BR112017023011B1

BR112017023011B1 - Dispositivo de cultura para enumerar colônias de microrganismos microaerofílicos e método de detecção de um microrganismo microaerofílico em uma amostra

Info

Publication number: BR112017023011B1
Application number: BR112017023011-9A
Authority: BR
Inventors: Jason W. Bjork; Evan D. Brutinel; Adam J. Stanenas
Original assignee: 3M Innovative Properties Company
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2022-04-05
Also published as: KR102645495B1; CN107532121A; KR20170138480A; EP3289062A1; JP6920212B2; BR112017023011A2; JP2018518158A; US20180094291A1; WO2016176176A1

Abstract

DISPOSITIVO DE CULTURA DE MICRORGANISMOS ANAERÓBICOS. A presente revelação fornece um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de microrganismos. O dispositivo pode compreender uma base, uma cobertura, e um elemento espaçador não poroso disposto entre as mesmas. O elemento espaçador compreende uma abertura que define um compartimento de crescimento. Pelo menos uma camada adesiva aderida à base ou à cobertura em um compartimento de crescimento. Um agente gelificante solúvel em água fria e um reagente removedor de oxigênio seco são aderidos ao menos a uma camada adesiva. O reagente removedor de oxigênio consiste essencialmente em partículas com um diâmetro menor que 106 mícrons.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido Provisório de Patente US n° 62/154.299, depositado em 29 de abril de 2015, cuja revelação está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Muitas bactérias são sensíveis ao oxigênio e não irão crescer em sua presença. Pode ser útil, em vários ambientes, determinar a viabilidade dos microrganismos anaeróbicos. Por exemplo, pode ser importante determinar se microrganismos anaeróbicos estão presentes no processamento de alimentos e bebidas e/ou em aparatos de embalamento. Também pode ser importante determinar a presença de microrganismos anaeróbicos em ambientes médicos, por exemplo, para determinar a presença de patógenos em exames diagnósticos. Como um outro exemplo, aparatos de tratamento de água testam amostras de água para determinar a presença ou ausência de tais micróbios.

[0003] Uma variedade de dispositivos está disponível para o cultivo de microrganismos. Por exemplo, microrganismos têm sido cultivados há muito tempo usando placas de Petri. Conforme conhecido na técnica, as placas de Petri são placas redondas, rasas e de fundo plano com um meio adequado para o crescimento de microrganismos, como ágar e nutrientes. O uso de meio de ágar, entretanto, pode ser inconveniente e demorado. Por exemplo, o meio de ágar deve ser esterilizado, fundido e resfriado antes da adição da amostra.

[0004] Além disso, pode ser difícil fornecer um ambiente adequado para cultivar microrganismos anaeróbicos usando placas de Petri. Pelo fato de os microrganismos anaeróbicos não se desenvolverem na presença de oxigênio, técnicas físicas e químicas pouco práticas podem ser necessárias para o crescimento de tais organismos. Tipicamente, tais dispositivos precisam ser modificados, ou seja, conformados ou configurados, de modo a proporcionar uma barreira física à transmissão do oxigênio.

[0005] Outras técnicas foram desenvolvidas que usam agentes químicos incorporados em um dispositivo de cultura anaeróbico para remover o oxigênio. Geralmente, tais dispositivos incluem um agente redutor ou fragmentos de membrana estéreis de bactérias incorporados em um gel ou em um meio nutriente. Além disso, a patente n° US 3.338.794 descreve um dispositivo de cultura de bactérias anaeróbicas formado de camadas de filme impermeáveis a oxigênio e um meio nutriente entre os filmes, que inclui um composto redutor.

[0006] Porém, estes e outros dispositivos também podem ser dispendiosos e podem não ser prontamente descartáveis. Esses dispositivos podem, também, ser pouco práticos para montar e/ou usar. Embora tentativas tenham sido feitas para produzir um dispositivo simples para cultivar microrganismos anaeróbicos em um ambiente aeróbio, ainda existe a necessidade de dispositivos de cultura anaeróbica melhorados.

SUMÁRIO

[0007] Em geral, a presente revelação refere-se à detecção e, opcionalmente, à enumeração dos microrganismos em uma amostra. Em particular, a presente revelação refere-se ao crescimento e à detecção de microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerofílicos e microaerotolerantes. O crescimento e a detecção podem ser realizados usando um dispositivo de cultura autocontido gerador de ambiente modificado. O dispositivo gerador de ambiente modificado é ativado com água para produzir um meio de crescimento aquoso que tem uma concentração reduzida de oxigênio dissolvido e, opcionalmente, uma concentração aumentada de dióxido de carbono dissolvido.

[0008] O dispositivo de cultura inventivo e os métodos revelados na presente invenção fornecem o crescimento, a detecção e a diferenciação de microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerofílicos ou microaerotolerantes mesmo quando os microrganismos são incubados em ambientes contendo oxigênio (por exemplo, contendo oxigênio atmosférico normal). Vantajosamente, isso elimina a necessidade de equipamento de incubação especializado e reagentes (por exemplo, frascos anaeróbicos, sachês anaeróbicos de uso único, catalisadores de paládio, caixas de luvas anaeróbicas) que são tipicamente necessários para cultivar microrganismos anaeróbicos. Adicionalmente, os métodos da invenção permitem realizar a diferenciação de bactérias mediante a detecção da produção de gás dióxido de carbono a partir de colônias individuais, eliminando, dessa forma, o tempo adicional de incubação necessário para o isolamento de culturas puras e o uso de tubos de fermentação para detectar a produção de gás. Além disso, a revelação refere-se à enumeração de microorganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerotolerantes ou microaerotolerantes em uma amostra. Os microrganismos microaerofílicos e anaeróbicos obrigatórios compartilham a característica comum de que necessitam de ambientes com oxigênio reduzido, onde possam crescer e se reproduzir.

[0009] Em um aspecto, a presente revelação fornece um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de microrganismos. O dispositivo pode compreender uma base que tem superfícies interna e externa opostas, uma cobertura que tem superfícies interna e externa opostas, um elemento espaçador disposto entre a base e a cobertura, uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio seco e um agente de gelificação seco solúvel em água fria. A cobertura pode ser acoplada à base ou ao elemento espaçador. O elemento espaçador pode ser acoplado à base e/ou à cobertura. O elemento espaçador compreende uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento. O compartimento de crescimento é disposto entre a superfície interna da base e a superfície interna da cobertura. Uma primeira camada adesiva pode ser aderida à base no compartimento de crescimento ou uma segunda camada adesiva pode ser aderida à cobertura no compartimento de crescimento. O reagente removedor de oxigênio pode ser aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva. O agente gelificante pode ser aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0010] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o reagente removedor de oxigênio pode consistir essencialmente em partículas com um diâmetro menor do que 106 mícrons. Em qualquer uma das modalidades anteriores, o dispositivo compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva no compartimento de crescimento, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono consiste essencialmente em partículas com um diâmetro menor do que 106 mícrons. Em qualquer uma das modalidades anteriores, o elemento espaçador pode ser não poroso. Em qualquer uma das modalidades anteriores, o dispositivo pode compreender, adicionalmente, um reagente tampão seco, um nutriente, um reagente indicador, um agente seletivo ou um agente redutor aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva. Em qualquer uma das modalidades anteriores, o reagente gerador de dióxido de carbono pode compreender um carbonato metálico. Em qualquer uma das modalidades acima, o reagente removedor de oxigênio pode ser disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1,5 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2.

[0011] Em outro aspecto, a presente revelação fornece um método para a detecção de um microrganismo anaeróbico em uma amostra. O método pode compreender colocar o dispositivo de cultura de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores em uma configuração aberta que permite o acesso ao compartimento de crescimento no mesmo, colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento, colocar uma amostra no compartimento de crescimento, fechar o dispositivo de cultura, incubar o dispositivo de cultura durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura e detectar a colônia microbiana. A colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento e o fechamento do dispositivo de cultura pode compreender a formação de um meio de cultura microbiano semissólido encerrado no compartimento de crescimento pela base, cobertura e o espaçador do dispositivo de cultura.

[0012] Em qualquer uma das modalidades anteriores do método, o fechamento do dispositivo de cultura pode compreender deixar uma passagem de fluido aberta a partir de um ambiente gasoso fora do dispositivo de cultura para o meio de cultura microbiano semissólido no compartimento de crescimento. Em qualquer uma das modalidades anteriores do método, após a incubação do dispositivo de cultura, a detecção da colônia microbiana pode compreender adicionalmente a enumeração de uma ou mais colônias oticamente detectáveis no dispositivo de cultura.

[0013] As expressões "preferencial" e "de preferência" referem-se às modalidades da invenção que podem proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem também ser preferenciais, sob circunstâncias iguais ou diferentes. Ademais, a menção de uma ou mais modalidades preferenciais não acarreta que outras modalidades não sejam úteis e não pretende excluir outras modalidades do escopo da invenção.

[0014] O termo "compreende", e variações do mesmo, não tem um significado limitador quando esses termos aparecerem nas descrições e nas reivindicações.

[0015] Como usados aqui, "um", "uma", "o", "a", "ao menos um", "ao menos uma", "um ou mais" e "uma ou mais" são intercambiáveis. Dessa forma, por exemplo, um nutriente pode ser interpretado como tendo o significado de "um ou mais" nutrientes.

[0016] O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos mencionados.

[0017] Conforme também usadas na presente invenção, as menções de faixas numéricas com extremos incluem todos os números contidos nessa faixa (por exemplo, de 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

[0018] O sumário supracitado da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica, mais particularmente, as modalidades ilustrativas. Em diversos lugares ao longo do pedido, é fornecida orientação através de listas de exemplos, os quais podem ser usados em várias combinações. Em cada exemplo, a lista mencionada serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva.

[0019] Detalhes adicionais destas e de outras modalidades são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A Figura 1 é uma vista em planta de uma modalidade de um dispositivo de cultura, de acordo com a presente revelação.

[0021] A Figura 2 é uma vista em seção transversal lateral, ao longo da linha 2-2, do dispositivo de cultura da Figura 1.

[0022] A Figura 3 é uma vista lateral explodida do dispositivo de cultura da Figura 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] Antes que quaisquer modalidades da presente revelação sejam explicadas em detalhe, deve-se compreender que a invenção não está limitada, em sua aplicação, aos detalhes de construção e à disposição de componentes demonstrada na descrição a seguir ou ilustrada nos desenhos a seguir. A invenção pode compreender outras modalidades e ser praticada ou realizada de várias maneiras. Deve-se entender também que a fraseologia e terminologia usadas na presente invenção têm o propósito de descrição, e não devem ser consideradas limitadoras. O uso dos termos "incluindo", "compreendendo", ou "tendo" e as variações dos mesmos na presente invenção, pretendem abranger os itens mencionados após os mesmos e os equivalentes dos mesmos, bem como itens adicionais. Exceto onde especificado ou limitado de outro modo, os termos "conectado" e "acoplado", bem como as variações dos mesmos, são amplamente usados e abrangem conexões e acoplamentos tanto diretos como indiretos. Adicionalmente, "conectado" e "acoplado" não estão restritos a conexões ou acoplamentos físicos ou mecânicos. Deve-se compreender que outras modalidades podem ser utilizadas e alterações estruturais ou lógicas podem ser feitas sem que se afaste do escopo da presente revelação. Além disso, os termos como "parte frontal", "parte traseira", "topo", "fundo" e similares são usados apenas para descrever a relação mútua entre os elementos, porém, não pretendem de forma alguma se referir às orientações específicas do aparelho, indicar ou conferir orientações necessárias ou requeridas do aparelho ou especificar como a invenção aqui descrita será usada, montada, exibida ou posicionada em uso.

[0024] O termo "microrganismo" ou "micróbio", como usado aqui, refere-se a qualquer organismo microscópico, que pode ser um organismo de célula única ou multicelular. O termo é geralmente usado para se referir a qualquer organismo microscópico procariótico ou eucariótico, capaz de crescer e se reproduzir em um meio de cultura adequado, incluindo sem limitação, uma ou mais bactérias. Os microrganismos abrangidos pelo escopo da presente invenção incluem procariotos, ou seja, as bactérias e arqueas; e várias formas de eucariotas, compreendendo os protozoários, fungos, leveduras (por exemplo, levedura anaeróbica), algas, etc. O termo "microrganismo alvo" refere-se a qualquer microrganismo que se deseja detectar.

[0025] O termo "microrganismo anaeróbico" ou "anaeróbio", como usado aqui, refere-se a microrganismos que são sensíveis ao oxigênio e não crescerão na presença de oxigênio. Um microrganismo anaeróbico ou anaeróbio é qualquer organismo que não requer oxigênio para o crescimento. Microorganismos anaeróbicos incluem tanto anaeróbicos facultativos quanto anaeróbicos obrigatórios. Micro-organismos anaeróbicos obrigatórios são aqueles que morrem quando expostos a níveis de oxigênio atmosféricos. Um anaeróbio facultativo é um organismo que pode realizar respiração aeróbica se o oxigênio está presente, mas que é capaz de trocar a fermentação ou respiração anaeróbica se o oxigênio está ausente. Métodos e sistemas da presente invenção poderiam ser usados para o enriquecimento e detecção tanto de anaeróbicos obrigatórios quanto de anaeróbicos facultativos.

[0026] O termo "microrganismo microaerofílico" ou "microaerófilos" é usado aqui para se referir a qualquer microrganismo que cresce na presença de micro quantidades de oxigênio. Microaerófilos usam oxigênio, mas apenas em concentrações muito baixas (faixa de baixo micromolar), tipicamente níveis de concentração de oxigênio de 5 a 15% com crescimento inibido por concentrações normais de oxigênio ou concentrações maiores que cerca de 15%.

[0027] O termo "cultura" ou "crescimento" de microrganismos, como usado aqui, refere-se ao método de multiplicação de organismos microbianos ao deixá-los reproduzir em meios de cultura predeterminados sob condições propícias para seu crescimento. Mais particularmente, é o método de fornecimento de um meio de cultura e condições adequados para facilitar ao menos uma divisão celular do microrganismo. Os meios de cultura são meios sólidos, semissólidos ou líquidos contendo todos os nutrientes necessários e todos os parâmetros físicos de crescimento necessários para o crescimento microbiano.

