DE60121351T2 - Kulturmedium und verfahren zur bestimmung gram-negativer mikroorganismen - Google Patents

Kulturmedium und verfahren zur bestimmung gram-negativer mikroorganismen Download PDF

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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der mikrobiologischen Diagnose, und genauer die Identifizierung oder Differenzierung von Gram-negativen Bakterien.
  • Stand der Technik
  • Die Diagnose von Gram-negativen Bakterien hat eine große Bedeutung für die Gesundheit von Mensch und Tier und für den Erhalt der Umwelt, da viele von ihnen, wie beispielsweise E. coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas schwere Krankheiten bei Menschen verursachen.
  • Seit mehr als 100 Jahren werden unterschiedliche Kullturmedien für die Identifizierung und das Zählen von diesen Bakterien entwickelt.
  • Mit Beginn der Dekade ab 1990 wurden neue Kulturmedien unter der Verwendung von chromogenen und/oder fluorogenen Substraten entwickelt, um einige dieser Pathogene auf eine bessere Weise zu identifizieren.
  • Ferguson schützte in 1994 (Patent Nr. US 5,358,854 von 1994) eine Erfindung, die in einem Kulturmedien bestand und chromogenen Reagenzien für die Identifizierung und Differenzierung von E. coli und coliformen Keimen. Der Kern der Erfindung bestand in der Verwendung eines Substrats für das Enzym beta-Galactosidase, das einen unlöslichen Niederschlag einer ersten Farbe erzeugte, und einem Substrat für beta-Glucuronidase, das das Auftreten einer zweiten Farbe verursachte. Das Medium erlaubt nur die Differenzierung von koliformen Keimen im Allgemeinen, ermöglicht jedoch keine Differenzierung zwischen ihnen.
  • Alain Rambach patentierte in 1993 (Patent Nr. US 5,194,374 ) ein Medium für die Isolierung von Salmonella auf Basis der Fähigkeit dieses Mikroorganismus, Polyole zu metabolisieren. Das Medium erlaubt nicht die Identifizierung einer breiten Vielfalt an Gattungen und Spezies coliformer Keime von großem diagnostischem Interesse.
  • In jenem Jahr veröffentlichte F. Denis und Mitarbeiter (Évaluation d'un nouveau milieu avec substrats chromogénes pour la recherche de salmonelles dans des coprocultures: un milieu SMID., Revue française des laboratoires, décembre 1994, Nr. 271, S. 19–22) die Auswertung eines chromogenen Mediums für die Isolierung und die Präidentifizierung von Salmonella. Das Medium besteht aus 2 chromogenen Substraten, von denen eines die Kolonien mit einer blauen Farbe auf Basis der β-Galactosidase-Aktivität färbt, und einem weiteren, das die Kolonien von Salmonella mit einer roten Farbe färbt, auf Basis des Abbaus des Glucuronats, die sich mit einem Farbindikator kombiniert.
  • Mit Hilfe dieses Mediums können Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B und Salmonella typhimurium, Proteus, Citrobacter, E. coli und Enterobacter differenziert werden. Das Medium enthält potente Inhibitoren für die Mikroorganismen, wie beispielsweise Kristallviolett und die Gallensalze, und es erfordent die Verwendung eines TRIS-Puffers, was das Medium komplexer und inhibierend macht, selbst für einige interessierende Organismen. Auf der anderen Seite wird Polyton verwendet. Es ist eine komplexe Mischung aus Proteinhydrolysaten. Schließlich erlaubt das Medium nicht die Identifizierung von sehr interessierenden Organismen, wie u. a. beispielsweise Pseudomonas, E. coli O157:H7.
  • Rambach patentierte in 1997 ein Kulturmedium und das Verfahren zum Nachweis der Stämme von enterohämorrhagischen E. coli (Patentanmeldung Nr. WO 97/391031). Die Erfindung besteht aus einem selektiven Medium für die Differenzierung von E. coli, insbesondere der Serotypen O157 und/oder O11, die ein chromogenes Substrat für das Enzym β-Galactosidase verwenden. Um die Differenzierungsfähigkeit des Verfahrens zu erhöhen, wurden verschiedene chromogene Substrate für β-Glucosidase, das von einer großen Anzahl an coliformen Bakterien hydrolysiert wird, und für β-Glucuronidase verwendet, das von O157 und O11 verschiedenen E. coli Serogruppen hydrolysiert wird. Dieses Kulturmedium erleichtert nicht die Differenzierung von anderen Gram-negativen Bakterien und Wallace und Jones berichteten, dass einige Stämme von E. coli und Citrobacter falsch-positive Ergebnisse ergeben könnten (Wallace und Jones, J. Appl. Bacteriol., 1996, 81: 663–668).
  • Jahre später, in 1998, patentierte Rambach ein neues Kulturmedium für den Nachweis von E. coli (Patent Nr. US 5,846,761 ), auf Basis der Verwendung eines chromogenen Substrats, das abgeleitet ist von der Indolylglucuronsäure und ihren Salzen. Dieses spezifische Medium erlaubt weder die Identifizierung von Stämmen von E. coli O57:H7 noch von anderen coliformen Keimen.
  • 1995 patentierten Monget und Mitarbeiter (Patent Nr. US 4,277,561 ) ein Verfahren für die bakteriologische Analyse und ein Medium für den Nachweis von Salmonella. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit von Salmonella, die Glucuronsäure oder ihre Salze zu fermentieren und das Enzym β-Galactosidase nicht zu produzieren. Das Medium enthält auch Nährstoffe, eine fluorogene oder chromogene Verbindung für das Enzym β-Galactosidase, Glucuronsäure oder eines ihrer Salze und einen pH-Indikator.
  • Dieses Medium enthält auch Inhibitoren für die von Salmonella verschiedenen Gattungen und Spezies, wie beispielsweise Brilliantgrün und Natriumdesoxycholat, die andere Gram-negative Organismen inhibieren können. Das Kulturmedium erfordert die Zugabe von Natriumglucuronat als einem Zusatz nach Sterilisierung. Nach Denis und Mitarbeitern ist die Spezifität dieses Mediums kleiner als 94% (93,3%), (Denis, et al, Revue française des laboratoires, décembre 1994, Nr. 271).
