DE69834116T2

DE69834116T2 - Kulturmedium für den nachweis von bakterieller pathogene der gattung listeria, sowie verfahren zur identifizierung von dieser bakterien

Info

Publication number: DE69834116T2
Application number: DE69834116T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Facon; Frederic Simon
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1997-07-15
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-07-11
Also published as: CA2296724C; AU731884B2; FR2766204B1; EP0998580B1; DE69834116D1; JP4083980B2; JP2001510054A; EP0998580A1; AU8734598A; FR2766204A1; CA2296724A1; WO1999004032A1; AR016336A1; ZA986275B; US6228606B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium, welches das Auszählen und direkte Identifizieren pathogener Bakterien der Gattung Listeria erlaubt, und ein Verfahren, in welchem dieses Medium verwendet wird.
Die Isolierung und Identifizierung des Bakteriums Listeria monocytogenes ist ein Hauptproblem bei der Überwachung der Hygiene in der Ernährungswirtschaft und der medizinischen Bakteriologie. Dabei ist von den Bakterien der Gattung Listeria spp. allein die Spezies monocytogenes dafür bekannt, für den Menschen pathogen zu sein. Die anderen Listeria-Spezies sind nicht pathogen oder nur für Tiere pathogen. Dies trifft insbesondere auf Listeria ivanovii zu. Weiterhin ist bekannt, dass es möglich ist, die Vermehrung der Listeria monocytogenes zu inhibieren, indem Bakteriozine verwendet werden. So ist beispielsweise in der Patentanmeldung EP 0 326 062 ein Verfahren zum Inhibieren der Listeria monocytogenes beschrieben, in welchem ein von Pediococcus acidilactici stammendes Bakteriozin verwendet wird.
Der Übertragungsweg von Listeria monocytogenes hat seinen Ursprung meist in Lebensmitteln. Somit ist es notwendig, für die Detektion von Listeria monocytogenes entlang der gesamten Kette der Ernährungswirtschaft, von den Rohstoffen, welche die Produktionshallen durchlaufen, bis zu dem für den Verbrauch bestimmten Endprodukt zu sorgen.
Im Rahmen der Diagnostik von von Bakterien beim Menschen verursachten Beschwerden ist es weiterhin von Bedeutung, Listeria monocytogenes von den anderen Bakterien der Gattung Listeria spp., die nicht pathogen sind, zu unterscheiden.
Detektion und Isolierung von Listeria spp. werden herkömmlicherweise mit selektiven Kulturmedien durchgeführt. Davon werden die selektiven Medien Oxford (Curtis et al., Lett. Appl. Microbiol., 8, 85–98 (1989)) und Palcam (Van Netten et al., J. Food Microbiol., 6, 187–188 (1988)) am häufigsten verwendet. Diese Medien erlauben die Detektion aller Spezies der Gattung Listeria spp. Somit müssen die typischerweise beobachteten Kolonien zusätzlichen Identifizierungstests wie mikroskopischen und/oder biochemischen und/oder immunologischen und/oder genetischen Tests derart unterworfen werden, dass das Vorhandensein der Spezies monocytogenes nachgewiesen wird. Jedoch werden von den zusätzlichen Arbeitsgängen, die zur Identifizierung von Listeria monocytogenes erforderlich sind, Dauer und Kosten der Analysen erhöht. Sie erfordern eine Vielzahl von Reagenzien und die Tätigkeit von qualifiziertem Personal. Außerdem ist die Entnahme der Kolonien, die der Identifizierung unterworfen werden sollen, willkürlich, und sind die zusätzlichen Arbeitsgänge oftmals eine Fehlerquelle oder wenigstens der Grund für eine geringere Genauigkeit und Zuverlässigkeit. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn auf dem Isoliermedium die Kolonien von Listeria monocytogenes gegenüber den von den anderen Listeria-Spezies gebildeten Kolonien weit in der Minderzahl sind.
In der Patentanmeldung EP 0 496 680 ist ein bakteriologisches Analyseverfahren beschrieben, durch welches Listeria monocytogenes von den anderen Bakterien der Gattung Listeria spp. unterschieden wird.
Gemäß jenem Verfahren wird ein Identifizierungsmedium verwendet, das ein chromogenes oder fluorogenes Substrat umfasst, das von der Glycinaminopeptidase hydrolysiert werden kann. Das verwendete Medium kann weiterhin gegebenenfalls ein Fermentationssubstrat und/oder ein reduzierbares und/oder ein enzymatisch hydrolysierbares Substrat (wie das Substrat der α-Mannosidase) enthalten, dessen chemische Umwandlung es erlaubt, die in der zu analysierenden Probe vorhandene Listeria-Spezies zu charakterisieren.
Weiterhin ist bekannt, dass es möglich ist, die pathogenen Listeria-Spezies Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii von den anderen Listeria durch den Nachweis der spezifischen Phosphatidylinositol-Aktivität der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PIPLC) zu unterscheiden.
