DE69534301T2 - Kulturmedium und vorrichtung zum nachweis und zur quantifizierung von enterobakteriaceae - Google Patents

Kulturmedium und vorrichtung zum nachweis und zur quantifizierung von enterobakteriaceae Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Produkte und Verfahren, die verwendet werden, um Enterobacteriaceae in einer Probe festzustellen und zu zählen, und betrifft insbesondere eine Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtung und ein Verfahren des Gebrauchs dieser Dünnfilmvorrichtung, die verwendet werden kann, um Enterobacteriaceae in Lebensmittelproben festzustellen und zu zählen.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Die Familie der Enterobacteriaceae umfasst Bakterien, die als kleine, gramnegative, Oxidase-negative, nicht Sporen bildende Stäbchen gekennzeichnet sind, die Glukose fermentieren können. Diese Mikroorganismen werden in Habitaten wie beispielsweise dem Darmtrakt, im Boden, Wasser, Gemüsen, sowie in allen Lebensmittelquellen, wie beispielsweise Fleisch und Milchprodukten gefunden. Manche Mitglieder dieser Familie sind bekannte Humanpathogene, wie beispielsweise Bakterien der Gattung Escherichia, Salmonella, Shigella und Enterobacter.
  • Klassische Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins und der Anzahl von Enterobacteriaceae in einer Probe sind zeitaufwändig, mühsam und arbeitsintensiv. Typischerweise muss ein Techniker Reagenzien und Nährstoffe vorbereiten, die Nährstoffe mit Agar mischen, die Mischung erhitzen, die Mischung in einer Petrischale gießen, eine Testprobe erhalten, die Testprobe verdünnen, ein Aliquot der verdünnten Probe dem Agar zugeben, den Agar gelieren lassen, die beimpfte Platte 24–48 Stunden inkubieren und schließlich die Anzahl der wachsenden Bakterienkolonien auf der Petrischale zählen. Gegebenenfalls müssen außerdem Bestätigungstests durchgeführt werden, um besonders bestimmte Bakterien zu identifizieren. Produkte und Verfahren, welche die Vorbereitungszeit reduzieren und ein zuver lässiges Feststellen und eine Zählung der Kolonien von Enterobacteriaceae in einer Probe ermöglichen, würden daher von auf dem Gebiet der Mikrobentestung arbeitenden Personen eindeutig begrüßt werden.
  • Ein Beispiel eines Produktes, welches die obige Herstellungszeit deutlich vereinfacht, sind Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtungen zum Anzüchten von Mikroorganismen, die in US-Patent 4,565,783 an Hansen et al., 5,089,413 an Nelson et al. und 5,232,838 an Nelson et al. beschrieben sind. In einer repräsentativen Dünnfilmvorrichtung wird ein wasserdichtes Substrat mit einem in kaltem Wasser löslichen Trockenpulver, das ein Geliermittel, Nährstoffe zum Wachstum von Mikroben und Mineralien und einen Indikatorfarbstoff enthält, beschichtet. Das wasserdichte Substrat ist mit einem Schaum-Abstandshalter bedeckt, der einen Animpfungsbereich bereit stellt. Ein durchsichtiges Deckblatt, durch das hindurchgelesen werden kann und das auf einer Innenfläche mit einem Acrylathaftmittel beschichtet ist, das einen Indikatorfarbstoff und ein pulverförmiges Geliermittel enthält, ist an den Schaum-Abstandshalter angebracht.
  • Wenn die Dünnfilmvorrichtung verwendet wird, wird typischerweise eine vorbestimmte Menge einer wässrigen Probe in einem von dem Abstandshalter definierten Bereich in Kontakt mit dem beschichteten Substrat gebracht und das Deckblatt wird über die Probe und das Substrat gelegt. Die wässrige Probe hydriert das lösliche Trockenpulver, das dann ein geliertes Medium bildet, das mikrobielles Wachstum unterstützen kann. Während der Wachstumsperiode reagiert der an dem Deckblatt haftende Indikatorfarbstoff in Gegenwart lebensfähiger Mikroorganismen, um ein feststellbares Signal zu ergeben, das eine Visualisierung von Bakterienkolonien, die auf der Kulturvorrichtung gewachsen sind, ermöglicht. Unterschiedliche Arten von Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtungen sind kommerziell als PETRIFILM Dünnfilm-Trockenkulturmediumplatten von 3 M, St. Paul, MN, USA erhältlich.
