JPH10504464A - 腸内細菌の検出及び計測のための培養培地及び製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一般にサンプル中の腸内細菌の存在を決定するために用いる製品及び方法に関し、そして特にサンプル中の腸内細菌の早期検出及び計測を可能にする製品及び方法に利用できうる細菌培養培地に関する。腸内細菌の早期検査及び計測を助長するこの細菌培養培地は所定量のグルコース、pH指示薬、及び生育する細菌に関連する有色指示薬ゾーンの培地中での拡散を防ぐバッファーを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 腸内細菌の検出及び計測のための培養培地及び製品 本発明は一般にサンプル中の腸内細菌の検出及び計測するために利用する製品 及び方法、そして特に食品サンプル中の腸内細菌の検出及び計測するのに利用さ れうる薄膜式乾燥培養培地製品並びにこの薄膜式製品の利用方法に関する。 背景 腸内細菌科にはグルコース発酵可能な小型、グラム陰性、オキシダーゼ陰性の 非胞子形成性の桿体として特徴付けられる細菌が含まれる。これらの微生物は腸 内管、土壌、水、植物、並びにその他の食品源、例えば肉類及び乳製品の如き生 育地の中において見い出せる。この科の一部の構成員は既知のヒト病原体、例え ばエッシェリヒア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shige lla）及びエンテロバクター（Enterobacter）属の細菌である。 サンプル中の腸内細菌の存在及び数を決定するための伝統的な方法は時間がか かり、めんどうであり、そして労力がかかる。一般に、技術者は試薬及び養分を 調製し、養分を寒天と混ぜ、その混合物を加熱し、その混合物をペトリ皿に注ぎ 、試薬サンプルを獲得し、試験サンプルを希釈し、その希釈サンプルのアリコー トを寒天に加え、寒天をゲル化させ、そのプレートを24〜48時間インキュベート し、そして最後にペトリ皿の中で成育している細菌コロニーの数を計測しなくて はならない。必要なら、特定の細菌を特別に同定するために確認試験も行わなく てはならないことがある。準備時間を短くし、且つサンプル中の腸内細菌の信頼 できる検査及びコロニー計 測を可能にする製品及び方法は微生物検査分野で働く者により明らかに歓迎され るであろう。 上記の準備時間を大いに短縮する製品の一例はHansenらの米国特許第4,565,78 3号、Nelsonらの同第5,089,413号及びNelsonらの同第5,232,838号に記載の微生 物を生育させるための薄膜式乾燥培養製品である。代表的な薄膜製品において、 ゲル化剤、微生物成育養分及び鉱物、並びに指示色素を含む冷水可溶性乾燥粉末 が防水性支持体の上にコーティングされている。この防水性支持体は接種領域を 担うフォームスペーサーで覆われている。指示色素及び粉末ゲル化剤を含むアク リレート接着剤により内面がコーティングされた透明な透読性(read−through) カバーがこのフォームスペーサーに取付けられている。 薄膜を使用するとき、一般に所定量の水性サンプルをこのフォームスペーサー により規定された領域におけるコーティングの施された支持体と接触させ、そし てカバーシートをサンプル及び支持体の上に載せる。この水性サンプルは可溶性 乾燥粉末を水和し、その粉末は微生物の成育を維持可能なゲル化培地を形成する ようになる。成育期間中、カバーシートに付着した指示色素は生存微生物の存在 下で反応して、培養製品上で成育する細菌コロニーの可視化を可能にする検出可 能な応答を示す。種々のタイプの薄膜式乾燥培養培地製品が３Ｍ，St．Panl，MN よりPETRIFILM薄膜式乾燥培養培地プレートとして市販されている。 