BR112013029740B1 - dispositivo de cultura para a detecção de um microrganismo alvo e uso de um dispositivo de cultura - Google Patents

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Abstract

DISPOSITIVO DE CULTURA PARA A DETECÇÃO DE UM MICRORGANISMO ALVO, SISTEMA PARA A DETECÇÃO DE UM MICRORGANISMO DE SALMONELLA E MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS DE SALMONELLA. A presente invenção refere-se a um artigo para a detecçãode microrganismos de Salmonella. O artigo compreende um meio nutritivo altamente seletivo e uma pluralidade de sistemas indicadores. Um método de uso do artigo para detectar microrganismos de Salmonella também é fornecido.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[001] Os microrganismos de Salmonellasão um agente causador significativo de doenças transmitidas por alimentos. Estes microrganismos podem ser encontrados em carnes cruas, vegetais, laticínios e alimentos processados, como manteiga de amendoim. Uma infecção por Salmonellapode resultar em sintomas de enterocolite como febre, dor abdominal e diarreia, bem como náusea e vômitos ocasionais. Grandes fábricas de produção de alimentos são fontes de produtos alimentícios contaminados que podem ser distribuídos a um grande número de consumidores, diversos dos quais podem ser infectados com as bactérias.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[002] Em geral, a invenção está relacionada a um artigo, um sistema, e um método para a detecção de um microrganismo. Em particular, o sistema e o método podem ser usados para se detectar microrganismos que pertencem ao gênero Salmonella.O artigo da presente invenção inclui um meio nutritivo e uma combinação de agentes altamente seletiva que evita substancialmente o crescimento da maioria dos microrganismos, enquanto permite o crescimento de microrganismos de Salmonella.O artigo inclui adicionalmente até três sistemas indicadores, cada sistema indicador servindo para uma função exclusiva de indicar a possível presença de um microrganismo de Salmonella.Quando o artigo da presente invenção indica a possível presença de um microrganismo de Salmonella,um quarto sistema indicador exclusivo pode ser usado para indicar adicionalmente a presença de um microrganismo de Salmonella.Vantajosamente, o sistema e o método podem ser usados para indicar a presença de um microrganismo de Salmonelladentro de algumas horas após o método ser iniciado.
[003] Em um aspecto, a presente descrição apresenta um dispositivo de cultura para a detecção de um microrganismo alvo. O dispositivo de cultura pode compreender um meio de cultura seletivo que inclui nutrientes para facilitar o crescimento do microrganismo alvo e uma pluralidade de agentes seletivos que inclui cefsulodina, ácido nalidíxico, estreptomicina, meticilina, e sais biliares. O dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente um primeiro sistema indicador diferencial e um agente gelificante.
[004] Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente um sistema indicador não diferencial para indicar a presença do microrganismo alvo. Em qualquer uma das modalidades acima, o primeiro sistema indicador diferencial pode compreender um indicador de pH. Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente um segundo sistema indicador diferencial para indicar a presença de um microrganismo não alvo. Em qualquer uma das modalidades acima, o segundo indicador diferencial pode compreender um substrato enzimático β- galactosidase cromogênico. Em qualquer uma das modalidades acima, o meio de cultura seletivo pode compreender um meio de cultura seletivo seco e reidratável, em que o agente gelificante compreende um agente gelificante seco e solúvel em água fria. Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo de cultura pode ser um dispositivo de cultura de filme fino.
[005] Em ainda um outro aspecto, a presente descrição apresenta um método para detecção de um microrganismo de Salmonella. O método pode compreender o fornecimento de uma amostra líquida, qualquer um dos dispositivos de cultura acima, e um terceiro sistema indicador diferencial. O método pode compreender adicionalmente o contato de um volume predefinido da amostra, no dispositivo de cultura, com o meio de cultura seletivo; o primeiro sistema indicador; o sistema indicador não diferencial, se presente; o segundo sistema indicador, se presente; e o agente gelificante para formar um dispositivo de cultura inoculado. O método pode compreender adicionalmente a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo; observação do meio de cultura para detectar uma indicação de uma possível presença do microrganismo alvo na amostra; quando houver uma indicação da possível presença do microrganismo alvo, colocação do terceiro diferencial em contato com o meio de cultura hidratado; e observação do terceiro sistema indicador diferencial no meio de cultura hidratado para uma indicação da presença do microrganismo alvo.
[006] Em ainda um outro aspecto, a presente descrição apresenta um método para detecção de microrganismos de Salmonella. O método pode compreender o fornecimento de uma amostra, qualquer um dos dispositivos de cultura de filme fino acima, e um terceiro sistema indicador diferencial. O método pode compreender adicionalmente, no dispositivo de cultura, o contato de um volume predefinido de um líquido aquoso livre de Salmonellacom o meio de cultura seletivo; o primeiro sistema indicador diferencial; o sistema indicador não diferencial, se presente; o segundo sistema indicador diferencial, se presente; e o agente gelificante para formar um meio de cultura hidratado. O método pode compreender adicionalmente a inoculação do meio de cultura hidratado com a amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado; incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo; observação do meio de cultura hidratado para detectar uma indicação de uma possível presença do microrganismo alvo na amostra; quando houver uma indicação da possível presença do microrganismo alvo, colocação do terceiro diferencial em contato com o meio de cultura hidratado; e observação do terceiro sistema indicador diferencial no meio de cultura hidratado para uma indicação da presença do microrganismo alvo.