So ist gezeigt worden, dass die PIPLC im Kulturmedium von den pathogenen Spezies der Gattung Listeria wie Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii abgesondert wird (Leimeister-Wächter et al., Mol. Microbiol., 5(2), 361–366 (1991), J. Mengaud et al., Mol. Microbiol., 5(2), 367–372 (1991) und Goldfine et al., Infection and Immunity, 60(10), 4059–4067 (1992)). Weiterhin ist es bekannt, dass es möglich ist, diese zwei pathogenen Spezies durch indirekte Verfahren zu identifizieren (Notermans et al., App. and Env. Microbiology, Bd. 57, Nr. 9, 2666–2670 (1991)). Gemäß dem von Notermans et al. vorgeschlagenen Verfahren wird mit dem zu testenden, zuvor isolierten Listeria-Stamm in Form eines Flecks die Oberfläche einer TY-(Trypton-Hefeextrakt-)Gelose beimpft. Nach 24 bis 48 Stunden langer Inkubation bei 37 °C wird eine zweite Geloseschicht in die Petrischalen gegossen. Diese zweite Schicht enthält Agarose, Chloramphenicol und L-α-Phosphatidylinositol, das natürliche Substrat für die PIPLC. Die Petrischalen werden anschließend erneut bei 37 °C inkubiert und fünf Tage lang beobachtet. Dieses Verfahren erfordert somit mehrere Stufen wie die Isolierung des Stamms, das fleckenförmige Beimpfen der Gelose und die Verteilung einer zweiten Geloseschicht, die das Substrat der PIPLC enthält. Außerdem erlaubt dieses Verfahren nicht, die Bakterien Listeria monocytogenes, die für den Menschen pathogen sind, von den Bakterien Listeria ivanovii zu unterscheiden, die, weiter oben erwähnt, für den Menschen nicht pathogen sind.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Medium bereitzustellen, das die Identifizierung von pathogenen Bakterien der Gattung Listeria in einer einzigen Stufe erlaubt.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein spezifisches Kulturmedium, welches das Auszählen und direkte Identifizieren der pathogenen Spezies der Gattung Listeria erlaubt und ein chromogenes Synthesesubstrat, insbesondere 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol, das von der PIPLC spezifisch gespalten wird, und außerdem Blut oder eines von dessen Derivaten, vorzugsweise Serum, enthält.
Dieses chromogene Substrat wird vorzugsweise in Form eines Salzes, beispielsweise in Form des Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzes, verwendet. Zu den bevorzugten Salzen gehört 5-Brom-4-chlor-3-indolylmyoinositol-1-yl-ammoniumphosphat.
Das erfindungsgemäße Medium erlaubt die direkte Unterscheidung zwischen einerseits Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii, die gefärbte Kolonien bilden, und andererseits den anderen Listeria-Spezies, deren Kolonien nicht gefärbt sind.
Entsprechend einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform erlaubt die Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol die Detektion der Spezies Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii, die blaue Kolonien bilden, wobei die anderen Listeria-Spezies ungefärbt bleiben.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Gelosenährkulturmedium 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol in freier Form oder in Form eines Salzes mit einer Konzentration von 100 bis 500 mg/l und vorzugsweise mit einer Konzentration von 150 bis 300 mg/l.
Das erfindungsgemäß verwendete Gelosenährkulturmedium muss die Vermehrung der Listeria spp. erlauben. Dabei ist es beispielsweise möglich, die Columbia-Gelose zu verwenden, die aus Peptonen, Stärke, Natriumchlorid und Agar besteht und dem Fachmann bekannt ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder einem seiner Salze zur Herstellung eines spezifischen Kulturmediums, das die Auszählung und direkte Identifizierung der pathogenen Spezies der Gattung Listeria und insbesondere des Bakteriums Listeria monocytogenes erlaubt.
Überraschenderweise ist außerdem festgestellt worden, dass es die Zugabe von Blut oder einem seiner Derivate, beispielsweise Plasma oder Serum, zu dem Kulturmedium erlaubt, positive PIPLC-Kolonien mit einer sehr reinen Färbung zu erhalten.
Die Erfindung betrifft auch ein spezifisches Gelosenährkulturmedium, das das Auszählen und direkte Identifizieren der pathogenen Spezies der Gattung Listeria und insbesondere des Bakteriums Listeria monocytogenes erlaubt, wobei das Medium 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen und Blut oder eines von dessen Derivaten, vorzugsweise Serum, enthält.
Der Anteil des Blutes oder seiner Bestandteile an dem erfindungsgemäßen Medium kann 20 bis 80 ml, insbesondere zwischen 40 und 60 ml, und vorzugsweise 50 ml auf ein Liter Kulturmedium betragen. Dabei sind Kulturmedien bevorzugt, die 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen mit einer Konzentration von 100 bis 200 mg/ml und Serum mit einem Anteil von 40 bis 60 ml auf 1 Liter Medium enthalten.
Die Zugabe eines pulverförmigen Mittels wie Kaolin oder Siliciumdioxid zu dem Kulturmedium trägt zur Intensivierung der Färbung der Kultur mit den positiven PIPLC-Kolonien bei, wodurch sich der Test leichter interpretieren lässt.
Das pulverförmige Mittel wird dem mit Serum vervollständigten Kulturmedium zugegeben.
Erfindungsgemäße Gelosenährkulturmedien, die 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen als chromogenes Synthesesubstrat, das spezifisch von PIPLC gespalten wird, Serum und ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid enthalten, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Die Konzentration des pulverförmigen Mittels im Gelosenährkulturmedium ist vom Charakter des verwendeten Mittels abhängig und kann zwischen 5 und 30 g/l und vorzugsweise zwischen 15 und 25 g/l variieren.