[0028] O termo "enriquecimento", como usado aqui, refere-se ao método de cultura de enriquecimento seletivo para o crescimento de um microrganismo específico pelo fornecimento de meio e condições com atributos específicos e conhecidos que favorecem o crescimento daquele microrganismo específico. O ambiente de cultura de enriquecimento influenciará positivamente o crescimento de um microrganismo selecionado e/ou influenciará negativamente o crescimento de outros microrganismos.

[0029] "Reagente removedor de oxigênio" e "removedor de oxigênio" serão usados amplamente aqui para referir-se a um composto que pode consumir, esgotar ou reagir com oxigênio de um dado ambiente. Preferencialmente, o reagente removedor de oxigênio não retarda ou inibe a proliferação de microrganismos anaeróbicos.

[0030] O termo "agente redutor" refere-se a uma substância que é capaz de diminuir o potencial Eh de um meio de cultura semissólido formado pela hidratação dos componentes secos no compartimento de crescimento de um dispositivo da presente revelação.

[0031] A presente revelação refere-se, de modo geral, a artigos e métodos para o crescimento de microrganismos anaeróbicos ou microaerofílicos. Em particular, a presente revelação fornece um dispositivo para cultivar bactérias anaeróbicas ou microaerofílicas. O dispositivo compreende uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio que reduz oxigênio regular. Vantajosamente, o dispositivo inventivo é altamente estável (por exemplo, à temperatura ambiente) e elimina a necessidade de equipamento especializado e/ou gases comprimidos a fim de alcançar e manter um ambiente anaeróbico para o cultivo de microrganismos anaeróbicos. Além disso, o dispositivo é capaz de criar um ambiente líquido que facilita o crescimento de um microrganismo anaeróbico ou microaerofílico menos de uma hora após o dispositivo ser hidratado.

[0032] A presente revelação refere-se, em geral, à detecção e, opcionalmente, à enumeração de microrganismos em uma amostra. Em particular, a presente revelação refere-se ao crescimento e à detecção de um grupo diverso de microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerotolerantes ou microaerofílicos. O grupo diverso inclui um subgrupo coletivamente conhecido como Bactérias de Ácido Lático (doravante denominado "LAB" (Lactic Acid Bacteria)). As LAB são caracterizadas pela habilidade de fermentar glicose principalmente em ácido lático (bactérias do ácido lático "homofermentativas") ou em ácido lático, dióxido de carbono e etanol (bactérias do ácido lático "heterofermentativas"). Sabe-se agora que o crescimento e a detecção de microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerotolerantes ou microaerofílicos podem ser realizados usando um dispositivo de cultura autocontido gerador de ambiente de oxigênio reduzido.

[0033] Certos microrganismos são considerados microrganismos anaeróbicos facultativos. Consequentemente, os mesmos podem crescer na presença ou na ausência de oxigênio. Esses microrganismos, assim como microrganismos obrigatoriamente-anaeróbicos, podem ser seletivamente enriquecidos em relação aos microrganismos aeróbicos estritos cultivando-os em um ambiente anaeróbico ou de teor reduzido de oxigênio. Um dispositivo da presente revelação pode ser vantajosamente usado para enriquecer seletivamente microrganismos anaeróbicos facultativos e anaeróbicos obrigatórios presentes em uma amostra que também contém microrganismos aeróbicos estritos.

[0034] Certos microrganismos crescem anaerobicamente. Além disso, outros microrganismos como LAB são capazes de proliferar na presença de oxigênio (isto é, os mesmos são "aerotolerantes"). Embora o metabolismo fermentativo seja usado para produzir certos alimentos (por exemplo, iogurte, queijo, chucrutes), os mesmos são também conhecidos como agentes de deterioração dos alimentos em carnes processadas, cerveja e vinho, por exemplo.

[0035] Sabe-se que dispositivos de cultura geradores de ambiente com oxigênio reduzido independente reidratáveis podem ser produzidos. O dispositivo de cultura compreende uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio substancialmente seco disposto em uma zona de crescimento do dispositivo de cultura e que é capaz de reidratar em um volume predeterminado de solução aquosa em que, mediante reidratação, o reagente removedor de oxigênio é capaz de participar em uma reação de consumo de oxigênio. Adicionalmente, sabe-se que a reação de consumo de oxigênio pode consumir oxigênio suficiente para facilitar o crescimento de um microrganismo microaerotolerante, um microrganismo microaerofílico ou um microrganismo obrigatoriamente anaeróbico. Além disso, o dispositivo de cultura pode ser mantido em um ambiente aeróbico, em que o dispositivo de cultura pode manter um ambiente de oxigênio reduzido por pelo menos cerca de oito dias, a fim de facilitar o crescimento dos microrganismos supracitados.

[0036] Os dispositivos de cultivo secos e reidratáveis revelados na presente invenção fornecem várias vantagens em relação à técnica. Por exemplo, a maioria das técnicas de enumeração e identificação de microrganismos anaeróbicos envolve o uso de meio de cultura líquido (por exemplo, caldo ou ágar) que é autoclavado antes do uso. A temperatura elevada de esterilização tende a direcionar a maior parte do oxigênio para fora do meio líquido. Após a esterilização, a agitação e/ou a exposição ao ar podem reintroduzir oxigênio ao meio. Por outro lado, um dispositivo da presente invenção contém ingredientes que geram o ambiente anaeróbico desejado para cultivar microrganismos microaerofílicos ou anaeróbicos.

[0037] Espécies bacterianas de interesse podem ser analisadas em uma amostra de teste que pode ser derivada de qualquer fonte, como um fluido fisiológico, por exemplo, sangue, saliva, fluido ocular, fluido sinovial, fluido cérebro-espinhal, pus, suor, exsudato, urina, muco, tecido mucoso (por exemplo, bucal, gengival, nasal, ocular, traqueal, bronquial, gastrointestinal, retal, uretral, ureteral, vaginal, cervical e membranas da mucosa uterina), leite de lactação, fezes ou similares. Adicionalmente, a amostra de teste pode ser derivada de um sítio corporal, por exemplo, ferimento, pele, narinas anteriores, cavidade nasofaringeal, cavidades nasais, vestíbulo nasal anterior, couro cabeludo, unhas, ouvido externo, ouvido médio, boca, reto, vagina, axila, períneo, ânus, ou outros sítios semelhantes.

[0038] Além de fluidos fisiológicos, outras amostras de teste podem incluir outros líquidos bem como sólido(s) dissolvido(s) ou suspenso(s) em um meio líquido. As amostras de interesse podem incluir correntes, água, alimentos, ingredientes alimentícios, bebidas, solo, plantas ou outra vegetação, ar, superfícies (por exemplo, paredes, pisos, equipamentos, utensílios em uma instalação de fabricação, hospital, clínica ou casa, por exemplo), e similares.

[0039] Alguns exemplos não limitadores de bactérias que requerem (isto é, bactérias microaerofílicas) e/ou toleram (isto é, bactérias aerotolerantes) ambientes com pressão de oxigênio reduzida nos quais crescem, incluem Helicobacter pylori, espécies de Campylobacter (por exemplo, C. jejuni, C. coli, C. fetus), Streptococcus intermedius, Streptococcus sanguis, Streptococcus constellatus, Gemella morbillorum, espécies de Lactobacillus, e Streptococcus pyogenes.

[0040] Alguns exemplos não limitadores de gêneros de LAB que podem ser detectados e enumerados nos dispositivos e métodos da presente descrição incluem os gêneros que pertencem à ordem Lactobacillales. Esses gêneros incluem, por exemplo, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus e Streptococcus. Outros gêneros de LAB que podem ser detectados e enumerados nos dispositivos e métodos da presente revelação incluem, por exemplo, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weisella.

[0041] As bactérias anaeróbicas são ubíquas na natureza. As bactérias anaeróbicas podem ser anaeróbicas obrigatórias ou, alternativamente, podem ser anaeróbicas facultativas. Alguns exemplos não limitadores de bactérias anaeróbicas obrigatórias incluem bactérias redutoras de sulfato (SRB; como Desulfovibrio spp. e Desulfotomaculum spp., por exemplo), as bactérias produtoras de ácido, (APB; como Acetobacterium, Pediococcus, Proteiniphilum, Lactobacillus, Staphylococcus, Thermococcoides, e Acinetobacter, por exemplo), espécies de Actinomyces, espécies de Clostridium (por exemplo, C. perfringens, C. tetani, C sporogenes, C. botulinum, C. difficile, C. butyricum, C. acetobutylicum), bactérias de ácido lático (por exemplo, espécies de Lactobacillus, espécies de Leuconostoc, espécies de Pediococcus, espécies de Lactococcus), espécies de Bacteroides (por exemplo, B fragilis), e espécies de Peptostreptococcus (por exemplo, P. micros, P. magnus, P. asaccharolyticus, P. anaerobius, e P. tetradius). Alguns exemplos não limitadores de bactérias anaeróbicas facultativas incluem Enterobacteria (por exemplo, E. coli, espécies de Salmonella, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus e espécies de Listeria (por exemplo, L. monocytogenes).

[0042] Devido ao fato de que muitas espécies de leveduras são anaeróbicas facultativas e algumas espécies de leveduras são anaeróbicas obrigatórias, é também contemplado que o dispositivo de cultura independente gerador de ambiente anaeróbico da presente revelação, seja útil para o crescimento e a detecção de microrganismos de levedura.

[0043] Em um aspecto, a presente revelação fornece um dispositivo de cultura para cultivar e detectar um microrganismo que cresce em ambientes com níveis reduzidos de oxigênio. Com referência às Figuras 1 a 3, um dispositivo de cultura 100 da presente revelação compreende uma base à prova d’água 10, uma cobertura à prova d’água 20, e um elemento espaçador 30 disposto entre a base 10 e a cobertura 20. A base 10 tem uma superfície interna 10b e uma superfície externa 10a oposta à superfície interna. A cobertura 20 tem uma superfície interna 20b e uma superfície externa 20a oposta à superfície interna. Em qualquer modalidade, a superfície interna 10b da base 10 está disposta em interação face a face com a superfície interna 20b da cobertura 20.

[0044] A base 10 é, de preferência, um filme relativamente rígido à prova d’água feito de um material (por exemplo, poliéster, polipropileno ou poliestireno) que não absorverá ou, de outro modo, será afetado adversamente pela água. A base 10 é, de preferência, produzida usando um material que é substancialmente não transmissível ao oxigênio gasoso. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados para a base 10 incluem filmes de poliéster de ao menos cerca de 15 μm a ao menos cerca de 180 μm de espessura, filmes de polipropileno de ao menos cerca de 100 μm a ao menos cerca de 200 μm de espessura, e filmes de poliestireno de ao menos cerca de 300 μm a cerca de 380 μm de espessura. Outras bases adequadas incluem os filmes de copolímero de álcool etileno vinílico, filmes de álcool polivinílico e filmes de cloreto de polivinilideno. A base 10 pode ser transparente se for desejado visualizar colônias através da base.

[0045] A cobertura 20 é usada para cobrir a superfície interna 10b da base 10, para definir o compartimento de crescimento 60, e, opcionalmente, para visualizar o compartimento de crescimento durante o transporte, armazenamento, incubação, e/ou contagem de colônias. A Cobertura 20 é, de preferência, um filme relativamente rígido à prova d’água feito de um material (por exemplo, poliéster, polipropileno ou poliestireno) que não absorverá, de outro modo, será afetado adversamente pela água. As coberturas 20 são, de preferência, transparentes, de modo a facilitar a contagem de colônias sem abrir o dispositivo de cultura 10, e são substancialmente impermeáveis aos microrganismos e vapor d’água.

[0046] De modo geral, as coberturas podem ser preparadas de materiais como aqueles usados para preparar a primeira base 10. A cobertura 20 é, de preferência, produzida usando um material que é substancialmente não transmissível ao oxigênio gasoso. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados para a base 10 incluem filmes de poliéster de ao menos cerca de 15 μm a ao menos cerca de 180 μm de espessura, filmes de polipropileno de ao menos cerca de 100 μm a ao menos cerca de 200 μm de espessura, e filmes de poliestireno de ao menos cerca de 300 μm a cerca de 380 μm de espessura. Outras bases adequadas incluem os filmes de copolímero de álcool etileno vinílico, filmes de álcool polivinílico e filmes de cloreto de polivinilideno. Conforme mostrado na Figura 1, a cobertura 20 pode ser fixada de uma forma articulada (por exemplo, com o uso de fita adesiva de dupla-face) ao longo de uma borda das superfícies internas de cada uma dentre a base 10 e a cobertura 20 para formar uma região de dobradiça 70. Opcionalmente, em qualquer modalidade, a cobertura 20 pode compreender uma região de aba 75 que se estende além da base 10. A região de aba 75 pode ser convenientemente manipulada durante a abertura do dispositivo 100 para inocular o compartimento de crescimento 60 com uma amostra.

[0047] Um versado na técnica reconhecerá que a transmissibilidade de oxigênio gasoso através de um dado tipo de filme polimérico pode ser reduzida pelo aumento da espessura do filme polimérico. Em qualquer modalidade, a base e a cobertura da presente revelação são filmes poliméricos tendo uma espessura adequada para serem substancialmente não transmissível ao oxigênio gasoso.

[0048] O elemento espaçador 30 inclui uma abertura 36. A abertura 36 forma uma cavidade que serve tanto para definir uma localização quanto a espessura de um compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100. O elemento espaçador 30, juntamente com a base 10 e a cobertura 20, definem os limites do compartimento de crescimento 60. O elemento espaçador 30 ajuda a confinar uma amostra aquosa (não mostrada) no interior do compartimento de crescimento 60 durante a inoculação do dispositivo de cultura 100.

[0049] A abertura 36, conforme ilustrada na Figura 1, define um formato circular. Entretanto, é contemplado que a abertura 36 possa definir outros formatos (por exemplo, quadrado, retângulo, oval). As paredes da abertura 36 fornecem uma cavidade de tamanho e formato predeterminados, e define a espessura do compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100.