[007] Em qualquer uma das modalidades do método acima, a detecção de uma indicação da possível presença do microrganismo alvo pode compreender adicionalmente observar uma colônia que reage com o sistema indicador não diferencial e o primeiro sistema indicador diferencial, mas não reage com o segundo sistema indicador diferencial. Em qualquer uma das modalidades acima, após o contato do segundo componente com o meio de cultura hidratado, o método pode compreender adicionalmente a incubação do dispositivo de cultura por um segundo período de tempo. Em qualquer uma das modalidades do método acima, a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo pode compreender incubar o dispositivo de cultura inoculado durante cerca de 0,5 horas a cerca de 24 horas. Em qualquer uma das modalidades do método acima, a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um segundo período de tempo pode compreender incubar o dispositivo de cultura inoculado durante cerca de 30 minutos a cerca de 360 minutos.
[008] Em um outro aspecto, a presente descrição apresenta um sistema para a detecção de um microrganismo de Salmonella.O sistema pode compreender um dispositivo de cultura que compreende um meio nutritivo que é altamente seletivo para microrganismos de Salmonellae pelo menos dois sistemas indicadores diferenciais, em que um primeiro sistema indicador diferencial é um indicador positivo do microrganismo de Salmonellae um segundo sistema indicador diferencial é um indicador negativo do microrganismo de Salmonella. O sistema pode compreender adicionalmente um artigo de detecção que compreende um terceiro sistema indicador diferencial, em que o terceiro sistema indicador diferencial é um indicador positivo do microrganismo de Salmonella.
[009] Em qualquer modalidade do sistema, cada um dentre o segundo e o terceiro sistemas indicadores diferenciais podem compreender um substrato enzimático cromogênica, em que cada substrato enzimático cromogênica compreende um componente de carboidrato e um cromóforo. Em qualquer modalidade do sistema, cada um dentre o segundo e terceiro sistemas indicadores diferenciais pode compreender o mesmo cromóforo. Em qualquer modalidade do sistema, o segundo sistema indicador diferencial pode compreender um indicador cromogênico de atividade enzimática de β- galactosidase. Em qualquer modalidade do sistema, o terceiro sistema indicador diferencial compreende um indicador cromogênico de atividade enzimática de a- galactosidase.
[010] As palavras "preferencial" e "de preferência"referem-se às modalidades da invenção que podem proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem, também, ser preferenciais sob circunstâncias iguais ou diferentes. Além disso, a recitação de uma ou mais modalidades preferenciais não implica que outras modalidades não sejam úteis e não tem a intenção de excluir outras modalidades do escopo da invenção.
[011] O termo "sistema indicador não diferencial", como usado aqui, refere-se a um sistema indicador geral como um corante indicador, por exemplo, que não distingue tipos diferentes de microrganismos.
[012] O termo "sistema indicador diferencial", como usado aqui, refere-se a um sistema indicador que distingue entre dois ou mais tipos de microrganismos. Em algumas modalidades, um sistema indicador diferencial pode compreender, por exemplo, um carboidrato e um indicador de pH, em que o sistema pode distinguir entre microrganismos que fermentam o carboidrato em produtos finais ácidos e microrganismos que não fermentam o carboidrato em produtos finais ácidos. Em algumas modalidades, um sistema indicador diferencial pode compreender um substrato enzimático cromogênica ou fluorogênica, em que o sistema pode distinguir entre microrganismos que compreendem uma enzima para reagir com o substrato enzimático e microrganismos que não compreendem uma enzima para reagir com o substrato enzimático.
[013] Os termos "compreende" e variações do mesmo não têm um significado limitador, em que esses termos aparecem na descrição e nas reivindicações.
[014] Para uso na presente invenção, "um,""uma,""o,""a,""ao menos um,""ao menos uma,""um ou mais"e "uma ou mais"são usados de maneira intercambiável. Dessa forma, por exemplo, um micro-organismo pode ser interpretado como "um ou mais"micro-organismos.
[015] O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos mencionados.
[016] Para uso na presente invenção, as recitações de intervalos numéricos com extremos incluem todos os números contínuos nesta faixa (por exemplo 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
[017] O sumário anterior da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica mais particularmente as modalidades ilustrativas. Em diversos lugares ao longo do pedido, orientação é fornecida através de listas de exemplos, nas quais os exemplos podem ser usados de várias maneiras. Em cada caso, a lista recitada serve apenas com um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva.
[018] Detalhes adicionais destas e outras modalidades são demonstrados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens se tomarão aparentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[019] A Figura 1 é uma vista em perspectiva superior de uma modalidade de um dispositivo de cultura para detectar microrganismos de Salmonellade acordo com a presente descrição.
[020] A Figura 2 é uma vista superior do dispositivo de cultura da Figura 1 mostrando o dispositivo de cultura em uma posição "aberta" para inoculação do dispositivo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[021] Os métodos presentes para detecção de microrganismos de Salmonella em amostras de alimento incluem o uso de um procedimento de enriquecimento seletivo para aumentar o número e/ou a concentração de microrganismos alvo (Salmonella), em relação a microrganismos não alvo (por exemplo, não Salmonella Enterobacteriaceae: Citrobacter, E. coli, Proteus/Morganella/Providencia, não Enterobactericeae: Aeromonas, etc.. Após o procedimento de enriquecimento, que dura tipicamente de 16 a 48 horas, a cultura resultante pode ser testada quanto à presença de microrganismos de Salmonella através de uma variedade de técnicas que são conhecidas na técnica como, por exemplo, técnicas de plaqueamento, técnicas de imunodiagnóstico (por exemplo, ELISA, imunocromatografia), e técnicas genéticas (por exemplo, PCR, rt-PCR, técnicas de hibridização). Cada uma destas técnicas exige tempo adicional para identificar os microrganismos de Salmonella, exigem operadores altamente treinados para executar as técnicas e/ou interpretar os resultados, e com frequência exigem reagentes, dispositivos, e/ou equipamentos caros.
