AT403054B - Verfahren und vorrichtung zum bestimmen coliformer und fäkalcoliformer keime in wasser - Google Patents

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Description

AT 403 054 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Bestimmen von coliformen Keimen und von fäkalcoliformen Keimen in Wasser.
Gesamtcoliforme Keime sind Enterobacteriaceae, die beim Bebrüten bei 37 *C Lactose unter Gasbildung abbauen. Zur Gruppe der gesamtcoliformen Keime zählen unter anderem Escherichia coli, Klebsiella spp. und Enterobacter spp. Fäkalcoliforme Keime sind alle Enterobacteriaceae, die beim Bebrüten bei 44 *C Lactose unter Gasbildung abbauen. Wesentliches Mitglied der Gruppe der fäkalcoliformen Keime ist Escherichia coli.
Zum Bestimmen von gesamtcoliformen Keimen und fäkalcoliformen Keimen in Wasser (Bestimmung der Anzahl der Keime) werden derzeit zwei Verfahren verwendet, wobei im Falle gesamtcoliformer Keime bei 37’ C und im Falle der Bestimmung fäkalcoliformer Keime bei 44* C bebrütet wird.
Bei der Filtrationsmethode erfolgt eine quantitative Bestimmung der Keimzahl durch Auszählen der Kolonien bildenden Einheiten (colony forming unit, CFU) nach Filtration der zu untersuchenden Wassermenge durch ein Filter und nach Auflegen des Filterpapiers auf einen Nährboden und 24 bis 48 stündigem Bebrüten des Nährbodens bei 37 bzw. 44 *C.
Nach dem Verfahren der Flüssigkeitsanreicherung wird die höchstwahrscheinliche Zahl der zu bestimmenden Keime (most probable number, MPN) bestimmt. Hiezu werden Flüssignährmedien mit unterschiedlichen Mengen des Wassers, in dem die Keime zu bestimmen sind, beschickt. Beispielsweise werden Röhrchen mit 10ml, 1ml, 0,1ml u.s.w. beschickt. Dem flüssigen Nährmedium ist ein Indikator zugesetzt, der die durch den Lactoseabbau bedingte Änderung des pH-Wertes im Nährmedium anzeigt. Auf Grund der Anzahl der Röhrchen, in denen nach 24 bis 48 stündigem Bebrüten bei 37 bzw. 44*C einen Farbumschlag der Indikatorsubstanz anzeigen, läßt sich entsprechend statistischer Analysen die höchstwahrscheinliche Zahl der Keime mit einer Sicherheit über 95% ermitteln.
Beide bekannten Verfahren sind nachteilig, da sie insbesondere hinsichtlich der Filtrationsmethode arbeitsintensiv sind und geschultes Personal benötigen und insbesondere bei der Methode der Flüssigkeitsanreicherung eine visuelle Auswertung (Beobachten des Farbumschlages) erfordern. Weiters sind die bekannten Verfahren nur bei geringen Keimmengen durchführbar, bei höheren Keimmengen sind Verdünnungen erforderlich, was einen weiteren Arbeitsaufwand darstellt.
Aus der WO 96/06183 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen von Enterobakterien bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren wird ein Kulturmedium enthaltend Glukose, einen pH-lndikator und einen Puffer verwendet. Zum Bestimmen von Enterobakterien in einer Probe wird ein aliquoter Teil dieser dem Kulturmedium zugesetzt und der pH-Wert auf etwa 6,5 bis 7,5 eingestellt und das Kulturmedium bebrütet. Die Enterobakterien werden dann anhand der pH-Änderung bestimmt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein verbessertes und automatisierbares Verfahren zum Bestimmen der Zahl gesamtcoliformer bwz. fäkalcoliformer Keime in Wasser zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das in Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Prinzip des Farbumschlages einer dem Nährmedium zugesetzten Indikatorsubstanz bei einer durch den Abbau eines im Nährmedium enthaltenen Stoffes (z.B. Lactose), dessen Abbauprodukt eine Änderung des pH-Wertes des Nährmediums bewirkt, angewendet. Anders als bei dem Verfahren der Flüssigkeitsanreicherung wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kontinuierlich eine einzige Probe beobachtet während sie bei 37 bzw. 44 *C bebrütet wird. Ermittelt wird die Zeitspanne vom Beginn der Inkubation (Bebrüten) bis zum Farbumschlag, wobei der Farbumschlag automatisiert mit Hilfe photooptischer Einrichtungen erfaßt werden kann. Auf Grund der Zeitspanne zwischen dem Beginn der Inkubation bis zum festgestellten Farbumschlag (Änderung des pH-Wertes angezeigt durch die dem Nährmedium zugesetzte Indikatorsubstanz) kann die Ausgangsmenge der Bakterien in der Wasserprobe ermittelt werden, da die Teilungsphase der coliformen und fäkalcoliformen Keime etwa 30 Minuten beträgt.
