CN102713617B - 产生葡萄糖氧化酶的霉菌的快速检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法和试剂盒。所述方法包括提供培养基和包含生色底物的过氧化氢指示剂，所述生色底物可提供指示产生葡萄糖氧化酶的微生物的存在的可检测的生色反应，并且公开了用于通过检测另外的生色反应来区分微生物的另外的方法。

Description

产生葡萄糖氧化酶的霉菌的快速检测

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2009年12月30日提交的临时专利申请61/291,144的优先权，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法和用于检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的试剂盒。

背景技术

在多种行业中，例如奶制品、果汁、酒和啤酒行业，需要分析细菌和霉菌。当讨论用于微生物分析的装置时，本领域通常并不将霉菌分析与细菌分析区分开，但是本领域技术人员已知霉菌分析常常比细菌分析慢。用于检测低浓度霉菌菌种的方法通常依赖于生长培养基，例如3MPETRIFILM^TM酵母菌和霉菌计数板或酸化的马铃薯葡萄糖琼脂。也使用用抗生素（例如，氯霉素）处理过的琼脂。取决于生物体的生长速率，这些方法需要3至7天才能得出确定的答案。食品制造商尤其需要更快响应的测试，因为其他生长相关测试结果（例如总需氧（活）细菌计数）可在两天内得出，并且要等待额外一天或更多天才能获得酵母菌和霉菌测试结果，代价很大。荧光显微镜法或流式细胞术可提供更直接的测试结果，但是这些技术花费过高。

霉菌菌种黑曲霉(Aspergillusniger)是常见的真菌食品污染物。虽然一般是非病原性的，但它确实会造成各种水果和蔬菜的黑腐病或黑穗病。黑曲霉也通常发现于室内环境，该菌落在室内环境中可被误认为产毒葡萄穗霉属霉菌。

在葡萄栽培行业中，需要提高对黑曲霉和炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)的辨别能力。后者是葡萄中赭曲霉毒素A的主要来源，赭曲霉毒素A是肾毒性、致畸、致癌并且抑制免疫系统的霉菌毒素。黑曲霉和炭黑曲霉通过肉眼难以区别，并且主要由有经验的真菌学家使用显微镜法基于形态学而区分。目前直接检测赭曲霉毒素A的技术建立在液相色谱或免疫测定基础上，但是这些方法也很昂贵并且需要专门技术。

已经探索了用于检测产生赭曲霉毒素的真菌的其他技术。例如，美国专利No.7,560,234（Dobson等人）推定地描述了可用于检测和/或鉴定产赭曲霉毒素真菌的聚合酶链式反应(PCR)分析技术。

需要能够以简单、高性价比的方式快速检测和辨别黑曲霉和炭黑曲霉以及相关菌种的方法。

发明内容

本发明包括简单的制品和方法以检测和/或鉴定产生葡萄糖氧化酶的微生物，包括曲霉属霉菌的某些菌种。在一些实施例中，本发明的方法提供某些曲霉属菌种的区分。除此以外或作为另外一种选择，一些实施例提供产生葡萄糖氧化酶的微生物的计数。在一些实施例中，本发明的方法提供产生葡萄糖氧化酶的微生物的自动检测和/或计数。

在一个方面，本发明提供检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法。该方法可包括提供包含冷水可溶性胶凝剂的薄膜培养装置、支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基、包含辣根过氧化物酶和至少一种生色底物的过氧化氢指示剂以及怀疑含有微生物的样品。该方法还可包括在所述培养装置中将预定体积的样品、培养基和过氧化氢指示剂合并。该方法还可包括温育所述培养装置，然后检测生色底物的反应。在一些实施例中，在开始温育所述培养装置的48小时内，生色底物的反应是可检测的。在一些实施例中，该培养装置包含培养基。

在另一方面，本发明提供检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法。该方法可包括提供包含冷水可溶性胶凝剂的薄膜培养装置、支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基、包含辣根过氧化物酶和至少一种生色底物的过氧化氢指示剂以及怀疑含有微生物的样品。该方法还可包括将预定体积的样品和培养基合并形成第一混合物，然后在培养装置中将第一混合物和过氧化氢指示剂合并。该方法还可包括温育所述培养装置，然后检测生色底物的反应。在一些实施例中，在开始温育所述培养装置的48小时内，生色底物的反应是可检测的。