[0050] O elemento espaçador 30 deve ser espesso o suficiente para formar uma cavidade tendo um volume predeterminado, por exemplo, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 5 ml ou 10 ml, dependendo do tamanho do compartimento de crescimento 60 e do tamanho da amostra a ser colocada no dispositivo de cultura. Em qualquer modalidade, o elemento espaçador 30 é feito de qualquer material não poroso que seja hidrofóbico (que não se molha), inerte a microrganismos e que pode ser esterilizado. Em qualquer modalidade, o elemento espaçador 30 pode ser acoplado (por exemplo, por meio de um adesivo sensível à pressão) diretamente à base 10 ou à cobertura 20. Adicionalmente ou alternativamente, o elemento espaçador 30 pode ser acoplado (por exemplo, por meio de uma fita adesiva 50), indiretamente, à base ou à cobertura (por exemplo, o elemento espaçador pode ser acoplado ao primeiro ou ao segundo revestimento seco que é revestido sobre a base ou cobertura, respectivamente).

[0051] O compartimento de crescimento 60 pode estar em qualquer local acessível no dispositivo de cultura 100 entre a base 10 e a cobertura 20. De preferência, o compartimento de crescimento 60 está localizado distante das bordas periféricas 80 do dispositivo 100.

[0052] De preferência, o elemento espaçador 30 é construído de um material não poroso (por exemplo, um metal, vidro, uma resina polimérica) que não inibe substancialmente o crescimento de microrganismos e não absorve água substancialmente ou bolhas macroscópicas de dióxido de carbono de um hidrogel que é colocado em contato com o elemento espaçador. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados a partir dos quais um elemento espaçador 30 pode ser feito incluem poliolefinas (por exemplo, polietileno, polipropileno, e similares), tereftalato de polietileno, poliuretano, poliestireno, cloreto de polivinilideno, metacrilato de polimetila, fluoreto de polivinilideno ou outros filmes poliméricos, por exemplo.

[0053] Um dispositivo da presente revelação compreende um agente gelificante seco solúvel em água fria disposto no compartimento de crescimento. De preferência, o agente gelificante é aderido diretamente ou indiretamente à base 10 e/ou à cobertura 20 do dispositivo 100. Em qualquer modalidade, o agente gelificante pode ser uniformemente distribuído sobre a superfície interna 10b da base 10 e/ou a superfície interna 20b da cobertura 20 no compartimento de crescimento 60 do dispositivo 100.

[0054] Agentes gelificantes adequados para uso no primeiro revestimento seco 24 incluem agentes gelificantes naturais e sintéticos solúveis em água fria. Agentes gelificantes naturais, como algina, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, goma guar, goma de alfarrobeira, goma xantana, e agentes gelificantes sintéticos, como poliacrilamida, poliuretano, óxidos de polietileno e misturas dos mesmos são em geral adequados. Agentes gelificantes adequados podem ser selecionados de acordo com os ensinamentos da presente revelação e as revelações de U.S. n° 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838. Agentes gelificantes preferenciais incluem goma guar, goma de alfarroba, e goma xantana; estes agentes gelificantes sendo individualmente úteis, ou de preferência, em combinação um com o outro.

[0055] Dessa forma, em qualquer modalidade, um dispositivo 100 da presente revelação pode compreender opcionalmente um primeiro revestimento seco 14 aderido ao menos a uma porção ou toda a superfície interna 10b da base 10 no compartimento de crescimento 60. O primeiro revestimento seco 14, se estiver presente, pode compreender o agente gelificante seco solúvel em água fria. Opcionalmente, uma primeira camada adesiva 12 é aderida à base 10 e ao menos uma porção do primeiro revestimento seco é aderida à primeira camada adesiva no compartimento de crescimento 60.

[0056] A cobertura 20 pode ser isenta de qualquer revestimento (não mostrado). Alternativamente, se o dispositivo 100 não tiver um primeiro revestimento seco 14 aderido à superfície interna 10b da base 10 no compartimento de crescimento 60, a cobertura 20 pode compreender um segundo revestimento seco 24 aderido à mesma no compartimento de crescimento. O segundo revestimento seco 24, se estiver presente, pode compreender o agente gelificante seco solúvel em água fria. Opcionalmente, uma segunda camada adesiva 22 é aderida à cobertura 20 e ao menos uma porção do segundo revestimento seco 24 é aderida à segunda camada adesiva no compartimento de crescimento 60. Em qualquer modalidade, uma porção da camada da segunda camada adesiva 22 pode ser usada para facilitar a vedação da cobertura 20 ao menos a uma porção do elemento espaçador 30.

[0057] Com relação aos primeiro e segundo revestimentos secos, os revestimentos podem compreender opcionalmente qualquer nutriente ou meio de nutrientes que é reconstituível em água fria, não interferindo substancialmente no reagente removedor de oxigênio (discutido abaixo) ou nas propriedades de gelificação em água fria do agente gelificante, e que facilita o crescimento de um microrganismo redutor de sulfato. Nutriente ou nutrientes particulares adequados para uso no dispositivo de cultura dependerão do microrganismo a ser cultivado no dispositivo, e serão facilmente selecionados pelos versados na técnica. Em geral, tais nutrientes são solúveis em água fria. Nutrientes adequados para suportar o crescimento bacteriano são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, extrato de levedura, peptona, açúcares, sais adequados e similares. Em qualquer modalidade, o primeiro e/ou o segundo revestimento seco pode compreender adicionalmente um agente seletivo (por exemplo, um nutriente, um antibiótico, e combinações dos mesmos) que facilita o crescimento de um microrganismo anaeróbico particular ou grupo de microrganismos em relação a um outro microrganismo ou grupo de microrganismos. Os versados na técnica reconhecerão que uma variedade de outras formulações poderiam ser usadas e que estas não prejudicariam o escopo da presente invenção.

[0058] Em qualquer modalidade, o nutriente ou meio de nutrientes facilita o crescimento de um microrganismo anaeróbico ou grupo de microrganismos anaeróbicos. Por exemplo, em qualquer modalidade, um dispositivo da presente revelação pode ser usado para crescer, identificar e/ou enumerar bactérias redutoras de sulfato. Nessas modalidades, o meio de nutrientes usado no dispositivo pode compreender, por exemplo, os ingredientes do meio B de Postgate.

[0059] De preferência, quando o primeiro revestimento seco 14 consiste principalmente em pó seco ou aglomerado de pó seco, o primeiro revestimento 14 é disposto em uma primeira camada adesiva 12 que é disposta ao menos sobre uma porção da superfície interna 10b da base 10. O primeiro revestimento seco 14 pode ser depositado sobre a base 10 ou sobre a primeira camada adesiva opcional 12 usando processos de formulação, processos de revestimento de adesivos, e processos de revestimento líquido e/ou processos de revestimento seco descritos, por exemplo, nas patentes US n° s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838; as quais estão todas aqui incorporadas na íntegra, a título de referência em suas totalidades.

[0060] De preferência, quando o segundo revestimento seco 24 consiste principalmente em pó seco ou aglomerado de pó seco, o segundo revestimento 24 é disposto em uma segunda camada adesiva 22 que é disposta ao menos sobre uma porção da superfície interna 20b da cobertura 20. O segundo revestimento seco 24 pode ser depositado sobre a cobertura 20 ou sobre a segunda camada adesiva opcional 22 usando processos de formulação, processos de revestimento de adesivos, e processos de revestimento líquido e/ou processos de revestimento seco descritos, por exemplo, nas patentes US n° s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838; as quais estão todas aqui incorporadas na íntegra, a título de referência em suas totalidades.

[0061] O compartimento de crescimento 60 é definido como um volume disposto entre as superfícies internas da base 10 e da cobertura 20 (superfícies internas 10b e 20b, respectivamente), o volume que circunda ao menos uma porção do primeiro revestimento seco 14 e/ou do segundo revestimento seco 24. Dessa forma, quando um líquido aquoso é distribuído no compartimento de crescimento, o líquido aquoso está em contato fluídico com ao menos uma porção do primeiro revestimento seco 14, se presente, e/ou o segundo revestimento seco 24, se estiver presente. A espessura do compartimento de cultura 60 pode variar dependendo, por exemplo, do volume de líquido aquoso (não mostrado) depositado no dispositivo de cultura, a presença de sólidos (por exemplo, particulados em suspensão e/ou uma membrana filtrante) associada à amostra (não mostrados), e/ou um elemento espaçador 30 no dispositivo de cultura 10.

[0062] Os dispositivos de cultura da presente revelação compreendem adicionalmente uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio seco. O reagente removedor de oxigênio é disposto no compartimento de crescimento. "Seco", como usado aqui, significa que o reagente é substancialmente isento de água. A frase "substancialmente isento de água" refere-se a um reagente que tem um teor de água não superior que aproximadamente o teor de água do material (por exemplo, fornecido como um pó ou como um revestimento aquoso desidratado) uma vez que foi permitido equilibrar-se com o meio ambiente.

[0063] Opcionalmente, um dispositivo de cultura da presente revelação pode compreender adicionalmente outros componentes secos, reidratáveis em água, como um componente de um tampão e/ou uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono.

[0064] Ao menos um componente seco (por exemplo, o agente gelificante) é hidratado com um líquido aquoso antes, durante, ou após a introdução (por exemplo, inoculação) do material de amostra no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura, conforme aqui descrito. Tipicamente, o material de amostra e/ou o líquido aquoso é introduzido no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura em condições ambiente (isto é, em um ambiente gasoso aeróbica). Dessa forma, após a inoculação do compartimento de crescimento com uma amostra sob condições aeróbicas, o líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura compreende uma primeira concentração de oxigênio dissolvido. O reagente removedor de oxigênio no dispositivo de cultura atua de modo a reduzir a primeira concentração de oxigênio dissolvido no líquido aquoso no compartimento de crescimento para uma segunda concentração de oxigênio dissolvido que é substancialmente menor que a primeira concentração de oxigênio dissolvido. Esta redução da concentração de oxigênio dissolvido no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura inoculado facilita o crescimento de microrganismos microaerofílicos ou obrigatoriamente anaeróbicos no dispositivo de cultura.

[0065] Em qualquer modalidade, a quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio e a concentração do mesmo é selecionada de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra na faixa de cerca de 120 minutos após colocar um reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer modalidade, a quantidade eficaz do reagente removedor de oxigênio e a concentração do mesmo são selecionadas de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra na faixa de cerca de 60 minutos após colocar um reagente removedor de oxigênio em contato fluido com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer modalidade, a quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio e a concentração do mesmo são selecionadas de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra na faixa de cerca de 30 minutos após colocar o reagente removedor de oxigênio em contato fluido com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0066] Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorre a uma temperatura entre a temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 23 graus C) e cerca de 42 graus C, inclusive. Dessa forma, em qualquer modalidade de um método de acordo com a presente revelação, não é necessário incubar o dispositivo de cultura em uma temperatura elevada (isto é, acima da temperatura ambiente), de modo a reduzir a primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido após colocar o reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0067] Um versado na técnica reconhecerá que a quantidade de oxigênio removido do compartimento de crescimento de um dispositivo de cultura da presente revelação dentro de um período de tempo adequado para cultivar microrganismos depende, inter alia, da quantidade do reagente removedor de oxigênio no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Portanto, pelo ajuste da quantidade de reagente removedor de oxigênio no compartimento de crescimento de acordo com a presente revelação, o dispositivo de cultura pode ser configurado para cultivar microrganismos aerotolerantes ou para cultivar microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos.

[0068] Diversos reagentes removedores de oxigênio são conhecidos incluindo, por exemplo, ácido ascórbico (por exemplo, ácido L- ascórbico e seus sais, sais de ferro ferrosos, sais metálicos de sulfito, bissulfito e metabissulfito). Um reagente removedor de oxigênio de acordo com a presente revelação consome oxigênio suficiente para criar um ambiente local pobre em oxigênio ou anaeróbico no dispositivo de cultura e produz quantidades e tipos de produtos de reação que podem ficar em comunicação fluídica com os microrganismos a serem cultivados no dispositivo sem substancialmente inibir o crescimento daqueles microrganismos. Em qualquer modalidade, o reagente removedor de oxigênio está disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1,5 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2.

[0069] Preferencialmente, em qualquer modalidade, o reagente removedor de oxigênio é fornecido sob a forma de um pó seco. Com mais preferência, em uma modalidade, o reagente removedor de oxigênio é fornecido como um pó seco que é triturado e classificado para formar uma população de partículas com uma distribuição de tamanho consistindo essencialmente em partículas com um diâmetro de 106 mícrons ou menos. Vantajosamente, um reagente removedor de oxigênio fornecido em partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons ou menos pode ser aderido à base ou à camada de cobertura (por exemplo, aderido a uma camada adesiva revestida sobre a base ou a camada de cobertura), em uma quantidade eficaz para criar e manter (por exemplo, até cerca de 24 horas de incubação, até cerca de 48 horas de incubação, até cerca de 72 horas de incubação, até 4 dias de incubação, até 5 dias de incubação, até 7 dias de incubação, ao menos 24 horas de incubação, ao menos 48 horas de incubação, ao menos 72 horas de incubação, ao menos 4 dias de incubação, ao menos 5 dias de incubação, ao menos 7 dias de incubação) um ambiente anaeróbico no compartimento de crescimento quando o dispositivo é inoculado com um volume predefinido de líquido aquoso e fechado.

[0070] O adesivo usado na camada adesiva opcional 22 disposta sobre a cobertura 20 pode ser igual ou diferente ao adesivo usado na camada adesiva opcional 12 disposta sobre a base 10. Além disso, o segundo revestimento seco 24 disposto sobre a cobertura 20 pode ser igual ou diferente do primeiro revestimento seco 14 disposto sobre a base 10. Revestimentos na cobertura 20 podem cobrir toda a superfície voltada para a base, mas, de preferência, eles cobrem ao menos uma parte da superfície interna 20b que define ao menos uma porção do compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100.

[0071] Em qualquer modalidade, um agente seletivo pode ser disposto no dispositivo em um revestimento seco ou, opcionalmente, em uma camada adesiva no compartimento de crescimento.

[0072] Opcionalmente, o dispositivo de cultura da presente revelação inclui adicionalmente um meio para indicação de oxigênio em um dispositivo de cultura. De preferência, o meio é capaz de indicar uma quantidade (por exemplo, uma quantidade limite predeterminada ou uma quantidade relativa) de oxigênio presente no dispositivo. Vantajosamente, o meio pode indicar se ou quando o reagente removedor de oxigênio esgotou adequadamente o oxigênio no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura a uma concentração que facilita o crescimento de microrganismos microaerofílicos, obrigatoriamente anaeróbicos ou microaerotolerantes. Meios para detecção de oxigênio em um dispositivo de cultura são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, corantes redox (por exemplo, azul de metileno) e corantes fluorescentes extintos por oxigênio.

