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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der mikrobiologischen
Diagnose, und genauer die Identifizierung oder Differenzierung von
Gram-negativen Bakterien.
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Stand der Technik
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Die
Diagnose von Gram-negativen Bakterien hat eine große Bedeutung
für die
Gesundheit von Mensch und Tier und für den Erhalt der Umwelt, da
viele von ihnen, wie beispielsweise E. coli, Salmonella, Klebsiella,
Pseudomonas schwere Krankheiten bei Menschen verursachen.
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Seit
mehr als 100 Jahren werden unterschiedliche Kullturmedien für die Identifizierung
und das Zählen von
diesen Bakterien entwickelt.
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Mit
Beginn der Dekade ab 1990 wurden neue Kulturmedien unter der Verwendung
von chromogenen und/oder fluorogenen Substraten entwickelt, um einige
dieser Pathogene auf eine bessere Weise zu identifizieren.
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Ferguson
schützte
in 1994 (Patent Nr.
US 5,358,854 von
1994) eine Erfindung, die in einem Kulturmedien bestand und chromogenen
Reagenzien für
die Identifizierung und Differenzierung von E. coli und coliformen
Keimen. Der Kern der Erfindung bestand in der Verwendung eines Substrats
für das
Enzym beta-Galactosidase, das einen unlöslichen Niederschlag einer
ersten Farbe erzeugte, und einem Substrat für beta-Glucuronidase, das das Auftreten einer
zweiten Farbe verursachte. Das Medium erlaubt nur die Differenzierung von
koliformen Keimen im Allgemeinen, ermöglicht jedoch keine Differenzierung
zwischen ihnen.
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Alain
Rambach patentierte in 1993 (Patent Nr.
US 5,194,374 ) ein Medium für die Isolierung
von Salmonella auf Basis der Fähigkeit
dieses Mikroorganismus, Polyole zu metabolisieren. Das Medium erlaubt
nicht die Identifizierung einer breiten Vielfalt an Gattungen und
Spezies coliformer Keime von großem diagnostischem Interesse.
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In
jenem Jahr veröffentlichte
F. Denis und Mitarbeiter (Évaluation
d'un nouveau milieu
avec substrats chromogénes
pour la recherche de salmonelles dans des coprocultures: un milieu
SMID., Revue française
des laboratoires, décembre
1994, Nr. 271, S. 19–22)
die Auswertung eines chromogenen Mediums für die Isolierung und die Präidentifizierung
von Salmonella. Das Medium besteht aus 2 chromogenen Substraten,
von denen eines die Kolonien mit einer blauen Farbe auf Basis der β-Galactosidase-Aktivität färbt, und
einem weiteren, das die Kolonien von Salmonella mit einer roten
Farbe färbt,
auf Basis des Abbaus des Glucuronats, die sich mit einem Farbindikator
kombiniert.
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Mit
Hilfe dieses Mediums können
Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B und Salmonella typhimurium,
Proteus, Citrobacter, E. coli und Enterobacter differenziert werden.
Das Medium enthält
potente Inhibitoren für
die Mikroorganismen, wie beispielsweise Kristallviolett und die
Gallensalze, und es erfordent die Verwendung eines TRIS-Puffers,
was das Medium komplexer und inhibierend macht, selbst für einige
interessierende Organismen. Auf der anderen Seite wird Polyton verwendet.
Es ist eine komplexe Mischung aus Proteinhydrolysaten. Schließlich erlaubt
das Medium nicht die Identifizierung von sehr interessierenden Organismen,
wie u. a. beispielsweise Pseudomonas, E. coli O157:H7.
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Rambach
patentierte in 1997 ein Kulturmedium und das Verfahren zum Nachweis
der Stämme
von enterohämorrhagischen
E. coli (Patentanmeldung Nr. WO 97/391031). Die Erfindung besteht
aus einem selektiven Medium für
die Differenzierung von E. coli, insbesondere der Serotypen O157
und/oder O11, die ein chromogenes Substrat für das Enzym β-Galactosidase
verwenden. Um die Differenzierungsfähigkeit des Verfahrens zu erhöhen, wurden
verschiedene chromogene Substrate für β-Glucosidase, das von einer
großen
Anzahl an coliformen Bakterien hydrolysiert wird, und für β-Glucuronidase
verwendet, das von O157 und O11 verschiedenen E. coli Serogruppen
hydrolysiert wird. Dieses Kulturmedium erleichtert nicht die Differenzierung von
anderen Gram-negativen
Bakterien und Wallace und Jones berichteten, dass einige Stämme von
E. coli und Citrobacter falsch-positive Ergebnisse ergeben könnten (Wallace
und Jones, J. Appl. Bacteriol., 1996, 81: 663–668).
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Jahre
später,
in 1998, patentierte Rambach ein neues Kulturmedium für den Nachweis
von E. coli (Patent Nr.
US 5,846,761 ),
auf Basis der Verwendung eines chromogenen Substrats, das abgeleitet
ist von der Indolylglucuronsäure
und ihren Salzen. Dieses spezifische Medium erlaubt weder die Identifizierung
von Stämmen
von E. coli O57:H7 noch von anderen coliformen Keimen.
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1995
patentierten Monget und Mitarbeiter (Patent Nr.
US 4,277,561 ) ein Verfahren für die bakteriologische
Analyse und ein Medium für
den Nachweis von Salmonella. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit
von Salmonella, die Glucuronsäure
oder ihre Salze zu fermentieren und das Enzym β-Galactosidase nicht zu produzieren.
Das Medium enthält
auch Nährstoffe,
eine fluorogene oder chromogene Verbindung für das Enzym β-Galactosidase,
Glucuronsäure
oder eines ihrer Salze und einen pH-Indikator.
