BR0113717B1 - Meio de cultivo e método para a identificação de microorganismos gram-negativos - Google Patents

Description

“MÈIO DE CULTIVO E MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS GRAM-NEGATIVOS”.

Setor Técnico A presente invenção relaciona-se com o campo do diagnóstico microbiológico e, mais e especificamente com a identificação ou a diferenciação de bactérias Gram-negativas. Técnica Anterior O diagnóstico microbiológico das bactérias Gram-negativas tem uma importância crucial para a saúde do Homem, dos animais e para a conservação do ambiente, já que muitas delas, como E. coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, provocam sérias doenças no Homem. Há mais de 100 anos, tem-se desenvolvido diferentes meios de cultivo para sua identificação e contagem. A partir da década de 90, começam a desenvolver-se novos meios de cultivo, que empregam substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos para identificar de maneira mais acertada alguns destes patógenos.

Desta forma, Ferguson em 1994 (Patente n° US 5,358,854), protegeu uma invenção consistindo de um meio de cultivo e reagentes cromogênicos para a identificação e diferenciação de E. coli e coliformes. A essência da invenção consistia em empregar um substrato para a enzima beta- galactosidase que produzia um precipitado insolúvel com uma primeira cor e um substrato beta glucuronidase que provocava o aparecimento de uma segunda cor. O meio permite apenas a diferenciação de coliformes em geral, mas não entre os mesmos.

Alain Rambach patenteou em 1993 (Patente n° US 5,194,374) um meio para o isolamento de Salmonella baseado na capacidade destes microorganismos de metabolizar os polióis e identificar sua degradação com ajuda de um indicador de pH e na presença de um substrato cromogênico beta galactosidase. O meio não permite a identificação de uma ampla variedade de gêneros e espécies de coliformes de grande interesse diagnóstico.

Nesse ano, F. Denis et col {Évaluation d'un nouveau milieu avec substrats chromogénes pour recherché de salmonellas dans les coprocultures: le milieu SMID., Reme française des laboratories, decembre 1994, n° 271, pp. 19-22) apresentaram a avaliação de um meio cromogênico para o isolamento e a pré-identificação de Salmonella. O meio compreendia 2 substratos cromogênicos, um que conferia uma cor azul às colônias baseado na atividade 0-galactosidase, e outro que conferia uma cor vermelha às colônias de Salmonella, baseado na degradação do glucuronato, que se combinava com um indicador de cor.

Com ajuda do meio pode-se identificar a Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B e Salmonella typhimurium, Proteus, Citrobacter, E. coli e Enterobacter. O meio contém inibidores potentes dos microorganismos como o cristal violeta e os sais biliares, e requer o emprego de um tampão de TRIS, o que toma o meio mais complexo e mais inibidor, inclusive para alguns organismos de interesse. Por outro lado, emprega-se politona, mistura complexa de hidrolisados de proteína. Por último, o meio não permite identificar organismos de grande interesse, como Pseudomonas, E. coli 0157:H7, entre outros.

Rambach em 1997 patenteou um meio de cultivo e o método para a detecção das cepas entero-hemorrágicas de E. coli (Pedido de Patente WO 97/39103). A invenção consiste de um meio de cultivo seletivo para a diferenciação de E. coli, em especial dos sorotipos 0157 e Ol 1, que emprega um substrato cromogênico para a enzima α-galactosidase. Com o propósito de aumentar a capacidade diferencial do método, empregou outros substratos cromogênicos, para /3-glocosidase que é hidrolisado por um grande número de bactérias coliformes e para β-glucuronidase que é hidrolisado por E. coli de sorogrupos diferentes de 0157 e 011. Este meio de cultivo não possibilita a diferenciação de outras bactérias Gram-negativas e, Wallace e Jones reportaram que algumas cepas de E. coli e Citrobacter podem dar resultados falsos-positivos (Wallace and Jones, J. Appl BacterioL, 1996, 81: 663-668).

Rambach, anos depois, em 1998, patenteou novamente um meio de cultivo para a detecção de E. coli (Patente n° US 5,846,761), baseado no emprego de um substrato cromogênico derivado do ácido indolil- glucurônico e seus sais. Este meio específico não permite a identificação de cepas de E. coli 057:H7 nem de outros coliformes.

Em 1995 Monget e colaboradores (Patente n° US 4,277,561) patentearam um método de análise bacteriológica e um meio para a detecção de Salmonella. O método baseia-se na capacidade das Salmonella de fermentar o ácido glucurônico ou seus sais e não produzir a enzima β- galactosidase. O meio continha adicionalmente um composto fluorogênico ou cromogênico para a enzima β-galactosidase, ácido glucurônico ou um de seus sais, e indicador de pH.

Este meio de cultivo também contém inibidores dos gêneros e espécies diferentes de Salmonella, tais como verde brilhante e desoxicolato de sódio, o que pode inibir outros organismos Gram-negativos. O meio de cultivo precisa da adição do glucuronato de sódio como suplemento após a esterilização. De acordo com Denis e colaboradores, a especificidade deste meio é menor que 94 % (93,3 %) (Denis, et al, Revue francaise des laboratoires, décembre 1994, n° 271).