この薄膜式乾燥培養培地製品は慣用のゲル化寒天培地／ペトリ皿システムより もはるかに簡単に利用でき、その理由は使用者が培養培地、寒天及びその他の試 薬を加熱及び混合し、次いでこの混合物をペトリ皿又は注入プレートに添加する 必要がないからである。更に、これらの製品はコンパクトであり、且つ容易に廃 棄でき、それ 故使用がより簡単且つ安全である。 大腸菌の迅速な計測を担うために薄膜プレートに利用されうる培養培地はMach らの米国特許第5,364,766号に報告されている。この文書においては、大腸菌を 含むサンプルのアリコートをトリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁 塩及び過剰量のpH指示薬フェノールレッドを含んで成る培養培地に加えている。 この培地はその中で成育する細菌の非常に近くで高濃度のフェノールレッドを供 する。報告の培地及び高濃度のフェノールレッドの利用は24時間以内での大腸菌 の検出及び計測を可能にする。しかしながら、報告の培地は、その製品のインキ ュベートの際の培地中でのpH指示薬の拡散により妨げられる。より詳しくは、大 腸菌の存在は、成育する微生物による有機酸の生成により引き起こされる成育微 生物コロニーの周辺のゾーンにおけるフェノールレッド指示薬の赤色から黄色に 至る可視変色によりまず検出される。成育細菌が有色ゾーンをもたらしめる有機 酸を生産し続けると、有色ゾーンのサイズは大きくなり、そしてコロニーの周辺 の有色ゾーンと融合してしまう。十分な成育酸生産性コロニーが存在していると 、培地の色は赤から黄色へと事実上完全に変わってしまいうる。培地の色が約24 時間以降に赤色から黄色へと完全に変わる場合、培地の中に別の指示薬を用いて 第二の変色を検出することが可能である。 発明の概要 本発明は、腸内細菌の検出及び計測を可能にする、並びに生育する腸内細菌コ ロニーにより生産される有機酸に応答して変化するpH指示薬により引き起こされ る培地での有色指示薬ゾーンの拡散の制御を可能にする製品及び方法を供するこ とにより、上述の現在の製品及び方法の欠点を解消する。 本発明の一の態様は、培地の中で成育する腸内細菌の検出及び計測を助長する 細菌培養培地である。この培地は特定量のグルコース、pH指示薬、及び有色指示 薬ゾーンの培地中での過剰な拡散を阻止するバッファーを含む。使用時、グルコ ース、pH指示薬及びバッファーの量は、pH指示薬との関連で成育コロニーの周辺 の有色ゾーンが培地にわたって拡散してしまうことなく、コロニーの中の微生物 の最適成育を供するように選定する。 本発明における使用にとって好適な培地は最初のサンプルを用意するために用 いる希釈剤に依存する。サンプルを用意するのに用いる希釈剤が約0.6mmolのリ ン酸カリウムの水性希釈液であるとき（一般にButterfields標準方法バッファー と称される）、好適なゼラチンペプトン培養培地はそれを約７〜14ｇ／ｌ含み、 ６〜９ｇ／ｌの酵母抽出物、５〜20ｇ／ｌのグルコース、５〜15ｇ／ｌの塩化ナ トリウム、2.7〜3.15ｇ／ｌの胆汁塩、５〜13ｇ／ｌのグアーガム、0.6〜２ｇ／ ｌの一塩基性リン酸カリウム、1.8〜６ｇ／ｌの二塩基性リン酸カリウム、及び0 .2〜0.8ｇ／ｌのpH指示薬を含む。特に好適な培養培地は約14ｇ／ｌのゼラチン ペプトン、６ｇ／ｌの酵母抽出物、20ｇ／ｌのグルコース、10ｇ／ｌの塩化ナト リウム、３ｇ／ｌの胆汁塩、11ｇ／ｌのグアーガム、0.4ｇ／ｌの一塩基性リン 酸カリウム、1.2ｇ／ｌの二塩基性リン酸カリウム及び0.4ｇ／ｌのpH指示薬を含 む。 他方、サンプルを調製するのに利用する希釈剤が約0.1重量／容量％のカゼイ ンペプトン及び0.85重量／容量％の塩化ナトリウムの水性希釈剤であるとき（一 般にはペプトン塩バッファーと呼ぶ）、好適な培養培地は約７〜14ｇ／ｌのゼラ チンペプトン、６〜９ｇ／ｌの酵母抽出物、５〜20ｇ／ｌのグルコース、2.7〜3 .15ｇ／ｌの胆汁塩、５〜13ｇ／ｌのグアーガム、0.2〜１ｇ／ｌの一塩基性リ ン酸カリウム、、0.6〜３ｇ／ｌの二塩基性リン酸カリウム及び0.2〜0.8ｇ／ｌ のpH指示薬を含む。