[022] A presente descrição apresenta um dispositivo de cultura para a detecção de microrganismos de Salmonella. A Figura 1 mostra uma vista em perspectiva superior de uma modalidade de um dispositivo de cultura 110 parcialmente aberto, de acordo com a presente descrição. O dispositivo de cultura 110 é similar em construção aos dispositivos de cultura de filme seco apresentados na patente US n° 4.565.783, que está aqui integralmente incorporada, por referência.
[023] O dispositivo de cultura 110 compreende um substrato autossuportado à prova d'água 112 e uma capa 124. Em uma posição fechada, a capa 124 está em posição adjacente ao substrato 112.
[024] O substrato 112 é, de preferência, um filme relativamente rígido de um material como poliéster, polipropileno ou poliestireno que não irá absorver ou, de outro modo, ser afetado pela água. Os filmes de poliéster de aproximadamente 0,10 a 0,18 mm (0,004 a 0,007 polegadas) de espessura, filmes de polipropileno de aproximadamente 0,10 a 0,20 mm (0,004 a 0,008 polegadas) de espessura e filmes de poliestireno de aproximadamente 0,38 mm (0,015 polegadas) de espessura se mostraram funcionais. Outros substratos adequados incluem papel com um revestimento de polietileno ou outro revestimento à prova d'água. O substrato 12 pode ser ou transparente ou opaco, dependendo de se alguém deseja ver as colônias de bactéria no substrato. Para facilitar a contagem de colônias de bactéria, o substrato 12 tem, de preferência, um padrão de grade quadrada estampado no mesmo.
[025] O substrato 12 é revestido em sua superfície superior com uma camada de adesivo 116, que serve para manter o pó 114, que compreende um agente gelificante seco e/ou nutrientes em uma camada única uniforme para hidratação fácil. O adesivo 116 deve ser insolúvel em água e não inibitório ao crescimento dos microrganismos. De preferência, o adesivo 116 é suficientemente transparente quando molhado para permitir a visualização das colônias de bactéria ao longo do filme revestido com o adesivo 116. É preferencial que o adesivo 116 seja sensível à pressão. Entretanto, adesivos ativados por calor onde uma substância com ponto de fusão mais baixo é aplicada como revestimento sobre uma substância com ponto de fusão mais alto podem também ser usados.
[026] Os adesivos ativados por água, como mucilagem, podem também ser úteis. O adesivo 116 deve ser aplicado como revestimento sobre o substrato 112 em uma espessura que é, de preferência, menor que o diâmetro das partículas do agente gelificante e/ou nutrientes em pó. O objetivo é aplicar adesivo 116 suficiente para aderir as partículas ao substrato, mas não tanto que as partículas sejam completamente embebidas em adesivo 116.
[027] Uma camada única uniforme de pó 114 é desejada, com uma área superficial suficiente exposta para hidratação. Em geral, uma camada adesiva na faixa de espessura de 0,0051 a 0,013 mm (0,0002 a 0,0005 polegadas) é adequada. Um adesivo preferencial 116 é um copolímero de iso-octilacrilato/acrilamida (em uma razão molar de 94/6). Outros adesivos sensíveis à pressão que podem ser usados incluem acrilato de isooctila/ácido acrílico (em uma razão molar de 95/5 ou 94/6) e borracha de silicone. Adesivos que se tomam leitosos quando expostos à água são menos preferenciais, mas podem ser usados em conjunto com um substrato não transparente ou onde a visualização das colônias não seja necessária.
[028] Uma camada única de pó solúvel em água fria 114 é aderida uniformemente à camada adesiva 116. O pó 114 compreende ao menos um ingrediente selecionado do grupo que consiste em um agente gelificante, um ou mais nutrientes para microrganismos em crescimento, e uma mistura de um agente gelificante e um ou mais nutrientes para microrganismos em crescimento. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "pó" designa um material particulado finamente dividido com um diâmetro médio menor que 400 micrometres. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "solúvel em água fria" designa um material que forma uma solução em água à temperatura ambiente.
[029] A "solubilidade em água fria" dos pós empregados nos dispositivos da presente invenção pode resultar, por exemplo, da inclusão nestes pós de um agente gelificante adequado. Os agentes gelificantes adequados para inclusão no pó 114 incluem ambos agentes gelificantes naturais e sintéticos que formam soluções em água à temperatura ambiente. Os agentes gelificantes como hidroxi etil celulose, carboximetilcelulose, poliacrilamida, goma de alfarrobeira e algina formam soluções em água à temperatura ambiente e são agentes gelificantes adequados para o fornecimento de pós que são "solúveis em água fria".
[030] Conforme indicado, o pó 114 pode compreender apenas um agente gelificante. Onde o dispositivo, conforme fabricado, contém um pó que compreende apenas agente gelificante, o usuário final adiciona seus próprios nutrientes especiais "adaptados" para os tipos de microrganismos que ele deseja cultivar. Por exemplo, nutrientes em pó secos podem ser suspensos em um líquido de evaporação rápida como etanol ou "freon". Em outras instâncias, nutrientes pulverizados secos podem ser suspensos ou dissolvidos em soluções aquosas. Uma alíquota deste líquido é adicionada à superfície do substrato 112, que foi revestida anteriormente com adesivo e agente gelificante. O líquido é deixado para evaporar, deixando uma grande quantidade de nutrientes junto com o agente gelificante.