[0073] O meio pode ser um composto luminescente que indica a ausência de oxigênio no interior do dispositivo. Indicadores de oxigênio adequados são revelados na patente US n° 6.689.438, (Kennedy et al.), que está aqui integralmente incorporada, por referência. Os compostos luminescentes apropriados como indicadores para um dispositivo de cultura da presente revelação mostrarão luminescência que é extinta por oxigênio. Mais precisamente, os indicadores exibirão luminescência mediante exposição à sua frequência de excitação com uma emissão que é inversamente proporcional à concentração de oxigênio. O indicador pode ser revestido, laminado, ou extrudado sobre uma outra camada, ou porção de uma outra camada, no interior do dispositivo. Tal camada pode ser disposta no compartimento de crescimento e, opcionalmente, ser separada do compartimento de cultura por uma ou mais camadas permeáveis ao oxigênio. Compostos adequados para indicação do oxigênio incluem derivados de metalo de octaetilporfirina, tetrafenilporfirina, tetrabenzoporfirina, clorinas ou bacterioclorinas. Outros compostos adequados incluem coproporfirina de paládio (PdCPP), octaetilporfirina de platina e paládio (PtOEP, PdOEP), tetrafenilporfirina de platina e paládio (PtTPP, PdTPP), canforquinona (CQ) e corantes do tipo xanteno, como eritrosina B (EB). Outros compostos adequados incluem complexos de rutênio, ósmio e irídio com ligantes como 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina, 4,7-difenil-1,10-fenantrolina e similares. Exemplos adequados destes incluem, perclorato de tris(4,7,-difenil-1,10- fenantrolina)rutênio (II), perclorato de tris(2,2’-bipiridina)rutênio (II), perclorato de tris(1,10-fenantrolina)rutênio(II) e similares.

[0074] Um dispositivo de cultura da presente revelação inclui opcionalmente uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco disposto no compartimento de crescimento. Sem se ater à teoria, o reagente gerador de dióxido de carbono, quando ativado pelo contato com um líquido aquoso no compartimento de crescimento, estabelece um equilíbrio das seguintes espécies dissolvidas: um ou mais sais de ácido carbônico, ácido carbônico e dióxido de carbono. Vantajosamente, a quantidade do reagente gerador de dióxido de carbono é suficiente para elevar o nível de dióxido de carbono dissolvido até uma concentração que facilita o crescimento de uma variedade de microrganismos.

[0075] Preferencialmente, em qualquer modalidade, o reagente gerador de dióxido de carbono é fornecido sob a forma de um pó seco. Com mais preferência, em uma modalidade, o reagente gerador de dióxido de carbono é fornecido como um pó seco que é triturado e classificado para formar uma população de partículas com uma distribuição de tamanho consistindo essencialmente em partículas com um diâmetro menor do que 106 mícrons. Vantajosamente, em partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons, pode ser aderido à base ou à camada de cobertura (por exemplo, aderido a uma camada adesiva revestida sobre a base ou a camada de cobertura) em uma quantidade eficaz para criar e manter (por exemplo, até cerca de 24 horas de incubação, até cerca de 48 horas de incubação, até cerca de 72 horas de incubação, até 4 dias de incubação, até 5 dias de incubação, até 7 dias de incubação, ao menos 24 horas de incubação, ao menos 48 horas de incubação, ao menos 72 horas de incubação, ao menos 4 dias de incubação, ao menos 5 dias de incubação, ao menos 7 dias de incubação) um ambiente enriquecido com CO2 no compartimento de crescimento após o dispositivo ser inoculado com um volume predefinido de líquido aquoso e fechado.

[0076] Um dispositivo de cultura da presente revelação inclui opcionalmente um reagente tampão seco disposto no compartimento de crescimento que, quando hidratado com água deionizada, traz a água para um pH que é adequado para cultura e opcionalmente enriquecendo seletivamente certos grupos de microrganismos. Por exemplo, em qualquer modalidade, o pH predefinido pode ser cerca de 5,2 a cerca de 7,8. Em qualquer modalidade, o pH predefinido pode ser menor ou igual a 6,35 (por exemplo, cerca de 4,5 a cerca de 6,35). Esse pH ligeiramente ácido oferece várias vantagens: i) o ambiente ácido favorece seletivamente o crescimento de microrganismos tolerantes a ácido (por exemplo, LABs) em relação a outros microrganismos que podem estar presentes em uma amostra e ii) o ambiente ácido pode deslocar o equilíbrio do reagente gerador de carbono, caso haja, em direção a uma proporção mais elevada de CO2 dissolvido. Ambas as vantagens podem facilitar o crescimento de LABs, por exemplo, no dispositivo de cultura.

[0077] Reagentes usados em tampão de um dispositivo da presente revelação incluem qualquer tampão microbiologicamente compatível tendo um pKa de cerca de 8,0 ou menos. As partes ácidas e básicas do reagente tampão estão presentes no dispositivo de cultura em uma razão tal que, quando um volume predefinido de água deionizada é colocado em contato com o reagente tampão, o pH no compartimento de crescimento é adequado para o crescimento e a detecção de um microrganismo ou grupo de microrganismos. Reagentes tampão adequados incluem, por exemplo, um sal de fosfato metálico, um sal de acetato metálico, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico e ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico de sódio, e ácido succínico e succinato de sódio. Um versado na técnica reconhecerá que a razão de reagentes tampão ácido ou básico pode ser ajustada para obter o pH desejado da mistura aquosa formada quando um volume predeterminado de líquido aquoso (por exemplo, compreendendo a amostra) é depositado no compartimento de crescimento e o dispositivo é fechado.

[0078] O dispositivo de cultura da presente revelação pode incluir opcionalmente um reagente indicador. Reagentes indicadores apropriados (por exemplo, cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)) pode detectar substancialmente todos os microrganismos presentes no dispositivo de cultura. Opcionalmente, o reagente indicador pode ser um indicador diferencial; isto é, o reagente indicador distingue certos microrganismos de outros microrganismos. Reagentes indicadores adequados incluem, por exemplo, um indicador de pH, um indicador redox, um substrato enzimático cromogênico, um substrato enzimático fluorogênico para detectar a presença de um microrganismo. O indicador não deve interferir substancialmente no reagente removedor de oxigênio. Em qualquer modalidade, o reagente indicador pode ser disposto no dispositivo em um revestimento seco ou, opcionalmente, em uma camada adesiva no compartimento de crescimento.

[0079] O dispositivo de cultura da presente revelação pode incluir opcionalmente um reagente redutor. Reagentes redutores adequados são úteis para reduzir o potencial de oxidação-redução do meio de crescimento e, desse modo, facilita o crescimento de microrganismos anaeróbicos. Agentes redutores adequados incluem, por exemplo, tioglicolato de sódio, L-cisteína, ditiotreitol, ditioeritritol e combinações dos mesmos.

[0080] Em qualquer modalidade, o compartimento de crescimento pode ser dimensionado para ser hidratado com um volume de 1 mililitro de líquido aquoso. Água compreende cerca de 0,54 μmols de oxigênio dissolvidos por mililitro. Dessa forma, o primeiro revestimento seco e/ou o segundo revestimento seco compreende ao menos reagente removedor de oxigênio suficiente para consumir 0,54 μmol de oxigênio em um período de 120 minutos ou menos, de cerca de 22 graus C a cerca de 42 graus C. Com mais preferência, o primeiro revestimento seco e/ou o segundo revestimento seco compreende preferencialmente ao menos reagente removedor de oxigênio suficiente para consumir mais que 0,54 μmol de oxigênio em um período de 120 minutos ou menos, de cerca de 22 graus C a cerca de 42 graus C.

[0081] Em qualquer modalidade, o primeiro revestimento seco e/ou o segundo revestimento seco podem incluir qualquer número de outros componentes, como corantes (por exemplo, um indicador de pH), agentes de reticulação, reagentes (por exemplo, reagentes seletivos ou reagentes indicadores como substratos enzimáticos cromogênicos ou fluorogênicos), ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos componentes anteriormente mencionados. Por exemplo, para alguns usos, é desejável a incorporação de um indicador do crescimento microbiano (por exemplo, um indicador de pH, um substrato enzimático cromogênico, um corante redox) no primeiro e/ou segundo revestimento seco ou em um adesivo no qual o primeiro e/ou o segundo revestimento seco está aderido. Corantes adequados incluem aqueles que são metabolizados pelos, ou que, de outro modo, reagem com os microrganismos em crescimento, e que fazem com que as colônias sejam coloridas ou fluorescentes para uma visualização mais fácil. Tais corantes incluem cloreto de trifenil tetrazólio, vermelho de p-tolil tetrazólio, violeta de tetrazólio, azul de veratril tetrazólio e os corantes relacionados, e 5-bromo-4-chloroindolil fosfato. Outros corantes adequados incluem aqueles sensíveis às alterações de pH durante o crescimento de microrganismos, como vermelho neutro.

[0082] Para alguns usos, é desejável formar um revestimento seco que, quando reconstituído com um líquido aquoso, forma um hidrogel que é rígido o bastante para permitir a inoculação por estriamento. Para formar um meio que possa ser estriado, uma quantidade eficaz de um agente de reticulação adequado pode ser incorporada em um ou mais revestimentos secos que incluem um agente gelificante. Agentes de reticulação adequados não afetam substancialmente o crescimento dos microrganismos de interesse. Tipos e quantidades adequados de agentes de reticulação são facilmente selecionados por aqueles versados na técnica. Por exemplo, com goma guar, agentes de reticulação como tetraborato de potássio, sais de alumínio, ou sais de cálcio são adequados, e podem ser adicionados em quantidades eficazes, por exemplo, menores do que cerca de 1,0 por cento em peso do revestimento seco.

[0083] Ao menos um revestimento seco pode opcionalmente incluir reagentes necessários para realização de certos testes microbiológicos. Por exemplo, antibióticos podem ser incluídos para realização testes de suscetibilidade a antibiótico. Para identificação de microrganismos, reagentes diferenciais que sofrem uma mudança de cor na presença de um tipo particular de microrganismo podem ser incluídos.

[0084] Em qualquer modalidade, o sistema de tampão seco, o agente redutor, o reagente gerador de dióxido de carbono e/ou o reagente indicador podem ser dispostos no compartimento de crescimento sob a forma de um pó seco (por exemplo, o pó seco 40 das figuras 2 e 3) que não é aderido à primeira ou à segunda camada adesiva. Alternativamente, o sistema de tampão seco, o agente redutor, o reagente gerador de dióxido de carbono e/ou o reagente indicador podem ser incluídos no primeiro e/ou no segundo revestimento, conforme é descrito na presente invenção.

[0085] Um dispositivo de cultura da presente invenção pode ser preparado usando uma variedade de técnicas. Em geral, um dispositivo pode ser feito artesanalmente ou com equipamentos comuns de laboratório, conforme descrito nas patentes US n°s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838, por exemplo.

[0086] Um exemplo não limitador de um adesivo sensível à pressão adequado que pode ser usado na primeira camada de adesivo e/ou na segunda camada adesiva é um copolímero de 2-metilbutilacrilato / ácido acrílico em uma razão molar de 90/10. Outros adesivos sensíveis à pressão que podem ser usados incluem acrilato de iso-octila/ ácido acrílico em uma razão molar de 95/5 ou 94/6 e borracha de silicone. Adesivos que se tornam leitosos (por exemplo, opacos) quando expostos à água são menos preferenciais, mas podem ser usados em conjunto com uma base não transparente ou em situações onde a visualização das colônias não seja necessária. Adesivos ativados por calor tendo uma substância de ponto de fusão mais baixo sobre uma substância com ponto de fusão mais alto e/ou adesivos ativados por água, como mucilagem, são também conhecidos e podem ser usados nesta invenção. Ao incorporar um reagente indicador, como descrito acima, a fim de facilitar a visualização de colônias, é, de preferência, em geral para incorporar o reagente indicador, no adesivo ou mistura de revestimento em caldo, ao invés de pó.

[0087] A primeira camada adesiva e a segunda camada adesiva é revestida (por exemplo, usando um revestidor tipo faca) sobre a superfície superior da base ou cobertura para formar uma camada adesiva em uma espessura que é, de preferência, menor que o diâmetro médio das partículas de pó seco ou de pó aglomerado a serem aderidas ao adesivo. Em geral, o adesivo é revestido o suficiente para aderir as partículas ao substrato (por exemplo, o primeiro ou cobertura aqui descritos), mas não tanto que as partículas se tornem completamente incorporadas no adesivo. De modo geral, uma camada adesiva com espessura de cerca de 5 μm a cerca de 12 μm é adequada.

[0088] De preferência, quando o agente gelificante é incluído no primeiro e/ou no segundo revestimento seco, ele é incluído em uma quantidade tal que uma quantidade predeterminada de água ou uma amostra aquosa, por exemplo, de 1 a 3 ml ou mais, colocada no compartimento de crescimento formará um hidrogel com uma viscosidade adequada, por exemplo, de cerca de 1.500 cps, ou mais, quando medida a 60 rpm com um Viscosímetro Brookfield Modelo L VF a 25°C. Hidrogéis com essa viscosidade possibilitam a manipulação e o empilhamento conveniente dos dispositivos de cultura durante a incubação e permitem a formação de colônias distintas no meio. Por exemplo, de 0,025 g a 0,050 g de goma guar em pó espalhada de forma substancialmente uniforme sobre uma área superficial de 20,3 cm2 proporcionará um meio suficientemente viscoso quando reconstituído com de 1 a 3 mL de uma amostra aquosa. O tamanho das partículas de pó pode ser usado para controlar o peso de revestimento por unidade de área. Por exemplo, sob condições onde uma goma guar malha 100 reveste até um peso de cerca de 0,05 g/20,3 cm2, a goma guar malha 400 reveste até um peso de cerca de 0,025 g/20,3 cm2.