Tuompo e colaboradores, em 1998, patentearam, por sua parte, um método e um meio de cultivo para a identificação de Salmonella, baseado na utilização de melibiosa, manitol e sorbitol e de substratos beta- glucuronidases (Patente n° US 5,786,167). O restante dos coliformes era identificado por sua cor carmelita*, azul ou verde, dependendo do substrato cromogênico empregado. Com este método, os autores não conseguiam diferenciar adequadamente os coliformes de maior interesse entre si.

Miller e colaboradores, em 1999 (Patente n° US 5,871,944 de 1999), patentearam um meio para diferenciar Salmonella usando lactose e celobiose para suprimir a ocorrência de precipitados negros no meio, o que permite detectar a presença ou ausência de Salmonella. O meio requer o emprego de um tamponador de TRIS, peptonas e extrato de carne, X-gal e outros ingredientes.

Esse meio somente é apropriado para algumas bactérias Gram negativas, como Salmonella e Shigella, sendo que estas últimas só se diferenciam como tal, e não entre si. Butchner patenteou em 1996 um meio e um método para o isolamento e a identificação presuntiva de várias bactérias, em particular, aquelas que causam sepses urinárias ou infecções urinárias. (Patente n° US 5,541,082). O método baseia seu princípio em distinguir as mesmas com base na morfologia colonial e na cor. O meio contém um material protéico opaco, dois ou mai? substratos cromogênicos arilsulfatases, galactosidases, glucuronidaseb. triptofano oxidases e tiramino oxidases, além disso não prova ser específico para as bactérias Gram negativas que são indicadoras da qualidade dos alimentos e águas.

Por outro lado, com seu emprego, organismos de grande importância clínica e sanitária não podem ser devidamente identificados, entre eles, E. coli 0157:H7, Serratia, Citrobacter, Aeromonas, entre outros. Além disso, necessita-se de provas de "spot" adicionais para confirmar alguns dos microorganismos, e sempre como diagnóstico presuntivo.

Quesada Muniz e Rodriguez Martínez obtiveram proteção (Certificado de Autor de Invenção n° 20000083) para uma formulação que inclui uma mistura de hidrolisados de proteínas, proteínas, alcoóis e outros elementos que permite, além de identificar os organismos de interesse, como E. coli e Salmonella, a identificação de Pseudomonas aeruginosa em menos de 24 h. Contudo, este meio é incapaz de possibilitar a identificação de outros organismos Gram-negativos de interesse que crescem como colônias incolores.

Roth e colaboradores, em 1993, protegeram um método e um meio cromogênico para a identificação e diferenciação de coliformes totais e E. coli.. (Patente n° US 5, 393,662). O meio se constitui de substratos com os grupos cromofóricos diferentes. Este meio não possibilitava a identificação e contagem de E. coli 015TH7, Salmonella e outras enterobactérias não coliformes. Shigella sonnei provoca resultados falsos positivos já que no mesmo crescem as colônias com as mesmas características de cor que E. coli.

Em 1997, ΚΑΙ A. Hengstler et col. (ΚΑΙ A. Hengstler, Rainer Hammann and Anne Marie Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Médium for Detection and Presumptive Identification of Urinary Tract Pathogens. Journal of Clinicai Microbiology, nov., 1997, p. 2773-2777) avaliaram o meio CHROMagar Orientation, para a detecção e identificação presuntiva de patógenos em amostras de urina. O meio permitiu a detecção de várias espécies de microorganismos de interesse através da coloração das colônias, entre estas, de rosado a vermelho (E. coli), Azul violeta {Klebsiella spp), Azul-vermelho (Enterobacter spp.), Rosa (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), Azul {Serratia spp.), Azul-violeta {Citrobacter freundii e koserí), Incolores a bege com meio carmelita* (Morganella morganii, Proteus mirabilis e vulgaris), Azul com meio carmelita {Proteus vulgaris), incolores em meio carmelita* {Enterococcus spp.), Azul brilhante {Streptococcus agalactiae), Azul verdes {Enterococcus spp.) e Rosa claro {Staphylococcus saprophyticus).

Como se pode apreciar considerando o estado da arte conhecida, um mesmo microorganismo não pode ser identificado corretamente, já que não responde a um único padrão de cor, com o que se pode afirmar que a identificação não pode ser realizada apenas pelos atributos da colônia ou do meio, e portanto tomam-se necessárias outras provas, como é o caso de Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp.

Em outro aspecto, os meios não possibilitam uma identificação correta, já que diferentes espécies apresentavam a mesma coloração, como é o caso de Enterobacter spp., Citrobacíer freundii e Proteus Mirabilis, que aparecem, todos, de coloração rosa.

Em março de 1998, Roth e colaboradores, patentearam uma invenção (Patente n° US 5,726,031) em que se reporta um meio de ensaio e um método quantitativo para a identificação e diferenciação de material biológico em uma amostra a experimentar. Este meio emprega um substrato cromogênico específico para um dos materiais biológicos que confere uma coloração a este material, um segundo substrato cromogênico que é específico para um segundo tipo de material biológico e possibilita obter uma segunda coloração diferente da primeira para colônias de outra espécie, e um terceiro material biológico a experimentar que degrada um dos dois substratos. Tanto o primeiro, como o segundo material biológico degradam um açúcar, e o terceiro material biológico não degrada este açúcar.

