BRPI0608682A2 - meios de teste e mÉtodo quantitativo ou qualitativo para a identificaÇço e a diferenciaÇço de materiais biolàgicos em uma amostra de teste - Google Patents

Abstract

MEIOS DE TESTE E MÉTODO QUANTITATIVO OU QUALITATIVO PARA A IDENTIFICAÇçO E A DIFERENCIAÇçO DE MATERIAIS BIOLàGICOS EM UMA AMOSTRA DE TESTE. A presente invenção refere-se a um meio de teste e método para detectar, quantificar, identificar e diferenciar até quatro (4) materiais biológicos separados em uma amostra de teste. Divulga-se um meio de teste que permite a quantificação e a diferenciação, sob luz ambiente, de agregados de entidades biológicas que produzem enzimas específicas, que poderiam incluir os coliformes gerais, a E. coli, o Aeromonas, e a Salmoneila em um único meio de teste. Divulga-se uma nova classe de substratos não cromogênicos, os quais produzem um precipitado não difusível, substancialmente preto. Este precipitado não está sujeito à interferência de outros substratos cromogênicos presentes no meio de teste. Em uma modalidade, os substratos são selecionados tal que as colônias de E. coli presentes no meio de teste mostrem-se como substancialmente pretas, as colônias de coliformes gerais mostrem-se no meio de teste como uma cor azul-violeta, as colônias de Aeromonas presentes no meio de teste mostrem-se como uma cor geralmente vermelha-rosa, e as colônias de Salmonelia mostrem-se como uma cor geralmente azul petróleo-verde. Outros microorganismos e possibilidades de cor para a detecção e a quantificação destes são também divulgados. Um inibidor e o método para preparar um meio de teste que incorpora o inibidor são divulgados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIOS DE TESTE E MÉTODO QUANTITATIVO OU QUALITATIVO PARA A IDENTIFICAÇÃO E A DIFERENCIAÇÃO DE MATERIAIS BIOLÓGICOS EM UMA AMOSTRA DE TESTE".

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se a um meio de teste e método para a detecção, quantificação, identificação e/ou diferenciação de materiais biológicos em uma amostra, que pode conter uma pluralidade de materiais biológicos diferentes.

As bactérias são o fator causador em muitas doenças de seres humanos, animais e plantas superiores, e são comumente transmitidas por veículos, tais como a água, as bebidas, o alimento e outros organismos. O exame destes veículos potenciais de bactérias é de importância crítica e geralmente vale-se de "organismos indicadores" Borrego e outros, Microbiol. Sem. 13:413-426, (1998). Por exemplo, a Escherichia coli (E. coli) é um membro gram-negativo da família Enterobacteriaceae, que é parte da flora intestinal normal de animais de sangue quente, e a sua presença indica contaminação fecal (por exemplo, esgoto não tratado). Embora a maioria das cepas de E. coli não seja a causa real da doença, a sua presença é uma forte indicação da possível presença de patógenos associados com a doença intestinal, tal como a cólera, a disenteria, e a hepatite, entre outras. Consequentemente, a E. coli tornou-se um organismo indicador principal para a contaminação fecal, e como um resultado, qualquer método que diferencie e identifique a E.coli das outras bactérias é muito útil.

Os outros membros da família Enterobacteriaceae, comumente referidos como "coliformes gerais", especialmente os gêneros Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella, são também considerados serem organismos indicadores significativos para a qualidade da água, bebidas e alimentos. Portanto, os testes para identificar e diferenciar os coliformes gerais da E. coli são também muito úteis. Também, diversas espécies do gênero Aeromonas têm sido mostradas não somente serem patógenos potenciais, como terem uma correlação com outros organismos indicadores (Pettibone e outros, J.Appl. Microbiol. 85:723-730 (1998)). Necessita-se de métodos de teste atuais para identificar, separar e enumerar as Aeromonas spp. da Enterobacte-riaceae muito similar e a maior parte dos métodos atuais que utilizam substratos de enzimas não separa as Aeromonas spp. da Enterobacteriaceae devido aos seus perfis bioquímicos quase idênticos. Qualquer método que dependa da identificação de coliformes gerais por meio de um substrato de |3-galactosidase não diferencia as Aeromonas spp. dos coliformes gerais ou elimina o Aeromonas da amostra pelo uso de inibidores específicos (antibióticos, tais como a cefsulodina). Brenner e outros, Appl. Envir. Micróbio. 59:3534-44 (1993). Eles não diferenciam, identificam e enumeram Aeromonas juntamente com E. coli e coliformes gerais. Landre e outros, Letters Appl. Microbiol. 26:352-354(1998). Necessita-se de métodos de teste aperfeiçoados para identificar, separar e enumerar efetivamente tais tipos bacterianos, e há uma busca contínua por métodos de teste e aparelho nesta área mais rápidos, mais acurados, mais fáceis de usar e mais versáteis.

Diversos métodos de teste têm sido utilizados para determinar, identificar e enumerar um ou mais organismos indicadores. Alguns destes métodos de teste somente indicam a presença ou a ausência do microorganismo, enquanto outros também tentam quantificar um ou mais dos organismos particulares na amostra de teste. Por exemplo, um teste qualitativo, referido como teste de Presença/Ausência (ou P/A), pode ser utilizado para determinar a presença ou a ausência de coliformes e E. coli em uma amostra de teste. Um meio de teste que inclui o substrato de p-galactosidase O-nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo (ONPG), e o substrato de p-glicuronidase 4-metil-umbreliferil-p-D-glicuronídeo (MUG), é inoculado com a amostra de teste. Para diferenciar os coliformes gerais da E. coli, este teste vale-se do fato que geralmente todos os coliformes produzem p-galactosidase, enquanto que somente a E. coli também produz p-glicuronidase além de p-galactosidase. Se quaisquer coliformes estiverem presentes (incluindo a E.coli), o meio de caldo muda para uma cor amarela devido à atividade da enzima galactosidase sobre o material de ONPG, causando a liberação de um pigmento amarelo difusível. Se a E. coli estiver presente, o meio de caldodemonstrará uma fluorescência azul quando irradiado com raios ultravioletas, devido à decomposição do reagente de MUG com a liberação do corante fluorogênico causada pela produção da enzima glicuronidase. Estas reações são muito específicas, e permitem que a presença tanto dos coliformes em geral, quanto da E. coli seja identificada em uma única amostra. Uma desvantagem deste teste é que ele não é diretamente quantitativo para o tipo bacteriano, visto que ambos os reagentes produzem pigmentos difusíveis. Uma segunda desvantagem é que pode haver uma falsa reação de coliformes positiva se as Aeromonas spp. estiverem presentes na amostra de teste.

Isto tem sido mostrado ser possível, mesmo quando existem inibidores presentes para supostamente prevenir isto de ocorrer (Landre e outros, Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998)). O teste também requer equipamento específico para produzir os raios ultravioletas. Ademais, este teste pode somente ser usado para detectar coliformes e E. coli. Outros microorganismos importantes, tais como a cepa E. coli 0157, que é negativa para glicuronidase, não são detectados, nem são outros microorganismos não produtores de galactosidase-glicuronidase.

O método do Ágar Vermelho Violeta Bile (VRBA) tem sido usado para determinar a quantidade tanto de coliforme quanto de E. coli em uma amostra de teste. O meio de teste usado neste método inclui os sais biliares (para inibir os não coliformes), a lactose e o indicador de pH vermelho neutro. À medida que os coliformes (incluindo a E. coli) desenvolvem-se no meio, a lactose é fermentada com a produção de ácido, e o vermelho neutro na área da colônia bacteriana torna-se uma cor vermelho-tijolo. Os resultados deste teste não são sempre fáceis de interpretar, e para determinar a presença de E. coli, testes de acompanhamento de confirmação, tais como a fermentação em caldo de lactose verde brilhante, o crescimento em caldo EC a 44,5-C e a risca sobre Ágar Eosina Azul-de-Metileno (EMBA), devem ser efetuados.

O método do Filtro de Membrana (MF) utiliza filtros de microporos, através dos quais as amostras são passadas, de modo que as bactérias são retidas sobre a superfície do filtro. Este método é usado mais freqüentemente quando as populações bacterianas são muito pequenas, e uma a-mostra grande é necessária para obter números adequados. O filtro é então colocado sobre a superfície de um meio escolhido, incubado, e as colônias bacterianas que se desenvolvem sobre a superfície do filtro de membrana são contadas e avaliadas. Este método é amplamente usado e proporciona bons resultados quando combinado com reagentes e meios adequados. Uma desvantagem deste método é que ele é dispendioso e consome tempo. Ele também não funciona bem com amostras sólidas, ou amostras com altas contagens de particulados. O método do MF pode ser usado em conjunção com o método inventivo descrito neste pedido.

O método de m-Endo é também usado para determinar a quantidade de E. coli e coliformes gerais e é um método oficial aprovado pela USEPA para testar a qualidade da água. O meio é comumente usado com um filtro de membrana e as unidades formadoras de colônias (CFU) de E. coli e coliformes gerais desenvolvem-se como colônias escuras, com umbrilho metálico verde dourado. Devido a uma alta taxa provada de erro de falso positivo, as colônias típicas devem ser confirmadas por teste adicional. Standard Methods for the Examination of water and Wastewater, 20a Edição, 9-10 e 9-60 (1998).

Outros testes, tais como o Número Mais Provável (MPN), utilizam caldos contendo lactose (LST, BGLB, EC) para estimar os números de coliformes gerais e E. coli, porém têm também sido mostrados terem altas taxas de erro, bem como sendo excessivamente complicados e lentos de produzir resultados. Evans e outros, Appl. Envir. Micróbio!. 41:130-138 (1981).

O reagente 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo (X-gal) é um composto de teste conhecido, para identificar coliformes. Quando atuando movido pela enzima p-galactosidase produzida pelos coliformes, o X-gal forma um precipitado azul-anil insolúvel. O X-gal pode ser incorporado em um meio nutriente, tal como uma placa de ágar, e se uma amostra con-tendo coliformes estiver presente, os coliformes desenvolver-se-ão como colônias azul-anis. O X-gal tem a vantagem sobre o composto ONPG, descrito acima, pelo fato de que ele forma um precipitado insolúvel em água, emvez de um composto difusível, desse modo capacitando uma determinação quantitativa de coliformes a ser feita quando a amostra de teste for incorporada em, ou sobre, um meio solidificado, ou quando as colônias de coliformes desenvolverem-se sobre a superfície de um filtro de membrana apoian-do-se sobre uma almofada saturada com um meio líquido, ou sobre um filtro de membrana apoiando-se sobre um meio sólido. Ademais, ele não requer o uso de luz ultravioleta.

Um composto similar, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo (X-gluc), é um composto de teste conhecido, para identificar E. coli. Quando atuando movido pela enzima p-glicuronidase produzida pela maioria das E. coli, o X-gluc forma um precipitado azul-anil insolúvel. O X-gluc tem a vantagem sobre o composto MUG, descrito acima, pelo fato de que ele forma um precipitado insolúvel em água, em vez de um composto difusível, desse modo capacitando uma determinação quantitativa de E. coli a ser feita quando a amostra de teste for incorporada em, ou sobre, um meio solidificado. O X-gluc e a sua capacidade de identificar E. coli são descritos em Watkins, e outros, Appl. Envir. Micróbio!. 54:1874-1875 (1988). Um composto similar, o indoxil-p-D-glicuronídeo, que também produz colônias azuis brilhantes de E. coli, foi descrito em Ley, e outros, Can. J. Microbiol. 34:690-693(1987).

Embora o X-gal e o X-gluc sejam, cada um separadamente, ú-teis na determinação quantitativa de coliformes (X-gal) ou E. coli (X-gluc), estes compostos indicadores têm a desvantagem que cada um deles contém o mesmo componente cromogênico. Portanto, eles não podem ser usados juntos para identificar e distinguir tanto E. coli quanto coliformes gerais em um único teste com uma única amostra, visto que ambos geram colônias de cores idênticas azul-anis. Uma pessoa que utilizasse ambos os reagentes juntos seria capaz de identificar quantitativamente o número total de coliformes, o mesmo que se o X-gal fosse usado sozinho, porém não seria capaz de indicar quais das colônias eram E. coli e quais eram outros coliformes além de E. coli.

Um método de teste recentemente desenvolvido e alta e comer-cialmente bem-sucedido, e um meio de teste para identificar e diferenciar quantitativamente coliformes gerais e E. coli em uma amostra de teste, é descrito nas Patentes U.S. N- 5.210.022, e 5.393.662, ambas as quais compartilham inventores comuns com o presente pedido e que são, pelo presente, incorporadas por referência. Este método, e o meio de teste, aperfeiçoa os métodos da técnica anterior permitindo a identificação quantitativa de coliformes gerais e E. coli em uma única amostra. Não são necessários testes confirmatórios adicionais. A amostra de teste é adicionada a um meio contendo um substrato de p-galactosidase, tal como o 6-cloroindolil-p-D-galactosídeo, e um substrato de B-glicuronidase, tal como o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo (X-gluc). O substrato de p-galactosidase é capaz de formar um precipitado insolúvel em água de uma primeira cor ao reagir com a B-galactosidase, e o substrato de B-glicuronidase é capaz de formar um precipitado insolúvel em água de uma segunda cor, contrastando com a primeira cor, ao reagir com a B-glicuronidase. Como um resultado, os coliformes gerais podem ser quantificados enumerando-se as colônias da primeira cor (tendo atividade de B-galactosidase), e a E. coli pode ser quantificada enumerando-se as colônias da segunda cor (tendo atividade tanto de B-galactosidase e B-glicuronidase). Esta tecnologia tem sido amplamente copiada.

Um outro método de teste recentemente desenvolvido, e aparelho, proporciona excelentes resultados para a diferenciação e a identificação de coliformes gerais, cepas de E. coli e E. coli 0157 e Enterobacteriaceae que não seja coliforme. O método e o meio de teste são descritos na Patente U.S. N2 5.726.031, que compartilha inventores comuns com o presente pedido, e que é, pelo presente, incorporada por referência.