  • Tuompo und Mitarbeiter patentierten andererseits ein Verfahren und ein Medium zum Kultivieren und Identifizieren von Salmonella auf Basis der Verwendung von Melibiose, Mannitol und Sorbitol und von Substraten für beta-Glucuronidase (Patent Nr. US 5,786,167 ). Seine braune, blaue oder grüne Farbe identifizierte den Rest der coliformen Keime in Abhängigkeit von dem verwendeten chromogenen Substrat. Mit diesem Verfahren waren die Autoren nicht in der Lage, in geeigneter Weise jeweils die relevanteren coliformen Keimorganismen zu differenzieren.
  • Miller und Mitarbeiter patentierten 1999 (Patent Nr. US 5,871,944 von 1999) ein Medium, um Salmonella unter Verwendung von Lactose und Cellobiose zu differenzieren, um das Auftreten von schwarzen Niederschlägen in dem Medium zu unterdrücken, und es ermöglicht somit den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Salmonella. Das Medium erfordert die Verwendung eines TRIS-Puffers, von Peptonen und Fleischextrakt, X-Gal und weiterer Bestandteile.
  • Dieses Medium ist nur geeignet für einige Gram-negative Bakterien, wie beispielsweise Salmonella und Shigella, diese können nur als solche differenziert werden, es kann aber nicht zwischen ihnen differenziert werden.
  • Butchner patentierte 1996 ein Medium und ein Verfahren für die Isolierung und die präsumptive Identifizierung von einigen Bakterien, insbesondere jene, die urinäre Sepsis oder urinäre Infektionen verursachen. (Patent Nr. US 5,541,082 ). Das Verfahren basiert in seinem Prinzip auf der Unterscheidung zwischen ihnen durch die Morphologie der Kolonien und der Farbe.
  • Das Medium enthält ein proteinhaltiges bzw. proteinähnliches opakes Material, zwei oder mehr chromogene Substrate, Arylsulphatasen, Galactosidasen, Glucuronidasen, Tryptophanoxidasen und Triaminooxidasen, es ist auch nicht spezifisch für die Gram-negativen Bakterien, die indikativ sind für die Qualität der Lebensmittel und Wässer.
  • Andererseits können bei seiner Verwendung Organismen mit großer klinischer und sanitärer Bedeutung nicht richtig bzw. genau identifiziert werden, beispielsweise E. coli O157:H7, Serratia, Citrobacter, Aeromonas, und weitere. Es sind auch zusätzliche "Tüpfelanalysen" erforderlich, um einige der Mikroorganismen zu bestätigen, und immer als eine präsumptive Diagnose.
  • Quesada Muñiz und Rodriguez Martinez erhielten Schutz (Erfinderzertifikat Nr. 20000083) für eine Formulierung, die eine Mischung aus Proteinhydrolysaten, Proteinen, Alkoholen und weiteren Elementen enthält, die neben der Identifierzung von interessierenden Organismen, wie beispielsweise E. coli und Salmonella, die Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa in weniger als 24 Stunden ermöglicht. Jedoch war das Medium nicht in der Lage, die Identifizierung anderer interessierender Gram-negativer Organismen zu erleichtern, die als farblose Kolonien wuchsen.
  • Roth und Mitarbeiter schützten 1993 ein Verfahren und ein chromogenes Medium für die Identifizierung und Differenzierung von totalcoliformen Keimen und E. coli. (Patent Nr. US 5,393,662 ). Das Medium ist aus Substraten mit verschiedenen chromophoren Gruppen zusammengesetzt. Dieses Medium erleichterte nicht die Identifizierung und das Zählen von E. coli O157:H7, Salmonella und weiterer nicht-coliformer Enterobakterien. Shigella sonnei verursacht positiv-falsche Ergebnisse, da die Kolonien mit der gleichen Farbcharakteristik wachsen wie E. coli.
  • 1997 bewerteten KAI A. Hengstler und Mitarbeiter (KAI A. Hengstler, Rainer Hammann und Anne Marie Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Medium for Detection und Presumptive Identification of Urinary Tract Pathogens. Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1997, S. 2773–2777) das CHRO-Magar Orientierungsmedium für den Nachweis und die präsumptive Identifizierung von Pathogenen in Urinproben. Das Medium erlaubte den Nachweis von verschiedenen interessierenden Spezies von Mikroorganismen durch die Färbung bzw. Farbgebung der Kolonien, unter anderem: rosa bis rot (E. coli), blau-violett (Klebsiella spp.), blau-rot (Enterobacter spp.), rosa (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), blau (Serratia spp.), blau-violett (Citrobacter freundii und koseri), farblos bis beige mit braunem Medium (Morganella morganii, Proteus mirabilis und vulgaris), blau mit braunem Medium (Proteus vulgaris), farblos in braunem Medium (Enterococcus spp.), brilliant blau (Streptococcus agalactiae), grün-blau (Enterococcus spp.) und hellrosa (Staphylococcus saprophyticus).
  • Wie man aus dem Stand der Technik erkennen kann, kann nicht jeder Mikroorganismus korrket identifiziert werden, da er nicht einem einzelnen Farbmuster entspricht bzw. auf ein einzelnes Farbmuster anspricht, für das man bestätigen kann, dass die Identifizierung nicht nur ausgeführt werden kann durch die Attribute der Kolonie oder des Mediums, und sie erfordern weitere Tests, wie beispielsweise im Fall von Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp. Gemäß einem weiteren Aspekt erleichtert das Medium nicht eine korrekte Identifizierung, da unterschiedliche Spezies die gleiche Färbung präsentieren, wie beispielsweise im Fall von Enterobacter spp., Citrobacter freundii und Proteus Mirasbilis, die alle mit einer pinken Farbe auftreten.
  • Im März 1998 patentierten Roth und Mitarbeiter eine Erfindung (Patent Nr. US 5,726,031 ), in der von einem Medium und einem quantitativen Verfahren für die Identifizierung und Differenzierung von biologischem Material in eine Testprobe berichtet wurde. Dieses Medium schließt ein chromogenes Substrat ein, das spezifisch ist für eines der biologischen Materialien, das jenes Material färbt, und ein zweites chromogenes Substrat, das spezifisch für eine zweite Art von biologischem Material ist und das das Erhalten von einer, von der ersten verschiedenen, zweiten Färbung für Kolonien der anderen Spezies erleichtert, und ein drittes zu testendes biologisches Material, das eines der zwei Substrate aufspaltet. Das erste und zweite biologische Material baut einen Zucker ab, und das dritte biologische Material baut jenen Zucker nicht ab.