No meio inclui-se um indicador de pH que permite a troca de cor do meio ao hidrolisar-se o açúcar em tomo da colônia, que assume as cores proporcionadas pelos substratos cromogênicos. Os componentes principais são: a 6-cloro-3-indolil galactosidase, 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronidase, sorbitol e fenol vermelho. Além disso, incluem-se os sais biliares, lauril sulfato de sódio, desoxicolato de sódio, éter de poliglicol e antibióticos derivados da acriflavina.

Prevê-se na composição o uso de um indutor das reações enzimáticas (isopropil-beta.-D-tiogalactopiranosídeo), agares, pectinas, carrageninas, alginatos, xantina e peptonas. Esta solução técnica pode ser considerada como o análogo mais próximo da presente invenção.

Os inconvenientes da referida solução técnica podem ser agrupados como a seguir: - A Salmonella typhi não pode ser diferenciada das Salmonella no typhi, e sua identificação confirmatória é difícil e, para algumas cepas, impossível, devido ao fato de que, no meio, esta pode ocorrer como colônias brancas, tal e como sucede com outras bactérias Gram-negativas, tais como Proteus. - Nos casos em que crescem várias espécies numa mesma placa, é muito difícil identificar as zonas amarelas características da maioria das Salmonellas, já que esta é produzida devido à acidificação do meio e pode haver superposição das reações no meio. - Para a identificação e contagem de outros Gram-negativos não coliformes, tais como Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, entre outros, necessita-se do uso de outros ensaios. - Como para os meios convencionais, necessita-se de ^ mínimo 24 a 48 horas para identificar os organismos de interesse. - Os componentes que devem promover o crescimento aos organismos de interesse no meio, não são suficientes para permitir o desenvolvimento precoce (antes de 24 h) das reações de identificação, pelo fato de que se necessita do uso de um indutor para a enzima /3-galactosidase (IPTG). - O dodecilsulfato de sódio, a acriflavina e os antibióticos no meio tomam-no de preparação mais complexa e de maior custo.

Sua estabilidade é restrita pela presença de antibióticos que se adiciona como suplementos. - O método é realizado incubando-se a amostra a 40°C, e não à temperatura recomendada para a maioria dos organismos e pelas instituições que regulam os ensaios microbiológicos (44°C), o que pode trazer problemas de procedimentos não estandarizados e confusões aos laboratoristas.

Divulgação da invenção O objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um novo meio de cultivo para a identificação e/ou diferenciação de microorganismos Gram-negativos de interesse no diagnóstico microbiológico na clínica e na veterinária, no controle da qualidade de alimentos e na monitoração da contaminação do ambiente, e um método para seu emprego. A novidade da invenção consiste em proporcionar ao laboratório um meio de cultivo capaz de diferenciar uma quantidade considerável de organismos Gram-negativos de interesse para o diagnóstico em uma única placa (determinação), com base nas diferenças em pelo menos 10 cores das colônias de diferentes tamanhos, e de pelo menos 5 tipos de halos diferentes devidos a suas cores e tamanhos.

Pela primeira vez, o meio permite avaliar simultaneamente a E.coli, E. coli 0157:H7, as Salmonella typhi e no typhi, e inclusive entre estas, as Klebsiellas, as Shigellas e entre estas; Serratia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Citrobacter e Aeromonas.

Alguns microorganismos ocorrem com colorações próprias deste meio, tais como Salmonella typhi e schotmueleri, que ocorrem com coloração laranja, Aeromonas hydrophila de cor verde claro, Pseudomona aeruginosa laranja-rosado, Shigella sonnei de cor violeta avermelhado e a flexneri translúcidas de laranja a amarelo, Serratia odorifera de cor violeta esverdeado. Por último, Proteus e Providencia, ocorrem como incolores.

Os halos característicos de determinados microorganismos mostraram ser características inesperadas, como é o caso de Pseudomonas aeruginosa com halo grande transparente, Shigella sonnei com halo amarelo, Klebsiella pneumoniae com halo bege rosado, Serratia com halo transparente e pequeno e Aeromonas hidrophila com um halo transparente e Salmonella typhimurium com halo laranja.

Também se mostraram inesperadas algumas respostas dos microorganismos a detectar, ao se empregar o vermelho fenol como indicador, especificamente, as colônias de Shigella sonnei de cor azul, bordas irregulares e meio de cor rosada framboesa, Pseudomonas aeruginosa-colônias de cor bege esverdeado e meio de cor rosada e Salmonella typhimurium-coXònms de cor bege ou incolores e meio de cor rosada framboesa.

Por outro lado, proporciona-se novas combinações de elementos que permitem obter halos bem diferenciados, não descritos previamente para os organismos anteriormente expostos. Entre estes elementos encontra-se terra silícica, leite desnatado, amidos e carvão ativado, que, nas proporções estabelecidas são adicionados ao meio.