Erfindungsgemäß kann das Kulturmedium auch ein Glucid (Kohlenhydrat), beispielsweise Xylose, enthalten, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt werden kann. Die Zugabe eines solchen Glucids zu einem Kulturmedium, das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen enthält, erlaubt dann die Unterscheidung von einerseits Listeria monocytogenes, die satte blaue Kolonien bildet, von andererseits Listeria ivanovii, die hellblaue bis grüne Kolonien bildet, und schließlich von den anderen Listeria-Spezies, deren Kolonien farblos sind. Kohlenhydrate, die sich von Listeria monocytogenes verstoffwechseln lassen, sind beschrieben in "Manual of Clinical Microbiology" (6. Auflage – 1995) ASM Press Washington D.C., 343–344.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein spezifisches Gelosenährkulturmedium, das das Auszählen und direkte Identifizieren von Listeria monocytogenes erlaubt und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen als chromogenes Synthesesubstrat, das spezifisch von PIPLC gespaltet wird, Blut-Derivate, vorzugsweise Serum, ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid und ein Glucid, vorzugsweise Xylose, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt oder fermentiert werden kann, enthält.
Die Konzentration des Glucids, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt werden kann, im Kulturmedium kann zwischen 5 und 15 g/l variieren und ist selbstverständlich von dem verwendeten Glucid abhängig.
Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann auch einen pH-Wert-Indikator enthalten. Als pH-Wert-Indikatoren sind diejenigen zu nennen, die üblicherweise in der Mikrobiologie verwendet werden, beispielsweise Alizarinsulfonsäure, Methylrot, Chlorphenolrot, Orcein, Bromkresolpurpur, Bromphenolrot, Bromxylenolblau, Alizarin, Bromthymolblau und Phenolrot. Selbstverständlich muss der pH-Wert-Indikator mit einer geeigneten Konzentration in dem Kulturmedium verwendet werden. Sie ist vom Charakter des Indikators abhängig und kann zwischen 50 und 300 mg/l variieren. von den verschiedenen pH-Wert-Indikatoren ist die Verwendung von Phenolrot bevorzugt. Von diesem Indikator wird die Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii noch weiter verbessert, da die Färbung der Kolonien, wenn das Medium 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen enthält, satt blau ohne Farbumschlag des Indikators bei Listeria monocytogenes bzw. hellblau und von einem gelben Kreis umgeben bei Listeria ivanovii ist, wobei dieses Phänomen mit dem Farbumschlag des Indikators verknüpft ist.
Erfindungsgemäß ist ein bevorzugtes Kulturmedium ein Gelosenährkulturmedium, das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen, Blut-Derivate, vorzugsweise Serum, ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid, ein Glucid, vorzugsweise Xylose, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt werden kann, und einen pH-Wert-Indikator wie Phenolrot enthält.
Andererseits ist die PIPLC-Aktivität nicht ausschließlich bei Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii vorhanden. Diese Enzymaktivität findet sich insbesondere bei bestimmten Spezies von Bacillus (Griffith et al., Methods Enzymol., 197, 493–502 (1991)) und Clostridium (Taguchi et al., Arch. Biochem. Biophys., 186, 196–201 (1978)). Außerdem kann die Entwicklung einer beträchtlichen Saprophytenflora (Bakterien oder Hefen) auf dem Kulturmedium den Nachweis der Listeria monocytogenes durch ein kompetitives Phänomen beeinträchtigen. So ist es wünschenswert, die Vermehrung von interferierenden Keimen zu hemmen, um die Gefahr von falsch positiv (blaue Kolonien, die von anderen Bakterien als Listeria monocytogenes gebildet worden sind) oder falsch negativ (Maskierung der blauen Färbung der Listeria-monocytogenes-Kolonien durch eine beträchtliche Vermehrung anderer Kontaminanten) auszuschalten. Um diese Phänomene zu verhindern, wird empfohlen, das Kulturmedium mit Bakteriziden und/oder Fungiziden zu ergänzen, gegenüber denen die Listeria spp. wenig oder nicht empfindlich sind. Diese Mittel können einzeln oder in Kombination verwendet werden. von diesen Mitteln ist beispielsweise Lithiumchlorid, Acriflavinhydrochlorid, Nalidixinsäure, Polymyxin B, Cefotan, Colistinsulfat, Fosfomycin, Ceftazimidin, Moxalactam, Cycloheximid und Amphotericin B zu nennen.
Gelosenährkulturmedien, die 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines von dessen Salzen, Blut-Derivate, vorzugsweise Serum, ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid, ein Glucid, vorzugsweise Xylose, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt werden kann, einen pH-Wert-Indikator wie insbesondere Phenolrot und Bakterizide oder Fungizide enthalten, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Identifizieren pathogener Bakterien der Gattung Listeria, welches das