  • Die Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtungen sind viel einfacher anzuwenden als herkömmliche gelierte Agarmedium-/Petrischalen-Systeme, da der Anwender das Wachstumsmedium, den Agar und andere Reagenzien nicht erhitzen und mischen und dann die Mischung in die Petrischalen oder Platten gießen muss. Darüber hinaus sind diese Vorrichtungen kompakt und sind einfach zu entsorgen und daher einfacher und sicherer in der Anwendung.
  • Ein Kulturmedium, das in einer Dünnfilmplatte verwendet werden kann, um eine schnelle Zählung koliformer Bakterien zu liefern, ist in US-Patent 5,364,766 an Mach et al. beschrieben. In diesem Dokument wird ein Aliquot der Probe, die koliforme Bakterien enthält, einem Kulturmedium, umfassend Tryptose, Laktose, Natriumchlorid, Gallensalze und eine Überschussmenge eines pH-Indikators, Phenolrot, zugegeben, welches sehr nahe bei den Bakterien, die in dem Medium wachsen, eine hohe Konzentration von Phenolrot bereit stellt. Der Gebrauch des berichteten Mediums und die hohe Konzentration von Phenolrot ermöglichen die Feststellung und Zählung koliformer Bakterien in weniger als 24 Stunden. Das berichtete Medium wird allerdings von einer Diffusion des pH-Indikators durch das Medium während der Inkubation der Vorrichtung beeinträchtigt. Insbesondere wird das Vorhandensein koliformer Bakterien anfangs durch eine sichtbare Farbveränderung des Phenolrotindikators von einer roten zu einer gelben Farbe in einer Zone um die wachsende mikrobielle Kolonie festgestellt, die von der Produktion organischer Säuren von den wachsenden Mikroorganismen verursacht wird. Da die wachsenden Bakterien weiterhin organische Säuren produzieren, welche die gefärbten Zonen erzeugen, nimmt die Größe der gefärbten Zonen zu und sie beginnen, mit den gefärbten Zonen von benachbarten Kolonien zu ver schmelzen. Wenn genügend wachsende, Säure produzierende Kolonien vorhanden sind, kann sich die Farbe des Mediums schließlich farblich vollständig von rot nach gelb ändern. Wenn sich nach etwa 24 Stunden die Farbe des Mediums vollständig von rot nach gelb verändert hat, ist es möglich, eine zweite Farbveränderung festzustellen, indem ein anderer Indikator in dem Medium verwendet wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung überwindet die Mängel derzeitiger Produkte und Verfahren, auf die oben Bezug genommen wird, indem sie Produkte und Verfahren bereit stellt, die das Feststellen und Zählen von Enterobacteriaceae sowie das Kontrollieren der Diffusion gefärbter Indikatorzonen durch das Medium ermöglichen, die von einem pH-Indikator verursacht wird, der als Reaktion auf organische Säuren, die von wachsenden Enterobacteriaceae-Kolonien hergestellt werden, seine Farbe ändert.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein bakterielles Kulturmedium, das das Feststellen und Zählen von in dem Medium wachsenden Enterobacteriaceae erleichtert. Das Medium enthält ausgewählte Mengen an Glukose, einen pH-Indikator und Puffer, um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorzonen zu sehr in das Medium diffundieren. Wenn verwendet, sind die Mengen an Glukose, pH-Indikator und Puffer ausgewählt, um ein optimales Wachstum von Mikroorganismen in der Kolonie bereit zu stellen, ohne dass die mit dem pH-Indikator verknüpfte, gefärbte Zone um die wachsenden Kolonien durch das Medium diffundieren kann.
  • Ein bevorzugtes Medium zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung richtet sich nach dem Verdünnungsmittel, das verwendet wird, um die ursprüngliche Probe herzustellen. Wenn es sich bei dem Verdünnungsmittel, das zur Herstellung der Probe verwendet wird, um ein wässriges Verdünnungsmittel mit etwa 0,6 mMol Kaliumphosphat (üblicherweise als Butterfields Standard Methods Buffer bezeichnet) handelt, enthält ein bevorzugtes Gelatinepepton-Kulturmedium etwa 7–14 g/l Gelatinepepton, 6–9 g/l Hefeextrakt, 5–20 g/l Glukose, 5–15 g/l Natriumchlorid, 2,7–3,15 g/l Gallensalze, 5–13 g/l Guar-Gummi, 0,6–2 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 1,8–6 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,2–0,8 g/l pH-Indikator. Ein besonders bevorzugtes Kulturmedium enthält etwa 14 g/l Gelatinepepton, 6 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Glukose, 10 g/l Natriumchlorid, 3 g/l Gallensalze, 11 g/l Guar-Gummi, 2 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 6 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,4 g/l pH-Indikator.