As substâncias que, juntamente com os ingredientes descritos no parágrafo anterior, e misturadas entre si, garantem a ocorrência de diferentes colorações nas colônias e os halos, selecionadas entre o propilenoglicol (de 5 a 15 ml/1), vermelho neutro (até 0,05 g/1), vermelho fenol (até 0,05 g/1), magenta glucuronidase (de 0,05 a 0,25 g/1), X-gal (de 0,03 a 0,1 g/1) e MUG (até 0,07 g/L), formam parte da novidade, pois nestas combinações e proporções garantem a ocorrência de colorações nas colônias e halos não descritos previamente.

As quantidades em que se encontram as três bases nutrn que o meio emprega com respeito aos inibidores do crescimento dos organismos Gram-negativos, oferecem uma nova combinação capaz de promover o crescimento de organismos competitivos.

As vantagens do meio e do método propostos, descritos na presente invenção, serão detalhadas a seguir: - O meio permite não só a diferenciação dos coliformes em geral, mas especificamente entre a maioria dos mesmos, os de maior importância diagnostica no caso da clínica e dos alimentos. r - E possível identificar simultaneamente uma grande variedade antes não descrita de gêneros e espécies diferentes em uma única placa, com a conseqüente economia de recursos de laboratório, redução do tempo de preparação de materiais e economia de pessoal. - O meio não se esteriliza e sua preparação é simples. - O método permite que, durante seu emprego, se incube os meios numa ampla faixa de temperatura, inclusive superior aos 40 °C, já que a duração desta etapa é de apenas 18 horas e o meio não sofre deterioração. - O alto conteúdo de sólidos no meio, a natureza de seus componentes, e seu pH, garantem a conservação do mesmo por períodos de tempo suficientes como para manter uma reserva no laboratório, prontos para emprego. - Até o momento, não se reportou reações de falsos positivos ou falsos negativos dos microorganismos ensaiados, respondendo todos aos padrões de identificação que o meio propõe, ou seja, as cores das colônias, centros, halos e bordas são característicos e não variam. - Não se emprega substâncias que podem provocar sua rápida deterioração, tanto por sua capacidade de oxidação, e, ao contrário, contém substâncias que ajudam a conservar sua viabilidade, e inclusive protegem as células de danos por agentes químicos, como é o caso do carvão, do leite, amido e terra silícica. - Com o método consegue-se a diferenciação, não apenas de Salmonella typhi de no typhi, mas de algumas delas entre si. - Ao se identificar os organismos fundamentalmente na zona de crescimento, ou seja pela cor da colônia e seu centro, de seu halo e sua morfologia, depende-se menos significativamente das reações de alteração de cor no meio, que podem confundir-se ou superpor-se, ao se expor a amostras contaminadas a uma ampla gama de organismos de diferentes espécies e gêneros, como é o caso das fortemente contaminadas ou putrefatas. - Não são necessários ensaios adicionais para identificar organismos de interesse sanitário, tais como Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella. - As bases nutritivas empregadas nas quantidades propostas, juntamente com a presença de protetores e considerando a concentração dos inibidores, possibilitam um rápido crescimento e recuperação, antes de 24 horas, de todos os organismos de interesse.

Divulgação detalhada da invenção A presente invenção proporciona um meio de cultivo para a identificação de microorganismos Gram-negativos, que compreende uma mistura de componentes que proporcionam a ocorrência de halos de diferentes cores e tamanhos, sendo que a referida mistura constitui-se de terra silícica, leite desnatado, amidos e carvão bacteriológico. O meio da invenção compreende adicionalmente uma mistura [de] bases nutritivas, substâncias que garantem a ocorrência de diferentes colorações nas colônias, substâncias que garantem a inibição dos organismos Gram-positivos e substâncias que proporcionam a matriz sólida necessária para o crescimento e desenvolvimento das colônias.

Dentro do meio de cultivo da invenção, os componentes que proporcionam a ocorrência de halos de diferentes cores e tamanhos encontram- se no mesmo em quantidades entre 8 a 20 g/1, particularmente cada um deles se encontram as seguintes quantidades: terra silícica de 2 a 10 g/1 leite desnatado de 2 a 20 g/1 amidos até 4 g/1 carvão bacteriológico até 4 g/1 Assim mesmo, a mistura de bases nutritivas é empregada em quantidades entre 10 e 38 g/1 e constitui-se de: Peptonas de 2 a 15 g/1 Triptonas de 2 a 15 g/1 Extrato de levedura de 2 a 8 g/1 O meio de cultivo da invenção possui adicionalmente substâncias que garantem a ocorrência de diferentes colorações nas colônias, as quais são selecionadas do grapo que consiste de propilenoglicol, que é empregado em quantidades entre 5 e 15 ml/1; vermelho neutro, que é empregado em quantidades até 0,05 g/1; vermelho fenol, que é empregado em quantidades até 0,05 g/1; magenta glucuronida, que é empregado em quantidades entre 0,05 e 0,25 g/1; X-gal, que é empregado em quantidades entre 0,03 e 0,1 g/1 e MUG, que é empregado em quantidades até 0,07 g/1.