– Beimpfen eines Gelosekulturmediums, das ein für die PIPLC spezifisches chromogenes Substrat umfasst, mit einer Probe, die diese pathogenen Bakterien der Gattung Listeria enthalten kann,
– Inkubieren des mit der Probe beimpften Kulturmediums und
– Bestimmen des Vorhandenseins der pathogenen Bakterien der Gattung Listeria durch die charakteristische Färbung des Substrats umfasst; die Probe, die pathogene Bakterien der Gattung Listeria enthalten kann, wird in einer rohen Form beimpft oder ist zuvor verdünnt oder angereichert worden, bevor mit ihr ein wie weiter oben definiertes Kulturmedium beimpft wird.

Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine zu testende rohe Probe, die verdünnt oder einer bzw. mehreren Anreicherungsphasen unterworfen worden ist, auf einem Gelosenährkulturmedium, das ein chromogenes Synthesesubstrat, das spezifisch von der PIPLC gespalten wird und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines dessen von dessen Salzen ist, Blut-Derivate wie Serum, ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid, ein Glucid, vorzugsweise Xylose, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselt werden kann, und gegebenenfalls einen pH-Wert-Indikator wie insbesondere Phenolrot und Bakterizide oder Fungizide enthält, kultiviert. Das Vorhandensein von Listeria monocytogenes wird durch die für ihre Kolonien charakteristische Färbung bestimmt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Unterscheidung zwischen pathogenen Listeria, anderen Listeria spp. und interferierenden Spezies
Herstellung der Kulturmedien