[0089] Em qualquer modalidade, o primeiro revestimento seco ou o segundo revestimento seco pode compreender um ou mais nutrientes para facilitar o crescimento de microrganismos. Quando o revestimento é constituído essencialmente de pós ou de aglomerados de pó, a razão preferencial de agente gelificante para nutriente em um meio em pó aderido é determinada pelo microrganismo específico a ser cultivado no dispositivo. Para propósitos gerais, entretanto, uma razão de cerca de 4 para 1 a cerca de 5 para 1 (total de agente gelificante para total de nutriente, com base no peso) pode ser preferencial. O pó em um meio em pó aderido pode ser aplicado à camada adesiva (por exemplo, a primeira camada adesiva 12 e/ou a segunda camada adesiva 22) por quaisquer meios adequados de aplicação de uma camada substancialmente uniforme. Exemplos de métodos adequados para aplicar a camada de pós incluem o uso de um dispositivo tipo agitador, ou o uso de um dispositivo de aplicação de revestimento em pó.

[0090] Um versado na técnica reconhecerá nutrientes adequados para uso em um dispositivo da presente revelação para cultivar e detectar microrganismos microaerofílicos, microaerotolerantes ou anaeróbicos obrigatórios. Exemplos não limitadores de nutrientes adequados incluem uma fonte de peptona (por exemplo, extrato de carne, peptona de carne), extrato de levedura, uma digestão enzimática da caseína, e um carboidrato (por exemplo, maltose, glicose, trealose, sacarose). Em qualquer modalidade, o carboidrato pode ser um nutriente que é fermentado a glicose por certos microrganismos. De preferência, o carboidrato está presente no dispositivo em uma quantidade que é alta o suficiente para facilitar o crescimento (produção de biomassa) dos microrganismos e, opcionalmente, ser fermentado pelos microrganismos para formar quantidades detectáveis de CO2 que podem ser detectáveis como uma bolha adjacente à colônia microbiana.

[0091] Ao usar o dispositivo de cultura da presente revelação, uma contagem precisa das colônias de microrganismos presentes pode ser desejável. Dessa forma, em qualquer modalidade, um dispositivo de cultura da presente revelação pode compreender um padrão de grade sobre a base ou, alternativamente, sobre a cobertura. O padrão de grade pode incluir um padrão de grade quadrada como, por exemplo, o padrão de grade quadrada revelado na patente US n° 4.565.783. O padrão de grade pode ser produzido sobre a primeira camada ou cobertura por meio de qualquer processo adequado, como métodos de impressão, por exemplo.

[0092] Em um outro aspecto, a presente revelação fornece um método de fabricação de um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente de acordo com qualquer uma das modalidades acima. O método compreende aderir um agente gelificante solúvel em água fria sobre uma porção de uma base. O agente gelificante pode estar seco (por exemplo, na forma de partículas substancialmente isentas de água) quando aderido à base ou o agente gelificante pode estar aderido à base, como um revestimento líquido (por exemplo, um revestimento líquido aquoso) e, subsequentemente, seco a um estado substancialmente isento de água. O método compreende adicionalmente o posicionamento da base adjacente a uma cobertura e colocação de um elemento espaçador entre as mesmas, o elemento espaçador compreendendo uma abertura que define um compartimento de crescimento, conforme aqui descrito. Em qualquer modalidade, o elemento espaçador pode ser fixado (por exemplo, por meio de um adesivo) à base ou à cobertura.

[0093] A base é posicionada adjacente à cobertura de tal modo que ao menos uma porção do agente gelificante aderido fica voltada para o compartimento de crescimento disposto entre a base e a cobertura. Opcionalmente, em qualquer modalidade, uma primeira camada adesiva pode ser aplicada (por exemplo, com o uso de processos de revestimento conhecidos na técnica) à base e o agente gelificante solúvel em água fria pode ser aderido à primeira camada adesiva.

[0094] Em uma modalidade alternativa, o agente gelificante solúvel em água fria pode ser aderido à dita cobertura por meio de qualquer um dos processos descritos para aderir o agente gelificante à base. A secagem do agente gelificante aderido, se o agente gelificante é revestido com líquido, pode ser realizada por meio de diversos processos conhecidos na técnica. O revestimento pode ser seco em um forno (por exemplo, um forno por gravidade, um forno de convecção), por exemplo, de acordo com o processo descrito na patente US n° 5.601.998, que está aqui integralmente incorporada, por referência. De preferência, o agente gelificante aderido é submetido à secagem até que o meio esteja substancialmente isento de água. Como usado aqui, as expressões "substancialmente seco", "substancialmente isento de água" ou similares refere-se a um revestimento que tem um conteúdo de água não maior que aproximadamente o conteúdo de água do revestimento desidratado, uma vez que tenha sido deixado se equilibrar com o ambiente.

[0095] O método compreende, ainda, a deposição do reagente removedor de oxigênio, do reagente tampão e do reagente gerador de dióxido de carbono em um compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer modalidade, qualquer um ou a totalidade do reagente removedor de oxigênio, do reagente de tampão e do reagente gerador de dióxido de carbono podem ser depositados no compartimento de crescimento sob a forma de um pó seco. Opcionalmente, qualquer um ou a totalidade do reagente removedor de oxigênio, do reagente de tampão e do reagente gerador de dióxido de carbono podem ser aderidos a um adesivo (por exemplo, uma primeira camada adesiva ou segunda camada adesiva, conforme aqui descrito) no compartimento de crescimento. Outros componentes opcionais (por exemplo, reagentes indicadores, agentes seletivos, nutrientes), também podem ser depositados no compartimento de crescimento, opcionalmente, aderidos a uma camada adesiva.

[0096] O posicionamento da base adjacente à cobertura, de modo que o agente gelificante aderido esteja voltado para o compartimento de crescimento disposto entre a base e a cobertura pode ser realizado de uma variedade de formas. Um exemplo representativo de posicionamento da base e da cobertura adjacentes entre si, de modo que uma porção do agente gelificante se sobreponha ao compartimento de crescimento é mostrado nas Figuras 1 a 3. Pode-se notar que a configuração sobreposta permite que um operador deposite um líquido aquoso entre a base e a cobertura, por meio disso colocando o agente gelificante, o reagente removedor de oxigênio, e outros componentes secos presentes no compartimento de crescimento em comunicação de fluidos.

[0097] Em ainda um outro aspecto, a presente revelação apresenta um método para detecção de um microrganismo. O método usa qualquer modalidade do dispositivo de cultura de acordo com qualquer uma das modalidades descritas anteriormente. O dispositivo de cultura compreende uma base; uma cobertura; um elemento espaçador disposto entre as superfícies internas da base e da cobertura, o elemento espaçador compreendendo uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento; um agente gelificante seco solúvel em água fria aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento; e uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio disposto no compartimento de crescimento conforme aqui descrito.

[0098] Em qualquer modalidade, o método compreende abrir o dispositivo de cultura para fornecer acesso ao compartimento de crescimento no mesmo, colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento, colocar uma amostra no compartimento de crescimento, fechar o dispositivo de cultura, incubar o dispositivo de cultura durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura e detectar a colônia microbiana, sendo que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento e o fechamento do dispositivo de cultura compreendem a formação de um meio de cultura microbiano semissólido encerrado pela base, a cobertura e o elemento espaçador do dispositivo de cultura.

[0099] Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 0,1 mililitro a cerca de 10 mililitros. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 1 mililitro. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 2 mililitros. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 3 mililitros. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 4 mililitros. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 5 mililitros. Em qualquer modalidade, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 10 mililitros. Em qualquer modalidade, o líquido aquoso usado para hidratar a região de crescimento do dispositivo de cultura é distribuído sobre uma área que resulta em aproximadamente um mililitro de líquido por 20,3 cm2 da região de crescimento.

[0100] Em qualquer modalidade do método, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode ser um líquido (por exemplo, água ou amostra de bebida a ser testada para contaminação microbiana) ou a amostra pode ser uma amostra sólida ou semissólida suspensa em um veículo líquido ou diluente.

[0101] Alternativamente, em qualquer modalidade, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode compreender um líquido, um sólido, ou um material semissólido que é colocado dentro do compartimento de crescimento antes ou após um volume predefinido (de preferência, estéril) de veículo líquido ou diluente é colocado no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0102] Tipicamente, o dispositivo de cultura é colocado em uma superfície geralmente plana, e a base e a cobertura são separadas (por exemplo, a cobertura é levantada) para permitir acesso ao compartimento de crescimento do dispositivo de cultura, enquanto o compartimento de crescimento está sendo hidratado e/ou inoculado. Vantajosamente, o dispositivo de cultura pode ser hidratado e/ou inoculado em um ambiente aeróbico (isto é, ar). Tipicamente, um líquido aquoso (que pode incluir material da amostra a ser testada) usado para hidratar o dispositivo é pipetado sobre o compartimento entre a base e a cobertura. Depois que o volume predefinido de líquido aquoso é depositado no compartimento de crescimento, o dispositivo de cultura é fechado (por exemplo, abaixando a cobertura, até entrar em contato com o elemento espaçador). Opcionalmente, um espalhador plano ou côncavo, similar àqueles usados para inocular dispositivos de cultura PETRIFILM, pode ser usado para distribuir o líquido aquoso sobre uma área predefinida no dispositivo de cultura.

[0103] Em qualquer modalidade do método, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento pode compreender colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Nessas modalidades, a amostra pode compreender um líquido aquoso e/ou a amostra pode ser diluída ou suspensa em um líquido aquoso.

[0104] Alternativamente, em qualquer modalidade, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Nessas modalidades, um volume predeterminado de líquido aquoso pode ser colocado (por exemplo, pipetado) no compartimento de crescimento antes ou após a colocação da amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode ser capturada em um filtro de membrana, que é colocado no interior do compartimento de crescimento antes ou após o agente gelificante ser hidratado com um líquido aquoso.

[0105] Em qualquer modalidade do método, a colocação da amostra no compartimento de crescimento compreende a colocação de um ou mais aditivos para o compartimento de crescimento. Um ou mais aditivos podem ser colocados no compartimento de cultura com a amostra ou separadamente. Um ou mais aditivos podem desempenhar uma variedade de funções no método. Por exemplo, em qualquer modalidade, um ou mais aditivos podem compreender um nutriente ou um meio de nutrientes para facilitar o crescimento dos microrganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerotolerantes ou microaerofílicos no dispositivo. Estes nutrientes e meios de nutrientes são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados com base no microrganismo particular a ser cultivado. O nutriente e o meio de nutrientes não devem interferir substancialmente no reagente removedor de oxigênio. Isso pode ser facilmente testado usando um sensor de oxigênio, conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 da Publicação PCT n° WO2015/061213, que está aqui integralmente incorporada, por referência.

[0106] Alternativa ou adicionalmente, em uma modalidade, o aditivo compreende um ou mais agentes seletivos (por exemplo, um antibiótico, um sal) que favorece o crescimento de um microrganismo em relação a pelo menos um outro microrganismo. Em uma modalidade, o agente seletivo favorece o crescimento de um microrganismo em relação a outros microrganismos presentes em uma amostra. Alternativa ou adicionalmente, em uma modalidade, o aditivo compreende um reagente indicador (por exemplo, um indicador de pH, um indicador redox, um substrato enzimático cromogênico, um substrato enzimático fluorogênico) para a detecção da presença de um microrganismo. Um versado na técnica reconhecerá agentes seletivos e reagentes indicadores úteis para detectar certos microrganismos. O agente seletivo e/ou o indicador não devem interferir substancialmente no reagente removedor de oxigênio. Isso pode ser facilmente testado pelo uso de um sensor de oxigênio conforme descrito acima.

[0107] Em qualquer modalidade, uma quantidade eficaz do agente seletivo permite substancialmente a germinação e crescimento de bactérias de ácido lático em um dispositivo de cultura, e a quantidade eficaz de agente seletivo inibe substancialmente o crescimento de espécies de E. coli, S. aureus, C. sporogenes, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogencia e/ou Fusobacterium.

[0108] Ao entrar em contato com líquido aquoso no compartimento de crescimento; os componentes secos (por exemplo, o reagente removedor de oxigênio, o reagente tampão, o reagente gerador de dióxido de carbono, o nutriente, o reagente indicador, o agente redutor e/ou o agente seletivo) e o líquido aquoso formam uma mistura que compreende uma primeira concentração de oxigênio dissolvido e uma primeira concentração de dióxido de carbono dissolvido.

[0109] Em qualquer modalidade, a primeira concentração de oxigênio dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento pode ser uma concentração que inibe substancialmente o crescimento de um microrganismo obrigatoriamente anaeróbico, um microrganismo microaerofílico e/ou um microrganismo microaerotolerante. Nessas modalidades, a colocação dos componentes aquosos em comunicação de fluido aquoso inicia uma reação de remoção de oxigênio, reduzindo assim a primeira concentração de oxigênio dissolvido no líquido aquoso no compartimento de crescimento para uma segunda concentração que é menor do que a primeira concentração (por exemplo, de ao menos cerca de 25% menor, ao menos cerca de 50% menor, ao menos cerca de 60% menor, ao menos cerca de 70% menor, ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 98%, ao menos cerca de 99% menor, ou mais do que 99% menor do que a primeira concentração).

[0110] Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido pode compreender a redução do oxigênio dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento para uma segunda concentração que é suficientemente baixa para suportar o crescimento de LAB (por exemplo, LAB aerotolerantes ou LAB obrigatoriamente anaeróbicos).

[0111] Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 120 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 90 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 60 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 45 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer modalidade, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 30 minutos após a mistura ser formada.

[0112] Em qualquer modalidade, a primeira concentração de dióxido de carbono dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento pode ser uma concentração que sustenta o crescimento de um microrganismo. Entretanto, alguns ou todos os microrganismos na amostra podem acumular biomassa mais rapidamente em um ambiente enriquecido com CO2. Dessa forma, nessas modalidades, colocar os componentes em comunicação fluida aquosa com o reagente gerador de dióxido de carbono opcional inicia uma reação geradora de dióxido de carbono, portanto aumentando a primeira concentração de dióxido de carbono disponível na mistura aquosa no compartimento de crescimento até uma segunda concentração (por exemplo, dentro de menos que 90 minutos, dentro de menos que 60 minutos ou dentro de menos que 30 minutos) que é maior (por exemplo, cerca de duas vezes a primeira concentração, cerca de 4 vezes a primeira concentração, cerca de 5 vezes a primeira concentração, cerca de 9,4 vezes a primeira concentração) do que a primeira concentração. O dióxido de carbono disponível adicional não resulta na formação de macroscópicos (isto é, bolhas de gás > 1 mm de diâmetro) no hidrogel formado no compartimento de crescimento, quando um dispositivo de cultura da presente revelação é inoculado e incubado. Dessa forma, os dispositivos de cultura contendo o reagente gerador de dióxido de carbono podem ser usados em métodos que envolvem a detecção de fermentação de um carboidrato fermentável em gás CO2, que se acumula sob a forma de uma bolha adjacente à colônia.