  • Wenn es sich bei dem Verdünnungsmittel, das zur Herstellung der Probe verwendet wird, um ein wässriges Verdünnungsmittel mit etwa 0,1 Gew.-/Vol.-% Caseinpepton und 0,85 Gew.-/Vol.-% Natriumchlorid (üblicherweise als Pepton-Salz-Puffer bezeichnet) handelt, enthält ein bevorzugtes Kulturmedium etwa 7–14 g/l Gelatinepepton, 6–9 g/l Hefeextrakt, 5–20 g/l Glukose, 2,7–3,15 g/l Gallensalze, 5–13 g/l Guar-Gummi, 0,2–1 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 0,6–3 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,2–0,8 g/l pH-Indikator. Ein besonders bevorzugtes Kulturmedium enthält etwa 14 g/l Gelatinepepton, 6 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Glukose, 3 g/l Gallensalze, 11 g/l Guar-Gummi, 0,4 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 1,2 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,4 g/l pH-Indikator.
  • Nachdem die Probe verdünnt ist, wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N wässriges Natriumhydroxid auf etwa 6,5-7,5, vorzugsweise auf etwa 7,0 eingestellt.
  • Ein durchschnittlicher Fachmann wird erkennen, dass der Unterschied zwischen dem bevorzugten Kulturmedium zur Verwendung mit Butterfields Standard Methods Buffer und dem bevorzugten Kulturmedium zur Verwendung mit Caseinpepton-Verdünnungsmittel der Unterschied an Salzkonzentration ist. Andere Verdünnungsmittel erfordern unter Umständen ähnliche Anpassungen oder Modifikationen, um eine gewünschte Salzkonzentration zur Verwendung in dem Kulturmedium bereit zu stellen. Im Allgemeinen sollte die Salzkonzentration eines Kulturmediums dieser Erfindung vorzugsweise im Bereich von etwa 10–25 mMol liegen.
  • Bevorzugte pH-Indikatoren zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen bekannte, kommerziell erhältliche Säure-Base-Indikatoren, die üblicherweise als Azobenzol-, Sulfonphthalein- oder Anthrochinonfarbstoffe bezeichnet werden. Repräsentative pH-Indikatoren aus den aufgeführten Indikatorklassen umfassen Methylrot (ein Azobenzolindikator), Bromkresolviolett, Chlorphenolrot, Bromthymolblau, Bromkresolblau (alle Sulfonphthaleinindikatoren) und Alizarin-Rot-S-Monohydrat (Anthrochinon). Ein besonders bevorzugter pH-Indikator ist Chlorphenolrot.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren des Feststellens und des Zählens von Enterobacteriaceae in einer Probe. Dieses Verfahren umfasst die Schritte der Zugabe eines Aliquots einer Probe in einem wässrigen Verdünnungsmittel zu einem Kulturmedium, enthaltend ausgewählte Mengen an Glukose, pH-Indikator und Puffer, um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorzonen zu sehr in das Medium diffundieren, Einstellen des pH-Werts des Verdünnungsmittels auf etwa 6,5–7,5, Anzüchten von Enterobacteriaceae in Gegenwart des Kulturmediums und Feststellen der Farbänderung des pH-Indikators in dem Medium. Wenn dieses Verfahren verwendet wird, ist eine bevorzugte Vorrichtung eine Dünnfilmkulturplattenvorrichtung mit einem selbsttragenden wasserfesten Substrat, einem Schaum-Abstandshalter und einem durchsichtigen Deckblatt. Eine bevorzugte Vorrichtung um fasst ein selbsttragendes wasserfestes Substrat, das mit einem Trockenmedium, einem Schaum-Abstandshalter und einem durchsichtigen Deckblatt beschichtet ist. Das selbsttragende wasserfeste Substrat ist mit dem Medium dieser Erfindung beschichtet, um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorzonen zu sehr in das Medium diffundieren. Darüber hinaus ist das Deckblatt der Dünnfilmvorrichtung in der Regel mit weiteren Gummiarten und/oder Geliermitteln sowie mit einem zweiten Indikator wie beispielsweise Triphenyltetrazoliumchlorid beschichtet. Das Deckblatt enthält vorzugsweise etwa 0,02 mg/Inch2 Triphenyltetrazoliumchlorid.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • 1 ist eine Darstellung einer Dünnfilmkulturplattenvorrichtung, die das Kulturmedium der vorliegenden Erfindung enthält.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Diese Erfindung stellt Produkte und Verfahren bereit, die verwendet werden können, um das Vorhandensein von Enterobacteriaceae in einer Probe, vorzugsweise in einer Lebensmittelprobe, festzustellen. Obwohl eine Vielzahl von Produkten und Verfahren zum Feststellen von Enterobacteriaceae verwendet werden kann, vereinfachen das Medium und die damit zusammenhängende Vorrichtung das Feststellen und das Zählen von Enterobacteriaceae in einer Probe erheblich.