Certa classe de substratos, referida neste documento como "não cromogênica", tem sido usada para detectar diversos microorganismos. Uma lâmina de imersão ("dipslide") para detectar E. coli usando hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo é divulgada por Dalet e outros, J. Clin. Microbiol, 33(5): 1395-8 (1995). Similarmente, uma técnica para detecção de E. coli em um meio à base de ágar usando 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo é divul-gada por James e outros, Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A], 267(3):316-21 (1988).

É desejável adicionalmente aperfeiçoar as cores distintivas geradas nos meios de teste. Isto é, nos meios de teste da técnica anterior, que detectam e distinguem duas entidades biológicas, pode surgir confusão entre as duas cores que aparecem nos meios.

Ademais, é desejável ser capaz de identificar e diferenciar outros organismos estreitamente relacionados, tais como os membros das famílias Aeromonaceae, Vibrionaceae, e Salmonella. Por exemplo, o gênero Aeromonas está estreitamente relacionado aos coliformes e dá um padrão de teste bioquímico quase idêntico. Além disso, o gênero Vibrio é também um tipo importante de bactéria que se desenvolve sob as mesmas condições gerais que os coliformes. É sabido distinguir as colônias de Aeromonas dos coliformes gerais testando-se todas as colônias em uma dada amostra quanto à presença de citocromo oxidase. Indesejavelmente, entretanto, isto requer uma outra série de testes. Também, o Aeromonas é comum em água e alimento, e ele é comumente indicado nas amostras de teste como coliformes gerais, o que resulta em um erro de falso positivo alto para os coliformes gerais pelos métodos de teste mais atuais. O Aeromonas pode ser impedido de interferir com os resultados de coliformes por adição de certos antibióticos ao meio. Entretanto, as quantidades de antibióticos adicionadas devem ser cuidadosamente controladas. Fora isto, os antibióticos que têm sido convencionalmente usados têm tempos de vida curtos nos meios, de modo que eles perdem a sua potência rapidamente em uma condição diferentemente da congelada. Pode freqüentemente ser desejável ser capaz de cultivar, identificar e enumerar as Aeromonas spp., o que não pode ser feito se elas forem inibidas.

Além disso, nestes casos onde for desejável inibir o Aeromonas, é desejável um melhor método de assim fazê-lo, um no qual a vida de prateleira do meio não seja apreciavelmente reduzida pela inclusão de um inibidor.

Adicionalmente, é também desejável distinguir as cepas de Salmonella de E. coli, coliformes gerais e Aeromonas.Sumário da Invenção

A presente invenção supera as desvantagens dos métodos da técnica anterior proporcionando um método de teste e um meio para identificar e diferenciar, quantitativa ou qualitativamente, entidades biológicas em uma amostra de teste que pode incluir uma pluralidade de diferentes entidades biológicas.

Em uma modalidade, a presente invenção introduz o uso de substratos "não cromogênicos" para aumentar a distinção entre as múltiplas cores produzidas por entidades biológicas distintas, presentes no meio de teste inventivo. Inesperadamente, foi descoberto que outros substratos "cromogênicos", presentes no meio de teste inventivo, não interferem com a cor substancialmente preta obtida com o substrato não cromogênico. Quer dizer, desde que uma dada entidade biológica seja sensível ao substrato não cromogênico, as suas agregações presentes no meio de teste mostrar-se-ão como uma cor substancialmente preta - independente de se tal entidade biológica é sensível a um, dois ou mais substratos cromogênicos que estejam também presentes no meio. A presente invenção explora esta propriedade até agora inexplorada dos substratos não cromogênicos.

Em uma forma dela, a presente invenção proporciona um meio de teste para detectar, identificar e qualificar ou quantificar uma primeira e uma segunda entidade biológica. O meio de teste inclui um meio de base de nutrientes que inclui íons de um sal, um substrato cromogênico e um substrato não cromogênico. A primeira entidade biológica é sensível ao substrato não cromogênico, enquanto que a segunda entidade biológica é sensível ao substrato cromogênico. Neste meio de teste, as agregações da primeira entidade biológica, presentes no meio de teste, são substancialmente pretas e as agregações da segunda entidade biológica, presentes no meio de teste, são uma segunda cor, a segunda cor sendo distinguível da substancialmente preta.

Em uma forma, o meio de teste inventivo é responsável pela primeira entidade biológica ser sensível ao substrato cromogênico, além do substrato não cromogênico. Em tal situação, as agregações da primeira en-tidade biológica, presentes no meio de teste, mostrar-se-ão, contudo, como substancialmente pretas.

Significativamente, embora as agregações da primeira entidade biológica sejam sensíveis tanto ao primeiro quanto ao segundo substrato, nesta forma, estas agregações ainda se mostram como substancialmente pretas no meio de teste. Ou seja, o substrato cromogênico não interfere com a cor substancialmente preta. De modo vantajoso, esta propriedade dos substratos não cromogênicos permite que diversas entidades biológicas diferentes sejam identificadas e diferenciadas em um único meio, as agregações de cada entidade biológica tendo uma cor visualmente distinguível.

Em uma outra forma do meio inventivo acima descrito, o meio adicionalmente inclui o antibiótico ácido nalidíxico para inibir o crescimento de Aeromonas spp. Vantajosamente, verificou-se que o ácido nalidíxico, em comparação com a cefsulodina, não reduz significativamente a vida de prateleira do meio de teste que o incorpora.

Neste contexto, uma outra forma da presente invenção proporciona um método de preparar um meio de teste para detectar pelo menos um primeiro tipo de entidade biológica e inibir um segundo tipo de entidade biológica de crescer no meio. O método inclui as etapas de combinar substratos desejados com um meio de base de nutrientes; adicionar um inibidor ao meio; e então esterilizar o meio sujeitando o meio a pelo menos 100-C. Porque o inibidor é adicionado como uma etapa inicial, a adição estéril subseqüente de inibidor é desnecessária.

Em uma outra forma dela, a presente invenção proporciona um meio de teste para detectar, identificar e qualificar ou quantificar umas primeira, segunda e terceira entidades biológicas. O meio de teste inclui um meio de base de nutrientes incluindo íons de um sal. Os primeiro e segundo substratos cromogênicos e um substrato não cromogênico são proporcionados no meio de teste. A primeira e segunda entidades biológicas são sensí-veis ao primeiro e segundo substratos cromogênicos, respectivamente, e a terceira entidade biológica é sensível ao substrato não cromogênico. As a-gregações da primeira entidade biológica presentes no meio de teste sãouma primeira cor, as agregações da segunda entidade biológica presentes no meio de teste são uma segunda cor, e as agregações da terceira entidade biológica presentes no meio de teste são substancialmente pretas.

Em uma forma, o meio de teste inventivo é responsável pela terceira entidade biológica ser sensível aos primeiro e/ou segundo substratos cromogênicos, além do substrato não cromogênico. Em tal situação, as a-gregações da terceira entidade biológica mostrar-se-ão, contudo, como substancialmente pretas.

Deve ser apreciado que o uso de um substrato não cromogênico juntamente com um ou mais substratos cromogênicos aumenta de modo sinérgico o número de entidades biológicas que podem ser detectadas e dis-tinguidas em um único meio, e aumenta sinergicamente as combinações de cores possíveis para um dado grupo de entidades biológicas a ser detectado. Dito de um outro modo, a inclusão de um componente não cromogênico como um dos substratos aumenta sinergicamente os graus de liberdade na seleção de outros substratos e cores correspondentes para um meio de teste. Isto é assim porque uma agregação da entidade biológica que é sensível ao substrato não cromogênico mostrar-se-á certamente como substancialmente preta. Nenhum efeito combinado de cores necessita ser considerado com os substratos não cromogênicos. Por exemplo, em um meio de teste que inclui três substratos cromogênicos e um substrato não cromogênico, pelo menos três efeitos combinados de combinação de cores são evitados pela utilização do componente não cromogênico, em comparação com a utilização de quatro componentes cromogênicos.

A presente invenção, em uma outra forma dela, proporciona um meio de teste capaz de detectar, quantificar, e diferenciar coliformes gerais e/ou E. coli spp. sob luz ambiente. O meio de teste compreende um meio à base de nutrientes que inclui um sal. Proporciona-se no meio um primeiro substrato capaz de formar um primeiro componente insolúvel em água de uma primeira cor na presença de E. coli e os íons do sal. A primeira cor é substancialmente preta. Proporciona-se um segundo substrato capaz de formar um segundo componente insolúvel em água de uma segunda cor napresença de coliformes gerais. A segunda cor é visualmente distinguível da primeira cor. Assim, as colônias de E. coli presentes no meio de teste são indicadas pela primeira cor substancialmente preta e as colônias de coliformes gerais são indicadas pela segunda cor.

Em uma forma da invenção acima mencionada, o meio de teste adicionalmente inclui um terceiro substrato capaz de formar um terceiro componente insolúvel em água de uma terceira cor na presença de Salmo-nella. A terceira cor é distinguível das primeira e segunda cores, pelo que o meio de teste é capaz de quantificar e/ou diferenciar a E. coli, os coliformes gerais e a Salmonella. Ademais, os substratos são selecionados de modo tal que os coliformes gerais presentes no meio de teste também reagirão com o terceiro substrato, para formar um composto insolúvel em água, o qual inclui a terceira cor. Consequentemente, as colônias de coliformes gerais são indicadas no meio de teste como uma quarta cor, a quarta cor sendo uma combinação da segunda cor e a terceira cor. A quarta cor é visualmente distinguível da primeira e da terceira cores. Ainda adicionalmente, os substratos podem ser selecionados de modo tal que as Aeromonas spp. formem um componente insolúvel da segunda cor por reação com o segundo substrato, porém não os primeiro e terceiro substratos. Assim, no meio de teste inventivo, as colônias de E. coli serão geralmente pretas, as colônias de coliformes gerais serão a quarta cor, as colônias de Aeromonas serão a segunda cor e as colônias de Salmonella serão a terceira cor.

Em uma outra forma dela, a presente invenção proporciona um método para detectar, quantificar e diferenciar, sob luz ambiente, coliformes gerais, E. coli, e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonella em uma amostra de teste. O método compreende as etapas de proporcionar um meio de base de nutrientes que inclui um primeiro, um segundo e um terceiro substrato. Cada um dos substratos é capaz de formar um componente insolúvel em água na presença de pelo menos um de coliformes gerais, E. coli, Aeromonas, Salmonella. Os substratos são selecionados de modo tal que as colônias de E. coli produzidas no meio de teste sejam uma primeira cor, as colônias de coliformes gerais produzidas no meio de teste sejam umasegunda cor, e as colônias de um de Aeromonas e Salmonella produzidas no meio de teste sejam uma terceira cor. Cada uma das cores é visualmente distinguível. O meio de teste é inoculado com a amostra de teste e então incubado. O meio de teste é então examinado quanto à presença das primeiras colônias tendo a primeira cor, das segundas colônias tendo a segunda cor, e das terceiras colônias tendo a terceira cor. As primeiras colônias são E. coli, as segundas colônias são coliformes gerais, e as terceiras colônias são um de Aeromonas ou Salmonella.

Em uma sua forma, o método inventivo adicionalmente inclui adicionar íons de um sal ao meio de teste para reagir com um ou mais dos substratos. Ao fazer assim, um precipitado é produzido, o qual se mostra como uma cor substancialmente preta na presença da enzima específica para aquele substrato. Um composto preferido para formar a cor substancialmente preta na presença dos íons do sal consiste em um (3-D-glicuronídeo. Estes compostos liberam uma aglicona quando hidrolisados, que forma um complexo insolúvel substancialmente preto na presença de íons.

Em uma outra forma do método inventivo, o método adicionalmente compreende examinar o meio de teste quanto à presença das quartas colônias tendo uma quarta cor, onde os substratos são selecionados de modo tal que as colônias de Aeromonas sejam a terceira cor e as colônias de Salmonella sejam a quarta cor, a quarta cor sendo visualmente distinguível da primeira, da segunda e da terceira cor. Os substratos podem ser selecionados de modo tal que a primeira cor seja substancialmente preta, a segunda cor seja substancialmente azul-violeta, a terceira cor seja substancialmente vermelho-rosa e a quarta cor seja substancialmente azul-petróleo-verde.

Em uma outra forma do método inventivo, os substratos são selecionados de modo tal que as colônias de Aeromonas, bem como as colônias de Plesiomonas e Vibríos sejam indicadas como a terceira cor.

Uma modalidade da presente invenção utiliza um substrato não cromogênico juntamente com um ou mais substratos cromogênicos e, desse modo, aumenta sinergicamente os graus de liberdade de projeto na seleçãode cores para o meio de teste inventivo. Isto é porque os substratos cromo-gênicos não interferem com o precipitado substancialmente preto formado pelo substrato não cromogênico.

Uma outra vantagem de uma modalidade da presente invenção é que ela capacita a quantificação, a identificação e a diferenciação simultaneamente de quatro (4) cepas bacterianas diferentes em um único meio de teste, usando uma única amostra de teste, sob iluminação ambiente. Evitam-se os testes subseqüentes com seu tempo extra gasto e custos extras. Obviamente, o meio de teste inventivo da presente invenção poderia também ser usado puramente para propósitos qualitativos, como um mero teste de presença/ausência (P/A).