在上述实施例的任何一个中，温育所述培养装置可包括有氧温育所述装置。在上述实施例的任何一个中，在开始温育所述培养装置的24小时内，生色底物的反应可以是可检测的。在上述实施例的任何一个中，微生物可选自例如黑曲霉、炭黑曲霉、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、尼崎青霉(Penicilliumamagasakiense)、和绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)。

在上述实施例的任何一个中，生色底物可选自例如4-氨基安替比林(4-AAP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、或它们的组合。在一些实施例中，生色底物还可包括3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐(TOOS)。

在一些实施例中，该方法还可包括通过检测与β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反应来区别微生物。在一些实施例中，β-D-吡喃木糖苷酶生色底物可选自例如邻硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷和对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(NXP)。

在另一方面，本发明提供一种试剂盒。所述试剂盒可包含薄膜培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂、支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基、以及包含辣根过氧化物酶和至少一种生色底物的过氧化氢指示剂。在一些实施例中，生色底物可选自例如4-氨基安替比林(4-AAP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、或它们的组合。在所述试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒还可包含3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐(TOOS)。

在所述试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒还可包含用于检测产生β-D-吡喃木糖苷酶的微生物的β-D-吡喃木糖苷酶生色底物。β-D-吡喃木糖苷酶生色底物可选自例如邻硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷和对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(NXP)。

在所述试剂盒的上述实施例的任何一个中，培养基可包含过氧化氢指示剂。在所述试剂盒的一些实施例中，培养装置可包含培养基、过氧化氢指示剂或二者。在所述试剂盒的上述实施例的任何一个中，所述试剂盒还可包括样品制备附属物，其选自例如样品稀释剂、缓冲液、样品采集装置和吸管。

通过以下详细描述，本发明这些和其他方面将显而易见。词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本发明的实施例。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或更多个优选实施例的详述并不意味着其他实施例不适用，并且并非意图将其他实施例排除在本发明的范围之外。在任何情况下都不应将上述总结理解为对要求保护的主题的限制，所述主题仅由所附权利要求限定，权利要求可在审查期间进行修改。

附图说明

图1是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图（局部剖视）。

图2是具有网格图案的自支撑基材的一个实施例的顶视图。

图3是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图（局部剖视）。

图4是包括隔片和捕集元件的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图（局部剖视）。

图5是根据本发明的检测系统的一个实施例的框图。

具体实施方式

在详细说明本发明的任何实施例之前，应当理解，本发明并不将其应用局限于以下描述所提及的或附图所示出的具体构造和组件布置方式。本发明能有其他的实施例，并且能够以多种方式进行操作或实施。而且，应当理解，本文中所用的措词和术语是用于描述，而不应认为是限制。本文使用“包括”、“包含”或“具有”以及它们的变体旨在涵盖之后所列出的项目和它们的等同物以及另外的项目。除非另外规定或限制，术语“支撑”和“结合”以及它们的变型形式以广义使用并且涵盖直接和间接的支撑物和结合物。应当理解可使用其他实施例，并且在不脱离本发明的范围的情况下可进行结构或逻辑改变。另外，例如“前部”、“后部”、“顶部”和“底部”等术语仅用于描述元件，因为它们彼此相关，而绝非意在述及设备的特定方位、指示或暗示必需或必要的设备的方位或者指定在使用中将要如何使用、安装、显示或设置本文描述的本发明。

本发明整体涉及用于检测和区别样品中黑曲霉和/或炭黑曲霉微生物和相关菌种的方法和制品。本发明的方法提供这些微生物的生长、检测和区别，所用方式是检测某些酶的存在，当使用本发明的生色底物时，这些酶以在24至48小时内或更少时间可检测出的级别产生。虽然不受任何特定理论的束缚，但认为产生葡萄糖氧化酶的微生物的菌种会在存在合适的底物和反应条件的情况下产生过氧化氢，继而可对过氧化氢进行检测。本发明提供一种过氧化氢指示剂，其能够在培养装置中温育48小时内、或在培养装置中温育42小时内、或在培养装置中温育26小时内、或甚至在培养装置中温育24小时内检测出产生葡萄糖氧化酶的微生物。