  • Insbesondere waren sowohl das Feststellen als auch das Zählen von Enterobacteriaceae in den meisten Proben aus mehreren Gründen problematisch. In den meisten Fällen sind die in einer Probe vorhandenen Bakterien gestresst und wachsen nicht optimal. Um für ein optimales Wachstum zu sorgen (und damit auch für eine frühest mögliche Nachweiszeit zu sorgen), muss den unter Stress stehenden Bakterien ein Zeitraum zur Erholung von dem ihnen auferlegten Stress eingeräumt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Medium bereit, das eine schnelle Erholung von Enterobacteriaceae ermöglichen soll. Das Medium enthält bekannte Reagenzien und Nährstoffe, die kommerziell erhältlich sind. Diese Reagenzien und Nährstoffe umfassen Gelatinepepton, Hefeextrakt, Glukose, Natriumchlorid, Gallensalze und Puffer, die von Acumedia Inc., Baltimore, MD, USA, und Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA, erhältlich sind. Das Medium enthält außerdem Guar-Gummi, das kommerziell von Rhone-Poulenc, Inc., Kreuzlinger, Schweiz, erhältlich ist. Die in dem Medium verwendeten Indikatoren sind ebenfalls kommerziell von Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA, erhältlich und Triphenyltetrazoliumchlorid ist kommerziell von AMRESCO, Solon, OH, USA, erhältlich. Die bevorzugten Reagenzien und Materialien werden unter Anwendung herkömmlicher aseptischer Verfahren gewogen und gemischt.
  • Das vorliegende Kulturmedium enthält mindestens einen Säure-Base- oder pH-Indikator. Geeignete Indikatoren ändern in Gegenwart von Säure ihre Farbe. Wenn eine Bakterienkolonie wächst, produziert die Kolonie metabolische organische Säuren, die mit dem Indikator reagieren und Zonen oder Bereiche in der Umgebung der Kolonie hervorbringen, die eine andere Farbe als das Medium haben. Beispielsweise liefert Chlorphenolrot ein rot gefärbtes Medium, das in Gegenwart einer Säure eine gelbe Farbe annimmt. Geeignete pH-Indikatoren sind allgemein als Azobenzol-, Sulfonphthalein- oder Anthrochinonfarbstoffe klassifiziert. Repräsentative pH-Indikatoren aus den aufgeführten Indikatorklassen umfassen Methylrot (ein Azobenzolindikator), Bromkresolviolett, Chlorphenolrot, Bromthymolblau, Bromkresolblau (alle Sulfonphthaleinindikatoren) und Alizarin-Rot-S-Monohydrat (ein Anthrochinonindikator).
  • 1 veranschaulicht eine Dünnfilm-Trockenkultur mediumvorrichtung, die für die Anwendung mit den Medien der vorliegenden Erfindung geeignet ist. In Kürze ist die Vorrichtung in US-Patenten 4,565,783, 5,089,413 und 5,232,838 beschrieben, von denen alle Verfahren der Herstellung und Anwendung dieser Art und Vorrichtung beschreiben.
  • Die Dünnfilmkulturvorrichtung 10 umfasst ein Gehäuseteil mit einem selbstragenden wasserfesten Substrat 12. Substrat 12 ist vorzugsweise ein relativ steifes Material, das aus einem wasserfesten Material besteht, das kein Wasser absorbiert, wie beispielsweise Polyester, Polypropylen oder Polystyrol. Andere geeignete wasserfeste Materialien umfassen Substrate wie Papier mit einer wasserfesten Polyethylenbeschichtung.