[031] Quando o agente gelificante for incluído em pó 114, uma quantidade suficiente de agente gelificante é aderida ao substrato 112, de modo que uma quantidade pré-determinada de água ou de uma amostra aquosa, por exemplo, de 1 a 3 mililitros, colocada sobre o substrato irá formar um gel que tem uma viscosidade de cerca de 1.500 cps ou mais, quando medida a 60 rpm com um viscosímetro Brookfield Modelo L VF a 25°C. Os géis com esta viscosidade irão permitir manuseio e empilhamento convenientes, e fornecem identificação distinta da colônia. Na maioria dos casos, de 0,025 a 0,050 gramas de goma guar sobre uma área superficial de 20,3 cm2 (3,14 polegadas quadradas) irá fornecer um gel viscoso o suficiente quando hidratado com 1 a 3 mililitros de uma amostra aquosa. O tamanho das partículas de pó pode ser usado para controlar o peso de revestimento por unidade de área. Por exemplo, uma escala de aproximadamente 100 mesh de goma guar reveste um peso de cerca de 0,0098 g/cm (0,05 gramas/2 polegadas) de diâmetro do disco; e uma escala de 400 mesh de goma guar reveste a um peso de cerca de 0,0049 g/cm (0,025 gramas/2 polegadas) de diâmetro do disco. Se quantidades adicionais de agente gelificante e/ou nutrientes forem necessárias, a capa 124 desta modalidade pode também ser revestida, conforme descrito aqui.
[032] Em qualquer modalidade, os dispositivos de cultura da presente descrição podem compreender um indicador não diferencial como cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), por exemplo. Em algumas modalidades, pode ser desejável incorporar um sistema indicador não diferencial ao pó 114. Alternativamente, o sistema indicador não diferencial (por exemplo, um corante) pode ser incorporado ao adesivo 116. Os corantes adequados são aqueles que são metabolizados por qualquer microrganismo em crescimento, e que faz com que as colônias sejam coloridas para facilitar a visualização. Exemplos de tais corantes incluem cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), vermelho de p-tolil tetrazólio, violeta de tetrazólio, azul de veratril tetrazólio e corantes relacionados.
[033] Para alguns usos pode ser desejável formar um meio rígido o bastante para permitir inoculação de microrganismos por esfriamento. Para formar um meio estriável, pode ser desejável incluir uma pequena quantidade de agente de reticulação em pó 114, onde o pó 114 inclui um agente gelificante. Por exemplo, com goma guar, agentes de reticulação como tetraborato de potássio, alumínio ou sais de cálcio podem ser adicionados em uma quantidade menor que 1,0 por cento, em peso, do pó 114. Deve-se tomar cuidado ao selecionar um agente de reticulação que não afete substancialmente o crescimento do microrganismo pretendido.
[034] A capa 124 é de preferência transparente para facilitar a visualização e, opcionalmente, a contagem das colônias de bactéria, e é substancialmente impermeável à bactérias e vapor d'água. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "substancialmente impermeável à bactérias e vapor de umidade"designa capas que evitam contaminação indesejada do meio desidratado durante transporte, armazenagem e uso dos dispositivos, e que fornece um ambiente que irá sustentar o crescimento dos microrganismos durante o período de incubação. Em geral, a capa 124 terá as mesmas propriedades que o substrato 112, mas não precisa ser tão rígida. Um material preferencial para a capa 124 é um filme de polipropileno de 0,041 mm (1,6 mil) orientado biaxialmente. A capa 124, pode ser revestida com uma camada opcional de adesivo (não mostrada). Em determinadas modalidades preferenciais, a capa 124 pode ser aderida ao substrato 112 através de uma fita adesiva de dupla-face 126 ou apenas um adesivo sensível à pressão, por exemplo.
[035] Revestido sobre ao menos uma porção de uma superfície da capa 124 está um revestimento 120 que é substancialmente isento de água e que consiste essencialmente em um material reconstituível por água fria que compreende um componente selecionado do grupo que consiste em um agente gelificante, um ou mais agentes seletivos, um ou mais nutrientes para microrganismos em crescimento, um sistema indicador não diferencial, um ou mais sistemas indicadores diferenciais, e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos componentes anteriormente mencionados. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase "substancialmente isento de água" designa um revestimento que tem um conteúdo de água não maior que cerca de o conteúdo de água do revestimento desidratado, uma vez que ele tenha sido deixado se equilibrar com o ambiente.
[036] O material empregado no revestimento 120 é reconstituível por água fria. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "reconstituível por água fria" designa um material que forma uma solução, sol ou gel em água à temperatura ambiente. Os agentes gelificantes adequados para inclusão no revestimento desta modalidade (se tais estiverem contidos no revestimento) incluem os agentes gelificantes descritos acima que formam soluções em água a temperatura ambiente. Além disso, revelou-se que ágar, depois ser dissolvido em água fervente e depositado como um revestimento, é um material que é "reconstituível por água fria".