过氧化氢指示剂

本说明书的过氧化氢指示剂包括过氧化物酶和生色底物。优选地，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。本领域已知在存在至少一种生色底物的情况下辣根过氧化物酶和过氧化氢反应为产生生色底物的反应。然而，据信，此前未描述过选择至少一种生色底物以使得能够使用过氧化氢指示剂在培养装置中温育的48小时内、或42小时内、或26小时内、或甚至24小时内检测产生葡萄糖氧化酶的微生物。

本说明书的生色底物的例子包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP,SigmaAldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI))。在本说明书的一些示例性的情况中，培养装置是市售的薄膜装置（例如，3MPETRIFILM^TM酵母菌和霉菌计数板），其包含BCIP作为磷酸酶检测剂。本文发现通过加入辣根过氧化物酶和另外的BCIP，可实现产生葡萄糖氧化酶的生物的早期检测。

本说明书的生色底物的另一个例子是4-氨基安替比林(4-AAP,SigmaAldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI))，其也可与另外的BCIP组合使用。本文也观察到3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐(TOOS,SigmaAldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI))与4-AAP的另外组合，或与和另外的BCIP组合的4-AAP的另外组合，相比仅使用4-AAP作为添加的生色底物的例子，提供了增强的可检测生色反应。

可选择适当浓度水平的过氧化氢指示剂组分以适应本说明书具体的实施例。使当前描述的检测得以实现的辣根过氧化物酶的浓度水平包括0.5μg/mL至50μg/mL，包括约10μg/mL的示例性水平。使当前描述的检测得以实现的4-AAP和TOOS的浓度包括0.1mg/mL至5mg/mL，包括约0.5mg/mL至约1.0mg/mL的示例性范围。

β-D-吡喃木糖苷酶生色底物

为了实现产生葡萄糖氧化酶的微生物的区分，可将能够与由微生物产生的不同酶反应的不同生色底物包括在内，从而达到对所关注的微生物亚群的可区分判读。例如，就炭黑曲霉和若干其他微生物而言，温育期间可产生酶β-D-吡喃木糖苷酶，而样品中的其他微生物可产生少量或不产生β-D-吡喃木糖苷酶。因此能够与β-D-吡喃木糖苷酶反应的吡喃木糖苷酶生色底物可通过生色反应得到检测，所述生色反应与单独使用过氧化氢指示剂获得的检测不同。合适的β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的例子是对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(NXP,SigmaAldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI))：

可使用β-D-吡喃木糖苷酶的其他合适的合成底物，包括邻硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷或荧光团例如4-甲基伞形酮-β-D-吡喃木糖苷或6-溴-2-萘基-β-D-吡喃木糖苷。可使用β-D-吡喃木糖苷酶的其他生色、荧光或发光底物，包括基于吲哚基-和荧光素-β-D-吡喃木糖苷类似物的合成底物，其可通过消除吡喃木糖苷部分而产生颜色、荧光或发光。

除β-D-吡喃木糖苷酶之外的酶的生色、荧光或发光底物同样可有助于区分产生葡萄糖氧化酶的生物体，其中一种产生葡萄糖氧化酶的生物体产生给定的酶（例如，磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶或脂肪酶），并且另一种产生葡萄糖氧化酶的生物体不产生相同的酶（或产量非常少）。

样品

合适的样品可获自或源自多种来源。术语“来源”通常用来指需要针对微生物进行测试的食品或非食品。来源可以为固体、液体、半固体、凝胶状材料、气体（例如空气）以及它们的组合。在一些实施例中，来源可由捕集元件提供，该捕集元件用于例如从所关注的表面或者从空气采集该来源。在一些实施例中，液体组合物可包括捕集元件，该捕集元件可进一步被破碎分开（例如在搅动或溶解过程中）以增强该来源和任何所关注的微生物的回收。所关注的表面可包括多种表面的至少一部分，所述表面包括但不限于壁（包括门）、地板、天花板、排水沟、冷却系统、管道（例如空气管道）、通风孔、马桶座圈、把手、门把手、扶手、工作台面、桌面、用餐表面（例如盘子、碟子等）、工作表面、设备表面、服装等，以及它们的组合。来源的全部或一部分可用于本方法中。当使用来源的一部分时，这有时可以称作该来源的“样品”。然而，术语“样品”在本文中一般用来指从来源获取并被引入到测试装置中以进行微生物检测的那部分材料体积或质量。