  • In dem Medium ist ein pH-Indikatior enthalten und er ermöglicht die Veränderung der Farbe des Mediums als ein Ergebnis der Hydrolyse des Zuckers um die Kolonie herum und die Kolonie nimmt die charakteristischen Farben der chromogenen Substratspaltung an. Die Hauptbestandteile sind: 6-Chlor-3-Indolylgalactosid, 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylglucuronid, Sorbitol und Phenolrot. Auch sind die Gallensalze, Natriumlaurylsulfat, Natriumdesoxycholat, Polyglycolether und von Acriflavin abgeleitete Antibiotika enthalten.
  • Die Zusammensetzung enthält auch einen Induktor für die enzymatischen Reaktionen (Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranosid), Agare, Pectine, Carragenine, Alginate, Xantin und Peptone. Diese Erfindung kann als das nächstkommende Analogon zu der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
  • Die Nachteile der erwähnten Erfindung können wie folgt zusammengefasst werden:
    • • Salmonella typhi kann nicht von Salmonella non-typhi differenziert werden, und seine bestätigende Identifizierung ist schwierig und für einige Stämme unmöglich, da es in dem Medium als weiße Kolonien auftreten kann, wie es beispielsweise bei anderen Gram-negativen Bakterien vorkommt, wie beispielsweise Proteus.
    • • In den Fällen, bei denen mehrere Spezies in einer Petrischale wachsen, ist es sehr schwierig, die gelben Zonen zu identifizieren, die charakteristisch sind für die meisten Salmonella, da dies aufgrund des Ansäurens des Mediums stattfindet und die Ausbildung der gelben Zonen durch das Überlappen der Reaktionen in dem Medium stattfinden kann.
    • • Die Identifizierung und Zählung anderer Gram-negativer nicht- coliformer Keime, wie beispielsweise Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, etc., ist nicht möglich, da sie die Verwendung von anderen Tests für ihre Identifizierung benötigen.
    • • Wie bei den konventionellen Medien werden im Minimum von 24 bis 48 Stunden zum Identifizieren der interessierenden Organismen benötigt.
    • • Die Komponenten, die das Wachstum der interessierenden Organismen in dem Medium fördern sollen, sind nicht ausreichend, um eine frühe Entwicklung der Identifizierungsreaktionen zu ermöglichen (vor 24 Stunden), und es ist die Verwendung eines Induktors für das Enzym β-Galactosidase (IPTG) erforderlich.
    • • Das Natriumdodecylsulfat, das Acryflavin und die Antibiotika in dem Medium machen seine Herstellung komplexer und teurer. Seine Stabilität ist beschränkt durch die Anwesenheit von Antibiotika, die als Zusätze zugegeben werden.
    • • Das Verfahren wird ausgeführt durch Inkubieren der Probe bei 40°C und nicht bei einer Temperatur, die für die meisten der Organismen und Institutionen empfohlen wird, die die mikrobiologischen Verfahren regeln (44°C) und es kann Probleme verursachen, da die Arbeitsschritte nicht standardisiert sind, und es kann Irritationen bei dem Laborpersonal verursachen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in dem zur Verfügungsstellen eines neuen Kulturmediums für die Identifizierung und/oder Differenzierung von Gram-negativen Mikroorganismen, die von Interesse sind in der klinischen und tierärztlichen mikrobiologischen Diagnose, der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln und der Überwachung der Verunreiniung der Umwelt, und einem Verfahren zu seiner Verwendung.
  • Die Neuheit der Erfindung besteht darin, dem Labor ein Kulturmedium zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, zwischen einer beachtlichen Menge an für die Diagnose interessanter Gram-negativer Organismen in einem einzelnen Behälter zu differnzieren (Nachweis), auf der Grundlage der Unterschiede von wenigstens 10 Farben der Kolonien unterschiedlicher Größen und von wenigstens 5 Typen unterschiedlicher Halos, durch ihre Farben und Größen.
  • Das Medium erlaubt, zum ersten Mal, gleichzeitig E. coli, E. coli O157:H7, Salmonella typhi und non-typhi auszuwerten, und selbst zwischen ihnen; Klebsiella, Shigella und zwischen ihnen; Serratia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Citrobacter und Aeromonas.
  • Einige Mikroorganismen treten auf diesem Medium mit charakteristischen Farben auf, wie beispielsweise Salmonella typhi und S. schotmuelleri, die eine orange Farbe zeigen, Aeromonas hydrophila mit hellgrüner Farbe, Pseudomonas aeruginosa mit orange-rosa Farbe, Shigella sonnei mit rötlich violetter Farbe, Shigella flexneri durchscheinend und mit oranger bis gelber Farbe, Serratia odorifera mit violett grünlicher Farbe und Proteus und Providence als farblose Kolonien.
  • Unerwartete Ergebnisse waren die charakteristischen Halos von bestimmten Mikroorganismen, wie im Fall von Pseudomonas aeruginosa mit einem breiten transparenten Halo, Shigella sonnei mit einem gelben Halo, Klebsiella pneumoniae mit einem rosa beigen Halo, Serratia mit einem kleinen transparenten Halo, Aeromonas hydrophila mit einem transparenten Halo und Salmonella typhimurium mit einem orangen Halo.
  • Einige unerwartete Antworten der nachzuweisenden Mikroorganismen wurden erhalten, wenn das Phenolrot als Indikator verwendet wurde, insbesondere die Kolonien von Shigella sonnei mit blauer Farbe, unregelmäßigen Rändern und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe, Pseudomonas aeruginosa-Kolonien mit grünlich beiger Farbe und Medium mit rosa Farbe und Salmonella typhimurium-Kolonien mit beiger Farbe oder farblos und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe.
  • Auf der anderen Seite werden neue Kombinationen von Elementen angeboten, die es erlauben, gut differenzierte Halos zu erhalten, die für die erwähnten Organismen vorher nicht beschrieben worden sind, in Form der Mengen an Kieselgur, Magermilch, Stärken und Aktivkohle, die zu dem Medium in den vorgeschlagenen Verhältnissen zugegeben werden.