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Dieses
Medium enthält
auch Inhibitoren für
die von Salmonella verschiedenen Gattungen und Spezies, wie beispielsweise
Brilliantgrün
und Natriumdesoxycholat, die andere Gram-negative Organismen inhibieren
können.
Das Kulturmedium erfordert die Zugabe von Natriumglucuronat als
einem Zusatz nach Sterilisierung. Nach Denis und Mitarbeitern ist
die Spezifität
dieses Mediums kleiner als 94% (93,3%), (Denis, et al, Revue française des
laboratoires, décembre
1994, Nr. 271).
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Tuompo
und Mitarbeiter patentierten andererseits ein Verfahren und ein
Medium zum Kultivieren und Identifizieren von Salmonella auf Basis
der Verwendung von Melibiose, Mannitol und Sorbitol und von Substraten
für beta-Glucuronidase
(Patent Nr.
US 5,786,167 ).
Seine braune, blaue oder grüne
Farbe identifizierte den Rest der coliformen Keime in Abhängigkeit
von dem verwendeten chromogenen Substrat. Mit diesem Verfahren waren
die Autoren nicht in der Lage, in geeigneter Weise jeweils die relevanteren
coliformen Keimorganismen zu differenzieren.
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Miller
und Mitarbeiter patentierten 1999 (Patent Nr.
US 5,871,944 von 1999) ein Medium,
um Salmonella unter Verwendung von Lactose und Cellobiose zu differenzieren,
um das Auftreten von schwarzen Niederschlägen in dem Medium zu unterdrücken, und
es ermöglicht
somit den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Salmonella.
Das Medium erfordert die Verwendung eines TRIS-Puffers, von Peptonen
und Fleischextrakt, X-Gal und weiterer Bestandteile.
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Dieses
Medium ist nur geeignet für
einige Gram-negative Bakterien, wie beispielsweise Salmonella und
Shigella, diese können
nur als solche differenziert werden, es kann aber nicht zwischen
ihnen differenziert werden.
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Butchner
patentierte 1996 ein Medium und ein Verfahren für die Isolierung und die präsumptive
Identifizierung von einigen Bakterien, insbesondere jene, die urinäre Sepsis
oder urinäre
Infektionen verursachen. (Patent Nr.
US
5,541,082 ). Das Verfahren basiert in seinem Prinzip auf
der Unterscheidung zwischen ihnen durch die Morphologie der Kolonien
und der Farbe.
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Das
Medium enthält
ein proteinhaltiges bzw. proteinähnliches
opakes Material, zwei oder mehr chromogene Substrate, Arylsulphatasen,
Galactosidasen, Glucuronidasen, Tryptophanoxidasen und Triaminooxidasen,
es ist auch nicht spezifisch für
die Gram-negativen Bakterien, die indikativ sind für die Qualität der Lebensmittel
und Wässer.
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Andererseits
können
bei seiner Verwendung Organismen mit großer klinischer und sanitärer Bedeutung
nicht richtig bzw. genau identifiziert werden, beispielsweise E.
coli O157:H7, Serratia, Citrobacter, Aeromonas, und weitere. Es
sind auch zusätzliche "Tüpfelanalysen" erforderlich, um
einige der Mikroorganismen zu bestätigen, und immer als eine präsumptive
Diagnose.
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Quesada
Muñiz
und Rodriguez Martinez erhielten Schutz (Erfinderzertifikat Nr.
20000083) für
eine Formulierung, die eine Mischung aus Proteinhydrolysaten, Proteinen,
Alkoholen und weiteren Elementen enthält, die neben der Identifierzung
von interessierenden Organismen, wie beispielsweise E. coli und
Salmonella, die Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa in weniger
als 24 Stunden ermöglicht.
Jedoch war das Medium nicht in der Lage, die Identifizierung anderer
interessierender Gram-negativer Organismen zu erleichtern, die als
farblose Kolonien wuchsen.
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Roth
und Mitarbeiter schützten
1993 ein Verfahren und ein chromogenes Medium für die Identifizierung und Differenzierung
von totalcoliformen Keimen und E. coli. (Patent Nr.
US 5,393,662 ). Das Medium ist aus
Substraten mit verschiedenen chromophoren Gruppen zusammengesetzt.
Dieses Medium erleichterte nicht die Identifizierung und das Zählen von
E. coli O157:H7, Salmonella und weiterer nicht-coliformer Enterobakterien. Shigella
sonnei verursacht positiv-falsche Ergebnisse, da die Kolonien mit
der gleichen Farbcharakteristik wachsen wie E. coli.
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1997
bewerteten KAI A. Hengstler und Mitarbeiter (KAI A. Hengstler, Rainer
Hammann und Anne Marie Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation
Medium for Detection und Presumptive Identification of Urinary Tract
Pathogens. Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1997, S. 2773–2777) das
CHRO-Magar Orientierungsmedium für
den Nachweis und die präsumptive
Identifizierung von Pathogenen in Urinproben. Das Medium erlaubte
den Nachweis von verschiedenen interessierenden Spezies von Mikroorganismen
durch die Färbung
bzw. Farbgebung der Kolonien, unter anderem: rosa bis rot (E. coli),
blau-violett (Klebsiella spp.), blau-rot (Enterobacter spp.), rosa
(Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), blau
(Serratia spp.), blau-violett (Citrobacter freundii und koseri),
farblos bis beige mit braunem Medium (Morganella morganii, Proteus
mirabilis und vulgaris), blau mit braunem Medium (Proteus vulgaris),
farblos in braunem Medium (Enterococcus spp.), brilliant blau (Streptococcus
agalactiae), grün-blau
(Enterococcus spp.) und hellrosa (Staphylococcus saprophyticus).