[037] Uma mistura de revestimento preferencial é preparada misturando-se os seguintes ingredientes: Proteose peptonada n° 3 50 gramas Peptona de porcino 14 gramas Extrato de levedura 6 gramas Cloreto de sódio 10 gramas Ácido MOPS 3,2 gramas Sal de sódio MOPS 5,2 gramas Vermelho de fenol 1,0 gramas Sais biliares n° 3 2,0 gramas 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-galactopiranosídeo 0,8 gramas Goma guar 13 gramas Água deionizada 1 litro
[038] Será entendido por um versado na técnica que a mistura acima inclui ao menos dois agentes seletivos (por exemplo, cloreto de sódio e sais biliares n° 3). Será adicionalmente entendido por um versado na técnica que a mistura acima inclui ao menos dois componentes (por exemplo, vermelho de fenol e 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosideo) que podem funcionar como um indicador diferencial ou uma porção de um sistema indicador diferencial. Por exemplo, vermelho de fenol pode ser usado em uma formulação com um composto metabolizável (por exemplo, 2-desoxi-D-ribose ou ureia) para formar um sistema indicador diferencial para indicar a presença de um microrganismo como um microrganismo de Salmonella,por exemplo. Os microrganismos de Salmonellapodem fermentar o 2-desóxi-D-ribose em subprodutos ácidos, produzindo assim uma zona ácida que pode ser visualmente detectada na presença de um indicador de pH. Os microrganismos de Salmonellapodem reagir adicionalmente com 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D- galactopiranosídeo para formar colônias de cor preta. Os microrganismos não- Salmonella (por exemplo, microrganismos coliformes) podem reagir com 5- bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosideo, formando colônias de cor verde azulada. Surpreendentemente, apesar do fato de que ambos os substratos de enzima cromogênica supracitados compreendem o mesmo cromóforo (5-bromo- 4-cloro-3-indoxil-), no artigo da presente invenção da presente descrição, eles são hidrolisados pelos microrganismos para produzir produtos com cores visualmente distintas. Os sistemas indicadores podem ser incorporados no dispositivo de cultura em uma camada adesiva, uma camada de pó, e/ou um revestimento reidratável seco.
[039] Em adição aos ingredientes seletivos mencionados na mistura acima, a mistura para revestimento pode compreender adicionalmente uma combinação altamente seletiva de antibióticos que permitem o crescimento de microrganismos de Salmonella,enquanto evitam substancialmente o crescimento de uma variedade de outros microrganismos (por exemplo, "não alvo"). Um exemplo não limitador de tal combinação inclui uma mistura de sal de Cefsulodina sódica (cerca de 12 mg/L), sal de ácido nalidíxico sódico (cerca de 4 mg/L), sal de sulfato de estreptomicina (cerca de 4 mg/L), e sal de meticilina sódica (cerca de 45 mg/L).
[040] Referindo-se novamente à Figura 1, a capa 124 inclui um elemento espaçador 118 aplicado à superfície da capa 124 que está voltada para o substrato 112. O elemento espaçador 118 inclui um orifício circular 122 cortado através do centro para expor o revestimento reidratável seco 120 na capa 124. As paredes do orifício 122 fornecem uma cavidade de tamanho e formato predeterminado para confinar o meio após a hidratação. O elemento espaçador 118 deve ser espesso o bastante para formar uma cavidade do volume desejado, por exemplo, 1,2 ou 3 mililitros. Espuma de polietileno ou espuma de poliestireno de célula fechada são materiais preferenciais para o elemento espaçador 118, mas qualquer material hidrofóbico (sem umedecimento), inerte a microrganismos, e capaz de suportar esterilização pode ser usado.
[041] Também é mostrado na Figura 1 uma perfuração 126 que atravessa a capa 124. A perfuração 126 facilita a abertura do dispositivo de cultura 110 e, em algumas modalidades, pode manter o dispositivo de cultura 110 aberto, conforme mostrado na Figura 2.
[042] A Figura 2 mostra uma vista superior de um dispositivo de cultura 110 aberto da presente descrição. É mostrado na Figura 2 o substrato 112, a capa 124, o elemento espaçador 118, o orifício 122, e a perfuração 126. Nesta posição, uma amostra líquida (não mostrada) pode ser colocada no substrato 112 ou na cavidade formada pelo elemento espaçador 118 para inocular a placa.
[043] Um dispositivo de cultura de filme fino da presente descrição pode ser usado para testar uma amostra para a presença de um microrganismo de Salmonella.Os materiais de amostra incluem materiais de amostra que são suspeitos de conter um microrganismo de Salmonella. O material de amostra pode ser um líquido, um sólido, um sólido suspenso ou disperso em um líquido, um hidrogel. Em qualquer uma das modalidades, a amostra pode compreender microrganismos e/ou materiais (por exemplo, alimentos, bebidas) que foram submetidos a uma ou mais técnicas de preparação de amostra, incluindo, mas não se limitando a concentração (por exemplo, por filtração, precipitação, aglomeração, centrifugação, absorção, e/ou adsorção), enriquecimento (por exemplo, enriquecimento de crescimento seletivo), e purificação (por exemplo, purificação cromatográfica).
[044] Em uma modalidade, um volume predefinido da amostra líquida pode ser colocado em contato com o revestimento na capa e o pó sobre o substrato para hidratar o dispositivo de cultura e formar um dispositivo de cultura inoculado. Em uma modalidade alternativa, revestimentos reconstituíveis por água do dispositivo de cultura podem ser hidratados com um líquido aquoso (por exemplo, água estéril) e a amostra pode ser aplicada (por exemplo, por uma pipeta, um chumaço, uma alça), usando-se opcionalmente a técnica de estriamento de placa, ao dispositivo de cultura hidratado. De preferência, um revestimento no dispositivo de cultura compreende um primeiro sistema indicador (por exemplo, 2-desoxi-D-ribose e um indicador de pH como vermelho de fenol), um sistema indicador não diferencial (por exemplo, TTC), e um segundo sistema indicador (por exemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D- galactopiranosídeo, "X-gal"). Opcionalmente, o dispositivo de cultura pode compreender um indutor para uma atividade microbiana associada a um ou mais dos sistemas indicadores como isopropil-β-D-tiogalactosideo, um indutor de atividade enzimática de β-galactosidase. Outro sistema indicador diferencial usado para indicar a presença de um microrganismo de Salmonellacompreende ureia e um indicador de pH como vermelho de fenol, por exemplo.