  • Die Substanzen, die, zusammen mit den im vorherigen Paragraphen beschriebenen Bestandteilen und miteinander gemischt, die Erscheinung von verschiedenen Farben in den Kolonien und den Halos garantieren, sind ausgewählt aus Propylenglycol (von 5 bis 15 mL/L), Neutralrot (bis zu 0,05 g/L), Phenolrot (bis zu 0,05 g/L), Magentaglucuronid (von 0,05 bis 0,25 g/L), X-Gal (von 0,03 bis 0,1 g/L) und MUG (bis zu 0,07 g/L), sind Teil der Besonderheit, da diese Kombinationen und Verhältnisse das Auftreten von Farben in den Kolonien und Halos garantieren, die vorher nicht beschrieben wurden.
  • Die Mengen der drei Nährstoffbasen in dem Medium in Bezug auf den Gehalt an Inhibitoren für das Wachstumg der Gram-negativen Organismen ermöglicht eine neue Kombination, die in der Lage ist, das Wachstum von konkurrierenden Organismen zu fördern.
  • Die Vorteile des vorgeschlagenen Mediums und Verfahrens, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, sind im Detail wie folgt:
    • • Das Medium erlaubt nicht nur die Differenzierung der coliformen Keime im Allgemeinen, sondern spezifisch zwischen ihnen, und jenen mit größerer diagnostischer Bedeutung im Bereich der Klinik und der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln.
    • • Mit diesem Medium können eine vorher nicht beschriebene Vielfalt an unterschiedlichen Gattungen und Spezies gleichzeitig in einer einzelnen Petrischale identifiziert werden, mit der Folge, dass Laborresourcen gespart werden, die Zeit für das Ansetzen der Materialien reduziert und Personal eingespart wird.
    • • Das Medium wird nicht sterilisiert und seine Herstellung ist einfach.
    • • Das Verfahren ermöglicht während seiner Anwendung die Probeninkubation in einem breiten Temperaturbereich, selbst höher als 40°C, da die Dauer dieser Stufe nur 18 Stunden beträgt und das Medium keine Verschlecherung erleidet.
    • • Der große Gehalt an Feststoffen in dem Medium, die Natur ihrer Komponenten und ihres pH garantieren seine Konservierung über eine ausreichende Zeitdauer, ausreichend, um einen verwendungsfertigen Vorrat in dem Labor aufzubewahren.
    • • Bis zu diesem Augenblick wurden keine falsch-positiven oder falsch-negativen Reaktionen bei den getesteten Mikroorganismen berichtet, die alle auf die Identifizierungsmuster reagieren, die für das Medium vorgeschlagen wurden, dies bedeutet, dass die Farben der Kolonien, der Zentren, der Halos und die Größen und Formen der Grenzen charakteristisch sind und dass sie nicht variieren.
    • • Es gibt keine Substanz in dem Medium, die eine rasche Verschlechterung auf Grund ihrer Fähigkeit, oxidiert zu werden, bewirken kann und, im Gegenteil, es enthält Substanzen, die helfen, die Lebensfähigkeit der Zielmikroorganismen zu erhalten, und sie schützen sogar die Zellen vor durch chemische Mittel verursachte Schäden, wie im Fall der Kohle, Milch, Stärke und Kieselgur.
    • • Mit dem beschriebenen Medium und Verfahren wird die Differenzierung nicht nur für Salmonella non-typhi von typhi, sondern für einige von ihnen zueinander erreicht.
    • • Wenn die Organismen hauptsächlich durch die Fläche des Wachstums identifiziert werden, das heißt durch die Farbe der Kolonien und ihres Zentrums, ihres Halos und ihrer Morphologie, hängt das Identifizierungsverfahren weniger deutlich von den Farbänderungsreaktionen in dem Medium ab, die eine falsche Identifizierung bewirken können, wenn Reaktionen überlappen, zum Beispiel, wenn verunreinigte Proben mit einem großen Bereich an Organismen verschiedener Spezies und Gattungen getestet werden, wie im Fall von stark verschmutzen oder fauligen Wässern.
    • • Es sind keine zusätzlichen Tests erforderlich, um Organismen von gesundheitlichem Interesse zu identifizieren, wie beispielsweise Pseudomonas, Aeromonas, und Klebsiella.
    • • Die in den vorgeschlagenen Mengen verwendeten Nährstoffbasen erleichtern zusammen mit der Anwesenheit von schützenden Mitteln und unter Berücksichtigung der Konzentration der Inhibitoren, ein rasches Wachstum und Gewinnen alle interessierenden Organismen vor 24 Stunden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Kulturmedium für die Identifizierung von Gram-negativen Mikroorganismen zur Verfügung, das eine Mischung aus Verbindungen enthält, die das Auftreten von Halos mit unterschiedlichen Farben und Größen bereitstellt, zusammengesetzt aus Kieselgur, Magermilch, Stärken und bakteriologischer Aktivkohle. Das Medium enthält auch eine Mischung aus Nährstoffbasen, Substanzen, die das Auftreten von verschiedenen Farben der Kolonien garantieren, Substanzen, die die Inhibierung der Gram-positiven Organismen garantieren, und Substanzen, die eine feste Matrix für das Wachstum und die Entwicklung der Kolonien zur Verfügung stellen.
  • In dem erfindungsgemäßen Kulturmedium sind die Mengen der Verbindungen, die das Auftreten von Halos mit unterschiedlichen Farben und Größen zur Verfügung stellen und in dem Medium in Mengen von 8 bis 20 g/L vorhanden sind, die folgenden:
    Kieselgur von 2 bis 10 g/L
    Magermilch von 2 bis 20 g/L
    Stärke bis zu 4 g/L
    Bakteriologische Aktivkohle bis zu 4 g/L
  • Die Mischung an in dem Medium enthaltenen Nährstoffbasen, die in Mengen von 10 bis 38 g/L vorhanden ist, ist zusammengesetzt aus:
    Peptone von 2 bis 15 g/L
    Triptone von 2 bis 15 g/L
    Hefeextrakt von 2 bis 8 g/L
  • In dem erfindungsgemäßen Medium sind die Substanzen, die das Auftreten von verschiedenen Farben garantieren ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Propylenglycol, das in Mengen von 5 bis 15 mL/L verwendet wird; Neutralrot, das in Mengen bis zu 0,05 g/L verwendet wird; Phenolrot, das in Mengen bis zu 0,05 g/L verwendet wird; Magentaglucuronid, das in Mengen von 0,05 bis 0,25 g/L verwendet wird; X-Gal, das in Mengen von 0,03 bis 0,1 g/L verwendet wird, und MUG, das in Mengen bis zu 0,07 g/L verwendet wird.