Em uma modalidade, os substratos são selecionados de modo tal que as cores sejam fáceis de distinguir visualmente uma da outra, sem a necessidade por luz UV ou outros auxílios visuais, exceto, talvez, os meios de ampliação. Por exemplo, em uma modalidade, as colônias de E. colisão claramente indicadas por um precipitado tendo uma cor substancialmente preta, as colônias de coliformes gerais são indicadas por uma cor azul-violeta, as colônias de Aeromonas são indicadas por uma cor vermelho-rosa, e as colônias de Salmonella são indicadas por uma cor azul-petróleo-verde. Porque estas cores são visualmente assim distintas, a confusão entre as cores é bastante reduzida em comparação com os meios da técnica anterior. Em uma modalidade, o MUGIuc (ácido 4-metilumbeliferil-Beta-D-glicurônico) é usado no lugar de um substrato não cromogênico. Neste meio de teste, os coliformes gerais ainda seriam indicados por uma cor azul-violeta ou acin-zentada. As colônias de Aeromonas indicadas por uma cor vermelho-rosa e as colônias de Salmonella indicadas por uma cor azul-petróleo-verde; entretanto, as colônias de E. coli pareceriam iguais na luz visível aos coliformes gerais, porém também exibiriam fluorescência de uma cor azulada brilhante, sob uma luz UV de ondas longas, e isto poderia ser distinguido das outras colônias. Ainda que o produto fluorescente difundisse mais rapidamente do que os substratos cromogênicos ou não cromogênicos e tornasse a quantificação das colônias de E. coli mais difícil, as colônias de E. coli podem serdetectadas em tempo de incubação de aproximadamente 14 horas, e em qualquer caso serão suficientes como um teste de presença/ausência para a E. coli.

Em mais uma outra modalidade da invenção, verificou-se que três substratos cromogênicos podem ser usados, se adequadamente combinados. Por exemplo, um (3-glicuronídeo, tal como X-Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicurônico) ou lodo-Gluc (ácido 5-iodo-3-indolil-p-D-glicurônico), pode ser usado com os substratos cromogênicos a- e p-D-galactosídeos. Os exemplos de substratos a- e p-galactosídeos que podem ser adequados são o 6-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo e o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo. Nesta modalidade, os substratos p-D-glicuronídeo e a-D-galactosídeo formam a mesma cor geral na presença de colônias que produzem as enzimas respectivas; entretanto, as cores podem ser distingui-das proporcionando os substratos em diferentes quantidades, de modo que a cor resultante produzida por um seja mais escura que aquela produzida pelo outro. Ademais, mesmo se os substratos forem proporcionados aproximadamente nas mesmas quantidades, as colônias que reagem tanto com o p-D-glicuronídeo quanto com o a-D-galactosídeo, tais como E. coli, devem ser mais escuras que as colônias, tais como os coliformes gerais, que somente reagem com o a-D-galactosídeo. Deve ser apreciado que não seria necessário adicionar íons de sal se um substrato não cromogênico não for usado.

Em um aspecto adicional da presente invenção, o MUGIuc ou um outro substrato de glicuronídeo fluorescente pode ser combinado, em um meio de teste, com um substrato de glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico. Neste caso, o substrato MUGIuc pode ser usado para detectar E. coli sob luz fluorescente com menos tempo de incubação do que é requerido par detectar colônias com um glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico. Ademais, o substrato MUGIuc pode servir como uma confirmação da presença/ausência de E. coli, se por quaisquer razões houver alguma dúvida quanto às cores visíveis em luz ambiente, produzidas pelas colônias na presença dos substratos.Uma outra vantagem do meio de teste da presente invenção é a sua flexibilidade e facilidade de uso. A temperatura de incubação não é crítica, visto que o crescimento e a diferenciação dos organismos mencionados podem ocorrer dentro de uma faixa ótima. Portanto, as etapas de renovação são evitadas e a inibição das cepas sensíveis à temperatura não ocorre. Também, pode ser usado equipamento econômico.

Em uma modalidade da presente invenção, a distinção de cor obtida em um meio de teste pode ser intensificada para identificar e diferenciar a E. coli dos coliformes gerais. Em um meio de teste, as colônias de E. coli apresentam uma cor substancialmente preta, enquanto que os coliformes gerais apresentam uma cor vermelho-rosa, a distinção entre elas sendo muito mais aparente do que nos meios de teste da técnica anterior. A confusão entre as duas cores é, portanto, bastante reduzida.

Ainda uma outra vantagem da presente invenção é que ela capacita a identificação e a diferenciação de Aeromonas spp. dos coliformes gerais. Os meios de teste da técnica anterior indesejavelmente requerem a utilização de um inibidor de cefsulodina para impedir que as Aeromonas spp. desenvolvam-se neles. Entretanto, o uso de cefsulodina como um inibidor requer uma etapa extra no processo, wz., a adição estéril de antibiótico esterilizado em filtro, e é difícil de controlar. Além disso, a presença de cefsulodina reduz significativamente a vida de prateleira efetiva do meio. Ademais, o uso de um inibidor, obviamente, impede a detecção e a quantificação das Aeromonas spp. Vantajosamente, com a presente invenção, as Aeromonas spp. podem ser detectadas, quantificadas e diferenciadas dos coliformes gerais em um único meio.

Como uma vantagem relacionada, se for, contudo, desejado inibir as colônias de Aeromonas spp. de crescimento no meio de teste, a presente invenção proporciona um meio superior para fazê-lo assim. Especificamente, as formas preferidas da presente invenção empregam o ácido nalidíxico como um inibidor, que tem sido mostrado ter um efeito de longe menos deletério para a vida de prateleira do meio que o incorpora. Além disso, o ácido nalidíxico pode ser adicionado como parte da formulação de meioinicial, antes da esterilização, desse modo evitando uma etapa de processo cara e difícil que é requerida com a cefsulodina. Finalmente, o ácido nalidíxico é muito menos caro do que a cefsulodina.

Uma outra vantagem da presente invenção é que ela pode proporcionar um meio de teste para o exame qualitativo ou quantitativo. Ou seja, os meios de teste de acordo com a presente invenção podem ser usados como meros dispositivos de teste de presença/ausência, ou podem ser usados para quantificar diversas entidades biológicas que se mostram como colônias coloridas diferentes sobre os meios de teste inventivos. Descrição Detalhada da Invenção

O método e o meio da presente invenção permitem a detecção, a quantificação, a identificação e a diferenciação simultâneas de uma variedade de entidades biológicas selecionadas, em uma amostra de populações mistas de entidades biológicas. O método e o meio inventivo são particularmente úteis para a detecção, a quantificação, a identificação e a diferenciação de E. coli e coliformes gerais, e adicionalmente a identificação e a diferenciação quantitativa de outras entidades biológicas selecionadas, incluindo as espécies bacterianas de Aeromonas, Salmonella, e Vibrio.

O método e os meios de teste que incorporam a presente invenção utilizam o fato que a atividade enzimática das entidades biológicas e, especificamente, das bactérias varia com o gênero, e/ou a família de bactérias de interesse. O método e os meios de teste incorporando a presente invenção adicionalmente utilizam o fato que diversos complexos de substratos identificadores de enzimas podem ser usados para identificar enzimas específicas, com a produção de cores diferentes. De modo significativo, em uma modalidade da presente invenção, o método e os meios de teste que incorporam a presente invenção exploram o fato que os substratos cromo-gênicos presentes em um meio de teste não interferem com a cor substancialmente preta produzida pelos substratos não cromogênicos.

Embora os substratos não cromogênicos sejam conhecidos na técnica, per se, as suas propriedades distintas vis-à-vis substratos cromogênicos não são reconhecidas. Entretanto, o comportamento de um substratonão cromogênico em um meio que inclui a combinação de substratos cro-mogênicos é único. Para ilustrar, as agregações de uma entidade biológica que são sensíveis a dois substratos cromogênicos tipicamente mostrar-se-ão em um meio de teste como uma combinação das duas cores produzidas com a clivagem dos dois substratos respectivos. Quando três substratos cromogênicos estiverem envolvidos, como em uma outra modalidade da invenção, o efeito combinado de cores não é óbvio para predizer e ser responsável. Ademais, as variações inerentes na quantidade de enzimas produzidas por cepas particulares de entidades biológicas podem resultar em diferentes tonalidades ou tons de cores com a clivagem dos substratos cromogênicos. Consequentemente, as cores podem ser difíceis de distinguir para a pessoa leiga que examina o meio de teste. Os substratos cromogênicos devem, portanto, ser escolhidos e usados em uma concentração considerando os outros substratos cromogênicos planejados para inclusão em um dado meio de teste.

Tal não é o caso com os componentes não cromogênicos. Embora as agregações de entidades biológicas que são sensíveis aos substratos cromogênicos, além dos substratos não cromogênicos, possam mostrar-se no meio de teste como tendo um "halo" colorido ou fluorescente, tais a-gregações, contudo, aparecem substancialmente pretas e são, portanto, fáceis de identificar. Os múltiplos "graus de liberdade" são atingidos com os componentes não cromogênicos.

A utilização de um substrato não cromogênico é um modo de capacitar um único meio de teste de diferenciar quatro (4) cepas bacterianas diferentes com quatro (4) cores visualmente distinguíveis. A cor preta é difícil de errar. Além disso, a pigmentação substancialmente preta não se difunde, de modo que a posição das colônias é conhecida precisamente e as colônias podem ser contadas exatamente. Os substratos não cromogênicos produzem um composto quelado insolúvel que é diferente do dímero que é produzido pelos substratos cromogênicos.

O meio de teste e o método inventivo permitem não somente uma detecção, quantificação ou identificação e diferenciação qualitativas decoliformes gerais e E. coli, como também de Salmonella e Aeromonas, bem como Plesiomonas e Vibrio. As espécies Plesiomonas e Vibrios são determinadas, porém não diferenciadas, das espécies Aeromonas, visto que elas são muito estreitamente relacionadas.

Definições

As entidades biológicas, tais como os coliformes gerais, a E. coli, etc, são neste documento referidas como sendo "sensíveis" a certos substratos cromogênicos e não cromogênicos. Mais especificamente, uma entidade biológica produzirá de modo previsível enzimas específicas, quando a entidade estiver presente em um meio de teste, tal como o descrito a seguir. Estas enzimas clivarão seletivamente os substratos cromogênicos e não cromogênicos. Com a clivagem, estes substratos produzem uma cor no meio de teste. O mecanismo para produzir a cor é diferente para os substratos cromogênicos e não cromogênicos, conforme descrito a seguir.

Os microorganismos que têm atividade de p-galactosidase incluem aqueles comumente conhecidos pela designação "coliforme". Existem diversas definições de "coliforme", porém, as geralmente aceitas incluem as bactérias que são membros da família Enterobacteriaceae, e têm a capacidade de fermentar o açúcar lactose com o desenvolvimento de gás e ácido. A maioria dos coliformes é positiva tanto para a- quanto para p-galactosidase. Ou seja, eles produzem tanto a quanto p-galactosidases.

Os microorganismos que têm atividade de p-glicuronidase, além de atividade de galactosidase, incluem principalmente a maioria das cepas de Escherichia coli. Ou seja, a E. coli é positiva para ambas a- e p-galactosidases, bem como p-glicuronidase.

O termo "coliformes gerais", conforme usado neste pedido, refere-se aos coliformes diferentes das diversas cepas de E. coli. Estes "coliformes gerais" são microorganismos gram-negativos, não formadores de esporos, geralmente tendo atividade de a- e p-galactosidase (isto é, fermentado-res de lactose), porém não tendo atividade de p-glicuronidase, e tendo a capacidade de fermentar o açúcar sorbitol.

Para os propósitos deste relatório descritivo, um "substrato cro-mogênico" é um substrato que não necessita de nenhuma substância química adicional, presente no meio de teste, na hidrólise, para a produção de cor. Ou seja, um substrato cromogenico é clivado pela enzima específica que corresponde àquele substrato, para formar um dímero com a cor que está sendo concentrada na área de clivagem do substrato. Muitos substratos cromogênicos são conhecidos na técnica. Para os propósitos deste relatório descritivo, "cromogênicos" inclui os substratos fluorogênicos. Os produtos de substratos fluorogênicos requerem luz ultravioleta (UV) para serem detectados e são mais solúveis em água do que os outros substratos cromogênicos.

Certos substratos, referidos aqui como "não cromogênicos", produzem um precipitado substancialmente preto, escuro, na presença de íons de um sal e atividade de enzima. Por exemplo, o 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, quando incluído em um meio juntamente com um sal que produz íons, tal como o citrato férrico de amônio, produzirá um precipitado substancialmente preto na presença da [3-glicuronidase produzida pela E. coli ou outras entidades biológicas. Mais especificamente, na clivagem do substrato não cromogenico pela enzima particular, forma-se no meio um complexo insolúvel em água, substancialmente preto. O precipitado substancialmente preto consiste nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase da E. coli. Este precipitado é um composto quelado que não se difunde. Nem a cor substancialmente preta é suscetível à interferência dos compostos cromogênicos presentes no meio de teste.

Para os propósitos deste relatório descritivo, um "substrato não cromogenico" significa que uma substância química, além daquelas usadas com os componentes cromogênicos, deve estar presente no meio de teste, quando o substrato for clivado por sua enzima correspondente. O precipitado substancialmente preto formado, desse modo, é uma combinação do complexo de substrato - sal e não é um dímero conforme é formado pelos "compostos cromogênicos".

Para os propósitos deste relatório descritivo, a expressão "sob luz ambiente" refere-se ao espectro visível, isto é, as cores que podem ser vistas e distinguidas a olho nu. Uma colônia presente em um meio de teste,que requer luz ultravioleta para ser vista, por exemplo, não se enquadraria na definição "sob luz ambiente". Entretanto, também é para ser entendido que o termo "sob luz ambiente" inclui a utilização de um dispositivo de ampliação, se necessário. A ampliação pode ser especialmente útil quando se contam diversas colônias. O termo "visualmente distinguíveis" refere-se a duas ou mais cores que podem ser diferenciadas sob luz ambiente.

Para os propósitos deste relatório descritivo, o termo "substancialmente preto" inclui marrom-escuro a preto, e também inclui preto com diversos halos coloridos, tais como vermelho-violeta, verde, fluorescente, etc.

Para os propósitos adicionais deste relatório descritivo, os nomes das cores referidos neste documento são dados como guia, porém é para ser entendido que os nomes das cores são para serem lidos de modo amplo. Ou seja, pode haver sobreposição entre as cores referidas. Isto é porque, conforme discutido, as entidades biológicas produzem quantidades variadas de enzimas, o que, por sua vez, afeta a tonalidade ou o tom da cor resultante.