Medium 1: Grundmedium

• Columbia-Gelose 39 g/l

• Lithiumchlorid 10 g/l

• Ceftazidim 20 mg/l

• Moxalactam 20 mg/l

• Polymyxin B 20 mg/l

• Amphotericin B 3 mg/l

Medium 2: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol
Die Zusammensetzung in Gramm pro Liter dieses Mediums ist gleich derjenigen des Mediums 1, wobei aber Medium 2 außerdem 300 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol in Form des Ammoniumsalzes (B-7404 5-Brom-4-chlor-3-indoxylmyoinositol-1-yl-ammoniumphosphat Biosynth Suisse) enthält.
Die Herstellung der Medien geschah wie folgt:

– Auflösung der nicht thermolabilen Komponenten in osmotisiertem Wasser.
– Erwärmung der Gemische bis zum Sieden.
– Einstellung, falls erforderlich, des pH-Werts auf 7,3 = /–0,2.
– Verteilung auf Kolben mit einer Menge von 95 ml/Kolben.
– 15 Minuten langes Autoklavieren der Kolben bei 120 °C.
– Zugabe der thermolabilen Komponenten zu der sterilen Lösung nach Abkühlung der Gelose auf etwa 47 °C.
– Verteilung der autoklavierten Medien auf sterile Petrischalen (Durchmesser 90 mm) mit einem Anteil von 15 bis 20 ml/Petrischale.

Getestete Stämme
Die getesteten Stämme waren Folgende:
Listeria spp.:

Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Listeria innocua
Listeria seeligeri
Listeria welshimeri

Interferenzielle Spezies:

Bacillus cereus
sStaphylococcus aureus
Candida tropicalis

Kultivieren – Inkubieren – Auswerten
Die Stämme wurden in Trypto-Casein-Soja-Brühen gegeben und anschließend bei 37 °C inkubiert.
Nach 18 Stunden langer Inkubation wurden die Brühen in dem Verdünnungsmittel "Tryptone Sel", das aus dem Pepton Trypton mit 1/100 und Natriumchlorid mit 8,5/1000 besteht, derart verdünnt, dass Suspensionen von 10⁶ bis 10⁷ Zellen/ml erhalten wurden.
Für jede Suspension wurde durch Isolation mit einer sterilen 1-μ1-Öse mit eine Petrischale mit dem Medium 1 und eine Petrischale mit dem Medium 2 beimpft. Die Petrischalen wurden bei 37 °C inkubiert. Nach 24 Stunden und nach 48 Stunden Inkubation wurden die Petrischalen ausgewertet. Die Auswertung bestand aus der Beobachtung der Färbung der Kolonien, die von dem jeweiligen Stamm auf dem jeweiligen Medium gebildet worden waren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Tabelle I
Medium 2 erlaubt die Unterscheidung der pathogenen von den nichtpathogenen Listeria-Spezies. Weiterhin erlaubt die selektive Ergänzung, die Bakterien Bacillus cereus und Staphylococcus aureus, die auf dem Kulturmedium potenziell falsch positiv sind, zu inhibieren.
Beispiel 2: Unterscheidung zwischen pathogenen Listeria-Spezies und anderen Listeria-Spezies
Herstellung der Kulturmedien
Medium 2: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol
Medium 2 war wie in Beispiel 1 beschrieben.
Medium 3: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol
Die Zusammensetzung des Mediums 3 war gleich der weiter oben angegebenen des Mediums 2, wobei aber dieses Medium 150 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol in Form des Ammoniumsalzes anstelle von 300 mg/l (Medium 2) enthielt.
Medium 4: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Blut
Die Zusammensetzung des Mediums 4 war gleich derjenigen des Mediums 3, wobei aber dieses Medium außerdem 50 ml/l Pferdeblut enthielt. Zur Herstellung des Mediums wurde das Blut wie eine thermolabile Komponente behandelt.
Medium 5: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Serum
Die Zusammensetzung des Mediums 5 war gleich derjenigen des Mediums 4, wobei aber dieses Medium anstelle von Blut 50 ml/l Pferdeserum enthielt.
Medium 6: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Serum + Siliciumdioxid
Die Zusammensetzung des Mediums 6 war gleich derjenigen des Mediums 5, wobei aber dieses Medium außerdem 20 g/l Siliciumdioxid, eine nicht thermolabile Komponente, enthielt.
Die Herstellung der Medien erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Getestete Stämme:
Die getesteten Stämme waren Folgende:
Listeria spp.:

Kultivieren – Inkubieren – Auswerten
Beim Kultivieren, Inkubieren und Auswerten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt. Tabelle II
Die Ergebnisse von Tabelle II zeigen, dass, um eine sichere und genaue Auswertung des Tests, d.h. eine gute Unterscheidung zwischen den pathogenen Listeria-Spezies und den nichtpathogenen Listeria-Spezies, zu erhalten, es wünschenswert ist, das Kulturmedium mit Blut, Serum oder einem Serum-Siliciumdioxid-Gemisch zu ergänzen. Die Zugabe von Blut, Serum oder einem Serum-Siliciumdioxid-Gemisch zu dem Medium trägt dazu bei, die Blaufärbung der positiven PIPLC-Kolonien stark zu intensivieren und erlaubt so, die 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol-Konzentration im Kulturmedium sehr deutlich zu senken.
Beispiel 3: Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes und anderen Listeria-Spezies, darunter Listeria ivanovii
Herstellung der Kulturmedien
Medium 6: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Serum + Siliciumdioxid
Medium 6 war wie in Beispiel 2 beschrieben.
Medium 7: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Serum + Siliciumdioxid + Xylose
Die Zusammensetzung des Mediums 7 war gleich der in diesem Beispiel beschriebenen des Mediums 6, wobei aber dieses Medium zusätzlich 10 g/l Xylose, eine Komponente, die für die Herstellung des Mediums als thermolabile Komponente angesehen wird, enthielt.
Medium 8: Grundmedium + 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol + Serum + Siliciumdioxid + Xylose + Phenolrot
Die Zusammensetzung des Mediums 8 war gleich der weiter oben angegebenen des Mediums 7, wobei aber dieses Medium zusätzlich 80 mg/l Phenolrot (nicht thermolabile Komponente) enthielt.
Die Herstellung der Medien erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Gestestete Stämme
Die getesteten Stämme waren Folgende:
Listeria spp.:

Listeria monocytogenes
sListeria ivanovii
sListeria innocua
Listeria seeligeri

Kultivieren – Inkubieren – Auswerten
Beim Kultivieren, Inkubieren und Auswerten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. Tabelle III

(-): kein Umschlag des Farbindikators, die Gelose blieb um die Kolonien (Stamm Xylose -) herum rot
(+): Umschlag des Farbindikators, gelber Kreis um die Kolonien (Stamm Xylose +) herum