  • Auf der anderen Seite werden die Substanzen, die die Inhibierung der Gram-positiven Organismen garantieren, in Mengen von 0,1 bis 1 g/L verwendet, wobei bevorzugt Natriumdesoxycholat verwendet wird.
  • Darüber hinaus besitzt das Medium Substanzen, die eine feste Matrix für das Wachstum und die Entwicklung der Kolonien zur Verfügung stellen, die zusammengesetzt sind aus der Kombination der Mischung der Verbindungen, die das Auftreten von Halos mit verschiedenen Farben und Größen bereitstellen, insbesondere Kieselgur, Magermilch, Stärken und bakteriologische Aktivkohle mit Agar, in Verhältnissen von 0,75:1 bis 2:1.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Identifizierung von Gram-negativen Mikroorganismen, das den Schritt des in Kontaktbringens der Mikroorganismen mit dem oben beschriebenen Kulturmedium beinhaltet, wobei die Differenzierung der interssierenden Organismen durch das Auftreten von wenigstens 10 charakteristischen Farben der regelmäßigen und unregelmäßigen Kolonien, und von Halos mit wenigstens 5 verschiedenen charakteristischen Farben und Größen erfolgt.
  • In dem genannten Verfahren erfolgt die Identifizierung der verschiedenen Organismen wie folgt:
    • • E. coli durch das Auftreten von Kolonien mit intensiver violett bläulicher Farbe und blauem Halo und einem Medium mit oranger Farbe und, in bestimmten Fällen, Fluoreszenz mit blauer Farbe;
    • • E. coli O157:H7 durch das Auftreten von Kolonien mit violett bläulicher oder grünlicher Farbe und einem Medium mit rosa Farbe;
    • • Shigella sonnei durch das Auftreten von Kolonien mit violett rötlicher Farbe, sehr unregelmäßigen Rändern und gelbem Halo;
    • • Shigella flexneri durch das Auftreten von transluzenten Kolonien mit oranger bis gelber Farbe, Mucoiden und Medium mit oranger bis gelber Farbe;
    • • Pseudomonas aeruginosa durch das Auftreten von Kolonien mit orange rosa Farbe, transparentem Halo und grünlicher Fluoreszenz vor 24 Stunden und grünlicher Farbe nach 24 Stunden;
    • • Klebsiella pneumoniae durch das Auftreten von Kolonien mit violett rötlicher Farbe, gelegentlich Mucoiden mit rosa beigem Halo;
    • • Serratia odorifera und Serratia marcencens durch das Auftreten von Kolonien mit violett grünlicher Farbe und sehr kleinem transparentem Halo;
    • • Proteus mirabilis, Proteus vulgaris und Providence spp durch das Auftreten von kleinen farblosen Kolonien und Medium mit oranger Farbe;
    • • Salmonella enteritidis durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und gleichmäßigen Rändern;
    • • Salmonella cholerasuiss durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und unregelmäßigen Rändern;
    • • Salmonella typhimurium durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und Halo mit variabler oranger Farbe;
    • • Salmonella schotmuelleri durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe, transluzent, und Medium mit oranger bis gelber Farbe;
    • • Salmonella typhi durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe und gelbem Medium;
    • • Enterobacter aerogenes und E. cloacae durch das Auftreten von Kolonien mit hellvioletter oder violett grünlicher Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe;
    • • Citrobacter freundii durch das Auftreten von kleinen Kolonien mit dunkelvioletter Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe;
    • • Aeromonas hydrophila durch das Auftreten von Kolonien mit hellgrüner Farbe und einem breiten transparenten Halo.
  • Wenn die Identifizierung von verschiedenen Organismen unter Verwendung von Phenolrot ausgeführt wird, werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
    • • E. coli wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit blauer Farbe und Medium mit rosa Farbe, und im Fall einer Verwendung von MUG, Fluoreszenz mit blauer Farbe;
    • • Shigella sonnei wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit blauer Farbe, unregelmäßigen Rändern und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe;
    • • Pseudomonas aeruginosa wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit grünlich beiger Farbe und Medium mit rosa Farbe;
    • • Salmonella typhimurium wird identifiziert durch das Auftreten von Kolonien mit beiger Farbe oder farblosen Kolonien und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe.
  • Das Kulturmedium wird hergestellt durch Mischen von 30 bis 50 Gramm des Mediums mit 1 Liter destilliertem oder deionisiertem Wasser, Rühren, Kochen bis zum vollständigen Schmelzen des Agars, Kühlen auf 45–50°C, Zugeben von Propylenglycol in Mengen von 5 bis 15 mL, Rühren und Verteilen in konstant geschüttelte Schalen. Dann werden die Proben oder die Mikroorganismen beimpft und bei einer Temperatur von 30 bis 45°C für bis zu 18 Stunden inkubiert, wobei schließlich die Organismen im Wesentlichen durch die Charakteristika der Farbe der Kolonien, ihres Zentrums, des Halos, der Grenzen, und sofern erforderlich durch die Farbe des Mediums identifiziert oder differenziert werden.
  • Im industriellen Maßstab wird das Medium hergestellt ausgehend von der Mischung der entwässerten Bestandteile, die vorher gemahlen und gesiebt wurden. Das Mischen wird in Homogenisatoren für 0,5 bis 6 Stunden ausgeführt. Es wird eine Probe entnommen und der pH bestimmt. Der pH wird mit Natriumcarbonat auf 6,6 bis 7,4 eingestellt und es wird erneut von 0,5 bis 6 Stunden gemischt. Nachdem der pH wieder festgestellt wurde, wird das Medium physikochemischer und funktioneller Kontrolle unterzogen, und wird, wenn die Ergebnisse zufrieden stellend sind, in Kolben mit unterschiedlichen Volumen gefüllt.