特定の好適な培養培地は約14ｇ／ｌのゼラチンペプトン、６ ｇ／ｌの酵母抽出物、20ｇ／ｌのグルコース、３ｇ／ｌの胆汁塩、11ｇ／ｌのグ アーガム、0.4ｇ／ｌの一塩基性リン酸カリウム、1.2ｇ／ｌの二塩基性リン酸カ リウム及び0.4ｇ／ｌのpH指示薬を含む。 サンプルを希釈した後、希釈剤のpHを0.1Ｎの水性水酸化ナトリウムの添加に より約6.5〜7.5、好ましくは約7.0に調整する。 当業者はButterfields標準方法バッファーに利用するために好適な培養培地と カゼインペプトン希釈剤に利用するために、好適な培養培地との相違は塩濃度の 相違にあることを認識しているであろう。その他の希釈剤は培養培地において利 用するための所望の塩濃度を供する似たような調整又は改変を必要としうる。一 般に、本発明の培養培地の塩濃度は約10〜25mMol範囲とすべきことが好ましい。 本発明において使用するのに好適なpH指示薬には、一般にアゾベンゼン、スル ホンフタレイン又はアントロキノン色素として分類される既知の市販の酸一塩基 指示薬が含まれる。上記の指示薬の列記したクラスに由来する代表的なpH指示薬 にはメチルレッド（アゾベンゼン指示薬）、ブロモクレゾールパープル、クロロ フェノールレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールブルー（全てスル ホンフタレイン指示薬）及びアリザリンレッドｓ一水和物（アントロキノン）が 含まれる。特に好適なpH指示薬はクロロフェノールレッドである。 本発明の別の態様はサンプル中の腸内細菌を検出及び計測する方法である。こ の方法は水性希釈剤中のサンプルのアリコートを特定量のグルコース、pH指示薬 、及び有色指示薬ゾーンが培地の中で過剰に拡散するのを防ぐためのバッファー を含む培養培地に加え、希 釈剤のpHを約6.5〜7.5に調整し、腸内細菌を培養培地の存在下で成育させ、そし て培地中のpH指示薬の変色を検査する工程を含む。この方法を利用するとき、好 適な製品は自立式防水性支持体、フォームスペーサー及び透明カバーシートを有 する薄膜式培養プレート製品である。好適な製品は乾燥培地のコーティングされ た自立式防水性支持体、フォームスペーサー及び透明カバーシートを含む。更に 、薄膜のカバーシートは一般に更なるガム及び／又はゲル化剤、並びにトリフェ ニルテトラゾリウムクロリドの如き第二指示薬でコーティングされている。好ま しくは、このカバーシートは約0.02mg／in²のトリフェニルテトラゾリウムクロ リドを含む。 図面の簡単な説明 図１は本発明の培養培地を含む薄膜式培養プレート製品の例示である。 詳細な説明 本発明はサンプル、好ましくは食品サンプル中の腸内細菌の存在を検出するた めに用いられうる製品及び方法を提供する。様々な製品及び方法が腸内細菌を検 出するのに利用されうるが、本発明の培地及び関連の製品はサンプル中の腸内細 菌の検出及び計測を大いに簡略化する。 特に、様々な理由のためにほとんどのサンプル中の腸内細菌の検出及び計測は 問題となっている。ほとんどのケースにおいて、これらの細菌がサンプル中に存 在しているとき、それらはストレスを受け、そして最適レベルに至るまで成育し ない。最適成育を供するため（それ故、最短の検出時間を供するため）、ストレ スを受けた細菌には誘導されたストレスから回復する時間を設けなければならな い。本発明は腸内細菌の迅速な回復を供するものと信じられている培地を提供す る。この培地は市販の公知の試薬及び養分を含む。このような試薬及び養分には ゼラチンペプトン、酵母抽出物、グルコース、塩化ナトリウム、胆汁塩及びバッ ファーを含み、それらはAcumedia，Inc.