Das Auswerten kann anhand von Diagrammen erfolgen, welche die Relation zwischen der Bakterienzahl in der zu untersuchenden Probe und der Zeitspanne zwischen Beginn der Inkubation und dem Farbumschlag anzeigen. Beispiele solcher Diagramme sind in Fig. 1 und 2 wiedergegeben, wobei das Diagramm der Fig. 2 den Zeitraum 11 bis 13 Stunden nach Beginn der Inkubation wiedergibt. Aus den Diagrammen ist ersichtlich, daß eine direkte Relation zwischen der Keimzahl in der Probe und der Zeitspanne zwischen Beginn der Inkubation bis zum Farbumschlag besteht, so daß aus der Zeitspanne zwischen Beginn der Inkubation und festgestelltem Farbumschlag der Indikatorsubstanz auf die Keimzahl in der zu untersuchenden Probe geschlossen werden kann.
Die Bestimmung der Keimzahl ist in Zehnerpotenzen möglich, was für die Zwecke der Keimbestimmung in Wasserproben hinreicht, ebenso wie es kein Problem darstellt, daß zwischen einzelnen Keimen nicht unterschieden werden kann, da dies in der Wasserbakteriologie ohnedies nicht üblich ist. 2
AT 403 054 B
Coliforme und fäkalcoliforme Keime verhalten sich hinsichtlich Bakterienanzahl/Inkubationszeit bis zum Farbumschlag gleich, weshalb unterschiedliche Diagramme für die Bebrütung bei 37 *C einerseits und 44‘C anderseits nicht erforderlich sind.
Zum Durchführen des erfindungsgemäBen Verfahrens kann ein Gerät verwendet werden, das die Merkmale des Anspruches 7 aufweist.
Bevorzugte und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsge-mäßen Gerätes sind Gegenstand der Unteransprüche.
In Rg. 3 ist der grundsätzliche Aufbau einer Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens zum Bestimmen von Keimen in Wasser (fäkalcoliforme Keime und gesamtcoliforme Keime) dargestellt.
Das in Fig. 3 dargestellte Gerät besteht aus einem lichtdichtem Kasten 1, in dem beim gezeigten Ausführungsbeispiel zwei Aufnahmen 2 für Cuvetten 3, in welchen die zu untersuchende Probe aufgenommen wird, eingebaut sind. Die Cuvetten 3 stehen zwischen einer Lichtquelle 4, die beispielsweise eine rotes Licht aussendende Leuchtdiode sein kann, und einem Empfänger 5, der beispielsweise eine Photodiode ist.
Das Gehäuse 1, das wie erwähnt geschlossen ist, so daß im Inneren des Gehäuses 1 keine störenden Lichteinflüsse auftreten können, ist beheizt, um das Bebrüten bei 37 bzw. 44*C ausführen zu können, ist in dem Gehäuse ein Gebläse 6 mit im Ausführungsbeispiel drei Heizwiderständen 7 vorgesehen. Dem Gebläse 6 gegenüber ist eine Leiteinrichtung 8 vorgesehen, damit die vom Gebläse 6 abgegebene Luft im Inneren des Gehäuses 1 gleichmäßig verteilt wird. Zur Steuerung der Heizleistung der Heizvorrichtung bestehend aus Gebläse und wenigstens einem Heizwiderstand sind drei Thermofühler 10,11 und 12 vorgesehen.