  • Im Labor oder in Form eines sofort zu verwendenden Mediums wird wie folgt verfahren:
    Zuerst wird eine kleine Menge destilliertes oder deionisiertes Wasser in einen Erlenmeyer-Kolben gegossen, das von dem Gesamtvolumen von 1 Liter genommen wird, das notwendig ist für die Herstellung des Mediums. Diese Wassermenge wird mit 10 mL Propylenglycol gemischt. Danach werden die entwässerten Bestandteile gewogen und zugegeben, beginnend mit den Mitteln, die rascher Feuchtigkeit aufnehmen könnten, wie beispielsweise die Nährstoffbasen, in Mengen von 10 bis 30 g, insbesondere die Peptone von 2 bis 15 g/L, die Tryptone von 2 bis 15 g/L und die Hefeextrakte von 2 bis 8 g/L. Als nächstes werden die Bestandteile, die das Auftreten von Halos zur Verfügung stellen, in einer Menge von 8 bis 20 g/L zugegeben, insbesondere die Magermilch von 2 bis 20 g/L, die Stärken bis zu 4 g/L, die Aktivkohle bis zu 4 g/L und schließlich das Kieselgur von 2 bis 10 g/L.
  • Danach werden die meisten der Bestandteile zugegeben, die das Auftreten der Färbungen garantieren, wie beispielsweise das Neutralrot in Mengen bis zu 0,05 g/L oder das Phenolrot in Mengen bis zu 0,05 g/L; das Magentaglucuronid in Mengen von 0,005 bis 0,02 g/L; das X-Gal von 0,003 bis 0,005 g/L und das MUG bis zu 0,002 g/L.
  • Als nächstes werden die Inhibitoren der Gram-positiven Organismen zugegeben, bevorzugt das Natriumdesoxycholat in einer Menge von 0,1 bis 1 g/L.
  • Zuletzt wird das Agar mit einem Anteil von 0,5:1 bis 1,5:1 in Bezug auf die Summe der Mengen an Milch, Stärken, Aktivkohle und Kieselgur zugegeben.
  • Alle Bestandteile sollten schließlich in Mengen zwischen 30 und 50 g zugegeben sein.
  • Man lässt die Mischung einige Minuten lang ruhen und danach wird der Rest des Wassers bis zur Auffüllung auf 1 Liter zugegeben, die Komponenten werden gut geschüttelt und man lässt sie über einen Zeitraum von bis zu 15 Minuten ruhen, so dass das Agar quillt.
  • Dann wird die Mischung unter ständigem Schütteln bis zum Sieden erwärmt und bis das vollständige Schmelzen des Agars erreicht ist.
  • Man lässt die Mischung bis auf 45–50°C abkühlen, es wird das Propylenglycol in Mengen von 5 bis 15 mL zugegeben, das Medium wird konstant bewegt und es wird unter ständigem Schütteln in Petrischalen verteilt.
  • Die Schalen werden mit dem Testproben durch eines der etablierten Verfahren beimpft, bevorzugt durch das Plattenverfahren oder durch Ausstreichen.
  • Als nächstes werden einige Beispiele präsentiert.
  • Beispiel Nr. 1
  • 1000 g des gepulverten entwässerten Kulturmediums wurden mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
    g/1000 g Medium
    Rindermuskel-Pepton 118,5
    Caseintripton 118,5
    Hefeextrakt 94,8
    Magermilchpulver 237,0
  • Diese Komponenten wurden vorher gesiebt.
  • In der Zusammensetzung war das Natriumdesoxycholat als ein Inhibitor enthalten (23,7 g).
  • Es wurde eine Vormischung aus 47,4 g Kieselgur mit 1,2 g X-Gal und 0,7 g Neutralrot und 3,0 g Magentaglucuronid hergestellt. Danach wurden alle Bestandteile mit Agar als ein Geliermittel mit einer Menge von 355 g und Natriumcarbonat mit einer Menge von 1 g gemischt. Nachdem Einheitlichkeit der Zusammensetzung erzielt und der pH auf 7,0 eingestellt worden war, wurde dieses in fest verschlossene Kolben mit 21 g der Zusammensetzung gepackt.
  • Gleichzeitig wurden 5 mL Propylenglycol in Kolben gepackt.
  • Der Inhalt des Kolben mit der Zusammensetzung wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegossen, der eine Mischung aus deionisiertem Wasser und dem Inhalt des Propylenglycol-Kolbens enthielt; die Mischung wurde gerührt, man ließ sie für 10 Minuten quellen, und dann wurde sie 3 Minuten lang gekocht; bis auf eine Temperatur von 45°C abgekühlt und in Petrischalen verteilt. Nachdem die Zusammensetzung geliert war, wurde das Medium getestet, um seine Charakteristika und Leistungsfähigkeit zu bewerten.
  • Die physikochemischen und organoleptischen Auswertungen sind in Tabelle Nr. 1 gezeigt.
  • Tabelle Nr. 1 Physikochemische und organoleptische Auswertung
    Figure 00190001
  • Die Differenzierung der Kolonien und die Förderung des Wachstums im Vergleich mit Mehrzweck- und Differentialmedium wurden für den interessierenden Mikroorganismus mit zertifizierten Stämmen bewertet, diese waren:
    Rot-violettes Gallenagar: Hergestellt mit einer Konzentration von 38,5 g/L in Wasser und gemischt und erwärmt bis zum Kochen, auf 45–50°C abgekühlt und in Schalen verteilt. S. S. Agar: Hergestellt mit einer Konzentration von 60 g/L in deionisiertem Wasser, gemischt und bis zum Kochen erwärmt, abgekühlt bis auf 45–50°C und in Schalen verteilt.
  • Der Tabelle Nr. 2 können die Charakteristika des Wachstums von verschiedenen Mikroorganismen ebenso wie die Zählungen bei den Verdünnungen 10–5 und 10–6 entnommen werden.
  • Diese Ergebnisse waren zufrieden stellend sowohl bei dem Medium, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, als auch bei den Referenzmedien, sie zeigen keine Inhibierung von Spezies von Salmonella und Shigella. Das Wachstum von Shigella sonnei war bei dem Testmedium im Vergleich zu dem S. S Agar vorzüglich, dies zeigte sich auch durch die Zahl und die Größe der Kolonien. In Bezug auf die Differenzierung der verschiedenen Spezies wurden in allen Fällen charakteristische Antworten für jede Spezies erhalten.
  • Eine ähnliche Untersuchung wurde mit Spezies der coliformen Gruppe unter Verwenden des rot-violetten Gallenagarmediums ausgeführt, wie in Tabelle Nr. 3 gezeigt ist.