O termo "substrato de p-galactosidase", conforme usado aqui, refere-se a um B-galactosídeo compreendendo a galactose unida, por ligação B, a um substituinte que forma um composto detectável quando liberado pela ação da p-galactosidase sobre o substrato. Similarmente, o termo "substrato de oc-galactosidase", conforme usado neste documento, refere-se ao oc-galactosídeo compreendendo galactose unida, por ligação a, a um substituinte que forma um composto detectável quando liberado pela ação da a-galactosidase sobre o substrato. O termo "substrato de B-glicuronidase", conforme usado aqui, refere-se a um p-glicuronídeo compreendendo ácido glicurônico unido, por ligação p, a um substituinte que forma um precipitado detectável quando liberado pela ação da p-glicuronidase sobre o substrato.

Os substratos de a- e p-galactosidase e os compostos e quaisquer outros substratos descritos aqui, bem como os substratos de p-glicuronidase e os compostos e quaisquer outros substratos descritos aqui podem compreender sais de carboxilato formados por reação de uma base adequada com o grupo carboxila do galactosídeo ou glicurônico. As basesadequadas incluem os hidróxidos ou os carbonates de metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, e os carbonatos correspondentes; e as bases de nitrogênios, tais como a amônia e as alquilaminas, tais como a trimetilamina, trietilamina e a cicloexilamina.

Projeto de um Meio de Teste para Entidades Biológicas Específicas

Certos membros da família Enterobacteriaceae podem ser dis-tinguidos pela presença de atividade de oc-galactosidase na ausência de atividade de p-galactosidase, ou vice-versa. Por exemplo, a maioria das Sal-monella e Shigella spp. é positiva para oc-galactosidase, porém negativa para P-galactosidase. Similarmente, as Aeromonas spp. podem ser distinguidas de outros membros da família Enterobacteriaceae pela presença de atividade de p-galactosidase na ausência de atividade de a-galactosidase. O método e o meio que incorporam a presente invenção são projetados para tirar proveito destas características distintivas. Por exemplo, a especificidade da atividade de enzima para Salmonella e Aeromonas spp., em oposição aos coliformes gerais, pode ser explorada, conforme ilustrado abaixo.

O método descrito aqui é particularmente adequado para a detecção, a quantificação ou a identificação e a diferenciação qualitativas das diferentes classes de microorganismos descritas anteriormente, viz., coliformes gerais, E. coli, Aeromonas e Salmonella. Embora o método inventivo seja particularmente adequado para estes microorganismos particulares, ele não está limitado aos mesmos. Em vez disso, as técnicas descritas aqui têm aplicação para a identificação e a diferenciação de uma ampla variedade de entidades biológicas.

Ou seja, as entidades biológicas específicas são "sensíveis" a diversos substratos. Mais particularmente, estas entidades biológicas previ-sivelmente produzem ou contêm enzimas conhecidas. Os substratos, cro-mogênicos ou não cromogênicos, podem ser selecionados, os quais, na presença de uma enzima(s) particular(es), formarão um produto de uma cor previsível e distinguível. Os substratos múltiplos podem ser selecionados para identificar simultaneamente uma pluralidade de entidades biológicasdistintas em um único meio de teste, as agregações de cada entidade distinta sendo identificáveis por uma cor distinguível, separada. Ademais, embora certas modalidades divulgadas neste documento distingam todas as diversas agregações presentes em um meio de teste sob luz ambiente, como es-5 te termo é definido, tal não é necessário. Por exemplo, diversos substratos divulgados aqui requerem o uso de luz ultravioleta para as agregações presentes no meio a ser visto.

A Tabela I lista diversas enzimas cuja presença pode ser detectada usando certos dos substratos listados na Tabela II.

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Tabela II

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Os compostos de substratos específicos, para uso com o meio de teste da presente invenção, estão disponíveis como se segue:

O 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo (X-gal) é um substrato de p-galactosidase comercialmente disponível, que produz um precipitado insoluvel tendo uma cor aproximadamente azul-petróleo quando reagido pela p-galactosidase e está disponível da Biosynth International, Na-perville, IL.

O 6-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo é um composto que produz um precipitado insoluvel tendo uma cor magenta, cuja preparação é descrita na Patente U.S. N2 5.210.022 antes mencionada, incorporada por referência, e está disponível da Research Organics, Cleveland, OH.

O composto 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo (X-gluc) é um p-glicuronídeo comercialmente disponível que produz um precipitado insoluvel tendo uma cor aproximadamente azul-petróleo quando reagido pela p-glicuronidase. Similarmente, o indoxil-p-glicuronídeo é um composto similar, cuja preparação é descrita no artigo antes mencionado por Ley e outros, em Can J. Microbiol., cuja divulgação é incorporada por referência.

Um outro p-galactosídeo adequado é o composto 6-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo, o qual produz um precipitado insoluvel tendo uma cor rosa/magenta, cuja preparação é descrita na Patente U.S. N2 5.210.022 antes mencionada.

Os outros compostos aplicáveis como substratos na prática dapresente invenção são especificados na Patente U.S. N2 5.210.022, todos os quais são incorporados aqui por referência.

O substrato 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo é um p-glicuronídeo comercialmente disponível que, na presença de íons metálicos, tais como o ferro, produz um precipitado insolúvel tendo uma cor substancialmente preta quando reagido pela (3-glicuronidase e na presença de outros substratos de a- ou (3-galactosídeo. O 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo está disponível da Biosynth International, Naperville, IL.

Ademais, um sal que proporciona íons adequados para uso com a presente invenção é o citrato férrico de amônio, disponível da Sigma Chemical, St. Louis, MO. Os substratos de cicloexenoesculetina são descritos em James e outros, Appl. & Envir. Micro. 62:3868-3870 (1996) e, na presença de íons férrico, produzem um precipitado insolúvel substancialmente preto.

Os substratos de N-metil-indolila, tais como o N-metilidróxi-p-D-galactopiranosídeo, estão comercialmente disponíveis da Biosynth International, Naperville, IL.

Os substratos de nitrofenila, tais como o 2-nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo, estão comercialmente disponíveis da Biosynth International, Naperville, IL. Similarmente, os compostos de nitroanilina estão disponíveis para síntese através da Sigma Chemical, St. Louis, MO.

Os outros substratos que produzem uma cor substancialmente preta incluem os substratos de esculetina, tais como o cicloexenoesculetina-P-D-galactosídeo, que é descrito em James e outros, Appl. & Envir. Microbiol. 62:3868-3870 (1996). Os substratos de quinolina, tais como o 8-hidroxiquinolina-p-D-galactopiranosídeo e o 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, estão disponíveis através da Biosynth International, Naperville, IL

Os substratos de iodo-indolila, tais como o 5-iodo-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo, estão disponíveis através da Biosynth International, Naperville, IL.

Diversos substratos fluorescentes são adequados para uso coma presente invenção. Os substratos de cumarina, tais como os substratos de 4-metilumbeliferila e os substratos de 5-trifluormetilumbeliferila, estão comercialmente disponíveis da Biosynth International, Naperville, IL. São também adequados os substratos de fluoresceína, os substratos de rodamina, e os substratos de resorufina. Nenhuma fonte comercial é conhecida para estes três substratos, porém os componentes estão disponíveis da Sigma Chemical, St. Louis, MO.

Embora exemplos específicos de substratos adequados para uso com a presente invenção tenham sido enumerados aqui acima, tal não é para ser interpretado como limitando a invenção de modo algum. Em vez disso, alguém de habilidade comum na técnica pode utilizar as Tabelas IV e V a seguir para identificar um número virtualmente ilimitado de substratos. Preparação do Meio de Teste

O meio de teste é formado por combinação dos substratos desejados com um meio de base de nutrientes. O meio de base de nutrientes pode ser qualquer meio de cultura, conhecido na técnica para proporcionar a manutenção e a reprodução de células vivas. Em geral, tais meios incluem nutrientes, tampões, água, e algumas vezes um agente gelificante. Os agentes gelificantes possíveis incluem os ágares, as pectinas, as carrageninas, os alginatos, a alfarroba, e as xantinas, entre outros.

O que segue é um exemplo da preparação de um meio de teste, adequado para uso nesta invenção. Este exemplo coincide com o Exemplo I, abaixo.

Os substratos 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo, e 6-Cloro-3-indolil-(3-D-galatopiranosí-deo são adicionados em quantidades de 250 mg/L de meio; 70 mg/L de mei-o; e 175 mg/L de meio, respectivamente. Os substratos são adicionados diretamente ao meio quente (75e-85eC) (fórmula abaixo), em um misturador, antes da esterilização.

O meio de ágar padrão pode ser feito por adição de 15 g de goma ágar de qualidade bacteriológica à seguinte fórmula de nutrientes Digesto Pancreático de Caseína 5,0 gExtrato de Levedura 3,0 g

Fosfato de Dipotássio 3,0 g

Água Desionizada 990 m l

Citrato Férrico de Amônio 800 mg em 10 ml de água desionizada

(esterilizado separadamente dos outros componentes)

Um meio de teste à base de pectina pode ser preparado usando e então esterilização a 121eC por 15 minutos. O meio deve ser ajustado para resultar em um pH de 7,0. O meio de ágar esterilizado é deixado abaixar até uma temperatura de 459C em um banho de água e então a solução estéril contendo os substratos, preparada como acima descrito, é adicionada. O meio é misturado completamente e vertido em placas de petri estéreis, em um volume de 20 ml/placa.

Um meio de teste à base de pectina pode ser preparado usando as mesmas etapas descritas acima, exceto que 25 g de pectina com pouca metoxila são usados como o agente solidificante, e o meio é vertido, na temperatura ambiente, em placas de petri contendo uma camada de gel fina contendo íons cálcio, que se combinam com a pectina para formar um gel sólido. Um meio de cultura de pectina adequado é descrito na Patente U.S. N- 4.241.186 e na Patente U.S. N2 4.282.317, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Um meio à base de pectina é preferido sobre um meio de ágar padrão, porque ele tem as vantagens de conveniência e independência de temperatura para o usuário. O uso de meios de pectina está bem descrito e aceito como um resultado dos estudos colaborativos de AOAC e outras investigações publicadas e internas.

Um meio de pectine adequado esta comercialmente disponivel da Micrology Laboratories, LLC, sob a marca registrada Easygel®. O meio de base aquoso sem agente gelificante está disponível da Micrology Labs, Go-shen IN., para uso com filtros de membrana.

Inoculação do Meio de Teste com a Amostra

O meio de teste pode ser inoculado com uma amostra a ser testada quanto à presença de microorganismos por qualquer método conhecido na técnica para inocular um meio com uma amostra contendo microorganismos. Por exemplo, a amostra a ser testada pode ser adicionada às placasde petri antes da adição do meio de base de nutrientes (técnica de derramar em placa) ou espalhada sobre a superfície das placas após elas terem esfriado e solidificado (técnica de esfregar e riscar em placa). As amostras líquidas podem também ser filtradas através de um filtro de membrana de micro-poros (tamanho de 0,45 micrometro), que é então colocado sobre a superfície de um meio sólido ou sobre uma almofada saturada com o meio.

Incubação do meio de Teste

O meio de teste inoculado é incubado por um tempo suficiente e em uma temperatura tal para os microorganismos individuais presentes na amostra crescerem em colônias detectáveis. As condições adequadas de incubação para o crescimento de microorganismos em um meio são conhecidas na técnica. Comumente, o meio de teste é incubado por cerca de 24-48 horas, em uma temperatura de cerca de 30g-40-C. Pode ser requerido menos tempo de incubação, tal como cerca de 14 horas, para obter resultados para um substrato fluorescente.

A não ser que sejam usados inibidores da população microbiana geral, a população microbiana geral, bem como os coliformes gerais, a E. coli, as Aeromonas spp., e as Salmonella spp. e as Shigella spp. crescerão no meio de teste incubado. Porque os precipitados formados são insolúveis (exceto pelos substratos fluorogênicos) no meio de teste, eles permanecem na vizinhança imediata dos microorganismos que produzem as diversas enzimas. À medida que os microorganismos se reproduzem para formar as colônias, as colônias mostram-se como unidades formadoras de colônias tendo a cor produzida pelo substrato particular.

Por exemplo, a E. coli produz a p-galactosidase e a oc-galactosidase, porém, ao contrário dos coliformes gerais e das Aeromonas spp., também produz a p-glicuronidase. Portanto, os precipitados insolúveis de cada um do substrato de p-galactosidase, do substrato de oc-galactosidase e do substrato não cromogênico de p-glicuronídeo são formados pela ação das enzimas respectivas, de modo tal que as colônias de E. coli mostram-se como uma cor substancialmente preta, algumas vezes tendo um halo violeta-azul em torno delas.Os coliformes gerais produzem p-galactosidase e ct-galactosidase e consequentemente clivam ambos os substratos de oc-galactosidase e p-galactosidase. No presente exemplo, o substrato de 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo produz uma cor azul-verde ou azul-petróleo, enquanto que o 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo produz uma cor rosa, ou vermelho-rosa. Assim, as colônias de coliformes gerais mostrar-se-ão como uma cor azul-violeta, que é uma combinação das cores produzidas por cada um dos a- e p-galactosídeos, respectivamente.

De modo significativo, entretanto, verificou-se que as Aeromonas spp., que estão estreitamente relacionadas aos coliformes, e dão um padrão quase idêntico de teste bioquímico, são positivas para p-galactosidase e negativas para a-galactosidase. Ou seja, as Aeromonas spp. não hidrolisarão o substrato de a-galactosídeo. Portanto, as colônias de Aeromonas presentes no meio de teste mostrar-se-ão como colônias tendo a cor rosa-vermelho produzida pelo substrato de p-galactosídeo.