，Baltimore，MD及びSigmaChemical Com pany，St.Louis，MOより入手できる。この培地は更にグアーガムも含み、それは Rhone−Poulenc，Inc.，Kreuzlinger，Switzerlandより市販されている。培地に 使用される指示薬はAldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，WIからも市 販され、そしてトリフェニルテトラゾリウムクロリドはAMRESCO，Solon，OHより 市販されている。好適な試薬及び材料を秤量し、そして慣用の無菌手順を利用し て混合する。 当該培養培地は少なくとも一種の酸一塩基又はpH指示薬を含む。適当な指示薬 は酸の存在下で変色するであろう。細菌コロニーが生育すると、コロニーはこの 指示薬と反応する代謝性有機酸を生産し、そしてその培地とは異なる色のコロニ ー周辺ゾーン又は領域を供する。例えば、クロロフェノールレッドの酸の存在下 で黄色に変色する赤色培地を供する。適当なpH指示薬は一般にアゾベンゼン、ス ルホンフタレイン又はアントロキノン色素に分類される。列挙した指示薬のクラ ス由来の代表的なpH指示薬にはメチルレッド（アゾベンゼン指示薬）、ブロモク レゾールパープル、クロロフェノールレッド、ブロモチモールブルー、ブロモク レゾールブルー（全てスルホンフタレイン指示薬）及びアリザリンレッドｓ一水 和物（アントロキノン指示薬）が含まれる。 図１は本発明の培地に利用するのに適当な薄膜式乾燥培養培地製品を示す。簡 単には、この製品は米国特許第4,565,783，5,089,413及び5,232,838号に記載さ れ、全てこのようなタイプの製品の作 製及び利用方法を述べている。 薄膜式培養培地10は自立式防水性支持体12を有する本体部材を含む。支持体12 は好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン又はポリスチレンの如き水を吸収 しない防水性材料より成る比較的剛性な材料である。その他の適当な防水性材料 には防水性ポリエチレンコーティングを含む紙の如き支持体が含まれる。 支持体12の上面には培養培地層14がコーティングされ、それは支持体12の上で の乾燥培地を担うように乾燥されている。他方、接着層が支持体12の上にコーテ ィングされていてよく、その接着剤は粉末として適用されうる培養培地の保持を 担う。接着剤は、コーティングの施された支持体を通じて支持体の表層の上で成 育する細菌コロニーが見えるように水和したときに十分に透明であるべきである 。この接着剤は、その中に培地が完全に埋没することなく支持体が乾燥培養培地 で均質にコーティングされるような厚みで支持体の上にコーティングされるべき でもある。 本発明の液体培養培地を乾燥状態で、又は乾燥粉末として使用するとき、試薬 、養分、ガム及びpH指示薬を液体として支持体に加え、次いで乾燥させる。本発 明の培養培地は液体培地をオーブンの中で約220°Ｆで、液体中の本質的に全部 の水が蒸発するまで加熱することによって容易に乾燥されうる。ところでもし培 地を水が蒸発した後に加熱すると、培地は劣化し始める。 フォームの中に円形の開口部を有するフォームスペーサー16を支持体12の培地 のコーティングされた表面に取付ける。支持体12の周囲を覆うフォームスペーサ ーはサンプルを接種する領域を規定し、そして支持体からのサンプルの漏出の防 止を担う。別の態様において、製品はサンプル含有フォーム層を含まなくてよい 。この製品においては、所定量のサンプルは培地のみの成分によって支持体の上 に含まれている。 カバーシート20がフォームスペーサー16の上面の一辺に取付けられている。カ バーシート20は好ましくは支持体の上にある細菌コロニーの計測を助長するため に透明のフィルム又はシート材料より成る。