In Fig. 4 ist schematisch eine andere Ausführungsform eines erfindungsgemäBen Gerätes zum Ausführen des Verfahrens der Erfindung dargestellt. Rg. 5 zeigt eine Einzelheit des Heizblockes im
Vertikalschnitt.
In einem Gehäuse 1 sind zwei Heizblöcke 20 sowie die Spannungsversorgung 21 und Elektronik 22 untergebracht. An der Frontplatte 23 des Gehäuses sind Bedienelemente und Anzeigen montiert.
Jeder der beiden Heizblöcke 20 besteht aus einer Heizwicklung 30, der zwei Temperatursensoren 31, 32 für die Regelung der Heizung 30 zugeordnet sind. Die Heizwicklung 30 ist um einen einen Aufnahmeraum 33 für die Cuvette 3 aufweisenden Körper 34 aus Metall herum angeordnet. Innerhalb der Heizwicklung 30 ist die Lichtquelle 4 und dieser bezüglich des Aufnahmeraumes 33 für die Cuvette 3 diametral gegenüberliegend die Photodiode 5 zum Erfassen des Farbumschlages untergebracht. Bei dem in Fig. 4 gezeigten Gerät ist vorgesehen, daß einer der Heizblöcke 20 für das Bebrüten bei 37 *C und der andere Heizblock 20 für das Bebrüten bei 44 · C ausgelegt ist.
Sowohl bei der in Fig. 3 als auch bei dem in den Fig. 4 und 5 gezeigten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gerätes wird nicht nur der Zeitpunkt des Farbumschlages angezeigt (z.B. durch eine Signall-Iampe), sondern es kann zusätzlich auch die Zeit angezeigt werden, die vom Beginn des Bebrütens bis zum Farbumschlag vergangen ist. beispielsweise jedem der als Cuvettenaufnahme 33 ausgebildeten Heizblöcke 20 ein Betriebsstundenzähler (Zeitanzeige) vorgesehen. Diese Betriebsstundenzähler, und zwar der für das Bebrüten bei 37 * C und der für das Bebrüten bei 44 · C, werden von Hand aus gestartet und von den Fotodioden 5 gesteuert automatisch gestoppt, so daß die für das Bestimmen der Keimzahl gemäß dem Verfahren der Erfindung maßgebliche Zeitspanne automatisch erfaßt und angezeigt wird.
Zum Bestimmen der Keimzahl in einer Wasserprobe wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens eine Cuvette mit einer vorgegebenen Menge des Wassers, in dem die Kennzahl zu bestimmen ist, zwischen die Lichtquelle und den Empfänger gestellt und bei 37 · C bzw. 44 · C bebrütet. Sobald auf Grund des Abbaues, z.B. des Lactoseabbaus, der im Nährmedium enthaltene Indikator umschlägt, z.B. bei Bromthymolblau von dunkelblau auf gelb, ändert sich die Absorption des von der Lichtquelle ausgesendeten Lichtes In der Cuvette, der Empfänger (Photodiode) registriert diese Farbänderung und gibt ein entsprechendes Signal ab.
Auf Grund der Zeitspanne zwischen dem Beginn des Bebrütens und der von der Photodiode festgestellten Änderung der Farbe des Indikators in der Cuvette (Farbumschlag, z.B. von dunkelblau auf gelb) kann anhand der weiter oben beschriebenen und in Fig. 1 und 2 gezeigten Diagramme auf die Keimzahl in der Probe geschlossen werden.
Es versteht sich, daß das Gerät weitestgehend automatisiert werden kann, da es genügt die Zeitspanne zwischen Beginn des Bebrütens und Farbumschlag, der von der Photodiode angezeigt wird, festzuhalten, da diese Zeitspanne direkt proportional zur Keimzahl in der Probe ist.
Da in dem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Gerätes zum Bestimmen der Keimzahl zwei Cuvetten und dementsprechend zwei Lichtquellen und zwei Empfänger (Photodioden) vorgesehen sind, ist es möglich zwei Proben - gegebenenfalls auch bei unterschiedlicher Bebrütungstemperatur - gleichzeitig zu bestimmen oder Parallelbestimmungen durchzuführen, um Fehler möglichst auszuschließen. 3
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Beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens in dem beschriebenen Gerät kann wie folgt vorgegangen werden.