[045] Após a inoculação do dispositivo de cultura, o dispositivo de cultura pode ser incubado durante um período de tempo para facilitar o crescimento dos microrganismos de Salmonella.Um versado na técnica irá reconhecer a temperatura ótima para facilitar o crescimento de Salmonella.O dispositivo de cultura pode ser incubado durante cerca de 0,5 a cerca de 48 horas, de preferência de cerca de 0,5 a cerca de 24 horas, com mais preferência, de cerca de 0,5 horas a cerca de 6 horas.
[046] Após o período de incubação, o meio de cultura inoculado pode ser observado para uma indicação de uma possível presença de um microrganismo de Salmonella.Uma indicação é o aparecimento de colônias vermelhas devido à formação de corante formazan a partir do TTC. Ainda mais adicionalmente, uma zona ácida circundando uma colônia vermelha indica que as bactérias na colônia fermentaram 2-desoxi-D-ribose em subprodutos ácidos, uma reação que pode indicar que a colônia compreende microrganismos de Salmonella.Se a colônia tem uma zona de cor verde azulada associada a uma reação com X-gal, isto indica que a colônia provavelmente não é um microrganismo de Salmonella.
[047] A presença de colônias vermelhas circundadas por uma zona ácida (por exemplo, uma zona amarela quando o indicador de pH é vermelho de fenol) sugere a presença de um microrganismo de Salmonellano dispositivo de cultura. Este resultado presumível pode ser adicionalmente suportado pelo contato de outro indicador diferencial (por exemplo, 5-bromo-4- cloro-3-indoxil-α-D-galactopiranosideo) com a colônia. Em algumas modalidades, isto pode ser feito pela abertura da placa e aplicação de uma solução de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D-galactopiranosídeo ao meio de cultura. Alternativamente, isto pode ser feito pela abertura da placa e aplicação de um artigo reidratável seco que compreende um revestimento que inclui 5- bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D-galactopiranosídeo. O artigo pode ser produzido conforme descrito na patente U.S. n° 6.022.682, que está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. O 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D- galactopiranosídeo é colocado em contato com a zona de crescimento do dispositivo de cultura durante um período de tempo como, por exemplo, de cerca de 30 minutos a cerca de 360 minutos. Opcionalmente, o contato pode ocorrer a uma temperatura elevada (por exemplo, 37°C).
[048] Após o contato do 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D- galactopiranosídeo com o meio de cultura, o dispositivo de cultura pode ser observado para uma cor bem escura (por exemplo, quase preto) associada às colônias. Qualquer colônia vermelha associada a uma zona ácida e uma cor bem escura (por exemplo, quase preta) da hidrólise de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D- galactopiranosídeo é muito provavelmente um microrganismo de Salmonella.
MODALIDADES
[049] A modalidade 1 é um dispositivo de cultura para a detecção de um microrganismo alvo, que compreende: um meio de cultura seletivo que inclui nutrientes para facilitar o crescimento do microrganismo alvo e uma pluralidade de agentes seletivos que inclui cefsulodina, ácido nalidíxico, estreptomicina, meticilina, e sais biliares; um primeiro sistema indicador diferencial; e um agente gelificante.
[050] A modalidade 2 é o dispositivo de cultura da modalidade 1, que compreende, ainda, um sistema indicador não diferencial para indicar a presença do microrganismo alvo.
[051] A modalidade 3 é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o primeiro sistema indicador diferencial compreende um indicador de pH.
[052] A modalidade 4 é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende, ainda, um segundo sistema indicador diferencial para indicar a presença de um microrganismo não alvo.
[053] A modalidade 5 é o dispositivo de cultura da modalidade 4, em que o segundo indicador diferencial compreende um substrato enzimático β- galactosidase cromogênica.
[054] A modalidade 6 é o dispositivo de cultura da modalidade 4 ou da modalidade 5, que compreende, ainda, um indutor de atividade enzimática de β-galactosidase microbiana.
[055] A modalidade 7 é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o meio de cultura seletivo compreende um meio de cultura seletivo reidratável seco, em que o agente gelificante compreende um agente gelificante seco solúvel em água fria.
[056] A modalidade 8 é o dispositivo de cultura da modalidade 7, caracterizada pelo fato de que o dispositivo de cultura compreende um dispositivo de cultura de filme fino.
[057] A modalidade 9 é um sistema para a detecção de um microrganismo de Salmonella,que compreende: um dispositivo de cultura que compreende um meio nutritivo que é altamente seletivo para microrganismos de Salmonellae pelo menos dois sistemas indicadores diferenciais, em que um primeiro sistema indicador diferencial é um indicador positivo do microrganismo de Salmonella,em que um segundo sistema indicador diferencial é um indicador negativo do microrganismo de Salmonella', e um artigo de detecção que compreende um terceiro sistema indicador diferencial, em que o terceiro sistema indicador diferencial é um indicador positivo do microrganismo de Salmonella.