[0113] Se o dispositivo de cultura é hidratado antes de o material de amostra ser colocado no aparelho, o agente gelificante solúvel em água fria pode ser opcionalmente deixado hidratar e formar um gel (por exemplo, à temperatura ambiente) por cerca de vários minutos até cerca de 30 minutos ou mais antes que o dispositivo seja reaberto para inocular com o material de cultura. Durante o período em que o agente gelificante é deixado hidratar e formar um gel, o reagente removedor de oxigênio reduz a concentração de oxigênio dissolvido no agente gelificante hidratado de uma primeira concentração para uma segunda concentração que facilita o crescimento de microrganismos microaerotolerantes ou anaeróbicos obrigatórios, conforme aqui discutido.

[0114] Antes ou depois do compartimento de crescimento do dispositivo de cultura ser hidratado, o material da amostra pode ser colocado em contato com o compartimento de crescimento de uma variedade de maneiras que são conhecidas na técnica. Em qualquer modalidade, o material de amostra é colocado em contato com a área de crescimento através da deposição do material de amostra na área de crescimento. Isso pode ser feito, por exemplo, por pipetagem, colocando o compartimento de crescimento em contato com um chumaço que foi usado para obter o material da amostra (por exemplo, através de esfregaço de uma superfície), colocando o compartimento de crescimento em contato com uma alça ou agulha de inoculação (por exemplo, com o uso de uma técnica de placa por estrias), ou colocando um dispositivo de captura de amostra (por exemplo, um chumaço, uma esponja, ou filtro de membrana) diretamente no compartimento de crescimento, e fechando novamente o dispositivo de cultura. Após a amostra ter sido depositada e o dispositivo de cultura ser novamente fechado (tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar visíveis macroscopicamente no dispositivo de cultura), o reagente removedor de oxigênio recomeça o esgotamento do oxigênio dissolvido no compartimento de crescimento.

[0115] Em qualquer modalidade, após os componentes secos no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura serem hidratados e o agente gelificante formar um gel, o dispositivo de cultura pode ser usado como uma placa de contato (por exemplo, uma placa Rodac). Dessa forma, após o gel ter sido formado, a base e a cobertura do dispositivo de cultura são separadas, expondo o gel hidratado. O gel hidratado é colocado em contato com uma superfície a ser amostrada, e o dispositivo de cultura é fechado novamente, tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar macroscopicamente visíveis no dispositivo de cultura. Ao se fechar novamente o dispositivo, o gel hidratado retorna para o compartimento de crescimento no interior do dispositivo de cultura. Vantajosamente, o procedimento de placa de contato pode ser realizado em ambiente aeróbico e, após fechar novamente o dispositivo de cultura, um ambiente de oxigênio reduzido pode ser restabelecido no dispositivo de cultura pelo reagente removedor de oxigênio.

[0116] Em qualquer modalidade do método, após a amostra ser colocada no compartimento de crescimento e fechada, o dispositivo de cultura é incubado por um período de tempo (por exemplo, um período de tempo predeterminado). As condições de incubação (por exemplo, a temperatura de incubação) podem afetar a taxa de crescimento dos microrganismos, como é bem conhecido por um versado na técnica. Por exemplo, a incubação a temperaturas mais baixas (por exemplo, abaixo de cerca de 25°C) pode possibilitar a detecção de bactérias psicrotróficas. A incubação a temperaturas mais elevadas (por exemplo, cerca de 30°C, cerca de 32°C, cerca de 35°C) pode facilitar o crescimento mais rápido de certos microrganismos mesofílicos.

[0117] Em algumas modalidades, após a inoculação, o dispositivo de cultura pode ser incubado durante ao menos cerca de 16 horas, ao menos cerca de 18 horas, ao menos cerca de 24 horas, ou ao menos cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, o dispositivo de cultura pode ser incubado por não mais que cerca de 24 horas, não mais que cerca de 48 horas, ou não mais que cerca de 72 horas. Em determinadas modalidades preferenciais, o dispositivo de cultura é incubado durante cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode ser incubado, e manter um ambiente de oxigênio reduzido no mesmo, por cerca de 72 horas, por cerca de 96 horas, por cerca de 120 horas, por cerca de 7 dias, por cerca de 8 dias ou antes da detecção ou contagem de colônias microbianas que crescem no compartimento de crescimento. Em qualquer modalidade, a incubação do dispositivo de cultura por um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana compreende a incubação do dispositivo de cultura durante um período de tempo em uma atmosfera aeróbica (isto é, o dispositivo de cultura é colocado em um recipiente de oxigênio reduzido ou caixa de luvas para incubação).

[0118] Após o dispositivo de cultura inoculado ser incubado, o método compreende adicionalmente a detecção de uma colônia microbiana. As colônias microbianas podem ser detectadas no dispositivo de cultura por uma variedade de técnicas que são conhecidas na técnica. Após um período de incubação adequado, a ausência de um microrganismo pode ser detectada em um dispositivo de cultura pela ausência de colônias observáveis, ausência de uma alteração em um indicador de crescimento (por exemplo, um indicador de pH, um substrato enzimático cromogênico, um indicador de oxirredução como TTC, um substrato enzimático fluorogênico) e ausência de bolhas de gás associadas ao metabolismo do carboidrato fermentável no meio de crescimento.

[0119] Uma zona ácida associada a uma colônia de microrganismos pode ser detectada visualmente e/ou com o uso de um sistema de imageamento. Por exemplo, em um método em que o meio de cultura compreende púrpura de bromocresol como um indicador de pH, o meio de cultura terá uma aparência púrpura ou cinza a cerca de um pH neutro. À medida que os microrganismos crescem e fermentam um carboidrato (por exemplo, glicose) no meio de cultura, o indicador púrpura de bromocresol aparecerá amarelo adjacente às colônias de bactérias em crescimento. Por exemplo, em um método em que o meio de cultura compreende vermelho de clorofenol como um indicador de pH, o meio de cultura terá uma aparência vermelha ou violeta a cerca de um pH neutro. À medida que os microrganismos fermentam um carboidrato no meio de cultura, o indicador vermelho de clorofenol aparecerá amarelo adjacente às colônias de micróbios.

[0120] As bolhas de gás, caso estejam presentes no compartimento de crescimento e associadas a uma colônia de microrganismos (por exemplo, ou tocando a colônia ou em uma distância de cerca de 1 mm ou menos a partir da colônia), podem ser detectadas visualmente e/ou com o uso de um sistema de imageamento. As bolhas de gás podem ser associadas a uma colônia visível e/ou uma zona ácida detectável através de uma alteração na cor do indicador de um pH em uma região adjacente à colônia de microrganismos. A bolha de gás pode compreender dióxido de carbono gerado pela fermentação anaeróbica de um carboidrato, por exemplo.

[0121] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o método pode compreender ainda a obtenção de uma imagem do dispositivo de cultura. Nessas modalidades, a detecção da presença ou ausência de um LAB compreende a exibição, a impressão ou a análise da imagem do dispositivo de cultura. O sistema de formação de imagens compreende um dispositivo de imageamento e pode compreender um processador. Em algumas modalidades, o dispositivo de formação de imagens pode compreender um scanner de linha ou um scanner de área (por exemplo, uma câmera). O dispositivo de formação de imagens pode incluir um escâner monocromático (por exemplo, preto-e- branco) ou um escâner policromático (por exemplo, colorido). Vantajosamente, os sistemas de formação de imagens monocromáticas podem fornecer imagens de resolução mais alta, o que pode otimizar a exatidão do resultado e/ou reduzir o tempo necessário para detectar a presença de microrganismos no dispositivo de cultura.

[0122] Em algumas modalidades, o sistema de formação de imagens compreende, ainda, um sistema de iluminação. O sistema de iluminação pode incluir pelo menos uma fonte de luz visível de amplo espectro (por exemplo, uma luz "branca"). Em algumas modalidades, o sistema de iluminação pode incluir pelo menos uma fonte de luz visível de espectro estreito (por exemplo, um diodo emissor de luz que emite uma largura de banda relativamente estreita da luz visível como, por exemplo, luz vermelha, verde ou azul). Em certas modalidades, o sistema de iluminação pode incluir uma fonte de luz visível de espectro estreito (por exemplo, um diodo emissor de luz) com um pico de emissão de luz em um comprimento de onda pré-selecionado (cerca de 525 nm).

[0123] A imagem pode ser obtida a partir da luz refletida pelos componentes (por exemplo, colônias microbianas, meio de crescimento e indicadores) para o compartimento de crescimento do dispositivo de cultura ou a imagem pode ser obtida a partir de luz transmitida através dos componentes no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Sistemas de imageamento adequados e os correspondentes sistemas de iluminação são descritos, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO 2005/024047 e nas publicações dos pedidos de patentes U.S. n° US 2004/0101954 e US 2004/0102903, cada uma das quais sendo aqui incorporada, a título de referência, em sua totalidade. Alguns exemplos não limitadores de sistemas de imageamento adequados incluem o leitor de placa PETRIFILM (PPR), disponível junto à 3M Company (St. Paul, MN, EUA), o contador de colônias PETRISCAN disponível junto à Spiral Biotech (Norwood, MA, EUA), e os scanners de placas PROTOCOL e ACOLYTE disponíveis junto à Synbiosis (Cambridge, Reino Unido).

[0124] Em algumas modalidades, a obtenção de uma imagem compreende a obtenção de uma imagem de comprimento de onda inclinado. Por exemplo, o sistema de formação de imagens pode incluir um filtro de inclinação que inclina a luz coletada pelo dispositivo de formação de imagens. Os elementos filtrantes são conhecidos na técnica e incluem tanto filtros de "corte" (isto é, filtros que permitem a passagem de comprimentos de onda da luz ou acima ou abaixo de um certo comprimento de onda especificado) e filtros de "passagem de banda" (isto é, filtros que permitem a passagem de comprimentos de onda de luz entre certos limites superior e inferior especificados). Um filtro de inclinação pode ser posicionado entre a fonte de iluminação e o dispositivo de cultura. Alternativa ou adicionalmente, um filtro de inclinação pode ser posicionado entre o dispositivo de cultura e o dispositivo de formação de imagens.

MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS

[0125] A Modalidade A é um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de microrganismos compreendendo: uma base tendo superfícies interna e externa opostas; uma cobertura tendo superfícies interna e externa opostas; um elemento espaçador, disposto entre a base e a cobertura, sendo que o espaçador é acoplado à base ou à cobertura, sendo que o elemento espaçador compreende uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento, sendo que o elemento espaçador e o compartimento de crescimento estão dispostos entre a superfície interna da base e a superfície interna da cobertura; uma primeira camada adesiva aderida à base no compartimento de crescimento ou uma segunda camada adesiva aderida à cobertura no compartimento de crescimento; uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio seco aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva; sendo que o reagente removedor de oxigênio consiste essencialmente em partículas com um diâmetro menor que 106 mícrons; e um agente gelificante seco solúvel em água fria aderido à primeira ou à segunda camada adesiva; sendo que a cobertura pode ser acoplada à base ou ao elemento espaçador.

[0126] A Modalidade B é o dispositivo de cultura da Modalidade A, sendo que o reagente removedor de oxigênio consiste essencialmente em partículas com um diâmetro menor que 106 mícrons.

[0127] A Modalidade C é o dispositivo de cultura da Modalidade A ou da Modalidade B, que compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva no compartimento de crescimento.

[0128] A Modalidade D é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono consiste essencialmente em partículas com um diâmetro menor que 106 mícrons.

[0129] A Modalidade E é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, sendo que o elemento espaçador não é poroso.

[0130] A Modalidade F é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente uma quantidade eficaz de um reagente de tampão seco disposto no compartimento de crescimento.

[0131] A Modalidade G é o dispositivo de cultura da Modalidade F, sendo que o reagente de tampão está aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0132] A Modalidade H é o dispositivo de cultura da modalidade G, sendo que o reagente tampão está aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva.

[0133] A Modalidade I é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente um nutriente seco para facilitar o crescimento de um microrganismo alvo.

[0134] A Modalidade J é o dispositivo de cultura da modalidade I, sendo que o nutriente compreende um carboidrato fermentável.

[0135] A Modalidade K é o dispositivo de cultura da Modalidade J, sendo que o carboidrato é selecionado do grupo consistindo em glicose, maltose, sacarose e trealose.

[0136] A Modalidade L é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades I a K, sendo que o nutriente está aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0137] A Modalidade M é o dispositivo de cultura da Modalidade L, sendo que o nutriente está aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva.

[0138] A Modalidade N é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente um primeiro reagente indicador para detectar o crescimento de um microrganismo anaeróbico alvo.

[0139] A Modalidade O é o dispositivo de cultura da Modalidade N, sendo que o primeiro reagente indicador está aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0140] A Modalidade P é o dispositivo de cultura da Modalidade O, sendo que o nutriente está aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva.

[0141] A Modalidade Q é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente uma quantidade eficaz de um agente seletivo para inibir o crescimento de um microrganismo não alvo.

[0142] A modalidade R é o dispositivo de cultura da Modalidade Q, sendo que o agente seletivo é selecionado dentre o grupo consistindo em ciclo- heximida, um polieno macrolídeo, anfotericina B, natamicina e filipina.

[0143] A Modalidade S é o dispositivo de cultura da Modalidade Q ou da Modalidade R, sendo que o agente seletivo é aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0144] A Modalidade T é o dispositivo de cultura da Modalidade S, sendo que o agente seletivo é aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva.

[0145] A Modalidade U é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente uma quantidade eficaz de um reagente redutor.

[0146] A Modalidade V é o dispositivo de cultura da Modalidade U, sendo que o agente redutor é selecionado do grupo consistindo em tioglicolato de sódio, ditiotreitol e ditioeritritol.

[0147] A Modalidade W é o dispositivo de cultura da Modalidade U ou da Modalidade V, sendo que o agente redutor é aderido à base ou à cobertura no compartimento de crescimento.