  • Die obere Fläche von Substrat 12 ist mit einer Schicht Kulturmedien 14 beschichtet, welche anschließend getrocknet wird, um ein Trockenmedium auf Substrat 12 bereit zu stellen. Alternativ kann auf Substrat 12 eine Haftmittelschicht beschichtet sein, die dazu dient, ein Kulturmedium zu halten, das als ein Pulver aufgetragen werden kann. Das Haftmittel sollte ausreichend durchsichtig sein, wenn es hydratisiert ist, um eine Betrachtung der Bakterienkolonien, die auf der Oberfläche des Substrates wachsen, durch das beschichtete Substrat hindurch zu ermöglichen. Das Haftmittel sollte auf dem Substrat außerdem in einer Stärke beschichtet sein, die erlaubt, dass das Substrat gleichmäßig mit Trockenkulturmedium beschichtet wird, ohne das Medium voll-ständig in dem Haftmittel einzubetten.
  • Wenn das flüssige Kulturmedium dieser Erfindung in einer trockenen Form oder als ein Trockenpulver verwendet werden soll, werden die Reagenzien, Nährstoffe, Gummiarten und pH-Indikator als eine Flüssigkeit zu dem Substrat gegeben und anschließend getrocknet. Das Kulturmedium dieser Erfindung kann leicht getrocknet werden, indem flüssiges Medium in einem Ofen bei etwa 104,4°C (220°F) erhitzt wird, bis im Wesentlichen das gesamte Wasser aus der Flüssigkeit verdunstet ist. Wenn das Medium allerdings erhitzt wird, nachdem das Wasser verdunstet ist, beginnt das Medium zu zerfallen.
  • An die mit Medium beschichtete Oberfläche von Substrat 12 ist ein Schaum-Abstandshalter 16 mit einer runden Öffnung in dem Schaum angebracht. Der Schaum-Abstandshalter, der die Peripherie von Substrat 12 bedeckt, definiert den Bereich, der mit einer Probe angeimpft werden soll und dient dazu zu verhindern, dass die Probe aus dem Substrat austritt. In einer alternativen Ausführungsform kann eine Vorrichtung keinen Probe enthaltenden Schaum-Abstandshalter 16 aufweisen. In der Vorrichtung dieser alternativen Ausführungsform ist die Menge an Probe auf dem Substrat 12 durch Absorption der Probe in die Bestandteile des Mediums enthalten.
  • An einem Rand einer oberen Fläche des Schaum-Abstandshalters 16 ist ein Deckblatt 20 angebracht. Deckblatt 20 besteht vorzugsweise aus einem durchsichtigen Film oder Blattmaterial, um das Zählen von auf dem Substrat vorhandenen Bakterienkolonien zu vereinfachen. Darüber hinaus ist Deckblatt 20 vorzugsweise gegenüber Bakterien und Wasserdampf undurchlässig, um das Risiko einer Verunreinigung und einer Verschlechterung der Bestandteile zu vermeiden. Ein bevorzugtes Material zur Verwendung als ein Deckblatt 20 ist zweiachsig ausgerichtetes Polypropylen. Das Deckblatt ist typischerweise mit weiteren Gummiarten und einem zweiten Indikator beschichtet.
  • Beim Gebrauch wird eine vorbestimmte Menge an Inokulum, typischerweise etwa ein Milliliter Inokulum, zu der in 1 veranschaulichten Vorrichtung gegeben, indem das Deckblatt 20 zurückgezogen und eine wässrige Testprobe oder Wasser in die Mitte von Substrat 12 gegeben wird. Dann wird das Deckblatt 20 wieder über Substrat 12 angebracht, und das Inokulum wird gleichmäßig auf dem Substrat verteilt. Ein praktisches Werkzeug, um dies durchzuführen, ist eine beschwerte runde Vorlage, die auch verwendet wird, um das Inokulum auf einen bestimmten Bereich von Substrat 12 einzugrenzen. Wenn das Inokulum das Substrat 12 berührt und darauf verteilt wird, hydratisiert das Kulturmedium auf Substrat 12, um ein wachstumsunterstützendes Nährstoffgel zu bilden. Die beimpfte Vorrichtung wird dann für einen vorbestimmten Zeitraum inkubiert, wonach die Anzahl der auf dem Substrat wachsenden Bakterienkolonien durch das durchsichtige Deckblatt 20 hindurch gezählt werden kann.