Ademais, verificou-se que os membros do gênero Salmonella são positivos para a-galactosidase, porém negativos para p-galactosidase. Ou seja, a Salmonella não hidrolisará o substrato de p-galactosidase. Portanto, as colônias de Salmonella presentes no meio de teste aparecerão como uma cor azul-petróleo, ou azul-verde, produzida pelo substrato de oc-galactosídeo.

Exame do Meio de Teste e Enumeração dos Microorganismos

Os substratos selecionados para o exemplo acima mencionado produzem três cores distintas, e os coliformes gerais são indicados por uma quarta cor, que é uma combinação de duas das três cores. Ou seja, as colônias de E. coli mostram-se como substancialmente pretas, as colônias de coliformes gerais mostram-se como azul-violeta, as colônias de Aeromonas mostram-se como vermelho-rosa, e as colônias de Salmonella mostram-se como azul-petróleo-verde. Embora as tonalidades individuais destas cores possam variar algo no meio de teste, devido a fatores tais como a produção variada de enzimas das entidades biológicas, verificou-se que estas quatro cores são distintas o suficiente, de modo que a confusão entre elas é impro-vável.

As colônias de cada tipo de microorganismo podem ser enumeradas por contagem das colônias ou por outros métodos conhecidos na técnica para enumerar os microorganismos sobre uma placa de teste. O número de colônias de cada tipo geralmente indica o número de microorganismos de cada tipo originalmente presente na amostra, antes da incubação.

Ingredientes Opcionais Inibidores

O método da presente invenção não requer inibidores. Entretanto, o meio pode ser tornado mais seletivo para os coliformes gerais e E. coli, se desejado, pela adição de diversos compostos que são inibitórios para a população microbiana geral, porém têm pouco ou nenhum efeito sobre os coliformes. Os que seguem são alguns compostos que podem ser usados: a) sais biliares, cerca de 0,3 g/litro, b) lauril sulfato de sódio, cerca de 0,2 g/litro, c) desoxicolato de sódio, cerca de 0,2 g/litro, d) Tergitol 7, cerca de 0,1 ml/litro. O uso de um ou mais destes compostos reduz a presença de microorganismos secundários (não coliformes) e torna uma placa menos misturada e elimina a possibilidade de inibição ou interferência pelos organismos não coliformes na amostra. O uso de certos antibióticos pode efetuar o mesmo resultado.

A cefsulodina é comumente usada nos meios de teste atualmente disponíveis para inibir Aeromonas spp. Entretanto, o uso de cefsulodina como um inibidor requer uma etapa extra no processo, viz., a adição estéril de antibiótico esterilizado em filtro. Esta etapa é difícil de controlar. Além disso, a presença de cefsulodina reduz significativamente a vida de prateleira efetiva do meio. Verificou-se que o Ácido nalidíxico pode ser usado, em vez da Cefsulodina, para inibir as Aeromonas spp. com aproximadamente a mesma eficácia. O ácido nalidíxico é preferível porque ele pode sobreviver à temperatura de aproximadamente 120 QC atingida na esterilização em auto-clave dos meios de teste. Portanto, diferente da cefsulodina, o ácido nalidíxico pode ser adicionado aos meios de teste como parte da formulação inicial do meio, antes da esterilização (ver a preparação do meio de teste, acimadescrita). Conclui-se também que a resistência do ácido nalidíxico a condições ambientais desfavoráveis resultará em uma vida de prateleira mais longa para um meio que o contém, em comparação com a cefsulodina.

Indutores

É possível que a produção de enzimas dos coliformes gerais possa ser aumentada pela adição às formulações do meio de quantidades muito pequenas de substâncias conhecidas como indutores de enzimas. Um indutor específico para a p-galactosidase está disponível e é conhecido qui-micamente como isopropil-p-tiogalactopiranosídeo. A adição de aproximadamente 100 mg/litro de meio tem um efeito positivo e notável sobre a velocidade de produção de enzimas para algumas espécies de coliformes. Outros indutores de enzimas estão disponíveis e podem ser adicionados às formulações dos meios, se a produção aumentada de enzima for considerada útil.

Exemplos

Estão listados abaixo exemplos amplos de combinações de meios de teste enzimas substratos, a serem usadas em combinação com a fórmula de nutrientes discutida acima ou outras fórmulas de nutrientes adequadas, as quais podem ser preparadas na prática da presente invenção.

A Tabela III ilustra a flexibilidade das modalidades preferidas que incorporam a presente invenção. A Tabela III é uma matriz de algumas das combinações de quatro cores possíveis, disponíveis para as entidades biológicas preferidas E. coli, coliformes gerais, e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonella a serem detectadas por utilização dos ensinamentos desta divulgação. São possíveis outras combinações de cores. Em muitos casos, uma pluralidade de diferentes substratos atingirá um resultado desejado, a única diferença sendo as cores detectadas para uma enzima específica. A escolha da cor preferida para a detecção de E. coli é indicada com um asterisco na Tabela III, dependendo das cores escolhidas para detectar os outros microorganismos. Conforme discutido acima, os outros substratos cromogênicos não interferem com a cor substancialmente preta, e a cor substancialmente preta é fácil de distinguir das outras cores.Conforme discutido acima, o uso da Tabela III requer levar em consideração o efeito combinado de cores discutido acima, que é produzido pela inclusão de múltiplos substratos cromogenicos em um único meio. Por exemplo, com referência à primeira entrada na Tabela III, pode-se entender que os coliformes gerais aparecerão como uma combinação de (1) verme-Iho-rosa (magenta) e (2) azul-petróleo, a cor resultante sendo azul-violeta. Este é o caso porque os coliformes gerais são sensíveis a dois substratos cromogenicos. Similarmente, os coliformes gerais mostrar-se-ão em um meio de teste, de acordo com a segunda entrada da Tabela III, como uma combinação de (1) vermelho-rosa (magenta) e (2) amarelo.<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>A Tabela IV é uma lista parcial de padrões de enzimas para as entidades biológicas preferidas a serem detectadas de acordo com os ensinamentos desta divulgação. É para ser entendido que alguém na técnica prontamente reconheceria que outras enzimas, as quais são conhecidas e tenham sido produzidas, e as enzimas que são conhecidas somente em um nível teórico, também atuariam satisfatoriamente.

Tabela IV

<table>table see original document page 39</column></row><table>A Tabela V é uma matriz que ensina uma ampla variedade de substratos e as suas cores associadas para uso nos meios de teste de acordo com os ensinamentos desta divulgação. O lado da esquerda da Tabela V indica a cor que resultará quando o componente cromogênico listado for clívado de seu substrato correspondente pela enzima específica para aquele substrato. No caso dos componentes não cromogênicos, a cor é substancialmente preta e o mecanismo de reação requer a presença de íons de um sal na clivagem do substrato, conforme acima explicado.

As enzimas de teste que são produzidas por certas entidades biológicas (ver a Tabela IV) são encontradas no lado direito da tabela V. Os "componentes de substratos" são mostrados à esquerda das enzimas de teste específicas. Cada um dos componentes de substratos listados no lado direito da tabela V pode ser combinado com quaisquer dos componentes cromogênicos ou não cromogênicos listados no lado esquerdo da tabela V, para identificar um substrato específico para uso em um meio de teste. Pode, portanto, ser entendido que a Tabela V ensina uma grande quantidade de substratos possíveis para uso de acordo com a presente invenção. Muitos dos substratos identificados pelo uso acima descrito da tabela V estão comercialmente disponíveis, enquanto que o método para a produção de outros substratos identificados é descrito na literatura. Ainda outros substratos identificados por utilização da tabela V são somente teoricamente possíveis.

Os componentes não cromogênicos estão incluídos no lado esquerdo inferior da Tabela V, e são diferentes dos componentes cromogênicos porque eles não formam cores específicas na clivagem. Em vez disso, os componentes de quinolina ou esculetina combinam-se com os íons de um sal (por exemplo, sal férrico), os quais devem estar presentes no meio quando o substrato for clivado pela enzima específica. O precipitado substancialmente preto formado pelos componentes não cromogênicos é uma combinação do complexo de quinolina ou esculetina - ferro, em vez de um dímero, o qual é formado pelos componentes cromogênicos.

Ao contrário dos componentes não cromogênicos, os componentes cromogênicos devem ser selecionados em vista de todos os outros com-ponentes cromogênicos selecionados para o meio e em vista dos padrões de enzimas das entidades a serem detectadas. A seleção e a concentração dos componentes cromogênicos devem maximizar a distinção entre as respectivas cores produzidas.

Embora muitas possibilidades diversas de componente cromo-gênico e componente de substrato/enzima sejam ensinadas pela Tabela V, outras possibilidades dentro do escopo das reivindicações em anexo seriam possíveis por alguém na técnica. Por exemplo, conforme mostrado na Tabela V, alguém na técnica poderia combinar um grupo N-acetila com muitos dos açúcares dos componentes de substratos listados na Tabela V. Por exemplo, um grupo N-acetila poderia ser combinado com o (3-D-manopiranosídeo para formar o N-acetil-p-D-manosaminídeo, a enzima correspondente sendo a N-acetil-(3-D-manosaminidase. Quaisquer dos componentes cromogênicos ou componentes não cromogênicos listados no lado esquerdo da Tabela V poderiam então ser combinados com o componente de substrato para identificar um substrato. Se o substrato estiver comercialmente disponível ou o método de prepará-lo for conhecido, o substrato poderia ser usado em um meio de teste. Na clivagem do substrato pela enzima correspondente no meio de teste, a cor listada aparecerá.

Geralmente, os ensinamentos desta divulgação podem ser usados como a seguir, para preparar um meio de teste para detectar diversos microorganismos ou tipos de células. Primeiro, os microorganismos desejados a serem detectados e diferenciados são selecionados. Os organismos preferidos a serem detectados são E. coli, coliformes gerais, e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonella. As enzimas produzidas pelos organismos selecionados podem ser identificadas com referência à Tabela IV. Equipado com conhecimento das enzimas específicas produzidas por cada microorganismo, pode-se então identificar os componentes de substratos correspondentes a partir do lado direito da Tabela V. Dependendo da cor desejada, pode-se selecionar um componente cromogênico ou não cromo-gênico a partir da Tabela V, a ser combinado com o componente de substrato para identificar um substrato para a inclusão no meio de teste. Se o subs-trato desse modo identificado estiver comercialmente disponível ou o método de sua síntese for conhecido, o substrato pode ser usado no meio de teste. Tabela V

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>tifiçados e diferenciados são E. coli, coliformes gerais, Aeromonas e/ou Sal-monella.

Com referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados a serem detectados. Com referência ao lado direito da Tabela V, pode ser visto que a enzima de teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de (3-D-glicuronídeo. Assim, um componente cromogênico ou não cromogênico que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. A 8-hidroxiquinolina é escolhida por sua cor substancialmente preta preferida. O primeiro substrato identificado é, portanto, o 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, cuja disponibilidade é descrita acima. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também requerido e é adicionado ao meio de teste de modo que, na clivagem do substrato pela Bgluc, se forme no meio um complexo insolúvel em água substancialmente preto. O precipitado substancialmente preto consiste nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu são comuns para Aeromonas e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu não são produzidas geralmente por Salmonella. Portanto, um componente de substrato correspondendo a uma de Bgal, Bfuc e Bglu pode ser selecionado a partir do lado direito da Tabela V. A Bgal e o componente de substrato associado (3-D-galactopiranosídeo são escolhidos. O componente cromogênico de 6-cloro-3-indolil- produz uma cor vermelho-rosa na clivagem de seu substrato, na presença de Bgal, e é selecionado como o componente cromogênico. O segundo substrato é, portanto, o 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo.

Novamente com referência à Tabela IV, a Bman, a Aara e a Agal são comuns para Salmonella e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bman, a Aara e a Agal não são produzidas por Aeromonas. Assim, uma de Bman, Aara e Agal pode ser escolhida e o seu componente de substrato associado identificado com referência à Tabela V. Aenzima de teste Agal e o componente de substrato respectivo a-D-galactopiranosídeo são escolhidos. A seguir, um componente cromogênico deve ser selecionado a partir da Tabela V. Conforme mostrado no lado esquerdo da Tabela V, o componente cromogênico 5-bromo-4-cloro-3-indolil produz uma cor azul-petróleo na clivagem de seu substrato associado e é, portanto, selecionado. O terceiro substrato é, portanto, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-cc-D-galactopiranosídeo.

Os coliformes gerais têm um amplo padrão de enzimas, que é sensível tanto ao substrato de 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo quanto ao substrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo. Portanto, os coliformes gerais mostrar-se-ão como uma quarta cor distinta, que é uma combinação das cores produzidas pelos dois substratos antes mencionados, respectivamente. Neste caso, a quarta cor será violeta-azul, que é uma combinação de vermelho-rosa e azul-petróleo.

Finalmente, conforme visto na Tabela IV, a E. coli também exibe um amplo padrão de enzimas e é sensível a todos os três substratos escolhidos neste exemplo, viz., 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo, e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-oc-D-

galactopiranosídeo. Contudo, as colônias de E. coli presentes no meio de teste mostrar-se-ão como uma cor substancialmente preta porque, conforme discutido acima, os substratos cromogênicos não interferem com a cor substancialmente preta. De modo vantajoso, esta cor substancialmente preta proporciona um meio superior para distinguir a E. coli, bem como permite que quatro microorganismos separados sejam detectados, quantificados, diferenciados e identificados em um único meio de teste. Ver a Tabela VI. Exemplo II

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma primeira cor; coliformes gerais e Salmonella como uma segunda cor; e Aeromonas como uma terceira cor.

Com referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados aserem detectados. Com referência ao lado direito da Tabela V, pode ser visto que a enzima de teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de p-D-glicuronídeo. Assim, um componente cromogênico ou não cromogênico que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. A 8-hidroxiquinolina é escolhida por sua cor substancialmente preta preferida. O primeiro substrato i-dentificado é, portanto, o 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, cuja disponibilidade é descrita acima. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também requerido e é adicionado ao meio de teste de modo que, na clivagem do substrato pela Bgluc, se forme no meio um complexo insolúvel em água substancialmente preto. O precipitado substancialmente preto consiste nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu são comuns para Aeromonas e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu não são produzidas por Salmo-nella. Usando a Tabela V no modo descrito acima, o 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo é selecionado como o segundo substrato, que produzirá uma cor vermelho-rosa na clivagem, como indicado pela lista de componentes cromogênicos da Tabela V.