Da mesma forma, as substâncias que garantem a inibição dos organismos Gram-positivos que o referido meio contém, encontram-se em quantidades entre 0,1 e 1 g/1, utilizando-se preferivelmente o desoxicolato de sódio. O meio de cultivo da invenção possui adicionalmente substâncias que proporcionam a matriz sólida para o crescimento e desenvolvimento das colônias, as quais são constituídas por combinação dos componentes que proporcionam a ocorrência de halos de diferentes cores e tamanhos, particularmente terra silícica, leite desnatado, amidos e carvão bacteriológico com agar, em proporções que vão de 0,75:1 até 2:1. A invenção também se refere a um método para a identificação de microorganismos Gram-negativos, o qual se baseia na diferenciação dos organismos de interesse através da ocorrência de pelo menos 10 cores características das colônias regulares e irregulares, e de halos de pelo menos 5 diferentes colorações características e tamanhos.

No referido método, a identificação dos diferentes organismos se realiza como a seguir: - E. coli com a ocorrência de colônias de cor violeta azulado intenso e halo azul e meio de cor laranja, e em determinados casos, fluorescência de cor azul; - E. coli 0157:H7 com ocorrência de colônias de cor violeta azulado ou esverdeado e meio de cor rosada; - Shigella sonnei com a ocorrência de colônias de cor violeta avermelhado, bordas muito irregulares e halo amarelo; - Shigella flexneri com a ocorrência de colônias translúcidas de cor de laranja a amarelo, mucóides e meio de cor laranja a amarelo; - Pseudomonas aeruginosa com a ocorrência de colônias de cor laranja-rosado, halo transparente e fluorescência esverdeada antes de 24 horas e cor esverdeada após 24 horas; - Klebsiella pneumoniae com a ocorrência de colônias de cor violeta avermelhado, mucóides com halo ocasionalmente bege rosado; - Serratia odorífera e Serratia marcencens com a ocorrência de colônias de cor violeta esverdeado e halo muito pequeno transparente; - Proteus mirabilis, Proíeus vulgaris, Providencia spp. com a ocorrência de colônias pequenas, incolores e cor do meio laranja; - Salmonella enteritidis com a ocorrência de colônias de cor vermelha e bordas regulares; - Salmonella cholerasuiss com a ocorrência de colônias de cor vermelha e bordas irregulares; - Salmonella typhimurium com a ocorrência de colônias de cor vermelha e halo de cor laranja variável; - Salmonella schotmuelleri com a ocorrência de colônias de cor laranja, translúcidas e meio de cor laranja a amarelo; - Salmonella Typha com a ocorrência de colônias de cor laranja e meio de cor amarelo; - Enterobacter aerogenes e cloacae com a ocorrência de colônias de cor violeta clara ou violeta esverdeada e centro de cor violeta mais intenso; - Citrobacter freundü com a ocorrência de colônias de cor violeta escura e centro de cor violeta mais intensa, colônias pequenas; - Aeromonas hydrophila com a ocorrência de colônias de cor verde claro e halo transparente e amplo.

No método da invenção, a identificação dos diferentes organismos ao se empregar vermelho fenol, é realizada como a seguir: - E. coli com a ocorrência de colônias de cor azul e meio de cor rosada e, no caso de se empregar MUG, fluorescência de cor azul; - Shigella sonnei-coXÒTÀzs de cor azul, bordas irregulares e meio de cor rosada framboesa; - Pseudomonas aemginosa-colômas de cor bege esverdeado e meio de cor rosada; - Salmonella typhimurium-colônias de cor bege ou incolores e meio de cor rosada framboesa. O meio de cultivo é preparado misturando-se de 30 a 50 gramas da mistura dos componentes com 1 litro de água destilada ou deionizada, agitando-se e fervendo-se até dissolução completa do agar, resfriando-se posteriormente a 45-50°C e adicionando-se o propilenoglicol em quantidades entre 5 e 15 ml, agitando-se e distribuindo-se em placas mediante agitação constante, semeando-se os microorganismos ou amostra de interesse e incubando-se a temperatura entre 30 a 45 °C durante um período de até 18 horas, e identificando-se os microorganismos de acordo com as características de cor das colônias, de seu centro, halo, bordas e, caso seja requerido, com a cor do meio de cultivo.