  • Tabelle Nr. 2 Differenzierung und Förderung des Wachstums bei dem erfindungsgemäßen Kulturmedium (Salmonella und Shigella)
    Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Tabelle Nr. 3 Differenzierung und Förderung des Wachstums (Coliforme Keime)
    Figure 00210002
  • Figure 00220001
  • Die Zählungen dieser zwei Mikroorganismen in dem Medium, das Objekt dieser Erfindung ist, und in dem als Referenz verwendeten Medium, waren die gleichen. Die Differenzierung der Mikroorganismen wurde in beiden Fällen durch ihre Farben und morphologische Charakteristika erzielt.
  • Es wurde eine Gruppe von Stämmen durch Ausstreichen beimpft bis isolierte Kolonien in der Oberfläche des Mediums erhalten wurden, was die Differenzierung von weiteren 5 Spezies gemäß Tabelle 4 ermöglichte.
  • Tabelle Nr. 4 Differenzierung von weiteren Gram-negativen Spezies in dem Medium
    Figure 00220002
  • Figure 00230001
  • Es wurde eine sehr gute Differenzierung aller Mikroorganismen in dem Medium beobachtet, wobei der Unterschied zwischen dem Stamm von E. coli O157:H7 und dem typischen E. coli auffiel, andere coliforme Keime, wie Klebsiella und Enterobacter, zeigten charakteristische Färbungen.
  • Beispiel Nr. 2
  • Die Formulierung wurde hergestellt, indem die Bestandteile getrennt voneinander in einer Menge zum Herstellen von 100 mL Medium in einen Erlenmeyer-Kolgen eingewogen wurden, die Bestandteile wurden in Konzentrationen gemäß Beispiel Nr. 1 verwendet mit Ausnahme des Kieselgurs, von dem eine Konzentration von 2 g/L verwendet wurde. Es wurden 100 mL deionisiertes Wasser zugegeben, das vorher mit 1 mL Propylenglycol vermischt worden war. Der pH-Wert wurde auf 6,94 eingestellt und die weitere Herstellung wurde wie im Beispiel Nr. 1 beschrieben ausgeführt.
  • Die getesteten Stämme von Mikroorganismen, die einen transparenten Halo in den Umgebungen der Kolonien erzeugen, wurden durch Ausstreichen beimpft, bis isolierte Kolonien erhalten wurden. Sie wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle Nr. 5 wiedergegeben.
  • Tabelle Nr. 5 Ergebnisse der Formulierung mit 2 g/L Kieselgur
    Figure 00230002
  • Figure 00240001
  • Es wurde eine gute Differenzierung der Mikroorganismen durch Farbe und Morphologie beobachtet, wobei der transparente Halo um die Kolonien sehr gut sichtbar war.
  • Beispiel Nr. 3
  • Das Medium wurde formuliert durch getrenntes Einwiegen der Bestandteile in einen Erlenmeyer-Kolben entsprechend den Konzentrationen von Beispiel 1, mit Ausnahme des Substrats Magentaglucuronid, von dem eine Konzentration von 1,5 μg/mL verwendet wurde, die weitere Herstellung wurde wie im Beispiel Nr. 2 ausgeführt und es wurde eine Antwort einer Gruppe von Enterobakterien in der Formulierung beobachtet, wie sie in der Tabelle Nr. 6 gezeigt ist.
  • Tabelle Nr. 6 Charakteristika des Wachstums von Enterobakterien in dem Medium.
    Figure 00240002
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • In diesem Beispiel kann die Funktionalität der Formulierung bei einer großen Gruppe zertifizierter Stämme der Enterobacteriaceae-Familie beobachtet werden. Die typischen Reaktionen des Mediums bei den beimpften interessierenden Spezies wurden mit Leichtigkeit beobachtet.
  • Beispiel Nr. 4
  • Das Medium wurde formuliert durch getrenntes Einwiegen der Bestandteile in einen Erlenmeyer-Kolben entsprechend den Konzentrationen von Beispiel 1, mit Ausnahme des Ersatzes des Substrats Magentaglucuronid gegen das fluorogene Substrat MUG, von dem eine Konzentration von 0,05 g/L verwendet wurde, die weitere Herstellung wurde wie im Beispiel Nr. 2 ausgeführt.
  • Eine Gruppe von Mikroorganismen wurde durch Ausstreichen beimpft, um isolierte Kolonien zu erhalten, wie in der Tabelle Nr. 7 gezeigt ist.
  • Tabelle Nr. 7 Bewertung der Formulierung mit MUG
    Figure 00260002
  • Figure 00270001
  • Beispiel Nr. 5
  • Das Medium wurde mit der folgenden Zusammensetzung formuliert:
    Bestandteil g/L
    Pepton 5
    Tripton 5
    Hefeextrakt 4
    X-Gal 0,05
    Magentaglucuronid 0,1
    Desoxycholate 1
    Unlösliche Stärke 4
    Phenolrot 0,018
    Agar 15
  • Die Bestandteile wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eingewogen, es wurde 1 L deionisiertes Wasser zugegeben, vermischt mit 10 mL Propylenglycol, der pH wurde auf 7.0 eingestellt, bis zum Kochen unter kontinuierlichem Rühren erwärmt und es wurde für 15 Minuten ohne Druck in einen Autoklaven gegeben. Man lies das Medium auf bis zu 45–50°C abkühlen und es wurde in Petrischalen verteilt.
  • Enterobakterien-Stämme wurden durch Ausstreichen beimpft, bis isolierte Kolonien erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle Nr. 8 gezeigt.
  • Tabelle Nr. 8 Bewertung der Formulierung mit Stärke und Phenolrot
    Figure 00280001

Claims (10)

  1. Kulturmedium zur Identifikation von Gram-negativen Mikroorganismen, das eine Mischung von Verbindungen enthält, die das Auftreten von Halos mit unterschiedlichen Farben und Größen bereitstellt, gebildet aus Kieselgur, Magermilch, Stärken und bakteriologischer (Aktiv)Kohle, und das auch eine Mischung aus Nährstoffbasen, Substanzen, die das Auftreten von unterschiedlichen Farben der Kolonien garantieren, Substanzen, die die Inhibierung der Gram-positiven Organismen garantieren, und Substanzen enthält, die eine feste Matrix für das Wachstum und die Entwicklung der Kolonien bereitstellen.