  • Wenn das Kulturmedium dieser Erfindung in einem trockenen Zustand auf einem Dünnfilmsubstrat vorliegt und dann mit einem Schaum-Abstandshalter bedeckt wird, ist die Menge der Bestandteile in dem Trockenmedium, die tatsächlich mit der Probe in Berührung kommt, eine Hälfte (0,5) der Gesamtmenge der Bestandteile in dem flüssigen Medium, bevor es auf dem Substrat getrocknet wird.
  • Das Feststellen von Enterobacteriaceae in dem Kulturmedium kann visuell oder mithilfe eines Gerätes durchgeführt werden. Geeignete Geräte sind in der verwandten, am 17. Dezember 1993 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/168,681, die zugunsten der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/646,291 aufgegeben wurde, welche als US-Patent 5,744,322 an Krejcarek et al. erteilt wurde, und in US-Patent 5,403,722 an Floeder et al. beschrieben.
  • Obgleich die Verwendung des Kulturmediums dieser Erfindung auf einer Dünnfilmvorrichtung oben beschrieben ist, wird ein durchschnittlicher Fachmann erkennen, dass die Kulturmedien in anderen Kulturvorrichtungen verwendet werden können, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann das Kulturmedium verwendet werden, um Bakterien auf bekannten Agar platten anzuzüchten.
  • Die Möglichkeit, das Vorhandensein spezifizierter Mikroorganismen festzustellen, ist in vielen Umständen wertvoll. Beispielsweise sind das Feststellen und Zählen von Enterobacteriaceae in der Lebensmittelbranche wichtig. Obgleich die Lebensmittelbranche von der Feststellung einer Verunreinigung mit Enterobacteriaceae eindeutig profitieren würde, würden auch andere Branchen, einschließlich der Kosmetik-, Wassertestungs- und Pharmaziebranche, die Möglichkeit begrüßen, diese Bakterien festzustellen.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, weitere Einzelheiten und Ausführungsformen in Verbindung mit der Anwendung der vorliegenden Erfindung bereit zu. stellen. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung, der in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist, nicht einschränken.
  • Beispiel 1 - Wachstum von Enterobacteriaceae in Medium mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen
  • Dieses Beispiel veranschaulicht, dass ein bevorzugtes Kulturmedium dieser Erfindung (Enterobacteriaceae-Wachstumsmedium, EGM) verwendet werden kann, um Enterobacteriaceae in einer Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtung anzuzüchten. Das in diesem Beispiel verwendete Medium enthielt 14 g/l Gelatinepepton (Accumedia), 6 g/l Hefeextrakt (Accumedia), 10 g/l Natriumchlorid (Sigma), 3 g/l Gallensalze (Accumedia) und 11 g/l Guar-Gummi (Rhone-Poulenc). Die Glukose und der pH-Indikator wurden in verschiedenen Konzentrationen verwendet, wie in Tabelle 1 unten angegeben ist. Die aufgeführten Bestandteile waren von den oben angegebenen Quellen kommerziell erhältlich.
  • Kurz gefasst, die verschiedenen Medien wurden hergestellt, indem die Nährstoffe, Salze und Gummiarten in einem Liter entionisiertem Wasser aufgelöst wurden. Diese Mischung wurde dann zum Kochen gebracht, auf etwa Raumtemperatur abgekühlt und anschließend wurden Glukose und pH-Indikator zugegeben.
  • Zwei repräsentative Enterobacteriaceae-Arten, Escherichia coli 149 (ATCC Zugangsnummer 55535) und Serratia liquefaciens C1 (von 3M Microbiology Products Laboratory verwendete Qualitätskontrollisolate, die als eingefrorene Proben von 3 M, St. Paul, MN, USA, aufbewahrt werden) wurden zunächst 18–24 Std. bei 35°C in Tryptikase-Soja-Brühe (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI, USA) angezüchtet. Diese wachsenden Kulturen enthielten etwa 108–109 Bakterien/ml und wurden anschließend etwa 106–107-fach in Butterfields Standard Methods Buffer (SMB, Fisher Scientific, Minneapolis, MN, USA) verdünnt, um Proben bereit zu stellen, die etwa 20–50 Kolonie-bildende Einheiten pro Platte enthalten. Ein durchschnittlicher Fachmann erkennt, dass äquivalente Stämme oder Arten von Bakterien kommerziell erhältlich sind oder anhand gut bekannter Verfahren oder Prozesse isoliert werden können.