术语“食品”通常用于指固体、液体（例如，包括但不限于溶液、分散体、乳状液、悬浮液等以及它们的组合）和/或半固体可食用组合物。食品的例子包括但不限于肉类、家禽、蛋、鱼、海鲜、蔬菜、水果、预加工食品（如汤、调味汁、糊）、谷物产品（如面粉、谷类食物、面包）、罐装食物、奶、其他乳制品（如奶酪、酸奶、酸奶油）、脂肪、油类、甜点、调味品、香料、面食、饮料（包括果汁、啤酒和酒）、水、动物饲料、其他合适的可食用材料以及它们的组合。

可通过各种方法处理样品例如食物（如，葡萄）以提高微生物体的释放用于分析。使样品经历剧烈的混合过程，如掺混或匀浆，以产生相对均匀的液体悬浮液。常常将样品在称为均质袋的塑料样品容器中进行处理。

在一些实施例中，样品的来源可包括来自工业加工的水（“工业用水”），或环境水。

“样品采集装置”在本文中以最广义的含义使用，指用来采集液体、半固体或固体样品材料的器具。样品采集装置的非限制性例子包括拭子、擦拭物、海绵、勺子、刮刀、压舌板、过滤器、吸管、吸管头和虹吸管。

用于检测表面上微生物的多种取样技术是已知的。这些取样技术也适用于本发明方法。例如，通常由擦拭食品加工装置的表面或由擦拭患者的鼻孔获得样品。特别优选的取样技术包括将表面与无菌拭子、海绵或取样装置接触（例如擦洗、擦拭）。

多种拭子或其他样品采集装置为市售的，例如可以商标名3M^TM快速拭子(3M^TMQuickSwab)购自3M公司(St.Paul,MN)，以商标名PURE-WRAPS购自PuritanMedicalProductsCo.LLC(Guilford,ME)或以商标名ESWAB购自CopanDiagnostics,Inc.(Corona,CA)，或以商标名FLOCKEDSWAB购自microRheologics,S.r.l.(Brescia,IT)。如果需要，也可以使用诸如（例如）在美国专利No.5,879,635(Nason)所公开的样品采集装置。拭子可为包括棉花、人造丝、藻酸钙、涤纶、聚酯、尼龙、聚氨酯等在内的多种材料。

然后可将样品采集装置（例如拭子）直接培养、直接分析或用适当的溶液提取（例如，通过洗涤，经涡旋洗脱）。这些提取（即洗脱）溶液通常包括水并可任选包括缓冲液和至少一种表面活性剂。洗脱缓冲液的例子包括例如磷酸缓冲盐水(PBS)，其可例如与TWEEN20或PLURONICL64组合使用。测试样品（例如液体）可先进行处理再作进一步的分析。这包括浓缩、沉淀、过滤、离心、透析、稀释、天然组分的灭活、试剂的加入、化学处理等。

培养装置

可影响曲霉属微生物生长的环境因素可包括营养物质存在与否、pH、含水量、盐度、氧化-还原电位、抗微生物化合物、温度、大气气体组成和生物结构或屏障。

用于培养曲霉属菌种的营养培养基在本领域是已知的。用于使真菌生长的通常采用的培养基是马铃薯葡萄糖琼脂，其可例如包含马铃薯淀粉(4g/L)、葡萄糖(20g/L)和琼脂(15g/L)。另一种用于真菌生长的常规培养基是麦芽提取物琼脂，其可配制成麦芽糖(12.75g/L)、糊精(2.75g/L)、甘油(2.35g/L)、蛋白胨(0.78g/L)和琼脂(15g/L)的混合物。这些生长培养基可得自BecktonDickinson(FranklinLakes,NJ)。