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Wie
man aus dem Stand der Technik erkennen kann, kann nicht jeder Mikroorganismus
korrket identifiziert werden, da er nicht einem einzelnen Farbmuster
entspricht bzw. auf ein einzelnes Farbmuster anspricht, für das man
bestätigen
kann, dass die Identifizierung nicht nur ausgeführt werden kann durch die Attribute
der Kolonie oder des Mediums, und sie erfordern weitere Tests, wie
beispielsweise im Fall von Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter
freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp. Gemäß einem
weiteren Aspekt erleichtert das Medium nicht eine korrekte Identifizierung,
da unterschiedliche Spezies die gleiche Färbung präsentieren, wie beispielsweise
im Fall von Enterobacter spp., Citrobacter freundii und Proteus
Mirasbilis, die alle mit einer pinken Farbe auftreten.
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Im
März 1998
patentierten Roth und Mitarbeiter eine Erfindung (Patent Nr.
US 5,726,031 ), in der von einem
Medium und einem quantitativen Verfahren für die Identifizierung und Differenzierung
von biologischem Material in eine Testprobe berichtet wurde. Dieses
Medium schließt
ein chromogenes Substrat ein, das spezifisch ist für eines
der biologischen Materialien, das jenes Material färbt, und
ein zweites chromogenes Substrat, das spezifisch für eine zweite
Art von biologischem Material ist und das das Erhalten von einer,
von der ersten verschiedenen, zweiten Färbung für Kolonien der anderen Spezies
erleichtert, und ein drittes zu testendes biologisches Material,
das eines der zwei Substrate aufspaltet. Das erste und zweite biologische
Material baut einen Zucker ab, und das dritte biologische Material
baut jenen Zucker nicht ab.
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In
dem Medium ist ein pH-Indikatior enthalten und er ermöglicht die
Veränderung
der Farbe des Mediums als ein Ergebnis der Hydrolyse des Zuckers
um die Kolonie herum und die Kolonie nimmt die charakteristischen
Farben der chromogenen Substratspaltung an. Die Hauptbestandteile
sind: 6-Chlor-3-Indolylgalactosid, 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylglucuronid,
Sorbitol und Phenolrot. Auch sind die Gallensalze, Natriumlaurylsulfat,
Natriumdesoxycholat, Polyglycolether und von Acriflavin abgeleitete
Antibiotika enthalten.
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Die
Zusammensetzung enthält
auch einen Induktor für
die enzymatischen Reaktionen (Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranosid),
Agare, Pectine, Carragenine, Alginate, Xantin und Peptone. Diese
Erfindung kann als das nächstkommende
Analogon zu der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
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Die
Nachteile der erwähnten
Erfindung können
wie folgt zusammengefasst werden:
- • Salmonella
typhi kann nicht von Salmonella non-typhi differenziert werden,
und seine bestätigende
Identifizierung ist schwierig und für einige Stämme unmöglich, da es in dem Medium
als weiße
Kolonien auftreten kann, wie es beispielsweise bei anderen Gram-negativen
Bakterien vorkommt, wie beispielsweise Proteus.
- • In
den Fällen,
bei denen mehrere Spezies in einer Petrischale wachsen, ist es sehr
schwierig, die gelben Zonen zu identifizieren, die charakteristisch
sind für
die meisten Salmonella, da dies aufgrund des Ansäurens des Mediums stattfindet
und die Ausbildung der gelben Zonen durch das Überlappen der Reaktionen in
dem Medium stattfinden kann.
- • Die
Identifizierung und Zählung
anderer Gram-negativer nicht- coliformer
Keime, wie beispielsweise Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, etc.,
ist nicht möglich,
da sie die Verwendung von anderen Tests für ihre Identifizierung benötigen.
- • Wie
bei den konventionellen Medien werden im Minimum von 24 bis 48 Stunden
zum Identifizieren der interessierenden Organismen benötigt.
- • Die
Komponenten, die das Wachstum der interessierenden Organismen in
dem Medium fördern
sollen, sind nicht ausreichend, um eine frühe Entwicklung der Identifizierungsreaktionen
zu ermöglichen
(vor 24 Stunden), und es ist die Verwendung eines Induktors für das Enzym β-Galactosidase
(IPTG) erforderlich.
- • Das
Natriumdodecylsulfat, das Acryflavin und die Antibiotika in dem
Medium machen seine Herstellung komplexer und teurer. Seine Stabilität ist beschränkt durch
die Anwesenheit von Antibiotika, die als Zusätze zugegeben werden.
- • Das
Verfahren wird ausgeführt
durch Inkubieren der Probe bei 40°C
und nicht bei einer Temperatur, die für die meisten der Organismen
und Institutionen empfohlen wird, die die mikrobiologischen Verfahren
regeln (44°C)
und es kann Probleme verursachen, da die Arbeitsschritte nicht standardisiert
sind, und es kann Irritationen bei dem Laborpersonal verursachen.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in dem zur Verfügungsstellen
eines neuen Kulturmediums für
die Identifizierung und/oder Differenzierung von Gram-negativen
Mikroorganismen, die von Interesse sind in der klinischen und tierärztlichen
mikrobiologischen Diagnose, der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln und
der Überwachung
der Verunreiniung der Umwelt, und einem Verfahren zu seiner Verwendung.