Conforme visto na Tabela IV, a enzima Bman é comum para Salmonella, porém não Aeromonas. A partir da tabela V, o componente de substrato associado com Bman é o (3-D-manopiranosídeo. Neste exemplo, deseja-se também produzir a segunda cor distinta (vermelho-rosa) com Salmonella de modo que, no fim, as colônias de Salmonella presentes no meio de teste mostrar-se-ão como a mesma cor que os coliformes gerais presentes no meio de teste. Assim, o componente cromogênico é 6-Cloro-3-indolil-e o terceiro substrato é, portanto, o 6-Cloro-3-indolil-p-D-manopiranosídeo.

Neste exemplo, novamente utilizando a Tabela V, um quarto substrato é identificado, que será clivado por uma das enzimas Bman, Aara, Agal, comuns para Salmonella, para produzir uma terceira cor distinta. U-sando a tabela V no modo descrito acima, o quarto substrato selecionado éo 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo, que produz uma cor a-zul-petróleo-verde na presença de Agal comum para Salmonella.

As cores resultantes das colônias presentes no meio de teste podem ser preditas como se segue. A E. coli exibe um padrão de enzimas amplo que é positivo para todos os quatro substratos escolhidos neste exemplo, incluindo o substrato de 8-hidróxi-glicuronídeo, o qual produz uma cor substancialmente preta na clivagem, na presença dos íons do sal férrico. As colônias de E. coli mostram-se como substancialmente pretas. O Aero-monas tem um padrão de enzimas que reage com somente o substrato de 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo escolhido neste exemplo e, portanto, as colônias de Aeromonas mostram-se como vermelho-rosas. A Salmonella tem um padrão de enzimas que cliva tanto o terceiro quanto o quarto substrato selecionado neste exemplo e, portanto, as colônias de Salmonella mostram-se como roxo-azuis (uma combinação de azul-petróleo e vermelho-rosa). Finalmente, os coliformes gerais são positivos para cada um do segundo, do terceiro e do quarto substratos selecionados e as suas colônias mostram-se como roxo-azuis, indistinguíveis das colônias de Salmonella. Conforme acima discutido, as diferentes cepas de todas as espécies dos diversos gêneros não produzirão, todas, as mesmas quantidades das diversas enzimas, de modo que pode haver ligeiras variações nas tonalidades de roxo-azuis, por exemplo. Exemplo MIA

Os microorganismos selecionados a serem quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli como a primeira cor, coliformes gerais e Aeromonas como uma segunda cor, e Salmonella como uma terceira cor.

Com referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados a serem detectados. Com referência ao lado direito da Tabela V, pode ser visto que a enzima de teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de (3-D-glicuronídeo. Assim, um componente cromogênico ou não cromogênico que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. A 8-hidroxiquinolina é esco-Ihida por sua cor substancialmente preta preferida. O primeiro substrato i-dentificado é, portanto, o 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, cuja disponibilidade é descrita acima. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também requerido e é adicionado ao meio de teste de modo que, na cliva-gem do substrato pela Bgluc, se forme no meio um complexo insolúvel em água substancialmente preto. O precipitado substancialmente preto consiste nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Usando as tabelas IV e V, em um modo similar àquele descrito acima com referência aos Exemplos I e II, o 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo é selecionado como um segundo substrato para combinar com uma das enzimas Bgal, Bfuc e Bglu, comuns para çoliformes e Ae-romonas, porém negativas para Salmonella, para produzir uma segunda cor distinta, neste caso substancialmente vermelho-rosa.

Similarmente, o 6-Cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo é selecionado como um terceiro substrato para combinar com a Agal, que é comum para çoliformes e Salmonella, porém negativa para Aeromonas. Na reação com a enzima, este substrato também produzirá a mesma segunda cor distinta, a saber, vermelho-rosa.

O 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-(3-D-galactopiranosídeo é selecionado como um quarto substrato, para combinar com a enzima Bgal, que é comum para çoliformes e Aeromonas, porém negativa para Salmonella. Este quarto substrato produz uma cor azul-petróleo-verde na reação com Bgal.

As cores resultantes das colônias presentes no meio de teste podem ser preditas como se segue. A E. coli exibe um amplo padrão de enzimas e é positiva para todos os quatro substratos escolhidos neste exemplo. Portanto, as colônias de E. coli mostrar-se-ão como substancialmente pretas. As colônias de çoliformes gerais têm um padrão de enzimas que é positivo para o segundo, o terceiro e o quarto substrato, de modo que as colônias de çoliformes gerais mostram-se como roxo-azuis. As colônias de Aeromonas têm um padrão de enzimas que é positivo para o segundo e o quarto substratos escolhidos, de modo que as colônias de Aeromonas também se mos-tram como roxo-azuis. Finalmente, as enzimas comuns para Salmonella são somente positivas para o terceiro dos quatro substratos, de modo que as colônias de Salmonella mostram-se como vermelho-rosas.

Exemplo IIIB

Como uma variação, o meio de teste do Exemplo IIIA pode ser preparado, de modo tal que as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como azul-petróleo em vez de rosa-vermelhas, todas as outras cores das colônias sendo as mesmas que o Exemplo IIIA. Com referência à Tabela VI, tal pode ser efetuado substituindo o 6-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo do E-xemplo IIIA pelo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo.

Exemplo INC

Um segundo método independente para a produção das mesmas três cores que o Exemplo IIIA, para os mesmos quatro componentes, pode ser obtido por adição de ácido nalidíxico ou outros antibióticos ou inibidores de Aeromonas aos componentes listados no Exemplo I. Ao assim fazer, a cefsulodina ou o ácido nalidíxico ou uma outra substância atua como um inibidor para Aeromonas, de modo que as colônias de Aeromonas não crescem. Se o Aeromonas for eliminado, então as colônias roxo-azuis são todas coliformes sem variação. Se não eliminado, qualquer Aeromonas será contado como parte dos coliformes, o que algumas pessoas podem preferir, visto que o Aeromonas é um organismo indicador importante.

Exemplo IV

Neste exemplo, os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli, coliformes e Salmonella, como uma primeira cor distinta, e Aeromonas, como uma segunda cor distinta. Um meio de teste que atinge este resultado é o meio de teste descrito no Exemplo II, exceto que o primeiro substrato e o sal metálico são omitidos. Assim, porque o padrão de enzimas de E. coli reage com os mesmos substratos que o padrão de enzimas para os coliformes gerais, a E. coli e os coliformes gerais serão a mesma cor neste meio de teste. Especificamente, as colônias de E. coli, coliformes e Salmonella mostrar-se-ão como uma cor roxo-azul, enquanto que as colônias de Aeromonas mostrar-se-ão comouma cor substancialmente vermelho-rosa.

Exemplo V

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli, coliformes gerais e Aeromonas, como uma primeira cor distinta, e Salmonella, como uma segunda cor distinta. Um meio de teste que atinge este resultado é o meio de teste do Exemplo 3, com o primeiro substrato e o sal metálico sendo omitidos. Neste meio de teste, as colônias de E. coli, coliformes gerais e Aeromonas mostrar-se-ão como uma cor geralmente roxo-azul, enquanto que as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como uma cor geralmente azul-petróleo-verde ou como uma cor vermelho-rosa.

Opcionalmente, o 6-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo pode ser substituído pelo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo, de modo que as colônias de Salmonella mostram-se como azul-petróleo, em vez de rosas.

Um terceiro modo de atingir o mesmo resultado é com um antibiótico, preferivelmente o ácido nalidíxico, para inibir o crescimento de colônias de Aeromonas. Se o Aeromonas for eliminado, então as colônias roxas/azuis são todas coliformes sem variação. Se não eliminado, qualquer Aeromonas será contado como parte dos coliformes, o que algumas pessoas podem preferir, visto que o Aeromonas é um organismo indicador importante.

Exemplo VI

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados são E. colie coliformes como uma primeira cor distinta, Aeromonas como uma segunda cor distinta e Salmonella como uma terceira cor distinta. Um meio de teste que atinge este resultado é o meio de teste do Exemplo I, com o primeiro substrato e o sal metálico sendo omitidos. Em tal meio de teste, as colônias de E. colie coliformes gerais mostrar-se-ão como roxo-azul, as colônias de Aeromonas mostrar-se-ão como geralmente ver-melho-rosas, e as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como geralmente azul-petróleo-verde.Exemplo VII

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli como uma primeira cor distinta, a qual é substancialmente preta; coliformes gerais como uma segunda cor distinta, a qual é substancialmente roxo-azul; AeromonasA/ibrio/Plesiomonas como uma terceira cor distinta, a qual é substancialmente vermelho-rosa; e Sal-monella como uma quarta cor distinta, a qual é substancialmente azul-petróleo-verde.

Gom referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados a serem detectados. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta com a clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir da Tabela V. O 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo produz uma cor substancialmente preta na presença de Bgluc e seria a escolha preferida de substrato, conforme explicado abaixo. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também adicionado para formar um complexo insoluvel em água, substancialmente preto, consistindo nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, pode ser visto que as enzimas Ngal e Naglu são comuns para os microorganismos Aeromonas, Ple-siomonas, e Vibríos. Portanto, um substrato adequado para testar todos estes microorganismos como uma única cor distinta é o 6-cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-galactosaminídeo, que produz uma cor substancialmente vermelho-rosa na presença destas enzimas.

Novamente com referência à Tabela IV, a Bman, a Aara e a Agal são comuns para Salmonella e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bman, a Aara e a Agal não são produzidas por Aeromonas. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V, que reage com uma de Bman, Aara e Agal para produzir uma terceira cor distinta. Conforme mostrado na Tabela V, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ct-D-galactosídeo produz uma cor azul-petróleo-verde na presença de Agal e é, portanto, selecionado como um substrato.Neste meio de teste, as colônias de E. coli mostrar-se-ão como substancialmente pretas, as colônias de coliformes gerais mostrar-se-ão como substancialmente roxas/azuis, as colônias de Aeromonas, Vibrio e Plesiomonas mostrar-se-ão como substancialmente vermelho-rosas, e as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como substancialmente azul-petróleo.

Exemplo VIII

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli como uma primeira cor distinta; coliformes e Salmonella como uma segunda cor distinta; e Aeromonas, Vibrio e Plesiomonas como uma terceira cor distinta. Um meio de teste para atingir este resultado é o meio de teste do Exemplo 2, exceto que o quarto substrato escolhido é o 6-Cloro-3-indolil-N-acetil-a-D-galactosaminídeo, ao qual é sensível cada um dos microorganismos Plesiomonas, Vibrios e Aeromonas, de modo que cada uma destas colônias mostra-se como uma cor geralmente vermelho-rosa.

Exemplo IX

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli e coliformes gerais como uma primeira cor distinta, a qual é roxo-azul; Aeromonas, Plesiomonas, e Vibrios como uma segunda cor distinta, a qual é vermelho-rosa; e Salmonella Como uma terceira cor distinta, a qual é azul-petróleo-verde. Este resultado pode ser atingido com o meio de teste como descrito no Exemplo 6, com a adição de 6-Cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-galactosaminídeo, ao qual é sensível cada um dos microorganismos Plesiomonas, Vibrio e Aeromonas.

Exemplo X

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli e coliformes gerais como uma primeira cor; Aeromonas, Vibrio e Plesiomonas como uma segunda cor distinta; e Salmonella como uma terceira cor distinta. Um meio de teste adequado que atinge este resultado é o meio de teste divulgado no Exemplo 7, exceto que o primeiro substrato para detectar as colônias de E. colié omitido. Neste exemplo, as colônias de E. coli e coliformes gerais mostram-se comogeralmente roxas/azuis, o Aeromonas, o Vibrio e o Plesiomonas mostram-se como geralmente vermelho-rosas, e a Salmonella mostra-se como geralmente azul-petróleo-verde. A adição de 6-Cloro-3-indolil-(3-D-galactopiranosídeo é necessária para produzir a cor roxo-azul para as colônias de E. coli.

Exemplo XI

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli, como uma cor substancialmente preta, e coliformes gerais, como uma cor vermelho-rosa. Com referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados a serem detectados. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir da Tabela V. O 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo produz uma cor escura na presença de Bgluc e seria a escolha preferida de substrato. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também adicionado para formar um complexo insolúvel em água, preto, consistindo nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu são comuns para Aeromonas e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu não são geralmente produzidas por Salmonella. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V, o qual reage com uma de Bgal, Bfuc e Bglu para produzir uma segunda cor distinta. O 6-cloro-3-indolil-|3-D-galactopiranosídeo produz uma cor rosa na presença de Bgal e é selecionado como o segundo substrato.

Opcionalmente, o 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo pode ser substituído pelo 5-bromo-6-cloro-3-indolil-f3-D-galactopiranosídeo, de modo que as colônias de Aeromonas e coliformes gerais mostrem-se como azul-petróleo, em vez de rosas.

Conforme observado, o segundo substrato selecionado resultará em colônias de Aeromonas também se mostrando como uma cor geralmente vermelho-rosa. Para evitar o crescimento de colônias de Aeromonas, adicio-na-se um inibidor, preferivelmente o ácido nalidíxico. Assim, as colônias de E. coli mostrar-se-ão como substancialmente pretas, enquanto que as colônias de coliformes gerais mostrar-se-ão como uma cor vermelho-rosa.