本发明在某些实施例中包括用于检测曲霉属霉菌的培养装置。本发明的培养装置包括例如薄膜培养板装置。薄膜培养板装置通常比传统的琼脂平皿更加紧凑，且通常含有干燥的可再水化的培养基以支持某些微生物的生长。薄膜培养板装置的非限制性例子包括美国专利No.4,565,783、No.5,089,413和No.5,681,712中公开的带涂层基材装置；这些专利中的每个均全文以引用方式并入本文。

图1示出根据本发明的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置110包括主体构件，该主体构件包括具有上表面和下表面（分别为112a和112b）的自支撑防水基材112。基材112可为相对刚性的膜（例如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯），该膜不会吸水或者以别的方式被水影响。基材112可为透明的或不透明的，这取决于是否想要透过该基材观察微生物菌落。为有利于对霉菌菌落计数，基材212可具有印在其上的网格图案（例如，方格），如图2中所示。

参见图1，基材112可在其上表面112a上涂覆有一层粘合剂114，该粘合剂的作用是将干胶凝剂、生色指示剂和/或营养物质以均匀单层的形式保持以便容易水化。粘合剂114应以优选小于粉末状胶凝剂和/或营养物质的粒子直径的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足够的粘合剂以将粒子粘附到基材，但又不太多而造成粒子完全嵌在粘合剂中。冷水可溶性粉末的均匀单层116是所期望的，其表面积充分暴露以便水化。图1中还示出了在覆盖片122上的可任选的粘合剂层114'和冷水可溶性粉末层116'。当用水溶液（例如该样品和/或含水助悬介质，如水或缓冲液）进行水化时，胶凝剂形成水凝胶。

在一些实施例中，粘合剂114可包含水性粘合剂组合物。优选地，当由含水试验样品湿润时，水性粘合剂114的层充分透明以允许观察微生物菌落。水性粘合剂组合物可掺入一种或多种亲水剂，包括营养物质、选择剂、指示剂（例如，生色指示剂）、或它们的组合。

干培养基可任选地包括执行某些微生物测试所必需的试剂。为使酵母菌或霉菌样品生长而不受细菌的干扰，可在干培养基中包含某些抑菌剂，例如氯霉素、氯四环素、酒石酸或合适的青霉素。

示例性的一类可用的指示剂包括这样的染料，其被生长中的微生物代谢或者以其他方式与生长中的微生物反应，由此造成微生物菌落被着色或者发荧光，以易于由技术人员或由自动读出器检测和/或定量。这种染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、对甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基和四唑蓝。但是应认识到，取决于所要鉴定的具体生物体，也可使用其他合适的染料。本领域普通技术人员会认识到，根据本发明使用的任何其他指示剂、染料、选择剂、酶底物或营养物质不应实质上干扰对本文所述的葡萄糖氧化酶指示剂的观察和/或成像。

可采用缓冲试剂如碳酸钠来提供显示中性pH的培养基，并可采用“Cab-O-SilM-5”作为加工助剂，如美国专利No.4,565,783中所描述，将该专利以引用方式全文并入本文。当然，可根据所要培养的微生物的类型，对用于粉末116的具体涂层混合物（例如营养物质、指示剂和/或胶凝剂）加以调整。

在本发明范围内还设想到，粉末116可任选包括为执行某些用于微生物鉴定的生化测试所必需的另外试剂。可将在存在特定类型的微生物的情况下发生颜色改变的这种试剂（例如酶底物）包括在粉末116或粘合剂114中。

在本发明的另一个实施例中，粉末116可构成涂层，该涂层包含已经被溶解或悬浮于溶液中、涂覆并干燥于基材112上的胶凝剂和营养物质、选择剂和/或指示剂的混合物。在该实施例中，该涂层基本上是无水的（即该涂层具有的水含量不高于约脱水涂层在允许其与周围环境平衡后的水含量）。