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Die
Neuheit der Erfindung besteht darin, dem Labor ein Kulturmedium
zur Verfügung
zu stellen, das in der Lage ist, zwischen einer beachtlichen Menge
an für
die Diagnose interessanter Gram-negativer
Organismen in einem einzelnen Behälter zu differnzieren (Nachweis),
auf der Grundlage der Unterschiede von wenigstens 10 Farben der
Kolonien unterschiedlicher Größen und
von wenigstens 5 Typen unterschiedlicher Halos, durch ihre Farben
und Größen.
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Das
Medium erlaubt, zum ersten Mal, gleichzeitig E. coli, E. coli O157:H7,
Salmonella typhi und non-typhi auszuwerten, und selbst zwischen
ihnen; Klebsiella, Shigella und zwischen ihnen; Serratia, Enterobacter, Proteus,
Pseudomonas, Citrobacter und Aeromonas.
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Einige
Mikroorganismen treten auf diesem Medium mit charakteristischen
Farben auf, wie beispielsweise Salmonella typhi und S. schotmuelleri,
die eine orange Farbe zeigen, Aeromonas hydrophila mit hellgrüner Farbe,
Pseudomonas aeruginosa mit orange-rosa Farbe, Shigella sonnei mit
rötlich
violetter Farbe, Shigella flexneri durchscheinend und mit oranger
bis gelber Farbe, Serratia odorifera mit violett grünlicher
Farbe und Proteus und Providence als farblose Kolonien.
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Unerwartete
Ergebnisse waren die charakteristischen Halos von bestimmten Mikroorganismen,
wie im Fall von Pseudomonas aeruginosa mit einem breiten transparenten
Halo, Shigella sonnei mit einem gelben Halo, Klebsiella pneumoniae
mit einem rosa beigen Halo, Serratia mit einem kleinen transparenten
Halo, Aeromonas hydrophila mit einem transparenten Halo und Salmonella
typhimurium mit einem orangen Halo.
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Einige
unerwartete Antworten der nachzuweisenden Mikroorganismen wurden
erhalten, wenn das Phenolrot als Indikator verwendet wurde, insbesondere
die Kolonien von Shigella sonnei mit blauer Farbe, unregelmäßigen Rändern und
Medium mit Erdbeer-rosa Farbe, Pseudomonas aeruginosa-Kolonien mit
grünlich beiger
Farbe und Medium mit rosa Farbe und Salmonella typhimurium-Kolonien
mit beiger Farbe oder farblos und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe.
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Auf
der anderen Seite werden neue Kombinationen von Elementen angeboten,
die es erlauben, gut differenzierte Halos zu erhalten, die für die erwähnten Organismen
vorher nicht beschrieben worden sind, in Form der Mengen an Kieselgur,
Magermilch, Stärken
und Aktivkohle, die zu dem Medium in den vorgeschlagenen Verhältnissen
zugegeben werden.
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Die
Substanzen, die, zusammen mit den im vorherigen Paragraphen beschriebenen
Bestandteilen und miteinander gemischt, die Erscheinung von verschiedenen
Farben in den Kolonien und den Halos garantieren, sind ausgewählt aus
Propylenglycol (von 5 bis 15 mL/L), Neutralrot (bis zu 0,05 g/L),
Phenolrot (bis zu 0,05 g/L), Magentaglucuronid (von 0,05 bis 0,25
g/L), X-Gal (von 0,03 bis 0,1 g/L) und MUG (bis zu 0,07 g/L), sind
Teil der Besonderheit, da diese Kombinationen und Verhältnisse
das Auftreten von Farben in den Kolonien und Halos garantieren,
die vorher nicht beschrieben wurden.
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Die
Mengen der drei Nährstoffbasen
in dem Medium in Bezug auf den Gehalt an Inhibitoren für das Wachstumg
der Gram-negativen Organismen ermöglicht eine neue Kombination,
die in der Lage ist, das Wachstum von konkurrierenden Organismen
zu fördern.
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Die
Vorteile des vorgeschlagenen Mediums und Verfahrens, die in der
vorliegenden Erfindung beschrieben sind, sind im Detail wie folgt:
- • Das
Medium erlaubt nicht nur die Differenzierung der coliformen Keime
im Allgemeinen, sondern spezifisch zwischen ihnen, und jenen mit
größerer diagnostischer
Bedeutung im Bereich der Klinik und der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln.
- • Mit
diesem Medium können
eine vorher nicht beschriebene Vielfalt an unterschiedlichen Gattungen
und Spezies gleichzeitig in einer einzelnen Petrischale identifiziert
werden, mit der Folge, dass Laborresourcen gespart werden, die Zeit
für das
Ansetzen der Materialien reduziert und Personal eingespart wird.
- • Das
Medium wird nicht sterilisiert und seine Herstellung ist einfach.
- • Das
Verfahren ermöglicht
während
seiner Anwendung die Probeninkubation in einem breiten Temperaturbereich,
selbst höher
als 40°C,
da die Dauer dieser Stufe nur 18 Stunden beträgt und das Medium keine Verschlecherung
erleidet.
- • Der
große
Gehalt an Feststoffen in dem Medium, die Natur ihrer Komponenten
und ihres pH garantieren seine Konservierung über eine ausreichende Zeitdauer,
ausreichend, um einen verwendungsfertigen Vorrat in dem Labor aufzubewahren.
- • Bis
zu diesem Augenblick wurden keine falsch-positiven oder falsch-negativen Reaktionen
bei den getesteten Mikroorganismen berichtet, die alle auf die Identifizierungsmuster
reagieren, die für
das Medium vorgeschlagen wurden, dies bedeutet, dass die Farben
der Kolonien, der Zentren, der Halos und die Größen und Formen der Grenzen
charakteristisch sind und dass sie nicht variieren.