更に、カバーシート20は好ましくは 汚染及び成分の劣化の危険性を避けるために細菌及び水蒸気不透過性である。カ バーシート20として使用するのに好適な材料は二軸延伸ポリプロピレンである。 カバーシートは一般に追加のガム及び第二指示薬でコーティングされている。 使用の際、所定量の接種物、一般には約１mlの接種物を、カバーシート20をひ っくり返し、そして支持体12の中央に水性試験サンプル又は水を加えることによ って図１に示す製品に添加する。次いでカバーシート20を支持体12の上に戻し、 そして接種物を支持体の上に均一に広げる。これを行うのに慣用の器具は重みの ある円形型板（テンプレート）であり、これは支持体12の特定の領域に接種物を 封じ込めるのにも使用される。接種物か支持体12に接触してその上で広がると、 支持体12の上の培養培地は水和して成育支持養分ゲルを形成する。次に接種済み 製品を所定時間インキュベートし、その後支持体の上で成育する細菌コロニーの 数を透明カバーシー卜20を介して計測することができるようになる。 本発明の培養培地が薄膜の上で乾燥状態であり、そしてフォームスペーサーで 覆われているとき、サンプルと実際に接触する培地中の成分の濃度は、支持体の 上で乾燥される前の液体培地中の成分の濃度の半分（0.5）となる。 培養培地中の腸内細菌の検査は目視により、又は装置を用いて行われうる。適 当な装置は1993年12月17日提出の関連米国特許出願第08/168,681号及びFloeder らの米国特許第5,403,722号に記載され ている。 薄膜式製品上での本発明の培養培地の利用を述べてきたが、当業者はこの培養 培地が当業者公知のその他の培養製品において利用されうることを認識している であろう。例えば、この培養培地は液体培地として利用され、そして細菌を懸濁 物として成育するのに利用でき、又はこの培養培地は既知の寒天プレート上で細 菌を成育するのに利用できうる。 列記の微生物の存在を検出する能力は数多くの状況において非常に有用である 。例えば、腸内細菌の検出及び計測は食品産業において重要である。食品産業が 腸内細菌の汚染が決定されることにより明らかに有利であろうが、化粧品、水質 検査及び薬品を含むその他の産業も、これらの細菌を容易に検出できる機会を歓 迎するであろう。 以下の実施例は本発明の実施に関連する更なる詳細及び態様を提供する。これ らの実施例は例示を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１−様々なグルコース濃度を有する培地中での腸内細菌の成育 本実施例は、本発明の好適な培養培地（腸内細菌増殖培地ＥＧＭ）が腸内細菌 を薄膜式乾燥培養培地製品の中で成育させるのに利用できうることを示す。本例 において使用する培地は14ｇ／ｌのゼラチンペプトン（Accumedia）、６ｇ／ｌ の酵母抽出物（Accumedia）、10ｇ／ｌの塩化ナトリウム（Sigma）、３ｇ／ｌの 胆汁塩（Accumedia）、及び11ｇ／ｌのグアーガム（Rhone−Poulenc）を含む。 グルコース及びpH指示薬を以下の表１に記載の様々な濃度で利用した。列記した 成分は上記のソースから市販されている。 簡単に述べると、種々の培地は養分、塩及びガムを１リットルの 脱イオン水に溶かすことにより調製する。この混合物を次いで煮沸し、ほぼ室温 に冷却し、次いでグルコース及びpH指示薬を加える。 ２種類の代表的な腸内細菌種エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)149(AT CC受託番号55535)及びセラッチア・リケファシエンスC1(Serratta liquefaciens ) （３Ｍ Microbiology Products Laboratoryにより使用され、３Ｍ，St．Panl， MNにより凍結サンプルとして維持されている品質管理単離体）をまずトリプトカ ーゼ・ダイズ培養液(Difco Laboratories，Inc.