In eine Cuvette werden beispielsweise 100ml des hinsichtlich der Keimzahl zu überprüfenden Wassers - es kann sich um Grund-, Oberflächen- oder Abwasser handeln -eingefüllt. Zur Wasserprobe werden 15ml eines Nährmediums (Bouillon) bestehend aus Pepton und Lactose, dem Bromthymolblau als Indikator zugesetzt ist, gegeben. Die Cuvette(n) wird dann in das Gerät gestellt und mit der Inkubation begonnen. Sobald von der Photodiode der Farbumschlag angezeigt wird, wird auf Grund der Zeitdauer vom Beginn der Inkubation bis zum Farbumschlag die Keimzahl bestimmt. Erfolgt kein Farbumschlag (in diesem Fall sind in der Probe keine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmbaren Bakterien enthalten) wird vom Empfänger (Photodiode) keine Änderung angezeigt, so daß nach 24 bzw. 48 Stunden Bebrüten ein negativen Ergebnis angezeigt wird.
Nachstehend werden eine nicht beschränkende Vorschrift für das Ermitteln der Eichkurve und nicht beschränkende Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren angegeben:
Vorschrift:
Bestimmen der Relation zwischen Keimzahl und Dauer vom Beginn des Bebrütens bis zum Farbumschlag (Eichkurve):
Sterilisierte Wasserproben (3 x 100ml) wurden mit verschiedenen bekannten Keimverdünnungen von Escherichia coli und/oder Klebsiella spp. und/oder Enterobakter spp. beimpft. 2 x 100ml wurden mit dem Gerät wie oben beschrieben bei 37 *C bebrütet und der Zeitpunkt des Farbumschlages notiert. Parallel dazu wurde von der gleichen Probe (3. Röhrchen) eine Keimzahlbestimmung mittels Flüssigkeitsanreicherung bei 37’C durchgeführt. Die so ermittelte Keimzahl wurde dann in Relation zum Zeitpunkt des Farbumschlages gesetzt.
Die selbe Prozedur wurde bei 44 · C wiederholt.
Beispiel 1:
Um die Anzahl fäkalcoliformer Keime in Teichwasser (Malteser Teich, Rosenauer Wald, NÖ) zu bestimmen, wurden zwei 100ml Proben gezogen. Die Proben wurden in Cuvetten eingefüllt und mit je 15ml Nährlösung versetzt.
Die Nährlösung war wie folgt zusammengesetzt:
Pepton 1,5 g
Lactose 0,5 g
Bromthymolblau 0,02 g gelöst in 15 ml Aqua dest.
Der pH mit 1M NaOH auf 8,5 eingestellt.
Die so mit Nährlösung versehenen Proben (beide alkalisch) wurden in das in Fig. 3 (oder Fig. 4 und 5) gezeigte Gerät gestellt und mit dem Bebrüten (Inkubation) bei 44* C begonnen.
Nach 9 Stunden zeigte ein von der der einen Cuvette zugeordneten Photodiode abgegebenes Signal den Farbumschlag von dunkelblau auf gelb (pH-Wert < 7) an. Die zweite Photodiode gab das den Farbumschlag anzeigende Signal 15 min später ab.
Dies bedeutet, daß in dem untersuchten Teichwasser aufgrund der in Fig. 1 gezeigten Eichkurve 1,5 -3.105 Keime I enthalten waren.
Beispiel 2:
Um die Anzahl gesamtcoliformer Keime in Schwimmbeckenwasser (1130 Wien) zu bestimmen, werden zwei 100ml Proben gezogen. Die Proben wurden in Cuvetten eingefüllt und mit je 15ml Nährlösung versetzt.
Die Nährlösung war wie folgt zusammengesetzt:
Pepton 1,5 g
Lactose 0,5 g
Bromthymolblau 0,02 g gelöst in 15 ml Aqua dest.
Der pH mit 1M NaOH auf 8,5 eingestellt.