  • Dünnfilm-Trockenkulturmediumvorrichtungen wurden wie folgt hergestellt. Eine Schicht EGM wurde durch eine kleine Öffnung gedrückt, um bei Raumtemperatur einen 7,5 mil (0,19 mm) (Länge und Breite erforderlich)-Polyestersubstratfilm (Imperial Chemical Industries, Wilmington, DE, USA) zu bedecken. Der bedeckte Polyesterfilm wurde anschließend etwa 1–20 Minuten bei etwa 200–250°F getrocknet. Ein 18 mil (0,46 mm)-Styropor-Abstandshalterblatt wurde geschnitten, um den Polyesterfilm zu bedecken, und in den Styropor-Abstandshalter wurde eine runde Öffnung geschnitten. Eine Fläche des Styropor-Abstandshalters wurde mit einem Isooktylacrylat-/Acrylsäure-Haftmittel (98 Gew.-% Isooktylacrylat, copolymerisiert mit 2 Gew.-% Acrylsäure) beschichtet und das Styroporblatt wurde an die beschichtete Fläche des Polyesterfilms angebracht. Die Öffnung in dem Styropor-Abstandshalter stellt eine Vertiefung mit einem Durchmesser von etwa 2 Inch (etwa 5 cm) bereit.
  • Es wurde ein durchsichtiger Polypropylenfilm geschnitten, um den Polyester-/Styropor-beschichteten Film zu bedecken. Eine Fläche des Polypropylenfilms (1,6 mil (0,041 mm), 3 M, St. Paul, MN, USA) wurde mit einem Isooktylacrylat-/Acrylsäure-Haftmittel (98 Gew.-% Isooktylacrylat, copolymerisiert mit 2 Gew.-% Acrylsäure) beschichtet und dann mit einer Schicht Guar-Gummi (Rhone-Poulenc, Inc., Kreuzlinger, Schweiz) und Triphenyltetrazoliumchlorid beschichtet. Eine Schicht doppelseitig beschichtetes Klebeband (3 M, St. Paul, MN, USA) wurde auf einem ausgesetzten Rand des Styropor-Abstandshalters angebracht und die Gummi enthaltende Fläche des Polypropylenfilms wurde entlang einer Kante an den Styropor-Abstandshalter angebracht.
  • Die kultivierten Aliquots (ein ml) wurden in der Öffnung des Styropor-Abstandshalters angebracht, der Polypropylenfilm wurde verwendet, um das Inokulum abzudecken und die Dünnfilmvorrichtung wurde 24 Std. bei 35°C inkubiert.
  • Nach einer Inkubation von 24 Std. wurden Dünnfilmplatten auf Vorhandensein von Säurezonen beurteilt, die als gelbe Bereiche auf dem roten Hintergrund der Platte identifiziert wurden. Die Größen der Säurezonen wurden gemessen und sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Die in Tabelle 1 unten aufgeführten Daten zeigen, dass EGM eine selektive Anzucht von Enterobacteriaceae bei verschiedenen Konzentrationen von Glukose und pH-Indikator ermöglichte, um getrennte, unterscheidbare gefärbte Zonen um wachsende Bakterienkolonien zu erhalten. TABELLE 1
    Figure 00150001
    Figure 00160001
    Figure 00170001
    • 0
    = keine Säure
    +–
    = Säurezone mit einem Durchmesser von < 1,5 mm
    1+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 1,5–2,0 mm
    2+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 2,0–3,0 mm
    3+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 3,0–4,0 mm
    4+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von >/= 4,0 mm
  • Beispiel 2 - Wachstum von Enterobacteria in Medium mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Konzentration von Puffer verwendet werden kann, um die Diffusion eines pH-Indikators in einem Medium, das zur Anzucht von Enterobacteriaceae ausgewählt worden ist, zu steuern. Das in diesem Versuch verwendete Medium wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, außer, dass die Konzentration an Glukose fest bei 10 g/l lag, während die Konzentrationen verschiedener Puffer und pH-Indikatoren verändert wurden wie in Tabelle 2 aufgeführt. Puffer, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, wurden gemäß anerkannter Verfahren hergestellt. Wenn zwei Puffer verwendet wurden, besteht die in Tabelle 2 aufgeführte Endkonzentration aus jeweils einer Hälfte der aufgeführten Puffer.