Em escala industrial ou meio é preparado a partir da mistura dos ingredientes desidratados, previamente moídos e peneirados. A mistura é realizada em homogeneizadores durante um período de 0,5 a 6 horas. Toma- se uma amostra e comprova-se o pH.. O pH é ajustado em de 6,6 a 7,4 com carbonato de sódio, mistura-se novamente durante um período de 0,5 a 6 horas. Uma vez comprovado novamente o pH, o meio é submetido a controle físico-químico e funcional, e obtendo-se resultados satisfatórios, envasa-se em frascos de volumes diferentes., No laboratório, ou em forma de meio pronto para o uso, procede-se da seguinte maneira: Em um matraz de Erlenmeyer despeja-se primeiramente um pequeno volume de água destilada ou deionizada, tomada do volume total de 1 litro, necessário para a preparação do meio e mistura-se com 10 ml de propilenoglicol. Seguidamente, pesa-se e adiciona-se os ingredientes desidratados, começando-se pelos agentes que se hidratam mais depressa, tais como as bases nutritivas em quantidades de 10 a 30 g, especificamente, as peptonas de 2 a 15 g/1, as triptonas de2al5g/leo extrato de levedura de 2 a 8 g/1. Prosseguindo, adiciona-se os ingredientes que proporcionam a ocorrência de halos em quantidade de 8 a 20 g/1, especificamente o leite desnatado, de 2 a 20 g/1, os amidos até 4 g/1, o carvão ativado de até 4 g/1 e, finalmente, a terra silícica de 2 a 10 g/1.

Posteriormente adiciona-se a maior parte dos ingredientes qir garantem a ocorrência das colorações, tais como o vermelho neutro t*. quantidades de até 0,05 g/1 ou o vermelho fenol em quantidades de até 0,05 g/1; o magenta glucuronidase em quantidades de 0,005 a 0,02 g/1; o X-gal de 0,003 a 0,005 g/1 e o MUG de até 0,002 g/1.

Em seguida adiciona-se as substâncias inibidoras dos organismos Gram-positivos, preferivelmente o desoxicolato de sódio em quantidade de 0,1 a 1 g/1.

Por último, adiciona-se o agar numa proporção de 0,5:1 a 1,5:1 com respeito à soma das quantidades de leite, amidos, carvão e terra silícica.

Todos os ingredientes devem somar finalmente entre 30 e 50 g. A mistura é deixada em repouso durante vários minutos e, ulteriormente, adiciona-se o resto da água até completar 1 litro, agitando-se bem os componentes e deixando-se repousar durante um intervalo de até 15 min. para que o agar inche.

Começa-se a elevar a temperatura, sempre agitando a mistura até a fervura e até obter a fusão completa do agar.

Resfria-se a mistura até 45-50 °C, adiciona-se o propilenoglicol em quantidades de 5 a 15 ml, continua-se agitando de forma constante e distribui-se em placas, sempre agitando.

As placas são inoculadas com as amostras de ensaio, por meio de qualquer dos métodos estabelecidos, preferivelmente por inundação de superfície ou estriado.

Em seguida, apresenta-se alguns exemplos de execução.

Exemplo n° 1 Preparou-se 1000 g do meio de cultivo desidratado em pó com a seguinte composição: g/1000 g de meio Peptona de músculo de bovino 118,5 Triptona de caseína 118,5 Extrato de levedura 94,8 Leite desnatado em pó 237,0 Os referidos componentes foram previamente peneirados.

Na composição incluiu-se o desoxicolato de sódio com qualidade de inibidor (23,7 g).

Preparou-se uma pré-mistura de 47,4 g de terra silícica, com 1,2 g de X-gal e 0,7 g de vermelho neutro e 3,0 g de magenta glucuronida.

Ulteriormente misturou-se todos os ingredientes com agar como agente gelificante em quantidade de 355 g e carbonato de sódio em quantidade de 1 g.

Uma vez conseguida a uniformidade da composição e ajustado o pH em 7,0, a mesma foi envasada em frascos hermeticamente fechados com 21 g da composição.

Paralelamente, o propilenoglicol foi envasado em frascos de 5 ml. O conteúdo de cada frasco da composição foi despejado num matraz de Erlenmeyer que continha uma mistura de água deionizada, e o conteúdo do frasco de propilenoglicol foi agitado deixando-se encharcar durante 10 minutos, ferver durante 3 minutos, resfriando até a temperatura de 45°C, e distribuiu-se isto em placas de Petri. Uma vez gelificada a composição, procedeu-se à avaliação de suas características e desempenho. A avaliação físico-química e organoléptica é mostrada na tabela n°l.

Tabela n° 1 - Avaliação físico-química e organoléptica Avaliou-se com cepas certificadas a diferenciação das colônias e a promoção do crescimento em comparação com meios gerais e diferenciais para o microorganismo em questão, que foram: Agar Violeta Vermelho Bílis: Preparado a uma concentração de 38,5 g/1 de água deionizada, foi agitado e aquecido com agitação até a ebulição, resfriando-se até 45-50°C e distribuiu-se em placas.

Agar S.S.: Preparado a uma concentração de 60 g/1 em água deionizada, foi agitado e aquecido com agitação até a ebulição, resfriando-se até 45-50°C e distribuiu-se em placas.

Na tabela n° 2 é possível observar as características do crescimento de diferentes microorganismos, bem como as contagens nas diluições de 10"5 e ΚΓ4.

Estes resultados são satisfatórios, tanto no meio objeto da presente invenção como nos controles utilizados, não existindo qualquer inibição de espécies de Salmonella e Sigella. Demonstrou-se a superioridade quanto ao crescimento de Shigella sonnei, relativamente ao Agar S.S., o que foi evidenciado pelo número e o tamanho das colônias. No que se refere à diferenciação das diferentes espécies obteve-se em todos os casos respostas características de cada espécie.