Exemplo XII

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli, coliformes gerais e Aero-monas spp. como uma cor substancialmente preta e Salmonella spp. como uma segunda cor distinta. O primeiro substrato selecionado é o 8-hidroxiquinolina-p-D-galactosídeo, que resulta em colônias de E. coli, coliformes gerais e Aeromonas mostrando-se como substancialmente pretas. O segundo substrato escolhido pode ser o 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-cc-D-galactopiranosídeo ou o 6-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo. Se o primeiro destes dois substratos for escolhido, as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como uma cor azul-petróleo, enquanto que se o último dos dois substratos antes mencionados for escolhido, as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como uma cor vermelho-rosa.

Opcionalmente, neste exemplo, o Aeromonas pode ser eliminado por adição de um inibidor, preferivelmente o ácido nalidíxico, conforme discutido em detalhe acima.

Exemplo XIII

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são os mesmos que no Exemplo 1, exceto que este exemplo ilustra uma correção para os positivos falsos. Ou seja, é possível que certas Enterobacter e Klebsiella spp. incomuns mostrem-se como colônias pretas juntamente com a E. coli no meio de teste divulgado no Exemplo 1. Assim, a contagem de E. coli poderia ser erroneamente alta.

Neste exemplo, o 4-metil-umbreliferil-(3-D-xilopiranosídeo é adicionado ao meio de teste descrito no Exemplo 1. Ao assim fazer, as Enterobacter e Klebsiella spp. que se mostram como colônias pretas também exibirão fluorescência, desse modo permitindo a redução na contagem de falsos positivos de E. coli. Este exemplo ilustra a flexibilidade das modalidades queincorporam a presente invenção. O componente fluorescente não interfere com a cor substancialmente preta, de modo que as colônias pretas são facilmente distinguidas a olho nu. Ainda, sob luz ultravioleta, os falsos positivos podem ser detectados e substancialmente reduzidos por exame das colônias pretas por fluorescência.

Exemplo XIV

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma cor substancialmente preta e Salmonella spp. como rosa-vermelha. Os coliformes gerais são incolores neste exemplo.

Com referência ao Exemplo I, a E. coli é sensível ao 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo. Os coliformes gerais, a Salmonella e o Aeromo-nas não são sensíveis ao 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo. Assim, o primeiro substrato escolhido é o 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo.

Com referência à tabela IV, a enzima esterase é positiva para Salmonella spp., porém não quaisquer dos outros microorganismos preferidos a serem detectados. Com referência à tabela V, o substrato caprilato de 6-cloro-3-indolila pode ser identificado, e produzirá uma cor rosa-vermelha na clivagem, e é, portanto, escolhido como o segundo substrato.

Neste meio de teste, as colônias de E. coli mostrar-se-ão como substancialmente pretas e as colônias de Salmonella mostrar-se-ão como rosa-vermelha.

Exemplo XV

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma cor substancialmente preta, Salmonella spp. como azul-escuro-roxa, e coliformes gerais como vermelho-rosa.

Com referência ao Exemplo I, a E. coli é sensível ao 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo. Os coliformes gerais, a Salmonella e o Aeromo-nas não são sensíveis ao 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo. Assim, o primeiro substrato escolhido é o 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo.

Com referência às tabelas IV e V, o caprilato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila pode ser identificado como o segundo substrato ao qual a Salmonella será sensível. Com referência adicional à Tabela V, o caprilato de 5-bromo-4-eloro-3-indolila forma uma cor azul-petróleo na clivagem.

O 6-cloro-3-indolil-ct-D-galactopiranosídeo, que produz uma cor rosa-vermelha na clivagem, é escolhido como o terceiro substrato ao qual a E. coli, os coliformes gerais e a Salmonella são sensíveis.

Neste exemplo, as colônias de E. coli mostram-se como substancialmente pretas, as colônias de coliformes gerais mostram-se como vermelho-rosa, e a Salmonella mostra-se como azul-violeta (= vermelho-rosa + azul-petróleo).

Exemplo XVI

Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E coli como uma cor substancialmente preta e coliformes gerais como uma segunda cor distinta.

Com referência à Tabela IV, a E. coli produz a enzima Bgluc, e a Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados a serem detectados. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir da Tabela V. O 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo produz uma cor escura na presença de Bgluc e seria a escolha preferida de substrato. Um sal metálico, tal como o citrato férrico de amônio, é também adicionado para formar um complexo insolúvel em água, preto, consistindo nos íons férricos e na aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu são comuns para Aeromonas e coliformes gerais. Entretanto, conforme indicado na Tabela IV, a Bgal, a Bfuc e a Bglu não são geralmente produzidas por Salmonella. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V, o qual reage com uma de Bgal, Bfuc e Bglu para produzir uma segunda cor distinta. O 5-bromo-4-cloro-3-indolil-|3-D-galactopiranosídeo pode ser escolhido como o segundo substrato, em cuja situação as colônias de E. coli aparecerão como substancialmente pretas e as colônias de coliformes gerais aparecerão como azul-petróleo. Opcionalmente, o 5-bromo-6-cloro-3-indolil-galatopiranosídeo pode ser escolhido como o segundo substrato, em cuja situação as colônias de E. coli aparecerão como substancialmente pretas e as colônias de coliformes gerais aparecerão magentas. Para evitar o crescimento de colônias de Aeromonas, um inibidor, preferivelmente o ácido nalidíxico, é adicionado. Assim, as colônias de E. coli mostrar-se-ão como substancialmente pretas, enquanto que as colônias de coliformes gerais mostrar-se-ão como uma cor magenta.

Exemplo XVII

Alguns microorganismos selecionados que podem ser detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli, coliformes gerais, Aeromonas, e/ou Salmonella. Os substratos 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo, 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo, e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo são adicionados em quantidades de aproximadamente 125 mg/l de meio; 200 mg/l de meio; e 65 mg/l de meio, respectivamente. A preparação e a inoculação restantes do meio de teste neste exemplo são similares àquelas discutidas acima, exceto que os íons de sal não são requeridos quando o meio não tiver um substrato não cromogênico. Neste meio, a E. coli, que reage com todos os substratos, aparecerá como uma cor azul muito escura e/ou roxa porque a alta concentração do (3-D-glicuronídeo predominará. Os coliformes gerais, que reagem tanto com o oc-quanto com o p-D-galactopiranosídeo, aparecem como uma cor azul-claro-cinza. A Salmonella, que reage com o a-D-galactopiranosídeo, terá uma cor azul-petróleo, e o Aeromonas, que reage com o p-D-galactopiranosídeo, terá uma cor rosa-vermelha. Pode ser benéfico se a concentração/quantidade usada do p-D-glicuronídeo for maior do que o p-D-galactopiranosídeo para aumentar a diferença na coloração/tonalidade escura entre a E. colie os coliformes gerais, visto que estes substratos utilizam um composto de mesma cor neste exemplo. Entretanto, mesmo se as mesmas quantidades de p-D-glicuronídeo e p-D-galactopiranosídeo fossem usadas, a E. coli pode ser ainda mais escura e distinguível dos coliformes gerais, visto que ela reage com ambos estes substratos, enquanto que os coliformes gerais não reagem com o p-D-glicuronídeo.Exemplo XVIII

Um substrato de p-D-glicuronídeo alternativo que pode ser utilizado é o 5-iodo-3-indolil-p-D-glicuronídeo, que é comumente conhecido como lodo-Gluc. Os microorganismos selecionados a serem detectados, quantificados e diferenciados neste exemplo são E. coli, coliformes gerais, Aeromonas, e Salmonella. A concentração do (3-D-glicuronídeo deve ser suficiente para proporcionar uma cor roxa muito escura, que pode ser prontamente distinguida da cor azul-cinza dos coliformes gerais.

Exemplo XIX

Um outro substrato de p-D-glicuronídeo alternativo que pode ser usado é o indoxil-p-D-glicuronídeo, que é comumente conhecido como IBDG. Com uma concentração suficiente de IBDG, a E. coli aparecerá mais escura do que as outras colônias, como uma cor azul-escuro-roxa. Os coliformes gerais, a Salmonella e o Aeromonas surgirão como azul-claro-cinza, azul-petróleo e vermelho-rosa, respectivamente.

Exemplo XX

Neste exemplo, o 4-metilumbeliferil-p-D-glicuronídeo, comumente conhecido como MUGIuc, é usado em vez de um p-D-glicuronídeo cromo-gênico ou não cromogênico. Com este meio, a E. coli será azul-claro-cinza e exibirá fluorescência sob luz ultravioleta, e os coliformes gerais serão azul-claro-cinza, a Salmonella será azul-petróleo, e o Aeromonas será rosa-vermelho na luz ambiente. Uma vantagem do MUGIuc é que os tempos de incubação requeridos para a detecção das colônias podem ser substancialmente menores do que aquele requerido com os outros substratos cromogê-nicos ou não cromogênicos. Um tempo de incubação de cerca de 14 horas deve ser suficiente para detectar E. coli com este substrato. Uma desvantagem é que os produtos fluorescentes são mais prontamente difusíveis do que os outros compostos e pode tornar mais difícil quantificar a E. coli. Entretanto, mesmo se a E. coli não puder ser quantificada em um dado teste, certamente ainda será adequado para um teste de presença/ausência para E. coli.Exemplo XXI

Neste meio, o 4-metilumbeliferil-p-D-glicuronídeo (MUGIuc) é combinado com um dos outros substratos de glicuronídeo cromogênicos ou não cromogênicos anteriormente mencionados, bem como com os a- e p-D-galactopiranosídeos cromogênicos. Este meio oferece a vantagem que um teste de presença/ausência para a E. coli pode ser efetuado com tempos de incubação mais curtos do que requeridos para os substratos cromogênicos e não cromogênicos. Além disso, se por qualquer razão, for incerto se as colônias de organismos detectados são E. coli ou coliformes gerais, o meio pode ser examinado sob luz ultravioleta, de modo que as colônias de E. coli podem ser confirmadas por fluorescência. Isto proporciona uma checagem dupla sobre a exatidão da identidade das colônias.

Exemplo XXII

Neste exemplo, um dos substratos de p-D-glicuronídeo cromogênicos ou não cromogênicos, anteriormente mencionados, é combinado com um oc-D-galactopiranosídeo cromogênico e um p-D-galactopiranosídeo cromogênico. Além disso, o meio inclui um 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosídeo. O substrato de glicuronídeo em um exemplo é um 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo cromogênico. O meio também inclui um 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo e um 5-bromo-4-cloro-3-indolil oc-D-galactopiranosídeo. Este meio oferece a vantagem que quaisquer organismos que reagirem com um cc-D-galactopiranosídeo exibirão fluorescência sob luz ultravioleta. Adicionalmente, os resultados fluorescentes tendem a mostrar-se até mais rápidos do que quaisquer resultados tendo uma reação positiva com os substratos cromogênicos ou não cromogênicos. Desse modo, a E. coli, os coliformes gerais, e a Salmonella, os quais todos reagem com o a-D-galactopiranosídeo, exibirão fluorescência sob luz ultravioleta. Ademais, quando as reações com os substratos cromogênicos tiverem tido tempo suficiente, esta E. coli será um azul muito escuro devido a uma reação tanto com os substratos de glicuronídeo e oc-D-galactosídeo azul-petróleo quanto com o substrato rosa de p-D-galactosídeo. Os coliformes mostrar-se-ão como um azul mais claro do que a E. coli devido a uma com-binação do substrato de oc-D-galactosídeo azul-petróleo e o substrato de p-D-galactosídeo rosa. O Aeromonas será uma cor rosa em resposta á reação com o substrato de p-D-galactosídeo e a Salmonella será uma cor azul-petróleo em resposta à reação com o substrato de a-D-galactosídeo.

Exemplo XXIII

Este exemplo utiliza os substratos cromogênicos de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo; 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo; e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo. Entretanto, em vez do 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosídeo, utiliza-se um 4-metilumbeliferil-p-D-galactopiranosídeo. Sob luz ambiente, a £ coli, os coliformes gerais, o Aeromonas e a Salmonella terão as mesmas cores que no Exemplo XXII. Além disso, a E. coli e os coliformes gerais ainda exibirão fluorescência, visto que ambos reagirão com o substrato de p-D-galactosídeo; entretanto, neste caso, o Aeromonas também exibirá fluorescência sob luz ultravioleta, por causa da presença da atividade de p-D-galactosidase. A Salmonella, entretanto, não exibirá fluorescência, uma vez que ela é negativa para o p-D-galactopiranosídeo.

Nos Exemplos XXII e XXIII, o mesmo componente de cor cro-mogênico é usado no p-D-glicuronídeo e no oc-D-galactopiranosídeo. A mesma quantidade de componente de cor pode ser usada em cada substrato, e a E. coli ainda aparecerá como um azul mais escuro do que os coliformes gerais, visto que os produtos formados na presença de E. coli resultam tanto do p-D-glicuronídeo e do oc-D-galactopiranosídeo, os quais, ambos, produzem uma cor azul-petróleo, como do p-D-galactopiranosídeo, que produz uma cor rosa, enquanto que os coliformes somente reagem com os a- e P-D-galactopiranosídeos. Também é possível aumentar a quantidade do componente de cor no p-D-glicuronídeo em comparação com o oc-D-galactopiranosídeo, de modo que a E. coli aparecerá ainda mais escura, tornando a E. coli mais prontamente distinguível dos coliformes gerais. Ademais, como uma outra alternativa, um substrato não cromogênico, tal como 8-hidroxiquinolina mais íons, pode ser usado para o p-D-glicuronídeo, em vez de um substrato cromogênico, como nos outros exemplos acima men-cionados.