Die Ergebnisse von Tabelle III zeigen, dass die Zugabe von Xylose, vorzugsweise zusammen mit Phenolrot, zu dem Kulturmedium die Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes und allen anderen Listeria-Spezies, insbesondere Listeria ivanovii, erlaubt.
Beispiel 4: Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Es wurden 214 Stämme der Gattung Listeria, geliefert von dem Listeria-Referenzzentrum (Institut Pasteur Paris) auf dem Medium 8 getestet.
Es wurden die folgenden Spezies entsprechenden Stämme verwendet:

12 Stämme von Listeria innocua
10 Stämme von Listeria seeligeri
10 Stämme von Listeria welshimeri
10 Stämme von Listeria ivanovii
1 Stamm von Listeria grayi
171 Stämme von Listeria monocytogenes

Beim Kultivieren, Inkubieren und Auswerten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren.
Es wurden alle Stämme von Listeria monocytogenes sowie alle Stämme von Listeria ivanovii identifiziert, wobei kein falsch positives Ergebnis gefunden wurde.
Durch diesen Versuch wurde die Spezifität und Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen.

Claims

Nährkulturmedium, das die spezifische Vermehrung von Bakterien der Gattung Listeria und die direkte Identifizierung pathogener Bakterien dieser Gattung erlaubt, ein chromogenes Synthesesubstrat, das von der für Phosphatidylinositol (PIPLC) spezifischen Phospholipase C spezifisch gespalten wird, und außerdem Blut oder eines von dessen Derivaten, vorzugsweise Serum, enthält.
Kulturmedium nach Anspruch 1, in welchem der Anteil an Blut oder dessen Derivaten 20 bis 80 ml, insbesondere zwischen 40 und 60 ml, und vorzugsweise 50 ml auf 1 Liter Kulturmedium beträgt.
Kulturmedium nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem ein pulverförmiges Mittel wie Kaolin oder Siliciumdioxid enthält.
Kulturmedium nach Anspruch 3, in welchem die Konzentration des pulverförmigen Mittels 5 bis 30 g/l und vorzugsweise zwischen 15 und 25 g/l beträgt.
Kulturmedium nach einem Ansprüche 1 bis 4, in welchem das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder eines seiner Salze ist.
Kulturmedium nach Anspruch 5, in welchem die Konzentration von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatidylmyoinositol oder einem seiner Salze 100 bis 500 mg/l und vorzugsweise 150 bis 300 mg/l beträgt.
Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das außerdem ein Glucid enthält, das sich von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechseln lässt.
Kulturmedium nach Anspruch 7, in welchem das Glucid, das von Listeria ivanovii, aber nicht von Listeria monocytogenes verstoffwechselbar ist, Xylose ist.
Kulturmedium nach Anspruch 7 oder 8, in welchem die Glucidkonzentration 5 bis 15 g/l beträgt.
Kulturmedium nach einem der Ansprüche 7 bis 9, das darüber hinaus einen pH-Wert-Indikator, vorzugsweise Phenolrot, enthält.
Kulturmedium nach Anspruch 10, in welchem die Konzentration des pH-Wert-Indikators 50 bis 300 mg/l beträgt.
Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das ein oder mehrere Bakterizide und/oder Fungizide enthält, das/die vorzugsweise aus Lithiumchlorid, Acriflavinhydrochlorid, Nalidixinsäure, Polymixin B, Cefotan, Colistinsulfat, Fosfomycin, Ceftazimidin, Moxalactam, Cycloheximid und Amphotericin B ausgewählt ist/sind.
Verfahren zum Identifizieren pathogener Bakterien der Gattung Listeria, welches das – Beimpfen mit einer Probe, die diese pathogenen Bakterien der Gattung Listeria enthalten kann, auf einem Gelosekulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 12, – Inkubieren des mit der Probe beimpften Kulturmediums und – Bestimmen des Vorhandenseins der pathogenen Bakterien der Gattung Listeria durch die charakteristische Färbung des Substrats umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die Probe, die pathogene Bakterien enthalten kann, aufkonzentriert wird, bevor mit ihr ein Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 12 beimpft wird.