如图1所示，主体构件可包括施加到基材112的上表面的隔离物118，隔离物118包括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圆形孔120。孔120的壁提供预定大小和形状的凹槽以限定水化后的培养基。孔120通常刻划出培养装置110的生长区域。隔离物118应足够厚以形成所需体积的凹槽，例如1、2或3毫升。聚乙烯闭孔泡沫塑料是隔离物118的优选材料，但也可使用任何疏水性（非湿润性）、对微生物惰性且能够承受灭菌的材料。在一些实施例中（未显示），隔离物118可包括多个孔20（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个孔），每个孔可接种上不同的液体样品。

隔离物118可包括相对较厚的设计，如美国专利No.5,681,712中所述的那些设计，该专利以引用方式全文并入本文。较厚的开孔的隔离物118的一个目的是对设置在隔离物118的孔120中的膜（例如微孔过滤器膜）（未示出）进行定位和保护。较厚的隔离物118的另一个目的是为了减少或防止覆盖片122与生长中的微生物菌落的接触（即提供生长表面和覆盖片122之间的“顶部空间”，这还可使得对生长中的微生物菌落的通气增加）。

隔离物118的厚度应足以围住在对培养装置接种时加到该装置的液体体积。取决于膜（当使用时）的厚度，隔离物可为至少约0.5mm厚、约1mm厚、约1.5mm厚和约2mm厚。

图3示出了薄膜培养装置310的另一个实施例。该实施例包括基材312、粘合剂314、冷水可溶性粉末316和覆盖片322，如图1中所描述的。

相比于图1的培养装置110，图3的培养装置310不包括隔离物来在接种过程中限定样品。可在覆盖片322闭合后将模板例如加重环（未显示）暂时施加到该覆盖片的外面，用以在冷水可溶性粉末316形成凝胶的同时将样品限定到特定区域。培养装置310接种有样品的部分通常刻划出装置310的生长区域。在一些实施例中，可将装置310接种有多个（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个）不同的液体样品，采用适当的隔离物和模板来将单独的样品限定于培养装置310的粉末316的不同部分。当用水溶液（例如该样品和/或含水悬浮介质，如水或缓冲液）进行水化时，包含胶凝剂的冷水可溶性粉末形成水凝胶。

在一个实施例中，可根据例如美国专利No.4,565,783中所述的方法，如下制备薄膜培养板装置：产生液体涂覆混合物，将该液体涂覆混合物涂覆到基材上，干燥该经涂覆的基材并任选地附接覆盖片，该专利全文以引用方式并入本文中。该实施例的示例性装置示出在图4中。薄膜培养装置410包括具有自支撑、防水基材412的主体构件411，所述基材412分别具有上表面412a和下表面412b。基材412优选为由不吸收水的防水材料如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯制成的相对刚性的材料。其他合适的防水材料包括含有防水聚乙烯涂层的基材如纸材。上表面412a涂覆有液体组合物，然后让该液体组合物干燥以在基材412上提供干涂层416。干涂层416包含如本文所述的冷水可溶性胶凝剂，并且还可包含营养物质、选择剂、指示剂、pH指示剂、或上述物质中的任意两种或更多种的组合。用于产生干涂层416的液体组合物可容易地通过在约104℃的烘箱中加热液体组合物直至基本上该组合物中的全部水已蒸发来干燥。然而，如果在水分已蒸发后加热组合物，则组合物的某些组分（例如营养物质、指示剂）可能开始降解。在使用时，用液体（例如液体样品和/或液体营养培养基）水化干涂层416以形成重构的液体组合物。

可将一层粘合剂414涂覆于基材412上。该粘合剂可起到将干涂层416保持在基材412上的作用。该粘合剂在水化时应该足够透明以允许观察在涂覆了的基材412的表面上生长的菌落。该粘合剂还应该以这样的厚度涂覆于基材412上，该厚度使得基材能均匀地涂覆有干涂层416而不会将该涂层嵌入粘合剂中。

具有大致圆形的孔420的隔离物418粘附于干涂层416和/或基材412上。隔离物418覆盖基材412的周边，孔420限定了待用样品接种的区域。隔离物418环绕装置410的生长区域并起到防止液体样品从基材412渗漏。在一个可供选择的实施例中，装置410可不包括容纳样品的隔离物418。在该装置（未示出）中，可使用上述的加重环状模板将样品在接种过程中容纳于基材上，并且样品在温育过程中仅由培养基的组分（例如胶凝剂）包含。