Die so mit Nährlösung versehenen Proben (beide alkalisch) wurden in das in Fig. 3 (oder Fig. 4 und 5) gezeigte Gerät gestellt und mit dem Bebrüten (Inkubation) bei 37 *C begonnen. 4

Claims (16)

  1. AT 403 054 B Nach 11 Stunden 53 min zeigte ein von der der einen Cuvette zugeordneten Photodiode abgegebenes Signal den Farbumschlag von dunkelblau auf gelb an. Die zweite Photodiode gab das den Farbumschlag anzeigende Signal 13 min später ab. Dies bedeutet, daß in dem untersuchten Schwimmbeckenwasser auf Grund der in Fig. 2 gezeigten Eichkurve 200 - 400 Keime/I enthalten waren. Patentansprüche 1. Verfahren zum Bestimmen gesamtcoiiformer und/oder fäkalcoliformer Keime im Wasser, bei dem eine Probe des zu untersuchenden Wassers mit einer Nährsubstanz, enthaltend wenigstens eine durch die Keime zu wenigstens einem den pH-Wert der Probe ändernden Abbauprodukt abbaubare Substanz und einen Indikator, versetzt wird, und bei dem die Probe bebrütet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe so lange bebrütet wird, bis die Indikatorsubstanz eine Änderung des pH-Wertes anzeigt, und daß auf Grund der Zeitspanne zwischen Beginn des Bebrütens und Farbumschlag auf die Zahl der Keime in dem zu untersuchenden Wasser geschlossen wird, wobei eine die Beziehung zwischen Keimzahl und Dauer bis zum Farbumschlag wiedergebende Eichkurve verwendet wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Bestimmen gesamtcoiiformer Keime bei 37· C bebrütet wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß zum Bestimmen fäkalcoliformer Keime bei 44 · C bebrütet wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in einer Cuvette enthaltene Probe mit monochromatischem Licht beleuchtet wird und daß das austretende Licht von einer P.hotodiode erfaßt wird und daß die Photodiode beim Farbumschlag des Indikators auf Grund der Änderung der Absorption des Lichtes ein Signal abgibt.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Nährmedium als Substanz, die durch bakteriellen Abbau zu den pH-Wert ändernden Abbauprodukten umgewandelt wird, Lactose verwendet wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß als Indikator Bromthymolblau verwendet wird.
  7. 7. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in einem geschlossenen Gehäuse (1) aus lichtundurchlässigem Werkstoff zwischen einer Lichtquelle (4) und einem Lichtempfänger (5) eine Cuvette (3) angeordnet ist und daß in dem Gehäuse (1) eine geregelte Heizung (7, 30) zum Aufrechterhalten der vorgegebenen Bebrütungstemperatur vorgesehen ist.
  8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß die Lichtquelle (4) eine Leuchtdiode ist.
  9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet daß der Lichtempfänger (5) eine Photodiode ist.
  10. 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet daß als Heizung (7) wenigstens ein Heizwiderstand, dem ein Gebläse (6) zugeordnet ist, vorgesehen ist.
  11. 11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet daß in dem Gehäuse (1) zwei Cuvetten (3) jeweils mit zugeordneter Lichtquelle (4) und Lichtemfänger (5) vorgesehen sind.
  12. 12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet daß jeder Cuvette (3) eine geregelte Heizung (7, 30) zugeordnet ist.
  13. 13. Vorrichtung nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet daß die Heizung als Heizblock (20) mit einem Aufnahmeraum (33) für die Cuvette (3) und mit außen liegender Heizwicklung (30) ausgebildet ist. 5 AT 403 054 B
  14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem Aufnahmeraum (33) für die Cuvette (3) je eine Lichtquelle (4) und ein Lichtempfänger (5) einander bezüglich des Aufnahmeraumes (33) diametral gegenüberliegend vorgesehen sind.
  15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufnahmeraum (33) für die Cuvette (3) im Heizblock (20) eine Ausnehmung ist, die in einem innerhalb der Heizwicklung (30) vorgesehenen Körper (34) vorgesehen ist.
  16. 16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Körper (24), in dem der Aufnahmeraum (33) für die Cuvette (3) vorgesehen ist, aus Metall besteht. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 6
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