Realizou-se um ensaio semelhante com espécies do grupo coliformes, utilizando-se como controle o meio Agar Violeta Vermelho Bílis, como se mostra na tabela n° 3.

Tabela No. 2 - Diferenciação e promoção do crescimento do meio de cultivo desenvolvido de acordo com a invenção (Salmonella e Shigella) INC: Incontáveis NC: Nenhum crescimento UFC/ml: Unidades formadoras de colônias por cada ml de diluição IO"6.

Tabela n° 3 - Diferenciação e promoção do crescimento (Coliformes) INC: Incontáveis; NC: Nenhum crescimento; UFC/ml: Unidades formadoras de colônias por cada ml de diluição 10'6 Realizou-se igualmente as contagens destes dois microorganismos no meio objeto da invenção e no meio de controle utilizado.

Obteve-se a diferenciação dos microorganismos segundo suas cores e morfologia característica em ambos os casos. Inoculou-se um grupo de cepas por meio de estrias até se obter colônias isoladas na superfície do meio, o que permitiu a diferenciação de outras 5 espécies de acordo com a tabela n° 4.

Tabela n° 4 - Diferenciação de outras espécies Gram-negativas no meio Observou-se uma magnífica diferenciação de todos os microorganismos no meio, destacando-se a diferença entre a cepa de E. coi 0157.H7 ea£ coli típica, outros coliformes como Klebsiella e Enterobacter, mostraram colorações características.

Exemplo n° 2 Preparou-se a formulação pesando-se os ingredientes em separado em um matraz de Erlenmeyer em quantidades para preparar 100 ml de meio, os ingredientes foram utilizados em concentrações de acordo com o exemplo n° 1 com exceção da terra silícica, da qual se utilizou uma concentração de 2 g/1. Adicionou-se 100 ml de água deionizada previamente misturada com 1 ml de propilenoglicol. Ajustou-se o valor do pH em 6,94 e a preparação posterior foi realizada de acordo com o que se descreve no exemplo n° 1. A inoculação foi realizada por meio de estrias até se obter colônias isoladas, cepas de microorganismos que produzem um halo translúcido nas cercanias das colônias. Incubou-se durante 24 h a 37°C. Os resultados podem ser observados na tabela n° 5.

Tabela n° 5 - Resultados da formulação com 2 g/1 de terra silícica Observou-se uma boa diferenciação dos microorganismos de acordo com cor e morfologia, sendo bem visível o halo translúcido em tomo das colônias.

Exemplo n° 3 Formulou-se o meio pesando os ingredientes de maneira separada em um matraz de Erlenmeyer, de acordo com as concentrações descritas no exemplo 1, com exceção do substrato Margenta Glucurinida, do qual se utilizou uma concentração de 1,5 pg/ml, a preparação posterior foi realizada de acordo com o exemplo n° 2 e observou-se o comportamento de um grupo de enterobactérias na formulação segundo se mostra na tabela n° 6.

Tabela n° 6 - Características do crescimento de enterobactérias no meio.

Neste exemplo pode-se observar a funcionalidade da formulação com um amplo grupo de cepas certificadas da família Enterobacteriaceae. Observou-se com facilidade as reações típicas do meio para as espécies de interesse inoculadas.

Exemplo n° 4 Formulou-se o meio pesando os ingredientes em separado em um matraz de Erlenmeyer, de acordo com as concentrações descritas no exemplo 1, com exceção da substituição do substrato Margenta Glucuronida pelo substrato fluorogênico MUG, do qual se utilizou uma concentração de 0,05 g/1, a preparação posterior foi realizada de acordo com o exemplo n° 2.

Inoculou-se por meio de estrias até se obter colônias isoladas [lacuna] um grupo de microorganismos segundo se observa na tabela n° 7.

Tabela n° 7 - Avaliação da formulação com MUG

Exemplo No. 5 O meio foi formulado com a seguinte composição: Ingrediente g/1 Peptona 5 Triptona 5 Extrato de levedura 4 x-gal 0,05 Magenta-glucuronida 0,1 Desoxicolato 1 Amido insolúvel 4 Vermelho fenol 0,018 Os ingredientes foram pesados em um Erlenmeyer, adicionou-se 1 1 de água deionizada, misturada com 10 ml de propilenoglicol, ajustou-se o pH em 7,0, aqueceu-se com agitação até à fervura e colocou-se 15 minutos em um autoclave sem pressão. Deixou-se resinar até 45-50°C e distribuiu-se em placas de Petri.

Inoculou-se cepas de enterobactérias por meio de estriados até se obter colônias isoladas. Os resultados foram observados na tabela n° 8.