，Detroit，MI)の中で18〜24時 間35℃で増殖させる。これらの増殖培地は約10⁸〜10⁹個の細菌／mlを含み、次い でButtersfield標準方法バッファー(SMB，Fischer Scientific，Minneapo1is，M N)で約10⁶〜10⁷倍に系列希釈し、プレート当り約20〜50のコロニー形成単位を含 むであろうサンプルを供した。当業者は同等の細菌の株又は種が市販されている か、又は公知の方法もしくは工程を利用して単離できうることを理解するであろ う。 薄膜式乾燥培養培地製品は下記の通りにして調製される。EGM層を室温で小さ なオリフィスに押し通して7.5mil(0.19mm)の（必要な長さ及び幅）ポリエステル 支持フィルム(Imperial Chemical industries，Wi1mington，DE)を被覆した。被 覆したポリエステルフィルムを約200〜250°Ｆで約１〜20分乾燥させた。18mil( 0.46mm)のスチロフォームスペーサーシートを切ってポリエステルフィルムを被 覆し、次いで円形の開口部をこのスチロフォームスペーサーに設けた。このスチ ロフォームスペーサーの片面をイソオクチルアクリレート／アクリル酸接着剤（ ２重量％のアクリル酸と共重合した98重量％のイソオクチルアクリレート）でコ ーティングし、そしてこのスチロフォームシートをポリエステルフィルムのコー ティングの施された面に付着させた。スチロフォームスペーサーにおける 開口部は約２インチ（約５cm）の直径を有するウェルを担う。 透明なポリプロピレンフィルムを切ってポリエステル／スチロフォーム積層フ ィルムにかぶせた。ポリプロピレンフィルム(1.6mil(0.041mm)、３Ｍ，St．Panl ，MN)の片面にイソオクチルアクリレート／アクリル酸接着剤（２重量％のアク リル酸と共重合した98重量％のイソオクチルアクリレート）をコーティングし、 次いでグアーガム(Rhone−Poulenc，Inc．Kreuzlinger，Switzerland)及びトリ フェニルテトラゾリウムクロリドの層をコーティングした。両面接着テープ（３ Ｍ，St．Panl，MN）の層をこのスチロフォームスペーサーの一の露出辺に載せ、 そしてポリプロピレンフィルムのガム含有表面をスチロフォームスペーサーにそ の一辺伝いで付着させた。 培養アリコート(１ml)をスチロフォームスペーサーの開口部に入れ、接種物を 覆うためにポリプロピレンフィルムを用い、そして薄膜式製品を35℃で24時間イ ンキュベートした。 24時間インキュベーション後、薄膜式フィルムを酸性ゾーンの存在について評 価した。それはプレートの赤色背景上に黄色領域として同定される。酸性ゾーン のサイズを測定し、そして表１に記録した。 表１に列記したデーターはEGMが、グルコース及びpH指示薬の様々な濃度にお いて、生育する細菌コロニーのまわりの孤立した識別可能な有色ゾーンを生み出 すように腸内細菌を生育するのに選択的であることを示唆する。 実施例２−種々のバッファー濃度を有する培地中での腸内細菌の生育 本実施例は、バッファーの濃度が、腸内細菌を生育するのに選定された培地の 中でのpH指示薬の拡散を制御するのに利用できうることを実証する。本実験に用 いる培地は実施例１に記載の通りに調製したが、ただしグルコースの濃度は10ｇ ／ｌに固定し、一方種々のバッファー及びpH指示薬の濃度は表２に列記の通りに 変更した。表２に列記したバッファーは認可されている手順に従って調製した。 ２種類のバッファーを用いるとき、表２に列記の最終濃度は列記したバッファー 半分づつより成る。 以下の表２に列記したデーターはEGMが腸内細菌の生育について選択的である ことを示唆する。