[058] A modalidade 10 é o sistema da modalidade 9, em que cada um dentre o segundo e o terceiro sistemas indicadores diferenciais compreende um substrato enzimático cromogênico, em que cada substrato enzimático cromogênico compreende um componente de carboidrato e um cromóforo.
[059] A modalidade 11 é o sistema da modalidade 10, em que cada um dentre o segundo e o terceiro sistemas indicadores diferenciais compreende o mesmo cromóforo.
[060] A modalidade 12 é o sistema de qualquer uma das modalidades de 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o segundo sistema indicador diferencial compreende um indicador cromogênico de atividade enzimática de β-galactosidase.
[061] A modalidade 13 é o sistema de qualquer uma das modalidades de 9 a 11, em que o terceiro sistema indicador diferencial compreende um indicador cromogênico de atividade enzimática de β-galactosidase.
[062] A modalidade 14 é um método para a detecção de microrganismos de Salmonella,que compreende: fornecimento de uma amostra líquida, do dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades de 1 a 8, e de um terceiro sistema indicador diferencial; contato de um volume predefinido da amostra, no dispositivo de cultura, com o meio de cultura seletivo; o primeiro sistema indicador; o sistema indicador não diferencial, se presente; o segundo sistema indicador, se presente; e o agente gelificante para formar um dispositivo de cultura inoculado; incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo; observação do meio de cultura inoculado para detectar uma indicação de uma possível presença na amostra do microrganismo alvo; quando há uma indicação da possível presença do microrganismo alvo, contato do terceiro diferencial com o meio de cultura hidratado; e observação do terceiro sistema indicador diferencial no meio de cultura hidratado para uma indicação da presença do microrganismo alvo.
[063] A modalidade 15 é um método para detecção de microrganismos de Salmonella,que compreende: fornecimento de uma amostra, de um dispositivo de cultura da modalidade 8, e de um terceiro sistema indicador diferencial; no dispositivo de cultura, contato de um volume predefinido de um líquido aquoso de livre de Salmonellacom o meio de cultura seletivo; o primeiro sistema indicador diferencial; o sistema indicador não diferencial, se presente; o segundo sistema indicador diferencial, se presente; e o agente gelificante para formar um meio de cultura hidratado; inoculação do meio de cultura hidratado com a amostra para formar um dispositivo de cultura inoculado; incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo; observação do meio de cultura hidratado para detectar uma indicação de uma possível presença na amostra do microrganismo alvo; quando há uma indicação da possível presença do microrganismo alvo, contato do terceiro diferencial com o meio de cultura hidratado; e observação do terceiro sistema indicador diferencial no meio de cultura hidratado para uma indicação da presença do microrganismo alvo.
[064] A modalidade 16 é o método da modalidade 14 ou modalidade 15, em que a detecção de uma indicação da possível presença do microrganismo alvo compreende adicionalmente a observação de uma colônia que reage com o sistema indicador não diferencial e o primeiro sistema indicador diferencial não reage com o segundo sistema indicador diferencial.
[065] A modalidade 17 é o método de qualquer uma das modalidades 14 a 16, em que, após o contato do segundo componente com o meio de cultura hidratado, o método compreende adicionalmente a incubação do dispositivo de cultura por um segundo período de tempo.
[066] A modalidade 18 é o método de qualquer uma das modalidades de 14 a 17, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo compreende incubação do dispositivo de cultura inoculado durante cerca de 0,5 horas a cerca de 24 horas.
[067] A modalidade 19 é o método da modalidade 18, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo compreende incubação do dispositivo de cultura inoculado durante cerca de 0,5 horas a cerca de 6 horas.
[068] A modalidade 20 é o método de qualquer uma das modalidades 14 a 19, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um segundo período de tempo compreende incubação do dispositivo de cultura inoculado durante cerca de 30 minutos a cerca de 360 minutos.
EXEMPLOS
[069] A presente invenção não deve ser considerada limitada pelos exemplos específicos descritos a seguir, mas em vez disso deve ser entendida por abranger todos os aspetos da invenção conforme razoavelmente demonstrado nas reivindicações em anexo. Várias modificações, processos equivalentes, bem como numerosas estruturas às quais a presente invenção pode ser aplicada serão prontamente aparentes aos versados na técnica a qual a presente invenção é direcionada, mediante exame do presente relatório descritivo. Exceto onde especificado em contrário, todas as porcentagens e partes são expressas em peso. Os materiais, exceto onde especificado em contrário, estão disponíveis comercialmente junto à Alpha Biosciences, de Baltimore, MD, EUA.
MATERIAIS EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE UM ARTIGO DE DETECÇÃO PARA SALMONELLA.
[070] Um elemento de base para uma placa de cultura de filme fino foi preparado de acordo com o Exemplo 4 da patente U.S. n° 5.409.838, exceto pelo fato de que o adesivo foi aplicado como revestimento sobre um papel revestido com polietileno à prova d'água que tem linhas de grade quadradas de 12,7 mm (0,5 polegadas) no mesmo. Uma composição em pó foi preparada misturando-se 2 partes, em peso, de 2-desoxi-D-ribose (2DR) e 98 partes de goma guar (M150 goma guar MEYPROGAT goma, Meyhall Chemical AG). Uma pequena quantidade (menor que 0,5%) de sílica (sílica CAB-O-SIL, Cabot Corp., de Boston, MA, EUA) foi adicionada conforme necessário para processamento. A mistura em pó foi, então, polvilhada sobre o papel de revestimento adesivo, que foi inclinado e golpeado levemente para remover o excesso de pó.