[0148] A Modalidade X é o dispositivo de cultura da Modalidade W, sendo que o agente redutor é aderido à primeira camada adesiva ou à segunda camada adesiva.

[0149] A Modalidade Y é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades D a X, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono compreende um carbonato metálico.

[0150] A Modalidade Z é o dispositivo de cultura da Modalidade Y, sendo que o carbonato metálico é selecionado do grupo que consiste em bicarbonato de sódio e carbonato de sódio.

[0151] A Modalidade AA é o dispositivo de cultura de quaisquer Modalidades precedentes: caracterizado pelo fato de que a superfície interna da base tem o primeiro adesivo aderido à mesma; sendo que um ou mais dos primeiros componentes dispostos no compartimento de crescimento são aderidos ao primeiro adesivo; sendo que o primeiro componente é selecionado do grupo consistindo em agentes gelificantes, reagente removedor de oxigênio, reagente tampão, nutriente, reagente indicador, agente seletivo, agente redutor, e uma combinação de quaisquer dos dois ou mais dos primeiros componentes anteriores.

[0152] A Modalidade AB é o dispositivo de cultura da Modalidade AA: sendo que um segundo componente é disposto no primeiro adesivo; sendo que o segundo componente é selecionado do grupo que consiste no reagente indicador, agente seletivo, e combinações dos mesmos.

[0153] A Modalidade AC é o dispositivo de cultura de quaisquer Modalidades precedentes: sendo que a superfície interna da cobertura tem o segundo adesivo aderido à mesma; sendo que um ou mais dos terceiros componentes dispostos no compartimento de crescimento são aderidos ao segundo adesivo; sendo que o terceiro componente é selecionado do grupo consistindo em agente gelificante, reagente removedor de oxigênio, reagente tampão, nutriente, reagente indicador, agente seletivo, agente redutor, e uma combinação de quaisquer de dois ou mais dos terceiros componentes anteriores.

[0154] A Modalidade AD é o dispositivo de cultura da Modalidade AC: sendo que um quarto componente é disposto no segundo adesivo; sendo que o quarto componente é selecionado do grupo que consiste no reagente indicador, agente seletivo, e combinações dos mesmos.

[0155] A Modalidade AE é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, sendo que o reagente removedor de oxigênio compreende ferro ferroso ou um sal do mesmo, ou ácido ascórbico ou um sal do mesmo.

[0156] A Modalidade AF é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, compreendendo adicionalmente um segundo reagente indicador seco disposto no compartimento de crescimento, sendo que o segundo reagente indicador indica a presença de microrganismos não alvos e de microrganismos alvos.

[0157] A Modalidade AG é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, em que o reagente removedor de oxigênio é disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2.

[0158] A Modalidade AH é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono é disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1 micromol/10 cm2 de área superficial da base ou da cobertura no compartimento de crescimento a cerca de 35 micromols/10 cm2 de área superficial da base ou da cobertura no compartimento de crescimento.

[0159] A Modalidade AI é um método de detecção de um microrganismo em uma amostra, o método compreendendo: colocar o dispositivo de cultura de qualquer uma das Modalidades precedentes em uma configuração aberta que permite acesso ao compartimento no mesmo; colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento; colocar uma amostra no compartimento de crescimento; fechar o dispositivo de cultura, sendo que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento e o fechamento do dispositivo de cultura compreende a formação de um meio de cultura microbiano semissólido encerrado pela base, cobertura e elemento espaçador do dispositivo de cultura; incubar o dispositivo de cultura inoculado por tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura; e detectar a colônia microbiana.

[0160] A Modalidade AJ é o método da Modalidade AI, sendo que a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento.

[0161] A Modalidade AK é o método da Modalidade AI, sendo que a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento.

[0162] A Modalidade AL é o método da Modalidade AK, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento ocorre após a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento.

[0163] A Modalidade AM é o método da Modalidade AK, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento ocorre antes da colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento.

[0164] A Modalidade AN é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AM, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento compreende a colocação de um aditivo no compartimento de crescimento.

[0165] A Modalidade AO é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AN, sendo que a colocação do aditivo no compartimento de crescimento compreende a colocação de uma quantidade eficaz de um agente seletivo ou um indicador.

[0166] A Modalidade AP é o método da Modalidade AO, sendo que a quantidade eficaz do agente seletivo permite substancialmente o crescimento de bactérias de ácido lático no dispositivo de cultura, e a quantidade eficaz de agente seletivo inibe substancialmente o crescimento de espécies de E. coli, S. aureus, C. sporogenes, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogencia e/ou Fusobacterium.

[0167] A modalidade AQ é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AP, sendo que a incubação do dispositivo de cultura durante um período de tempo compreende incubar o dispositivo de cultura durante o período de tempo em uma atmosfera aeróbica.

[0168] A modalidade AR é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AQ, sendo que após a incubação do dispositivo de cultura, a detecção da colônia microbiana compreende adicionalmente a enumeração de uma ou mais colônias opticamente detectáveis no dispositivo de cultura.

[0169] A Modalidade AS é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AR, sendo que o dispositivo de cultura compreende o reagente indicador disposto no compartimento de crescimento, sendo que a detecção da colônia microbiana compreende a detecção de uma mudança óptica associada ao reagente indicador, sendo que a mudança óptica é detectada próximo à colônia microbiana.

[0170] A Modalidade AT é o método de acordo com a Modalidade AS, sendo que a mudança óptica compreende uma mudança de cor.

[0171] A Modalidade AU é o método de qualquer uma das Modalidades AI a AT, sendo que a detecção da colônia microbiana compreende detectar opticamente uma bolha de gás próxima à colônia no compartimento de crescimento.

[0172] A Modalidade AV é o método de qualquer uma das Modalidades AR a AU, sendo que a enumeração de uma ou mais colônias microbianas compreende adicionalmente a distinção de colônias produtoras de dióxido de carbono das colônias não produtoras de dióxido de carbono.

[0173] Os objetivos e as vantagens da presente invenção são ilustrados, adicionalmente, pelos exemplos a seguir, porém, os materiais e as quantidades particulares relatados nesses exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser interpretados como limitando indevidamente esta invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE

[0174] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente de acordo com a Figura 1 foi construído. O primeiro substrato consistia em um filme de poliéster com 0,127 mm (5 mil) de espessura (filme de poliéster orientado biaxialmente MELINEX Grade 377 (PET), obtido junto à DuPont Teijin, Chester, VA). Uma formulação de nutrientes em pó (listada na Tabela 1) e goma guar (16 g/l) foram agitadas em água deionizada para obter uma mistura substancialmente uniforme. O pH da mistura foi definido para ser de 5,8 +/- 0,5 e ajustado com ácido ou base, se necessário, para alcançar o valor alvo. A mistura foi revestida com lâmina sobre o primeiro substrato, conforme descrito na patente U.S. n° 4.565.783, e seca durante 8 minutos a 98,9°C (210°F) em um forno de convecção. A camada de nutrientes foi revestida até uma espessura que resultou em um peso de revestimento alvo (após a secagem) de 3,6 mg/cm2 (0,56 g/24 pol2). Após a secagem, um espaçador de filme de polietileno (Optimum Plastics, Bloomer, WI, EUA) de aproximadamente 0,508 mm (20 mils) de espessura foi aderido ao revestimento seco, sobre o primeiro substrato através de uma camada fina de um adesivo sensível à pressão (98% em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com ácido acrílico 2% em peso). O espaçador continha uma abertura de diâmetro circular de 6,03 cm (2 3/8 polegadas) que definia o perímetro do compartimento de crescimento do dispositivo.

[0175] Ascorbato de sódio (Sigma-Aldrich Corporation, Saint Louis, MO, EUA) e bicarbonato de sódio (Sigma - Aldrich Corporation) foram individualmente moídos e, então, passados através de uma peneira de malha 140 (resultando em um tamanho de partícula menor do que 106 mícrons). Uma mistura homogênea de goma guar (89,75% em peso disponível junto à Dupont, Danisco, Copenhagen, Dinamarca), ascorbato de sódio peneirado (10% em peso), e bicarbonato de sódio peneirado (0,25% em peso) foi preparada. O segundo substrato consistia em um filme de poliéster transparente (PET) (0,73 mm de espessura) que foi revestido em um lado com um segundo adesivo sensível à pressão (96% em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com acrilamida 4%) a um peso de revestimento de 1,3 mg/cm2 (0,2 g/24 pol2). A mistura homogênea de goma guar, ascorbato de sódio peneirado e bicarbonato de sódio peneirado foi, então, revestida com pó sobre o adesivo do segundo substrato de adesivo. O segundo substrato foi fixado ao primeiro substrato ao longo de uma borda usando uma fita adesiva de dupla-face, e os dispositivos foram cortados em retângulos de aproximadamente 7,6 cm (3") por 10,1 cm (4"), similares àqueles mostrados na Figura 1. O lado revestido do segundo substrato foi orientado para estar voltado para o espaçador e o compartimento de crescimento. TABELA 1. FORMULAÇÃO DE NUTRIENTE EM PÓ USADA PARA REVESTIR O PRIMEIRO SUBSTRATO DO DISPOSITIVO DO EXEMPLO 1

EXEMPLO 2

[0176] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1 com a exceção de que ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo do segundo substrato foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,7% em peso), ascorbato de sódio (10% em peso) e bicarbonato de sódio (0,3% em peso).

EXEMPLO 3

[0177] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1 com a exceção de que ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo do segundo substrato foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,5% em peso), ascorbato de sódio (10%, em peso) e bicarbonato de sódio (0,5% em peso).

EXEMPLO 4

[0178] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1 com a exceção de que ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo do segundo substrato foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,0% em peso), ascorbato de sódio (10% em peso) e bicarbonato de sódio (1,0% em peso).

EXEMPLO 5

[0179] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1 com a exceção de que ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo do segundo substrato foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (88,0% em peso), ascorbato de sódio (10% em peso), e bicarbonato de sódio (2,0% em peso).

EXEMPLO 6. MEDIÇÕES DA CONCENTRAÇÃO DE CO2 NOS DISPOSITIVOS DOS EXEMPLOS 1 A 5

[0180] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente dos Exemplos 1 a 5 foram monitorados quanto à geração de CO2 usando um transmissor de fibra ótica mini v2 pCO2 (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, DE cat# 200001207) com o software fornecido pelo fornecedor para medição da tensão de CO2. Cada dispositivo foi aberto levantando a cobertura para expor a região de crescimento do compartimento de crescimento. Um mililitro de tampão de Butterfield estéril foi depositado no compartimento de crescimento de cada placa. Um sensor de CO2 fino (5 mm de diâmetro e 200 mícrons de espessura) (Planar pCO2 Minisensor Spot, PreSens Precision Sensing GmbH, cat# 200001178) foi imediatamente colocado no compartimento de crescimento hidratado, e a cobertura foi suavemente abaixada até que ela entrasse em contato a região de crescimento hidratada e o espaçador. Um distribuidor plástico plano foi pressionado sobre o dispositivo fechado para espalhar o líquido através do compartimento de crescimento. Após o fechamento do dispositivo, a fluorescência do sensor foi monitorada usando um cabo de fibra óptica polimérica para o transmissor. As medições da concentração de CO2 no compartimento de crescimento hidratado foram registradas imediatamente após o fechamento do dispositivo e 90 minutos mais tarde. Na Tabela 2 o aumento médio em vezes na concentração de CO2 medida após 90 minutos é relatado (n=5). TABELA 2

EXEMPLO 7. PREPARAÇÃO E USO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE

[0181] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente de acordo com a Figura 1 foi construído. O primeiro substrato foi revestido e preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1 com a única exceção de que goma guar (14 g/L) foi combinada com a formulação de nutrientes da Tabela 3, em vez da formulação de nutrientes na Tabela 1.

[0182] Ascorbato de sódio (Sigma-Aldrich Corporation, Saint Louis, MO, EUA) e bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich Corporation) foram individualmente moídos e então, passados através de uma peneira de malha 140 (resultando em um tamanho de partícula menor do que 106 mícrons). Uma mistura homogênea de goma guar (89,7% em peso disponível junto à Dupont, Danisco, Copenhagen, Dinamarca), ascorbato de sódio peneirado (10%, em peso) e bicarbonato de sódio peneirado (0,3%, em peso) foi preparada. O segundo substrato consistia em um filme de poliéster transparente (PET) (0,73 mm de espessura) que foi revestido em um lado com um segundo adesivo sensível à pressão (96% em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com acrilamida 4%) a um peso de revestimento de 1,3 mg/cm2 (0,2 g/24 pol2). Uma quantidade-traço de cloreto de trifenil tetrazólio (cerca de 0,003 mg/cm2 (0,48 mg/24 pol2)) foi incorporada no adesivo. A mistura homogênea de goma guar, ascorbato de sódio peneirado e bicarbonato de sódio peneirado foi, então, revestida com pó sobre o adesivo do segundo substrato de adesivo. O segundo substrato foi fixado ao primeiro substrato ao longo de uma borda usando uma fita adesiva dupla-face, e os dispositivos foram cortados em retângulos de aproximadamente 7,6 cm (3") por 10,1 cm (4") similares àqueles mostrados na Figura 1. O lado revestido do segundo substrato foi orientado para estar voltado para o espaçador e o compartimento de crescimento.

[0183] Amostras individuais das cepas bacterianas de espécies de Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp dextranicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbruekii, Streptococcus alactolyticus, Lactococcus garvieae, e Pediococcus acidilactici foram obtidos como isolados naturais de amostras de alimento. Suspensões individuais foram preparadas em tampão de Butterfield e diluídas em série para se obter suspensões com concentrações finais (de organismos individuais) que forneceram contagens de UFC de cerca de 100. Um mililitro de cada suspensão foi usado para inocular dispositivos de cultura individuais produzidos de acordo com o Exemplo. Os dispositivos de cultura foram inoculados pelo levantamento da cobertura para expor a região de crescimento do compartimento de crescimento, pipetagem de um mililitro da suspensão para o compartimento de crescimento, abaixando suavemente a cobertura até que entre em contato com a suspensão e o espaçador, e pressionando suavemente o distribuidor de plástico plano sobre o dispositivo fechado para espalhar a suspensão líquida por todo o compartimento de crescimento.