複数種のバッファー及びpH指示薬は生育する細菌コロニーのま わりの有色ゾーンのサイズの所望の縮小効果を供した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:425） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィッカート，ペーター ディー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427, セント ポール，ポスト オフィス ボッ クス 33427 （番地なし) (72)発明者 アダムス，カール エー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427, セント ポール，ポスト オフィス ボッ クス 33427 （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．培地中で生育する腸内細菌を検出及び計測するためのグルコース及びpH指 示薬／バッファー系を含んで成る細菌培養培地であって、前記培地が所定量のグ ルコース、pH指示薬、及び有色指示薬ゾーンが培地の中で過剰に拡散するのを防 ぐバッファーを含む、細菌培養培地。 ２．腸内細菌を含むサンプルを本質的に約0.6mmolのリン酸ナトリウムより成 る水性希釈剤中の培養培地に添加する、請求項１に記載の培養培地。 ３．約７〜14ｇ／ｌのゼラチンペプトン、６〜９ｇ／ｌの酵母抽出物、５〜20 ｇ／ｌのグルコース、５〜15ｇ／ｌの塩化ナトリウム、2.7〜3.15ｇ／ｌの胆汁 塩、５〜13ｇ／ｌのグアーガム、0.6〜２ｇ／ｌの一塩基性リン酸カリウム、1.8 〜６ｇ／ｌの二塩基性リン酸カリウム及び0.2〜0.8ｇ／ｌのpH指示薬を含んで成 る、請求項２記載の培養培地。 ４．腸内細菌を含むサンプルを本質的に約0.1重量／容量％のカゼインペプト ン及び0.85重量／容量％の塩化ナトリウムより成る水性希釈剤中の培養培地に添 加する、請求項１記載の培養培地。 ５．約７〜14ｇ／ｌのゼラチンペプトン、６〜９ｇ／ｌの酵母抽出物、５〜20 ｇ／ｌのグルコース、2.7〜3.15ｇ／ｌの胆汁塩、５〜13ｇ／ｌのグアーガム、0 .2〜１ｇ／ｌの一塩基性リン酸カリウム、0.6〜３ｇ／ｌの二塩基性リン酸カリ ウム及び0.2〜0.8ｇ／ｌのpH指示薬を含んで成る請求項４記載の培養培地。 ６．前記pH指示薬がアゾベンゼン、スルホンフタレイン及びアントロキノンpH 指示薬より成る群から選ばれる、請求項１記載の培養培地。 ７．前記pH指示薬がメチルレッド、ブロモクレゾールパープル、クロロフェノ ールレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールブルー及びアリザリンレ ッドｓ一水和物より成る群から選ばれる、請求項６記載の培養培地。 ８．サンプル中の腸内細菌を検出及び計測する方法であって、水性希釈剤中の サンプルのアリコートを所定量のグルコース、pH指示薬、及び有色指示薬ゾーン が培地中で過剰に拡散するのを防ぐバッファーを含む培養培地に添加し、このア リコートのpHを約6.5〜7.5に調整し、腸内細菌を培養培地の存在下で生育し、そ して培地におけるpH指示薬の変色を検出する工程を含んで成る方法。 ９．前記サンプルを自立式防水性支持体、フォームスペーサー及び透明カバー シートを有する製品を用いて培地含有薄膜に加え、ここで培養培地はこの防水性 支持体の上にコーティングされており、且つその後乾燥されている、請求項８記 載の方法。 10．サンプル中の腸内細菌を検出及び計測するための製品であって、コーティ ングの施された自立式防水性支持体、フォームスペーサー及び透明カバーシート より本質的に成り、ここで所定量のグルコース、pH指示薬、及び有色指示薬が培 地の中で過剰に拡散するのを防ぐためのバッファーを含む培養培地がこの自立式 防水性支持体の上にコーティングされている、製品。