Exemplo XXIV

Neste exemplo, um 4-metilumbeliferil-p-D-glicuronídeo, comu-mente conhecido como MUGIuc, é usado em combinação com um substrato de p-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico. Por exemplo, um substrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-(3-D-glicuronídeo pode ser usado. Este meio proporciona a capacidade de efetuar uma validação dupla dos resultados positivos para E. coli, em um único teste. Além disso, o método proporciona um meio de efetuar uma checagem inicial para E. coli sob luz ultravioleta, visto que a E. coli, que reage com o p-D-glicuronídeo, exibirá fluores-cência quando exposta à luz ultravioleta. Ademais, a E. coli também reagirá com o substrato cromogênico e será vista como uma cor azul-petróleo sob luz ambiente. Os resultados com o MUGIuc provavelmente estarão disponíveis antes dos resultados com o substrato cromogênico para um exame inicial, e o exame de acompanhamento do meio quanto à presença de colônias azul-petróleo confirmará a presença de E. coli, e permitirá a quantificação das colônias. Este método oferece uma vantagem significativa sobre os outros testes de verificação atuais para a checagem de E. coli, tais como um teste para a checagem quanto à presença de triptofanase, que é também única para E. coli e não está geralmente presente em outros coliformes. Entretanto, não há nenhum modo atual de incorporar o teste tanto para a triptofanase quanto para o glicuronídeo no mesmo meio, de modo que a checagem para triptofanase requer uma preparação e um teste separados.

Exemplo XXV

Neste meio, utilizam-se um 4-metilumbeliferil-a-D-galactopirano-sídeo fluorescente e o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo cromogênico. A E. coli e os coliformes gerais, ambos, reagem com o oc-D-galactopiranosídeo e o p-D-galactopiranosídeo, de modo que os coliformes totais aparecerão como azul-petróleo sob luz ambiente e exibirão fluores-cência sob luz ultravioleta. A E. coli será a mesma cor que os coliformes gerais neste meio particular. O Aeromonas, que reage com o p-D-galactopiranosídeo, aparecerá como azul-petróleo sob luz ambiente e nãoexibirá fluorescência, e a Salmonella, que não será colorida na luz ambiente, exibirá fluorescência sob uma luz ultravioleta.

Exemplo XXVI

Este exemplo utiliza o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopira-nosídeo cromogênico e o 4-metilumbeliferil-p-D-galactopiranosídeo fluorescente. Como com o Exemplo XXV, a E. coli e os coliformes gerais aparecerão iguais, de modo que os coliformes totais serão azul-petróleo sob luz ambiente e exibirão fluorescência sob luz ultravioleta. O Aeromonas não terá nenhuma cor sob luz ambiente, porém exibirá fluorescência sob uma luz ultravioleta, e a Salmonella mostrar-se-á como azul-petróleo em luz ambiente e não exibirá fluorescência sob luz ultravioleta. Deve estar evidente que outros componentes de substratos cromogênicos e não cromogênicos ou fluo-rogênicos podem substituir aqueles especificados nos Exemplos XXV e XX-VI.

Embora tenham sido descritos acima diversos exemplos amplos, os quais incorporam a presente invenção, é para ser entendido que a presente invenção não é para ser limitada pelos exemplos divulgados aqui. De fato, a divulgação e os exemplos acima mencionados ensinam alguém versado na técnica um número virtualmente ilimitado de meios de teste, que estariam dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Além disso, embora esta invenção tenha sido descrita como tendo um objetivo preferido, a presente invenção pode ser adicionalmente modificada dentro do espírito e do escopo desta divulgação. Este pedido é, portanto, pretendido para cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção, usando os seus princípios gerais. Ademais, este pedido é pretendido para cobrir tais desvios da presente divulgação, conforme venham dentro da prática conhecida ou usual na técnica à qual esta invenção diz respeito e que incidam dentro dos limites das reivindicações em anexo.

Claims (36)

1. Meio de teste para detectar, quantificar ou diferenciar coliformes gerais, E. coli, Aeromonas e Salmonella, o dito meio de teste compreendendo:um substrato de p-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogê-nico, o qual forma um primeiro produto que é visível na luz ambiente na presença de E. coli;um substrato de a-D-galactosídeo cromogênico, o qual forma um segundo produto que é visível na luz ambiente na presença da Salmonella, E. colie outros coliformes; eum substrato de p-D-galactosídeo cromogênico, o qual forma um terceiro produto que é visível na luz ambiente na presença de Aeromonas, E. coli e outros coliformes, os ditos produtos dos ditos substratos de a-D-galactosídeo e de p-D-galactosídeo formando uma cor combinada na presença de coliformes gerais e E. coli, e onde os coliformes gerais, a E. coli, o Aeromonas, e a Salmonella são todos distinguíveis um do outro; eum quarto substrato sendo um de um substrato de p-D-glicuronídeo, um substrato de a-D-galactosídeo, ou um substrato de p-D-galactosídeo, o qual forma um produto que exibe fluorescência sob luz ultravioleta na presença de pelo menos um de E. coli, coliformes gerais, Salmonella, ou Aeromonas.

2. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, onde o dito quarto substrato é um substrato de p-D-glicuronídeo e o produto do quarto substrato formado na presença de E. coli exibe fluorescência sob uma luz ultravioleta.

3. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, onde o dito quarto substrato é um substrato de a-D-galactosídeo, e o produto do quarto substrato formado na presença de E. coli, coliformes gerais e/ou Salmonella exibe fluorescência sob uma luz ultravioleta.

4. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, onde o dito quarto substrato é um substrato de p-D-galactosídeo e o produto formado na presença de E. coli, coliformes gerais e/ou Aeromonas exibe fluorescênciasob uma luz ultravioleta.

5. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, onde o dito substrato de B-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico produz cor e um do dito substrato de a-D-galactosídeo cromogênico ou dito substratode B-D-galactosídeo cromogênico inclui o mesmo componente de cor que o dito substrato de B-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico.

6. Meio de teste de acordo com a reivindicação 5, onde o dito substrato de B-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico e o dito substrato de a-D-galactosídeo cromogênico ou o dito substrato de B-D-galactosídeo cromogênico estão presentes em quantidades iguais.

7. Meio de teste de acordo com a reivindicação 5, onde o dito substrato de B-D-glicuronídeo e o dito um do dito substrato de a-D-galactosídeo cromogênico ou dito substrato de B-D-galactosídeo cromogênico estão presentes em diferentes quantidades.

8. Meio de teste de acordo com a reivindicação 7, onde há mais do dito substrato de B-D-glicuronídeo do que do dito substrato de a-D-galactosídeo cromogênico ou dito substrato de B-D-galactosídeo cromogênico do mesmo componente de cor.

9. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, onde o dito quarto substrato inclui o componente fluorescente 4-metilumbeliferila.

10. Meio de teste para detectar, identificar e qualificar ou quantificar entidades biológicas, o dito meio compreendendo:um meio à base de nutrientes;um primeiro substrato, o qual forma um primeiro produto na presença de uma primeira entidade biológica;um segundo substrato, o qual forma um segundo produto na presença de uma segunda entidade biológica; eum terceiro substrato, o qual forma um terceiro produto na presença de uma terceira entidade biológica, os ditos segundo e terceiro substratos também formando um produto combinado na presença de uma quarta entidade biológica, e a dita primeira entidade biológica também formando um produto combinado na presença dos ditos segundo e terceiro substratos.

11. Meio de teste de acordo com a reivindicação 10, onde o dito primeiro e o dito segundo substrato incluem o mesmo componente formador de cor, e a dita primeira entidade biológica aparece mais escura do que a dita quarta entidade biológica, visto que a dita primeira entidade biológica reage com todos os ditos substratos.

12. Meio de teste de acordo com a reivindicação 11, onde o dito primeiro substrato inclui mais do dito componente formador de cor do que o dito segundo substrato.

13. Meio de teste de acordo com a reivindicação 10, onde o dito primeiro e o dito terceiro substrato incluem o mesmo componente formador de cor, e a dita primeira entidade biológica aparece mais escura do que a dita quarta entidade biológica, visto que a dita primeira entidade biológica reage com todos os ditos substratos.

14. Meio de teste de acordo com a reivindicação 11, onde o dito primeiro substrato inclui mais do dito componente formador de cor do que o dito terceiro substrato.

15. Meio de teste de acordo com a reivindicação 10, incluindo um quarto substrato, o qual forma um produto na presença de uma das ditas entidades biológicas que exibe fluorescência sob uma luz ultravioleta.

16. Meio de teste de acordo com a reivindicação 15, onde o dito primeiro substrato é um substrato de (3-D-glicuronídeo cromogênico ou não cromogênico e a dita primeira entidade biológica é E. colr, o dito segundo substrato é um substrato de a-D-galactosídeo cromogênico e a dita segunda entidade biológica é Salmonella; o dito terceiro substrato é um substrato d p-D-galactosídeo cromogênico e a dita terceira entidade biológica é Aero-monas; e a dita quarta entidade biológica é coliformes gerais.

17. Meio de teste para detectar, identificar, ou quantificar uma entidade biológica, o dito meio compreendendo: um meio à base de nutrientes;um primeiro substrato, o qual é um substrato cromogênico ounão cromogênico, que forma um produto que é visível na luz ambiente na presença de uma primeira entidade biológica; eum segundo substrato, o qual produz um produto que exibe fluo-rescência sob uma luz ultravioleta, na presença da dita primeira entidade biológica.

18. Meio de teste de acordo com a reivindicação 17, onde o dito primeiro substrato é um substrato de B-D-glicuronídeo e a dita primeira entidade biológica é E coli.

19. Meio de teste de acordo com a reivindicação 18, onde o segundo substrato é um substrato de 4-metilumbeliferil B-D-glicuronídeo.

20. Meio de teste de acordo com a reivindicação 19, onde o dito meio proporciona uma verificação dupla da presença de E. coli, onde uma primeira verificação é a fluorescência de E coli sob luz ultravioleta e a segunda verificação é uma identificação visual sob luz ambiente de um produto a partir do substrato cromogênico ou não cromogênico.

21. Meio de teste de acordo com a reivindicação 20, onde a dita verificação de E coli como exibindo fluorescência sob uma luz ultravioleta é detectável antes da identificação visível do substrato cromogênico ou não cromogênico.

22. Meio de teste de acordo com a reivindicação 17, onde o dito primeiro substrato é um oc-D-galactopiranosídeo e o dito segundo substrato é um B-D-galactopiranosídeo.

23. Meio de teste de acordo com a reivindicação 22, onde a dita primeira entidade biológica é coliformes totais e o dito segundo substrato também produz um produto que exibe fluorescência sob uma luz ultravioleta na presença de Aeromonas.

24. Meio de teste de acordo com a reivindicação 23, onde o dito primeiro substrato é o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-cc-D-galactopiranosídeo, e o produto formado na presença de coliformes totais é azul-petróleo, e um produto azul-petróleo também é formado na presença de Salmonella.

25. Meio de teste de acordo com a reivindicação 17, onde o dito primeiro substrato é um B-D-galactopiranosídeo e o dito segundo substrato é um cc-D-galactopiranosídeo.

26. Meio de teste de acordo com a reivindicação 25, onde a ditaprimeira entidade biológica é coliformes totais e o dito segundo substrato também produz um produto que exibe fluorescência sob uma luz ultravioleta na presença de Salmonella.

27. Meio de teste de acordo com a reivindicação 26, onde o dito primeiro substrato é o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo, e o produto formado na presença de coliformes totais é azul-petróleo, e um produto azul-petróleo é também formado na presença de Aeromonas.

28. Meio de teste de acordo com a reivindicação 17, adicionalmente incluindo um ou mais substratos adicionais que são específicos para uma ou mais enzimas diferentes e adicionais do que o primeiro e o segundo substratos e que produzem um produto que é visível na luz ambiente ou exibe fluorescência sob luz ultravioleta na presença de entidades biológicas diferentes da dita primeira entidade biológica, e onde todos os ditos produtos são visualmente distinguíveis um do outro.

29. Meio de teste de acordo com a reivindicação 28, onde o dito primeiro substrato é um substrato de p-D-glicuronídeo e a dita primeira entidade biológica é E. coli.

30. Meio de teste de acordo com a reivindicação 28, onde o dito segundo substrato é um substrato de 4-metilumbeliferil p-D-glicuronídeo.

31. Meio de teste de acordo com a reivindicação 28, onde um dos ditos substratos adicionais é um substrato de p-D-galactosídeo.

32. Meio de teste de acordo com a reivindicação 28, onde o dito primeiro substrato é o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo, o dito segundo substrato é o 4-metilumbeliferil-p-D-glicuronídeo e o dito substrato adicional é o 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo, e a dita primeira entidade biológica é E. coli e uma entidade biológica adicional é uma espécie de conforme geral diferente de E. coli.

33. Meio de teste de acordo com a reivindicação 32, onde o dito meio proporciona uma verificação dupla da presença de E. coli, com a primeira verificação sendo uma identificação visual sob luz ambiente de um produto a partir do dito primeiro substrato, e uma segunda verificação é a fluorescência de E. coli sob luz ultravioleta, e onde a espécie de coliformegeral aparece como colônias de cor rosa/vermelha a partir do efeito do dito substrato adicional de 6-Cloro-3-lndolil-(3-D-galactosídeo, e a E. coli aparecerá como colônias azuis/roxa na luz ambiente devido à combinação dos ditos substratos de --5-Bromo-4-Cloro-3-lndolil-p-D-glicuronídeo e de 6-Cloro-3-Indolil-p-D-galactosídeo.

34. Meio de teste de acordo com a reivindicação 33, onde a dita verificação de E. coli como exibindo fluorescência sob uma luz ultravioleta é detectável antes da identificação visível a partir dos substratos cromogênicos.

35. Meio de teste de acordo com a reivindicação 32, adicionalmente incluindo um substrato de 5-Bromo-4-Cloro-3-lndolil-a-D-galactosídeo,uma terceira entidade biológica sendo uma espécie de Salmonella, e uma quarta entidade biológica sendo uma espécie de Aeromonas.

36. Meio de teste e as entidades biológicas de acordo com a reivindicação 35, onde a E. coli aparece azul/roxa em luz ambiente e exibe fluorescência sob luz ultravioleta, os coliformes gerais aparecem azuis-cinza na luz ambiente, a Salmonella aparece azul petróleo verde na luz ambiente, e o Aeromonas aparece rosa/vermelho na luz ambiente de modo que a E. coli, os coliformes gerais, a Salmonella, e o Aeromonas todos sejam visualmente distinguíveis um do outro.