  2. Kulturmedium nach Anspruch 1, worin die Verbindungen, die das Auftreten von Halos mit unterschiedlichen Farben und Größen bereitstellen, in dem Medium in Mengen von 8 bis 20 g/L vorhanden sind, und worin insbesondere jede Komponente in den folgenden Mengen vorhanden ist: Kieselgur von 2 bis 10 g/L Magermilch von 2 bis 20 g/L Stärke bis zu 4 g/L bakteriologische (Aktiv)Kohle bis zu 4 g/L
  3. Kulturmedium nach Anspruch 1, worin die Mischung an Nährstoffbasen in Mengen von 10 bis 38 g/L vorhanden ist und zusammengesetzt ist aus: Peptone von 2 bis 15 g/L Triptone von 2 bis 15 g/L Hefeextrakt von 2 bis 8 g/L
  4. Kulturmedium nach Anspruch 1, worin die Substanzen, die das Auftreten von unterschiedlichen Farben der Kolonien garantieren, ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Propylenglykol, das in Mengen von 5 bis 15 mL/L verwendet wird; Neutralrot, das in Mengen bis zu 0,05 g/L verwendet wird; Phenolrot, das in Mengen bis zu 0,05 g/L verwendet wird; Magenta-Glucuronid, das in Mengen von 0,05 bis 0,25 g/L verwendet wird; X-gal, das in Mengen von 0,03 bis 0,1 g/L verwendet wird; und MUG, das in Mengen bis zu 0,07 g/L verwendet wird.
  5. Kulturmedium nach Anspruch 1, worin die Substanzen, die die Inhibierung der Gram-positiven Organismen garantieren, in Mengen von 0,1 bis 1 g/L vorhanden sind, wobei bevorzugt Natriumdesoxycholat verwendet wird.
  6. Kulturmedium nach Anspruch 1, worin die Substanzen, die eine feste Matrix für das Wachstum und die Entwicklung der Kolonien bereitstellen, die Kombination der Mischung der Verbindungen ist, die das Auftreten von Halos unterschiedlicher Farben und Größen bereitstellen, insbesondere Kieselgur, Magermilch, Stärken und bakteriologische (Aktiv)Kohle, mit Agar, in Verhältnissen von 0,75:1 bis 2:1.
  7. Verfahren zur Identifikation von Gram-negativen Mikroorganismen, das den Schritt des in Kontakt Bringens der Mikroorganismen mit dem Kulturmedium nach Anspruch 1 enthält, worin die Differentiation der interessierenden Organismen durch das Auftreten von wenigstens 10 charakteristischen Farben der regelmäßigen und unregelmäßigen Kolonien erfolgt, und durch Halos mit wenigstens 5 unterschiedlichen charakteristischen Farben und Größen.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Identifikation der unterschiedlichen Organismen wie folgt erfolgt: – E. coli durch das Auftreten von Kolonien mit intensiver violett-bläulicher Farbe und blauem Halo und einem Medium mit oranger Farbe und, in bestimmten Fällen, Fluoreszenz mit blauer Farbe; – E. coli O157:H7 durch das Auftreten von Kolonien mit violett-bläulicher oder grünlicher Farbe und einem Medium mit rosa Farbe; – Shigella sonnei durch das Auftreten von Kolonien mit violett-rötlicher Farbe, sehr unregelmäßigen Rändern und gelbem Halo; – Shigella flexneri durch das Auftreten von transluzenten Kolonien mit oranger bis gelber Farbe, Mucoiden und Medium mit oranger bis gelber Farbe; – Pseudomonas aeruginosa durch das Auftreten von Kolonien mit orange-rosa Farbe, transparentem Halo und grünlicher Fluoreszenz vor 24 Stunden und grünlicher Farbe nach 24 Stunden; – Klebsiella pneumoniae durch das Auftreten von Kolonien mit violett-rötlicher Farbe, gelegentlich Mucoiden mit rosa-beigem Halo; – Serratia odorifera und Serratia marcencens durch das Auftreten von Kolonien mit violett-grünlicher Farbe und sehr kleinem transparentem Halo; – Proteus mirabilis, Proteus vulgaris und Providence spp durch das Auftreten von kleinen farblosen Kolonien und Medium mit oranger Farbe; – Salmonella enteritidis durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und gleichmäßigen Rändern; – Salmonella cholerasuiss durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und unregelmäßigen Rändern; – Salmonella typhimurium durch das Auftreten von Kolonien mit roter Farbe und Halo mit variabler oranger Farbe; – Salmonella schotmuelleri durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe, transluzent, und Medium mit oranger bis gelber Farbe; – Salmonella typhi durch das Auftreten von Kolonien mit oranger Farbe und gelbem Medium; – Enterobacter aerogenes und E. cloacae durch das Auftreten von Kolonien mit hell-violetter oder violett-grünlicher Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe; – Citrobacter freundii durch das Auftreten von kleinen Kolonien mit dunkel-violetter Farbe und einem Zentrum mit intensiverer violetter Farbe; – Aeromonas hydrophila durch das Auftreten von Kolonien mit hell-grüner Farbe und einem breiten transparenten Halo.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Identifikation von unterschiedlichen Organismen wie folgt erfolgt, wenn Phenolrot verwendet wird: – E. coli durch das Auftreten von Kolonien mit blauer Farbe und Medium mit rosa Farbe, und im Fall einer Verwendung von MUG, Fluoreszenz mit blauer Farbe; – Shigella sonnei durch das Auftreten von Kolonien mit blauer Farbe, unregelmäßigen Rändern und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe; – Pseudomonas aeruginosa durch das Auftreten von Kolonien mit grünlich-beiger Farbe und Medium mit rosa Farbe; – Salmonella typhimurium durch das Auftreten von Kolonien mit beiger Farbe oder farblosen Kolonien und Medium mit Erdbeer-rosa Farbe.
  10. Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 9, worin das Kulturmedium hergestellt wird durch Mischen von 30 bis 50 Gramm des Mediums mit 1 Liter destilliertem oder deionisiertem Wasser, Rühren, Kochen bis zum vollständigen Schmelzen des Agars, Abkühlen auf 45–50°C, Zugeben von Propylenglykol in Mengen von 5 bis 15 mL, Rühren und Verteilen in gleichmäßig geschüttelte Schalen, dann werden die Proben der Mikroorganismen angeimpft und bei einer Temperatur von 30 bis 45°C für bis zu 18 Stunden inkubiert, und schließlich werden sie identifiziert oder differenziert durch die Charakteristika der Farbe der Kolonien, ihres Zentrums, Halo, Ränder, und, sofern es erforderlich ist, durch die Farbe des Mediums.
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