- • Es
gibt keine Substanz in dem Medium, die eine rasche Verschlechterung
auf Grund ihrer Fähigkeit,
oxidiert zu werden, bewirken kann und, im Gegenteil, es enthält Substanzen,
die helfen, die Lebensfähigkeit der
Zielmikroorganismen zu erhalten, und sie schützen sogar die Zellen vor durch
chemische Mittel verursachte Schäden,
wie im Fall der Kohle, Milch, Stärke
und Kieselgur.
- • Mit
dem beschriebenen Medium und Verfahren wird die Differenzierung
nicht nur für
Salmonella non-typhi von typhi, sondern für einige von ihnen zueinander
erreicht.
- • Wenn
die Organismen hauptsächlich
durch die Fläche
des Wachstums identifiziert werden, das heißt durch die Farbe der Kolonien
und ihres Zentrums, ihres Halos und ihrer Morphologie, hängt das
Identifizierungsverfahren weniger deutlich von den Farbänderungsreaktionen
in dem Medium ab, die eine falsche Identifizierung bewirken können, wenn
Reaktionen überlappen,
zum Beispiel, wenn verunreinigte Proben mit einem großen Bereich
an Organismen verschiedener Spezies und Gattungen getestet werden,
wie im Fall von stark verschmutzen oder fauligen Wässern.
- • Es
sind keine zusätzlichen
Tests erforderlich, um Organismen von gesundheitlichem Interesse
zu identifizieren, wie beispielsweise Pseudomonas, Aeromonas, und
Klebsiella.
- • Die
in den vorgeschlagenen Mengen verwendeten Nährstoffbasen erleichtern zusammen
mit der Anwesenheit von schützenden
Mitteln und unter Berücksichtigung
der Konzentration der Inhibitoren, ein rasches Wachstum und Gewinnen
alle interessierenden Organismen vor 24 Stunden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Kulturmedium für die Identifizierung von Gram-negativen
Mikroorganismen zur Verfügung,
das eine Mischung aus Verbindungen enthält, die das Auftreten von Halos
mit unterschiedlichen Farben und Größen bereitstellt, zusammengesetzt
aus Kieselgur, Magermilch, Stärken
und bakteriologischer Aktivkohle. Das Medium enthält auch
eine Mischung aus Nährstoffbasen,
Substanzen, die das Auftreten von verschiedenen Farben der Kolonien
garantieren, Substanzen, die die Inhibierung der Gram-positiven
Organismen garantieren, und Substanzen, die eine feste Matrix für das Wachstum
und die Entwicklung der Kolonien zur Verfügung stellen.
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In
dem erfindungsgemäßen Kulturmedium
sind die Mengen der Verbindungen, die das Auftreten von Halos mit
unterschiedlichen Farben und Größen zur
Verfügung
stellen und in dem Medium in Mengen von 8 bis 20 g/L vorhanden sind,
die folgenden:
Kieselgur von 2 bis 10 g/L
Magermilch von
2 bis 20 g/L
Stärke
bis zu 4 g/L
Bakteriologische Aktivkohle bis zu 4 g/L
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Die
Mischung an in dem Medium enthaltenen Nährstoffbasen, die in Mengen
von 10 bis 38 g/L vorhanden ist, ist zusammengesetzt aus:
Peptone
von 2 bis 15 g/L
Triptone von 2 bis 15 g/L
Hefeextrakt
von 2 bis 8 g/L
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In
dem erfindungsgemäßen Medium
sind die Substanzen, die das Auftreten von verschiedenen Farben
garantieren ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Propylenglycol, das in Mengen von
5 bis 15 mL/L verwendet wird; Neutralrot, das in Mengen bis zu 0,05
g/L verwendet wird; Phenolrot, das in Mengen bis zu 0,05 g/L verwendet
wird; Magentaglucuronid, das in Mengen von 0,05 bis 0,25 g/L verwendet
wird; X-Gal, das in Mengen von 0,03 bis 0,1 g/L verwendet wird,
und MUG, das in Mengen bis zu 0,07 g/L verwendet wird.
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Auf
der anderen Seite werden die Substanzen, die die Inhibierung der
Gram-positiven Organismen garantieren, in Mengen von 0,1 bis 1 g/L
verwendet, wobei bevorzugt Natriumdesoxycholat verwendet wird.
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Darüber hinaus
besitzt das Medium Substanzen, die eine feste Matrix für das Wachstum
und die Entwicklung der Kolonien zur Verfügung stellen, die zusammengesetzt
sind aus der Kombination der Mischung der Verbindungen, die das
Auftreten von Halos mit verschiedenen Farben und Größen bereitstellen,
insbesondere Kieselgur, Magermilch, Stärken und bakteriologische Aktivkohle
mit Agar, in Verhältnissen
von 0,75:1 bis 2:1.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Identifizierung von Gram-negativen
Mikroorganismen, das den Schritt des in Kontaktbringens der Mikroorganismen
mit dem oben beschriebenen Kulturmedium beinhaltet, wobei die Differenzierung
der interssierenden Organismen durch das Auftreten von wenigstens
10 charakteristischen Farben der regelmäßigen und unregelmäßigen Kolonien,
und von Halos mit wenigstens 5 verschiedenen charakteristischen
Farben und Größen erfolgt.