[071] Uma mistura de caldo foi preparada pela adição dos materiais mencionados na Tabela 1 a 1 litro de água deionizada em um recipiente, e misturada de acordo com o método descrito no Exemplo 1 da patente US n° 6.022.682. TABELA 1
Figure img0001
* disponível junto à Biosynth AG, Suíça
[072] Uma mistura de agente seletivo foi preparada pela adição de 12 mg de sal de Cefsulodina sódica (Research Products International, Chicago, IL, EUA), 4 mg de sal de sódio de ácido nalidíxico (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 4 mg de sal de sulfato de estreptomicina (Sigma), 45 mg de sal de sódio de meticilina (Sigma), 0,4 mg de isopropil-B-D-galactopiranosídeo (Sigma), e 2 g de ureia (EMD), a 20 ml de água deionizada estéril, e mexida em um frasco de vidro até dissolução completa. O caldo foi resfriado até cerca de 40°C e a mistura seletiva foi adicionada com mistura vigorosa.
[073] Um filme de cobertura e placas de cultura de filme fino foram preparadas conforme descrito no Exemplo VI da patente US n° 6.022.682, exceto pelo fato de que o caldo seletivo foi aplicado como revestimento sobre o lado tratado por corona de um filme de poliéster de 0,074 mm (2,9 mil) de espessura para o filme de cobertura. As placas mediam aproximadamente 7,6 cm por 10,2 cm, com um círculo de 5 cm de diâmetro cortado a partir da espuma para fornecer uma cavidade ao redor do centro da placa.
EXEMPLO 2. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS DE SALMONELLA.
[074] Uma cultura pura de bactérias Salmonella(designação de cultura 3M FSDCC SALMO que foi isolada de uma mistura de carne) foi inoculada em água tamponada com peptona (Merck, Darmstadt, Alemanha) e incubada de um dia para o outro a 37°C. O caldo resultante tinha uma concentração de aproximadamente 1x109 unidades de formação de colônia/ml (ufc/ml). O caldo foi diluído em água de peptona tamponada estéril até uma concentração final de aproximadamente 1x106 ufc/ml.
[075] A placa de cultura de filme fino do Exemplo 1 foi preparada por esfriamento pela adição de 1,5 mL de tampão Butterfield até aproximadamente o meio da posição da cavidade no revestimento por pó. O filme de cobertura foi fechado e o gel foi deixado para se hidratar durante cerca de uma hora. Quando o filme de cobertura foi aberto, o revestimento de caldo havia sido transferido para a superfície de gel. Uma alça de 10 microlitres da concentração final foi aplicada por esfriamento à superfície de caldo no gel. A tampa foi fechada e a placa foi incubada de um dia para o outro a 37 C. As placas foram analisadas para contagens de colônia. Pontos vermelhos indicaram que colônias eram aparentes.
EXEMPLO 3. Uso DE UM ARTIGO INDICADOR PARA DETECTAR MICRORGANISMOS DE SALMONELLA.
[076] Um disco descrito nos Exemplos 1 e 2 do pedido de patente US n° 61/428.722, que está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade, é colocado sobre as colônias e o disco é incubado a 37°C. O disco é examinado para crescimento após 3, 4 e 5 horas.
[077] A descrição completa de todas as patentes, pedidos de patente, publicações, e material disponível eletronicamente citado na presente invenção estão aqui incorporadas a título de referência. Caso qualquer exista inconsistência entre a descrição do presente pedido e a(s) descrição(ões) de qualquer documento aqui incorporado, a título de referência, a descrição do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos apresentados anteriormente foram fornecidos apenas por uma questão de clareza. Nenhuma limitação desnecessária deve ficar implícita a partir disso. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.
[078] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue os cabeçalhos, a menos que esteja especificado. Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras modalidades estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (8)

1. DISPOSITIVO DE CULTURA PARA A DETECÇÃO DE UM MICRORGANISMO ALVO, caracterizado por compreende: um meio de cultura seletivo que inclui nutrientes para facilitar o crescimento do microrganismo alvo e uma pluralidade de agentes seletivos que inclui cefsulodina, ácido nalidíxico, estreptomicina, meticilina, e sais biliares; um primeiro sistema indicador diferencial compreendendo 2-desoxi-D-ribose e um indicador de pH; um segundo sistema indicador diferencial compreendendo um substrato enzimático β-galactosidase cromogênico; um terceiro sistema indicador diferencial compreendendo ureia e um indicador de pH; e um agente gelificante.
2. DISPOSITIVO DE CULTURA, caracterizado por compreender, ainda, um indutor de atividade enzimática de β-galactosidase microbiana.
3. DISPOSITIVO DE CULTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo meio de cultura seletivo compreender um meio de cultura seletivo seco reidratável, em que o agente gelificante compreende um agente gelificante seco, solúvel em água fria.
4. DISPOSITIVO DE CULTURA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo dispositivo de cultura compreender um dispositivo de cultura em filme fino.
5. DISPOSITIVO DE CULTURA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo indicador de pH ser vermelho de fenol.
6. DISPOSITIVO DE CULTURA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo indutor do dispositivo de cultura ser isopropiI- β-D-tiogalactosideo.
7. DISPOSITIVO DE CULTURA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo agente gelificante solúvel em água fria compreender hidroxi etil celulose, carboximetilcelulose, poliacrilamida, goma de alfarrobeira ou algina.
8. USO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para detectar um microrganismo de Salmonella.
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