Claims (5)

1. Meio de cultivo para a identificação de microorganismos Gram-negativos, caracterizado pelo fato de que compreende: - uma mistura de componentes que proporcionam a ocorrência de halos de diferentes cores e tamanhos constituída de terra silícica, leite desnatado, amidos e carvão bacteriológico, que estão no meio em quantidades de 8 a 20 g/L, e particularmente cada componente nas seguintes quantidades: terra silícica de 2 a 10 g/L, leite desnatado de 2 a 20 g/L, amido até 4 g/L, carvão bacteriológico até 4 g/L; e - compreende adicionalmente uma mistura bases nutritivas, em quantidades de 10 a 38 g/L, e é composta por: peptonas de 2 a 15 g/L, triptonas de 2 a 15 g/L, extrato de levedura de 2 a 8 g/L; -substâncias que garantem a ocorrência de diferentes colorações nas colônias, selecionadas do grupo que consiste em propilenoglicol que é utilizado em quantidades de 5 a 15 mL/L; vermelho neutro que é utilizado em quantidades até 0,05 g/L; vermelho de fenol, que é utilizado em quantidades até 0,05 g/L; magenta glucuronida, que é utilizada em quantidades de 0,05 a 0,25 g/L; X-gal, que utilizado em quantidades de 0,03 a 0,1 g/L e MUG que é utilizado em quantidades até 0,07 g/L; - substâncias que garantem a inibição dos organismos Gram- positivos em quantidades de 0,1 a 1 g/L, preferencialmente, sendo utilizado o desoxicolato; - substâncias que proporcionam a matriz sólida necessária para o crescimento e desenvolvimento das colônias, que é uma combinação da mistura de compostos que proporciona a ocorrência de halos de diferentes cores e tamanhos, particularmente, terra silícica, leite desnatado, amidos e carvão bacteriológico com agar, em proporções de 0,75:1 a 2:1.

2. Método para a identificação de microorganismos Gram- negativos, que crescem no meio de cultura como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato da diferenciação dos organismos de interesse ser através da ocorrência de pelo menos 10 cores características das colônias regulares e irregulares, e de halos de pelo menos 5 diferentes colorações características e tamanhos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a identificação dos diferentes organismos é realizada como a seguir: - E. coli com a ocorrência de colônias de cor violeta azulada intenso e halo azul e meio de cor laranja, e em determinados casos, fluorescência de cor azul; - E. coli 0157:H7 com a ocorrência de colônias de cor violeta azulada ou esverdeada e meio de cor rosada; - Shigella sonnei com a ocorrência de colônias de cor violeta avermelhada, bordas muito irregulares e halo amarelo; - Shigella flexneri com a ocorrência de colônias translúcidas de cor de laranja a amarelo, mucóides e meio de cor laranja a amarelo; - Pseudomonas aeruginosa com a ocorrência de colônias de cor laranja-rosada, halo transparente e fluorescência esverdeada antes de 24 horas e cor esverdeada após 24 horas; - Klebsiella pneumoniae com a ocorrência de colônias de cor violeta avermelhada, mucóides com halo bege rosado ocasionalmente; - Serratia odorífera e Serrada marcencens com a ocorrência de colônias de cor violeta esverdeada e halo muito pequeno transparente; - Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia spp. com a ocorrência de colônias pequenas, incolores e cor do meio laranja - Salmonella enteriddis com a ocorrência de colônias de cor vermelha e bordas regulares; - Salmonella cholerasuiss com a ocorrência de colônias de cor vermelha e bordas irregulares; - Salmonella typhimurium com a ocorrência de colônias de cor vermelha e halo de cor laranja variável; - Salmonella schotmuelleri com a ocorrência de colônias de cor laranja, translúcidas e meio de cor laranja a amarelo; - Salmonella typhi com a ocorrência de colônias de cor laranja e meio de cor amarelo; - Enterobacter aerogenes e cloacae com a ocorrência de colônias de cor violeta clara ou violeta esverdeada e centro de cor violeta mais intenso; - Citrobacter freundii com a ocorrência colônias pequenas de cor violeta escura e centro de cor violeta mais intenso; - Aeromonas hydrophila com a ocorrência de colônias de cor verde clara e halo transparente e amplo.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a identificação dos diferentes organismos, ao se empregar vermelho fenol, é realizada como a seguir: - E. coli com a ocorrência de colônias de cor azul e meio de cor rosada e, no caso de se empregar MUG, fluorescência de cor azul; - Shigella sonnei com ocorrência de colônias de cor azul, bordas irregulares e meio de cor rosada framboesa; - Pseudomonas aeruginosa pela ocorrência de colônias de cor bege esverdeada e meio de cor rosada; - Salmonella typhimurium pela ocorrência de colônias de cor bege ou incolores e meio de cor rosado framboesa.

5. Método para a identificação de microorganismos Gram- negativos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio é preparado misturando-se de 30 a 50 gramas do referido meio com 1 litro de água destilada ou deionizada, agitando-se e fervendo-se até dissolução completa do agar, resfriando-se posteriormente a 45-50°C e adicionando-se o propilenoglicol em quantidades entre 5 e 15 ml, agitando-se e distribuindo-se em placas mediante agitação constante, semeando-se os microorganismos ou amostra de interesse e incubando-se a temperatura entre 30 a 45°C durante um período de até 18 horas, e, fmalmente, identificando-se e diferenciado-se os microorganismos segundo as características da cor das colônias, de seu centro,halo, bordas e, caso se requeira, segundo a cor do meio de cultivo.