[0184] Após a inoculação, os dispositivos de cultura foram incubados a 32°C durante 48 horas em uma incubadora aeróbica. Após a incubação, as colônias de cor vermelha em cada dispositivo de cultura foram contadas por exame visual. A média da contagem de colônia (n=2) foi determinada para cada organismo.

[0185] Como uma referência comparativa, as placas de ágar foram inoculadas com suspensões individuais da mesma diluição e volume como usado anteriormente com o dispositivo de cultura deste Exemplo. A placa de ágar foi preparada com o uso de Ágar Lactobacilli MRS (Becton Dickinson Corporation, New Franklin, NJ, EUA). O ágar (70 g) foi sequencialmente suspenso em 1 L de água purificada; fervido durante 1 minuto para dissolver o pó; autoclavado a 121°C durante 15 minutos; e resfriado até 45 a 50°C. O meio resfriado (15 a 20 ml por placa) foi, então, vertido em placas de Petri estéreis que continham 1 ml da suspensão de amostra individual. O inóculo foi distribuído por toda a placa girando a placa em uma direção, e, então na direção oposta. A placa inoculada foi, então, colocada em uma câmara anaeróbica junto com um sachê gerador de gás (GASPAK EZ Anaerobe Sachet, Becton Dickinson Corp.) que forneceu uma atmosfera anaeróbia durante o período de incubação. As placas de ágar foram incubadas a 32°C durante 48 horas. Após a incubação, as colônias nas placas foram contadas por exame visual. A média da contagem de colônia (n=2) foi determinada para cada organismo.

[0186] Na Tabela 4, a razão entre a média de contagem de colônias determinada usando o dispositivo de cultura do Exemplo comparada com a média de contagem de colônias determinada com o uso de uma placa de ágar de referência é mostrada para cada organismo testado [isto é, razão=(média de contagem de colônias usando o dispositivo de cultura do Exemplo)/(média de contagem de colônia usando a placa de ágar de referência)]. TABELA 3. FORMULAÇÃO EM PÓ DE NUTRIENTES USADA PARA REVESTIR O PRIMEIRO SUBSTRATO DO DISPOSITIVO DO EXEMPLO 7 Componente Quantidade (g/L) Fonte

TABELA 4. RAZÕES DE CONTAGEM DE COLÔNIAS PARA CEPAS BACTERIANAS DO EXEMPLO 7 [RAZÃO=(MÉDIA DA CONTAGEM DE COLÔNIAS USANDO O DISPOSITIVO DE CULTURA DO EXEMPLO 7)/(MÉDIA DA COLÔNIA USANDO A PLACA DE ÁGAR DE REFERÊNCIA)]

EXEMPLO 8. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE.

[0187] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico independente de acordo com a Figura 1 foi construído. A base consistia em um filme de poliéster com 0,102 mm (4 mil) de espessura (filme de poliéster orientado biaxialmente MELINEX Grau 377 (PET), obtido junto à DuPont Teijin). Um membro espaçador de espuma de poliestireno (cerca de 0,38 mm de espessura e com uma densidade de aproximadamente 19,3 kg/m3) aderiu ao primeiro substrato por meio de uma fina camada de um adesivo sensível à pressão (98% em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com 2% em peso de ácido acrílico). O membro espaçador continha uma abertura de diâmetro circular de 6,03 cm (2 3/8 polegadas) que definia o perímetro do compartimento de crescimento do dispositivo.

[0188] Sulfato de ferro (II) hepta-hidratado (FeSO4-7H2O) (Sigma- Aldrich Corporation) foi moído e passado através de uma peneira de malha 140 (tamanho de partícula resultante menor do que 106 mícrons). Uma mistura homogênea de goma guar (70 g, disponível junto à Danisco Dupont) e FeSO4- 7H2O (1 g) peneirado foi preparada. A cobertura consistia em um filme de poliéster transparente (PET) (0,074 mm (2,9 mil) de espessura) que foi revestido em um lado com um segundo adesivo sensível à pressão (96% em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com acrilamida 4%) até um peso de revestimento de 1,3 mg/cm2 (0,2 g/24 pol2). A mistura homogênea de goma guar e FeSO4-7H2 peneirado foi, então, revestida com pó sobre o adesivo da cobertura. A cobertura foi fixada à base ao longo de uma borda, usando uma fita adesiva de dupla-face, e os dispositivos foram cortados em retângulos de aproximadamente 7,6 cm (3") por 10,1 cm (4"), similares àqueles mostrados na Figura 1. O lado revestido da cobertura foi orientado para estar voltado para o espaçador e o compartimento de crescimento.

EXEMPLO 9. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE.

[0189] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em peça única foi construído usando o procedimento conforme descrito no Exemplo 8 com a exceção de que ao invés do revestimento com a mistura em pó do Exemplo 8, o adesivo da cobertura foi revestido com uma mistura em pó de goma guar (70 g), L-cisteína (0,5 g, disponível junto à Sigma-Aldrich Corporation), e tioglicolato de sódio (2 g, disponível junto à Sigma-Aldrich Corporation).

EXEMPLO 10. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE.

[0190] Dispositivos de cultura geradores de ambiente anaeróbico independentes foram construídos usando o procedimento conforme descrito no Exemplo 8, com exceção de que, ao invés do revestimento com a mistura em pó do Exemplo 8, o adesivo da cobertura foi revestido com uma mistura em pó de goma guar (70 g), FeSO4-7H2O peneirado (1 g) e sulfito de sódio (0,5 g, disponível junto à Sigma-Aldrich Corporation).

EXEMPLO 11. Uso DE DISPOSITIVOS DE CULTIVO GERADORES DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTES DOS EXEMPLOS 9 E 10 PARA CULTIVAR CLOSTRIDIUM SPOROGENES

[0191] Clostridium sporogenes ATCC 3584 (armazenado a 4°C em água) foi diluído em série (diluições a 10 vezes) com tampão de Butterfield até uma concentração de cerca de 100 UFC/ml e, então, diluído adicionalmente (10 vezes) em caldo de infusão cérebro coração modificado para fornecer a amostra de inoculação. O caldo de infusão cérebro coração aquoso modificado foi preparado a partir da formulação mostrada na Tabela 5. Cloreto de trifenil tetrazólio (20 μg/ml) foi adicionado à amostra de inoculação. Dispositivos individuais de cultura produzidos de acordo com os exemplos 8 e 9 foram inoculados com 1 ml da amostra de inoculação. Os dispositivos de cultura foram inoculados pelo levantamento da cobertura para expor o compartimento de crescimento, pipetagem de um mililitro da suspensão para o compartimento de crescimento, abaixando suavemente a cobertura até entrar em contato com a suspensão e o membro espaçador e pressionando suavemente o distribuidor de plástico plano sobre o dispositivo fechado para espalhar a amostra de inoculação por todo o compartimento de crescimento.

[0192] Após a inoculação, os dispositivos de cultura foram incubados a 30°C durante 72 horas em uma incubadora aeróbica. Após a incubação, as colônias de cor vermelha com uma bolha associada foram contadas por examinação visual. Os resultados da contagem de colônias estão relatados na Tabela 6.

[0193] Como uma referência comparativa, as placas de contagem aeróbica PETRIFILM 3M (3M Corporation, Maplewood, MN) foram inoculadas conforme as instruções do fabricante com 1 ml de uma amostra de inoculação que havia sido diluída em série usando apenas um tampão de Butterfield como o diluente. As placas foram então incubadas a 37°C durante 72 horas em uma câmara anaeróbica (Don Whitley Scientific Ltd, Yorkshire, UK). Após a incubação, as colônias de cor vermelha com uma bolha de gás associada foram contadas por examinação visual. O resultado de contagem de colônia é registrado na Tabela 6. TABELA 5

XEMPLO 12. USO DO DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO INDEPENDENTE DO EXEMPLO 10 PARA CULTIVAR CLOSTRIDIUM SPOROGENES

[0194] As mesmas condições de inoculação e incubação, conforme descritas no Exemplo 11, foram usadas, com exceção de que o cloreto de trifenil tetrazólio não foi adicionado à amostra de inoculação. As colônias de cor preta acinzentada com um precipitado e bolhas de gás associadas foram contadas. Os resultados são relatados na tabela 6. TABELA 6

[0195] A revelação completa de todas as patentes, pedidos de patente, publicações e material disponível eletronicamente citados no presente documento está aqui incorporada, a título de referência. Caso exista qualquer inconsistência entre a revelação do presente pedido e a revelação (ou revelações) de qualquer documento aqui incorporado, a título de referência, a revelação do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos anteriormente mencionados foram oferecidos somente por uma questão de clareza de entendimento. Nenhuma limitação desnecessária deve ser inferida a partir dos mesmos. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

[0196] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue aos cabeçalhos, a menos que esteja especificado.

[0197] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras modalidades estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. DISPOSITIVO DE CULTURA PARA ENUMERAR COLÔNIAS DE MICRORGANISMOS MICROAEROFÍLICOS (100), que compreende: uma base (10) tendo superfícies interna (10b) e externa (10a) opostas; uma cobertura (20) tendo superfícies interna (20b) e externa (20a) opostas; um elemento espaçador (30), disposto entre a base (10) e a cobertura (20), sendo que o elemento espaçador (30) é acoplado à base (10) ou à cobertura (20), sendo que o elemento espaçador (30) compreende uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento (60), sendo que o elemento espaçador (30) e o compartimento de crescimento (60) estão dispostos entre a superfície interna (10b) da base (10) e a superfície interna (20b) da cobertura (20); uma primeira camada adesiva (12) aderida à base (10) no compartimento de crescimento (60) ou uma segunda camada adesiva (22) aderida à cobertura (20) no compartimento de crescimento (60); o dispositivo (100) caracterizado por compreender: uma quantidade de 1,5 micromol/10 cm2 a 15 micromols/10 cm2 de um reagente removedor de oxigênio seco aderidos à primeira camada adesiva (12) ou à segunda camada adesiva (22) dispostos no compartimento de crescimento (60); e um agente gelificante seco solúvel em água fria aderido à primeira camada adesiva (12) ou à segunda camada adesiva (22); sendo que a cobertura (20) é acoplada à base (10) ou ao elemento espaçador (30); em que o reagente removedor de oxigênio é selecionado a partir de ácido L-ascórbico e seus sais, sais de ferro ferrosos, sais metálicos de sulfito, bissulfito e metabissulfito.

2. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo reagente removedor de oxigênio consistir em partículas tendo um diâmetro de 106 mícrons ou menos.

3. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender adicionalmente uma quantidade de 1 micromol/10 cm2 a 35 micromols/10 cm2de um reagente gerador de dióxido de carbono seco aderido à primeira camada adesiva (12) ou à segunda camada adesiva (22) no compartimento de crescimento (60).

4. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo elemento espaçador (30) ser não poroso.

5. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente um nutriente seco aderido à base (10) ou à cobertura (20) no compartimento de crescimento (60) e, ainda compreender um primeiro reagente indicador para detectar o crescimento de um microrganismo anaeróbico alvo, sendo que o primeiro reagente indicador é aderido à base (10), ou à cobertura (20) no compartimento de crescimento (60), e ainda compreender um agente seletivo para inibir o crescimento de um microrganismo não-alvo, sendo que o agente seletivo é aderido à base (10) ou à cobertura (20) no compartimento de crescimento (60).

6. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente um agente redutor, sendo que o agente redutor é aderido à base (10) ou à cobertura (20) no compartimento de crescimento (60).

7. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela superfície interna (10b) da base (10) ter a primeira camada adesiva (12) aderida à mesma; sendo que um ou mais primeiros componentes são dispostos no compartimento de crescimento (60) são aderidos à primeira camada adesiva (12); sendo que o primeiro componente é selecionado do grupo consistindo em agentes gelificantes, reagente removedor de oxigênio, reagente tampão, nutriente, reagente indicador, agente seletivo, agente redutor, e uma combinação de quaisquer dos dois ou mais dos primeiros componentes anteriores.

8. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela superfície interna (20b) da cobertura (20) ter a segunda camada adesiva (22) aderida à mesma; sendo que um ou mais terceiros componentes dispostos no compartimento de crescimento (60) são aderidos à segunda camada adesiva (22); sendo que o terceiro componente é selecionado do grupo consistindo em agente gelificante, reagente removedor de oxigênio, reagente tampão, nutriente, reagente indicador, agente seletivo, agente redutor, e uma combinação de quaisquer de dois ou mais dos terceiros componentes anteriores.

9. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender adicionalmente um segundo reagente indicador em comunicação fluida com o compartimento de crescimento (60), sendo que o segundo reagente de indicador indica a presença de microrganismos não alvo e de microrganismos alvo.

10. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM MICRORGANISMO MICROAEROFÍLICO EM UMA AMOSTRA, o método caracterizado por compreender: colocar o dispositivo de cultura (100) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em uma configuração aberta que permite acesso ao compartimento de crescimento (60) no mesmo; colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento (60); colocar uma amostra no compartimento de crescimento (60); fechar o dispositivo de cultura (100), sendo que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento (60) e o fechamento do dispositivo de cultura (100) compreende a formação de um meio de cultura microbiano semissólido encerrado pela base (10), cobertura (20) e elemento espaçador (30) do dispositivo de cultura (100); incubar o dispositivo de cultura (100) inoculado por tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura; e detectar a colônia microbiana.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela colocação da amostra no compartimento de crescimento (60) compreender a colocação de um aditivo no compartimento de crescimento (60); em que o aditivo compreende um agente seletivo, sendo que o agente seletivo permite o crescimento de bactérias de ácido láctico no dispositivo de cultura (100) e o agente seletivo inibe o crescimento de espécies de E. coli, S. aureus, C. sporogenes, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogencia e/ou Fusobacterium.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado por incubar o dispositivo de cultura (100) por um período de tempo compreende incubar o dispositivo de cultura (100) pelo período de tempo em uma atmosfera aeróbica.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por após incubar o dispositivo de cultura (100), detectar a colônia microbiana ainda compreende enumerar uma ou mais colônias opticamente detectáveis no dispositivo de cultura (100).

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por detectar a colônia microbiana compreende detectar opticamente uma bolha de gás próxima à colônia no compartimento de crescimento (60).

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado pela enumeração de uma ou mais colônias microbianas compreender adicionalmente a distinção de colônias produtoras de dióxido de carbono das colônias não produtoras de dióxido de carbono.