumbelliferyl-Derivate sind in der Regel teurer.
Ausführungsbeispiel 1
L-Prolinaminopeptidaseaktivität bei Enterobacteriaceae
Tabelle 1
Von den geprüften Enterobacteriaceae (Tab. 1) zeigten nur Serra­ tia marcescens, Serratia liquefaciens und Hafnia alvei innerhalb 30 min bei 37°C im Tris - HCL-Puffer pH 7.5 bei der angegebenen Identifizierungskonzentration IK L-Prolinaminopeptidaseaktivität. Damit können diese Genera schnell und eindeutig von den anderen Enterobacteriaceae abgetrennt werden. Anwendung der Differenzierungs­ konzentration DK (=0.1 IK) ergab nur bei Hafnia alvei-Stämmen eine positive L-Prolinaminopeptidasereaktion.
Ausführungsbeispiel 2
L-Prolinaminopeptidaseaktivität bei Pseudomonaden
Tabelle 2
Hydrolyseaktivität von Pseudomonas spp. gegenüber L-Prolin-4-nitroanilid
Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Kämpfer und Dott (1988), die sich allerdings einer anderen Methode bedienten, waren hier alle geprüften P. aeruginosa-Stämme L-Prolinaminopeptidase - positiv; die Anzahl der übrigen getesteten Pseudomonaden und der Acinetobacter-Stamm waren nicht repräsentativ.
Ausführungsbeispiel 3
L-Prolinaminopeptidaseaktivität von Neisseria spp.- und B. catarrhalis-Stämmen
Neben der bekannt positiven Reaktion von N. gonorrhoeae ist die Trennung von B. catarrhalis (negativ) neu. Bei einer Keimzahl von 1.5.10⁹ CFU N. gonorrhoeae/ml kann die Hydrolyse bereits nach 5 min abgelesen werden.
Ausführungsbeispiel 4
Hydrolyse von L-Prolin-4-nitroanilid durch E. coli-, Klebsiella spp.- und Enterobacter spp.-Stämme nach 4 Std. und 24 Std.
Bei den E. coli-Stämmen treten keine signifikanten Unterschiede in der L-Prolinaminopeptidaseaktivität in Abhängigkeit von der Herkunft auf. Dagegen zeigen die Klebsiellen aus F nach 4 Stun­ den deutlich geringere Aktivität als die aus B1 und B2 isolier­ ten. Enterobacter spp. weisen die schwächste L-Prolinaminopep­ tidaseaktivität gegenüber den anderen Spezies aus. Hier domi­ nieren nach 24 Std. die aus F isolierten Stämme gegenüber den aus B1 isolierten.
Literatur
Chu, A. E.-Y. and P. K. Chu: Microorganisms detection methods and the coporation of agglutinated microorganisms, and a kit for use therein. Eur. Pat. App., Publ. Nr. 01 22 023, vom 17. Oktober 1984.
Fischer, G., G. Küllertz, G. Küllertz und A. Barth: Ver­ fahren zur Bestimmung von Bakterieninfektionen in Liquores. Wirtschaftspatent (DDR) WP C12 Q/2 74 982.2 (DDR) vom 9. April 1985.
Godsey, J. H., M. R. Matteo, D. Shen, G. Tolman, and J. R. Gohlke: Rapid identification of Enterobacteriaceae with microbial enzyme activity profiles. J. Clin. Microbiol. 13 (1981), 483-490.
Kämpfer, P., and Dott, W.: Growth Dependent Enzymatic Pro­ files of Some Gram-negative Nonfermentative Bacteria of Clinical Significance.
Zbl. Bakt. Hyg. A 269, 460-467 (1988).

Claims (1)

  1. Verfahren zur Identifizierung und Differenzierung gramnega­ tiver Bakterien mittels L-Prolinaminopeptidase, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man
    • a) aus den Substrat-, Zeit-, pH- und Temperaturoptima der Hydrolyse von L-Prolin-4-nitroanilid durch präformierte L-Prolinaminopeptidase die Bedingungen für die korrekte Identifizierung und Differenzierung ableitet,
    • b) eine Identifizierungskonzentration IK und eine Differen­ zierungskonzentration DK (= 0.1 IK) als Lösung oder auf­ getrocknet auf geeignete Träger wie z. B. Filterpapier­ blättchen verwendet,
    • c) die Reaktionen bei 37°C in Tris-HCl-Puffer pH 7.5 bei einer Keimzahl von ca. 109 CFU/ml ablaufen läßt,
    • d) mit der Identifizierungskonzentration in 30 min Serratia marcescens-, Serratia liquefaciens- und Hafnia alvei-Stämme von den übrigen Enterobacteriaceae abtrennen kann,
    • e) mit der Differenzierungskonzentration in 30 min Hafnia alvei-Stämme von allen anderen Enterobacteriaceae differen­ zieren kann,
    • f) mit der Differenzierungskonzentration bei 60°C in 15 min L-Prolinaminopeptidase von Hafnia alvei nachweisen kann,
    • g) mit der Identifizierungskonzentration bei P. aeruginosa L-Prolinaminopeptidaseaktivität in 15 min nachweisen kann,
    • h) mit der Identifizierungskonzentration in 30 min L-Prolin­ aminopeptidase-positive N. gonorrhoeae-Stämme von negativen B. catarrhalis unterscheiden kann,
    • i) bei einer Keimzahl von 10⁹ CFU/ml in 5 min die L-Prolinamino­ peptidase von N. gonorrhoeae nachweisen kann,
    • j) L-Prolinaminopeptidase in N. meningitidis-Stämmen in 30 min nachweisen kann,
    • k) bei Beobachtung der L-Prolin-4-nitroanilid-Hydrolyse über 4 bzw. 24 Std. für E. coli, Klebsiella spp. und Enterobacter spp. Biochemotypen ermitteln kann.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999038995A1 (fr) * 1998-01-28 1999-08-05 Bio Merieux Derives d'indolamine dans la detection de peptidases de micro-organismes
WO2006030119A1 (fr) * 2004-09-10 2006-03-23 bioMérieux Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganisme a activite peptidase

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999038995A1 (fr) * 1998-01-28 1999-08-05 Bio Merieux Derives d'indolamine dans la detection de peptidases de micro-organismes
WO2006030119A1 (fr) * 2004-09-10 2006-03-23 bioMérieux Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganisme a activite peptidase
US7626018B2 (en) 2004-09-10 2009-12-01 bioMérieux Enzymatic substrates derived from phenoxazinone and their use as developer in detection of microorganisms with peptidase activity
US7932050B2 (en) 2004-09-10 2011-04-26 Biomerieux Enzymatic substrates derived from phenoxazinone and their use as developers in detection of microorganisms with peptidase activity

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