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In
dem genannten Verfahren erfolgt die Identifizierung der verschiedenen
Organismen wie folgt:
- • E. coli durch das Auftreten
von Kolonien mit intensiver violett bläulicher Farbe und blauem Halo
und einem Medium mit oranger Farbe und, in bestimmten Fällen, Fluoreszenz
mit blauer Farbe;
- • E.
coli O157:H7 durch das Auftreten von Kolonien mit violett bläulicher
oder grünlicher
Farbe und einem Medium mit rosa Farbe;
- • Shigella
sonnei durch das Auftreten von Kolonien mit violett rötlicher
Farbe, sehr unregelmäßigen Rändern und
gelbem Halo;
- • Shigella
flexneri durch das Auftreten von transluzenten Kolonien mit oranger
bis gelber Farbe, Mucoiden und Medium mit oranger bis gelber Farbe;
- • Pseudomonas
aeruginosa durch das Auftreten von Kolonien mit orange rosa Farbe,
transparentem Halo und grünlicher
Fluoreszenz vor 24 Stunden und grünlicher Farbe nach 24 Stunden;
- • Klebsiella
pneumoniae durch das Auftreten von Kolonien mit violett rötlicher
Farbe, gelegentlich Mucoiden mit rosa beigem Halo;
- • Serratia
odorifera und Serratia marcencens durch das Auftreten von Kolonien
mit violett grünlicher
Farbe und sehr kleinem transparentem Halo;
- • Proteus
mirabilis, Proteus vulgaris und Providence spp durch das Auftreten
von kleinen farblosen Kolonien und Medium mit oranger Farbe;
- • Salmonella
enteritidis durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und
gleichmäßigen Rändern;
- • Salmonella
cholerasuiss durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und
unregelmäßigen Rändern;
- • Salmonella
typhimurium durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und
Halo mit variabler oranger Farbe;
- • Salmonella
schotmuelleri durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe,
transluzent, und Medium mit oranger bis gelber Farbe;
- • Salmonella
typhi durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe und gelbem
Medium;
- • Enterobacter
aerogenes und E. cloacae durch das Auftreten von Kolonien mit hellvioletter
oder violett grünlicher
Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe;
- • Citrobacter
freundii durch das Auftreten von kleinen Kolonien mit dunkelvioletter
Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe;
- • Aeromonas
hydrophila durch das Auftreten von Kolonien mit hellgrüner Farbe
und einem breiten transparenten Halo.
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Wenn
die Identifizierung von verschiedenen Organismen unter Verwendung
von Phenolrot ausgeführt wird,
werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
- • E. coli
wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit blauer Farbe
und Medium mit rosa Farbe, und im Fall einer Verwendung von MUG,
Fluoreszenz mit blauer Farbe;
- • Shigella
sonnei wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit blauer
Farbe, unregelmäßigen Rändern und
Medium mit Erdbeer-rosa Farbe;
- • Pseudomonas
aeruginosa wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit
grünlich
beiger Farbe und Medium mit rosa Farbe;
- • Salmonella
typhimurium wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien
mit beiger Farbe oder farblosen Kolonien und Medium mit Erdbeer-rosa
Farbe.
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Das
Kulturmedium wird hergestellt durch Mischen von 30 bis 50 Gramm
des Mediums mit 1 Liter destilliertem oder deionisiertem Wasser,
Rühren,
Kochen bis zum vollständigen
Schmelzen des Agars, Kühlen auf
45–50°C, Zugeben
von Propylenglycol in Mengen von 5 bis 15 mL, Rühren und Verteilen in konstant
geschüttelte
Schalen. Dann werden die Proben oder die Mikroorganismen beimpft
und bei einer Temperatur von 30 bis 45°C für bis zu 18 Stunden inkubiert,
wobei schließlich
die Organismen im Wesentlichen durch die Charakteristika der Farbe
der Kolonien, ihres Zentrums, des Halos, der Grenzen, und sofern
erforderlich durch die Farbe des Mediums identifiziert oder differenziert
werden.
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Im
industriellen Maßstab
wird das Medium hergestellt ausgehend von der Mischung der entwässerten Bestandteile,
die vorher gemahlen und gesiebt wurden. Das Mischen wird in Homogenisatoren
für 0,5
bis 6 Stunden ausgeführt.
Es wird eine Probe entnommen und der pH bestimmt. Der pH wird mit
Natriumcarbonat auf 6,6 bis 7,4 eingestellt und es wird erneut von
0,5 bis 6 Stunden gemischt. Nachdem der pH wieder festgestellt wurde,
wird das Medium physikochemischer und funktioneller Kontrolle unterzogen,
und wird, wenn die Ergebnisse zufrieden stellend sind, in Kolben
mit unterschiedlichen Volumen gefüllt.
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Im
Labor oder in Form eines sofort zu verwendenden Mediums wird wie
folgt verfahren:
Zuerst wird eine kleine Menge destilliertes
oder deionisiertes Wasser in einen Erlenmeyer-Kolben gegossen, das
von dem Gesamtvolumen von 1 Liter genommen wird, das notwendig ist
für die
Herstellung des Mediums. Diese Wassermenge wird mit 10 mL Propylenglycol
gemischt. Danach werden die entwässerten
Bestandteile gewogen und zugegeben, beginnend mit den Mitteln, die
rascher Feuchtigkeit aufnehmen könnten,
wie beispielsweise die Nährstoffbasen,
in Mengen von 10 bis 30 g, insbesondere die Peptone von 2 bis 15
g/L, die Tryptone von 2 bis 15 g/L und die Hefeextrakte von 2 bis
8 g/L. Als nächstes
werden die Bestandteile, die das Auftreten von Halos zur Verfügung stellen,
in einer Menge von 8 bis 20 g/L zugegeben, insbesondere die Magermilch
von 2 bis 20 g/L, die Stärken
bis zu 4 g/L, die Aktivkohle bis zu 4 g/L und schließlich das
Kieselgur von 2 bis 10 g/L.