  • Die in Tabelle 2 unten aufgeführten Daten zeigen, dass EGM für die Anzucht von Enterobacteriaceae selektiv war. Mehrere Puffer und pH-Indikatoren lieferten den gewünschten Effekt der Reduzierung der Größe gefärbter Zonen um wachsende Bakterienkolonien. TABELLE 2
    Figure 00180001
    Figure 00190001
    Figure 00200001
    Figure 00210001
    • 0
    = keine Säurezone
    Plus-Minus
    = Säurezone mit einem Durchmesser von < 1,5 mm
    1+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 1,5–2,0 mm
    2+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 2,0–3,0 mm
    3+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von 3,0–4,0 mm
    4+
    = Säurezone mit einem Durchmesser von >/= 4,0 mm

Claims (9)

  1. Medium für Bakterienkulturen in trockener Form, umfassend Glukose und ein pH-Indikator/Puffersystem, um Enterobacteriaceae, die in dem Medium wachsen, festzustellen und zu zählen, wobei das Medium ausgewählte Mengen von Glukose als einen Nährstoff für Wachstum, einen pH-Indikator, der in Gegenwart von Säure seine Farbe verändert, und Puffer zum Wachstum und zur Kontrolle der Diffusion des pH-Indikators um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorbereiche zu sehr in das Medium diffundieren, enthält.
  2. Verfahren des Feststellens und Zählens von Enterobacteriaceae in einer Probe, das die Schritte des Hinzufügens eines Aliquots der Probe in einem wässrigen Verdünnungsmittel zu einem Kulturmedium, das ausgewählte Mengen an Glukose, pH-Indikator und Puffer enthält um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorbereiche zu sehr in das Medium diffundieren, Einstellen des pH-Werts des Aliquots auf etwa 6,5–7,5, Züchten der Enterobacteriaceae in Gegenwart des Kulturmediums und Feststellen des Farbbereichs des pH-Indikators in dem Medium umfasst, wobei die Probe mittels einer Vorrichtung, die ein selbstragendes, wasserfestes Substrat, einen Schaum-Abstandshalter und ein durchsichtiges Deckblatt besitzt, zu einem dünnen Film gegeben wird, der das Medium enthält, wobei das Kulturmedium auf das wasserfeste Substrat geschichtet und dann getrocknet wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Enterobacteriaceae enthaltende Probe in einem wässrigen Verdünnungsmittel, das im Wesentlichen aus etwa 0,6 mMol Kaliumphosphat besteht, dem Kulturmedium zugegeben wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Kulturmedium etwa 7–14 g/l Gelatinepepton, 6–9 g/l Hefeextrakt, 5–20 g/l Glukose, 5–15 g/l Natriumchlorid, 2,7-3,15 g/l Gallensalze, 5–13 g/l Guar-Gummi, 0,6–2 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 1,8–6 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,2–0,8 g/l pH-Indikator umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Enterobacteriaceae enthaltende Probe in einem wässrigen Verdünnungsmittel, das im Wesentlichen aus etwa 0,1 Gew.-/Vol.-% Caseinpepton und 0,85 Gew.-/Vol.-% Natriumchlorid besteht, dem Kulturmedium zugegeben wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Kulturmedium etwa 7–14 g/l Gelatinepepton, 6–9 g/l Hefeextrakt, 5–20 g/l Glukose, 2,7–3,15 g/l Gallensalze, 5–13 g/l Guar-Gummi, 0,2–1 g/l monobasisches Kaliumphosphat, 0,6–3 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 0,2–0,8 g/l pH-Indikator umfasst.
  7. Vorrichtung zum Feststellen und Zählen von Enterobacteriaceae in einer Probe, die ein beschichtetes, selbstragendes, wasserfestes Substrat, einen Schaum-Abstandshalter und ein durchsichtiges Deckblatt enthält, wobei ein Kulturmedium, das ausgewählte Mengen an Glukose, pH-Indikator und Puffer enthält um zu verhindern, dass gefärbte Indikatorbereiche zu sehr in das Medium diffundieren, auf das selbstragende, wasserfeste Substrat geschichtet ist.
  8. Kulturmedium nach Anspruch 1 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 oder Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der pH-Indikator aus der Gruppe bestehend aus Azobenzol-, Sulfonphthalein- und Anthrochinon-pH-Indikatoren ausgewählt ist.
  9. Kulturmedium nach Anspruch 1 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 oder Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der pH-Indikator aus der Gruppe bestehend aus Methylrot, Bromkresolviolett, Chlorphenolrot, Bromthymolblau, Bromkresolblau und Alizarinrot-S-Monohydrat ausgewählt ist.
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