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Danach
werden die meisten der Bestandteile zugegeben, die das Auftreten
der Färbungen
garantieren, wie beispielsweise das Neutralrot in Mengen bis zu
0,05 g/L oder das Phenolrot in Mengen bis zu 0,05 g/L; das Magentaglucuronid
in Mengen von 0,005 bis 0,02 g/L; das X-Gal von 0,003 bis 0,005
g/L und das MUG bis zu 0,002 g/L.
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Als
nächstes
werden die Inhibitoren der Gram-positiven Organismen zugegeben,
bevorzugt das Natriumdesoxycholat in einer Menge von 0,1 bis 1 g/L.
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Zuletzt
wird das Agar mit einem Anteil von 0,5:1 bis 1,5:1 in Bezug auf
die Summe der Mengen an Milch, Stärken, Aktivkohle und Kieselgur
zugegeben.
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Alle
Bestandteile sollten schließlich
in Mengen zwischen 30 und 50 g zugegeben sein.
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Man
lässt die
Mischung einige Minuten lang ruhen und danach wird der Rest des
Wassers bis zur Auffüllung
auf 1 Liter zugegeben, die Komponenten werden gut geschüttelt und
man lässt
sie über
einen Zeitraum von bis zu 15 Minuten ruhen, so dass das Agar quillt.
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Dann
wird die Mischung unter ständigem
Schütteln
bis zum Sieden erwärmt
und bis das vollständige Schmelzen
des Agars erreicht ist.
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Man
lässt die
Mischung bis auf 45–50°C abkühlen, es
wird das Propylenglycol in Mengen von 5 bis 15 mL zugegeben, das
Medium wird konstant bewegt und es wird unter ständigem Schütteln in Petrischalen verteilt.
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Die
Schalen werden mit dem Testproben durch eines der etablierten Verfahren
beimpft, bevorzugt durch das Plattenverfahren oder durch Ausstreichen.
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Als
nächstes
werden einige Beispiele präsentiert.
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Beispiel Nr. 1
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1000
g des gepulverten entwässerten
Kulturmediums wurden mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
| | g/1000
g Medium |
| Rindermuskel-Pepton | 118,5 |
| Caseintripton | 118,5 |
| Hefeextrakt | 94,8 |
| Magermilchpulver | 237,0 |
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Diese
Komponenten wurden vorher gesiebt.
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In
der Zusammensetzung war das Natriumdesoxycholat als ein Inhibitor
enthalten (23,7 g).
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Es
wurde eine Vormischung aus 47,4 g Kieselgur mit 1,2 g X-Gal und
0,7 g Neutralrot und 3,0 g Magentaglucuronid hergestellt. Danach
wurden alle Bestandteile mit Agar als ein Geliermittel mit einer
Menge von 355 g und Natriumcarbonat mit einer Menge von 1 g gemischt.
Nachdem Einheitlichkeit der Zusammensetzung erzielt und der pH auf
7,0 eingestellt worden war, wurde dieses in fest verschlossene Kolben
mit 21 g der Zusammensetzung gepackt.
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Gleichzeitig
wurden 5 mL Propylenglycol in Kolben gepackt.
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Der
Inhalt des Kolben mit der Zusammensetzung wurde in einen Erlenmeyer-Kolben
gegossen, der eine Mischung aus deionisiertem Wasser und dem Inhalt
des Propylenglycol-Kolbens enthielt; die Mischung wurde gerührt, man
ließ sie
für 10
Minuten quellen, und dann wurde sie 3 Minuten lang gekocht; bis
auf eine Temperatur von 45°C
abgekühlt
und in Petrischalen verteilt. Nachdem die Zusammensetzung geliert
war, wurde das Medium getestet, um seine Charakteristika und Leistungsfähigkeit
zu bewerten.
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Die
physikochemischen und organoleptischen Auswertungen sind in Tabelle
Nr. 1 gezeigt.
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Tabelle
Nr. 1 Physikochemische und organoleptische Auswertung
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Die
Differenzierung der Kolonien und die Förderung des Wachstums im Vergleich
mit Mehrzweck- und Differentialmedium wurden für den interessierenden Mikroorganismus
mit zertifizierten Stämmen
bewertet, diese waren:
Rot-violettes Gallenagar: Hergestellt
mit einer Konzentration von 38,5 g/L in Wasser und gemischt und
erwärmt bis
zum Kochen, auf 45–50°C abgekühlt und
in Schalen verteilt. S. S. Agar: Hergestellt mit einer Konzentration von
60 g/L in deionisiertem Wasser, gemischt und bis zum Kochen erwärmt, abgekühlt bis
auf 45–50°C und in Schalen
verteilt.
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Der
Tabelle Nr. 2 können
die Charakteristika des Wachstums von verschiedenen Mikroorganismen ebenso
wie die Zählungen
bei den Verdünnungen
10–5 und
10–6 entnommen
werden.
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Diese
Ergebnisse waren zufrieden stellend sowohl bei dem Medium, das Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist, als auch bei den Referenzmedien,
sie zeigen keine Inhibierung von Spezies von Salmonella und Shigella.
Das Wachstum von Shigella sonnei war bei dem Testmedium im Vergleich
zu dem S. S Agar vorzüglich,
dies zeigte sich auch durch die Zahl und die Größe der Kolonien. In Bezug auf
die Differenzierung der verschiedenen Spezies wurden in allen Fällen charakteristische
Antworten für
jede Spezies erhalten.
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Eine ähnliche
Untersuchung wurde mit Spezies der coliformen Gruppe unter Verwenden
des rot-violetten Gallenagarmediums ausgeführt, wie in Tabelle Nr. 3 gezeigt
ist.
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Tabelle
Nr. 2 Differenzierung und Förderung
des Wachstums bei dem erfindungsgemäßen Kulturmedium (Salmonella
und Shigella)
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Tabelle
Nr. 3 Differenzierung und Förderung
des Wachstums (Coliforme Keime)
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Die
Zählungen
dieser zwei Mikroorganismen in dem Medium, das Objekt dieser Erfindung
ist, und in dem als Referenz verwendeten Medium, waren die gleichen.
Die Differenzierung der Mikroorganismen wurde in beiden Fällen durch
ihre Farben und morphologische Charakteristika erzielt.
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Es
wurde eine Gruppe von Stämmen
durch Ausstreichen beimpft bis isolierte Kolonien in der Oberfläche des
Mediums erhalten wurden, was die Differenzierung von weiteren 5
Spezies gemäß Tabelle
4 ermöglichte.
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Tabelle
Nr. 4 Differenzierung von weiteren Gram-negativen Spezies in dem
Medium
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Es
wurde eine sehr gute Differenzierung aller Mikroorganismen in dem
Medium beobachtet, wobei der Unterschied zwischen dem Stamm von
E. coli O157:H7 und dem typischen E. coli auffiel, andere coliforme
Keime, wie Klebsiella und Enterobacter, zeigten charakteristische
Färbungen.
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Beispiel Nr. 2
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Die
Formulierung wurde hergestellt, indem die Bestandteile getrennt
voneinander in einer Menge zum Herstellen von 100 mL Medium in einen
Erlenmeyer-Kolgen eingewogen wurden, die Bestandteile wurden in Konzentrationen
gemäß Beispiel
Nr. 1 verwendet mit Ausnahme des Kieselgurs, von dem eine Konzentration von
2 g/L verwendet wurde. Es wurden 100 mL deionisiertes Wasser zugegeben,
das vorher mit 1 mL Propylenglycol vermischt worden war. Der pH-Wert
wurde auf 6,94 eingestellt und die weitere Herstellung wurde wie im
Beispiel Nr. 1 beschrieben ausgeführt.
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Die
getesteten Stämme
von Mikroorganismen, die einen transparenten Halo in den Umgebungen
der Kolonien erzeugen, wurden durch Ausstreichen beimpft, bis isolierte
Kolonien erhalten wurden. Sie wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle Nr. 5 wiedergegeben.
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Tabelle
Nr. 5 Ergebnisse der Formulierung mit 2 g/L Kieselgur
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Es
wurde eine gute Differenzierung der Mikroorganismen durch Farbe
und Morphologie beobachtet, wobei der transparente Halo um die Kolonien
sehr gut sichtbar war.
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Beispiel Nr. 3
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Das
Medium wurde formuliert durch getrenntes Einwiegen der Bestandteile
in einen Erlenmeyer-Kolben entsprechend den Konzentrationen von
Beispiel 1, mit Ausnahme des Substrats Magentaglucuronid, von dem
eine Konzentration von 1,5 μg/mL
verwendet wurde, die weitere Herstellung wurde wie im Beispiel Nr.
2 ausgeführt
und es wurde eine Antwort einer Gruppe von Enterobakterien in der
Formulierung beobachtet, wie sie in der Tabelle Nr. 6 gezeigt ist.
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Tabelle
Nr. 6 Charakteristika des Wachstums von Enterobakterien in dem Medium.
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In
diesem Beispiel kann die Funktionalität der Formulierung bei einer
großen
Gruppe zertifizierter Stämme
der Enterobacteriaceae-Familie beobachtet werden. Die typischen
Reaktionen des Mediums bei den beimpften interessierenden Spezies
wurden mit Leichtigkeit beobachtet.
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Beispiel Nr. 4
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Das
Medium wurde formuliert durch getrenntes Einwiegen der Bestandteile
in einen Erlenmeyer-Kolben entsprechend den Konzentrationen von
Beispiel 1, mit Ausnahme des Ersatzes des Substrats Magentaglucuronid
gegen das fluorogene Substrat MUG, von dem eine Konzentration von
0,05 g/L verwendet wurde, die weitere Herstellung wurde wie im Beispiel
Nr. 2 ausgeführt.
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Eine
Gruppe von Mikroorganismen wurde durch Ausstreichen beimpft, um
isolierte Kolonien zu erhalten, wie in der Tabelle Nr. 7 gezeigt
ist.
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Tabelle
Nr. 7 Bewertung der Formulierung mit MUG
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Beispiel Nr. 5
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Das
Medium wurde mit der folgenden Zusammensetzung formuliert:
| Bestandteil | g/L |
| Pepton | 5 |
| Tripton | 5 |
| Hefeextrakt | 4 |
| X-Gal | 0,05 |
| Magentaglucuronid | 0,1 |
| Desoxycholate | 1 |
| Unlösliche Stärke | 4 |
| Phenolrot | 0,018 |
| Agar | 15 |
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Die
Bestandteile wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eingewogen, es wurde
1 L deionisiertes Wasser zugegeben, vermischt mit 10 mL Propylenglycol,
der pH wurde auf 7.0 eingestellt, bis zum Kochen unter kontinuierlichem
Rühren
erwärmt
und es wurde für
15 Minuten ohne Druck in einen Autoklaven gegeben. Man lies das
Medium auf bis zu 45–50°C abkühlen und
es wurde in Petrischalen verteilt.
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Enterobakterien-Stämme wurden
durch Ausstreichen beimpft, bis isolierte Kolonien erhalten wurden. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle Nr. 8 gezeigt.
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Tabelle
Nr. 8 Bewertung der Formulierung mit Stärke und Phenolrot