覆盖片422附接至泡沫隔离物418的上表面的边缘。覆盖片422优选由透明的膜或片材制成，以便于对基材上存在的微生物菌落进行计数。另外，覆盖片422优选对细菌和水蒸汽具有不透性，以避免各组分受污染和变质的风险。用作覆盖片422的优选材料是双轴取向的聚丙烯。任选地，覆盖片422可涂覆有一层粘合剂，该粘合剂可涂覆有包含胶凝剂、营养物质、选择剂和指示剂（例如pH指示剂）或上述物质中的两种或更多种的任意组合的干燥组合物（例如粉末）（未显示）。

在使用时，通过向后拉覆盖片并将接种物分布在干涂层416上来将预定量的接种物（通常约1毫升液体接种物）添加至图4中所示的装置。该接种物可任选包含营养物质、选择剂、指示剂或上述物质中的两种或更多种的组合。然后再将覆盖片422放回涂层417上，接种物均匀地散布在泡沫隔离物418的圆形开口内。用于该操作的简便工具是加重的圆形模板。随着接种物接触涂层417并散布在该涂层上，涂层发生水化而形成凝胶。凝胶中存在的营养物质可支持微生物的生长。然后将接种了的装置温育预定的时间，之后可透过透明的覆盖片422观察生长在基材上的菌落数目并进行计数。

可任选将捕集元件如膜式过滤器用于装置410。图4示出了设置在隔离物418的孔420中的膜式过滤器426。另外示出的是在膜式过滤器426上生长的微生物菌落428。合适的微孔膜基本上不妨碍本说明书的微生物产生葡萄糖氧化酶和/或β-D-吡喃木糖苷酶或其他关注的酶，或不妨碍使用过氧化氢指示剂检测微生物。在某些优选的实施例中，当与重构的液体组合物接触时，微孔膜基本上是透明的。可在将液体添加至装置410来重构干涂层416之前将膜式过滤器426设置在装置410中。可在将液体添加至装置410来重构干涂层416之后将膜式过滤器426设置在装置410中。在一些实施例中，膜式过滤器426可包含足够的液体以在将过滤器426设置在装置410中时重构干涂层416。

本发明的培养基可包含当对培养基接种怀疑含有目标微生物的样品时一般适于促进目标微生物（即，产生葡萄糖氧化酶的和/或产生β-D-吡喃木糖苷酶的微生物）生长的营养物质、盐和离子。可用已知的曲霉属菌种测试含有诸如（例如）营养物质、盐、离子、选择剂、指示剂等组分的培养基以确定所述组分促进目标微生物的生长、抑制非目标微生物的生长和/或不妨碍微生物产生葡萄糖氧化酶和/或β-D-吡喃木糖苷酶或不妨碍使用生色底物检测葡萄糖氧化酶和/或β-D-吡喃木糖苷酶。培养基还可包含一种或多种胶凝剂。本发明的培养基可包含至少一种选择所关注霉菌菌种生长的选择剂。

可任选地，培养基可包含缓冲液。合适的缓冲液包括碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和磺酸盐缓冲液。在一些实施例中，磷酸盐缓冲液是磷酸钾缓冲液。在一些实施例中，培养基可包含不止一种缓冲剂（例如磷酸钾和醋酸钠）。磷酸盐缓冲液可以为约22mM。在其他实施例中，缓冲液是磺酸盐种类，例如N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)或对应的钠盐；TES缓冲液可为约50mM。

选择培养基中各组分的浓度以在对该培养装置进行接种后提供适于目标微生物的生长和/或检测的浓度。用于使所关注的霉菌菌种在培养基中生长的营养物质和选择剂的合适浓度是本领域已知的。生色底物的合适浓度可受它们的内在性质（例如，溶解度和它们对某些目标微生物的潜在抑制性质）影响。

对目标微生物的选择可包括抑制非目标微生物的生长，促进目标微生物的生长，或者这两者兼备。促进目标微生物的生长，这可由至少一种第一选择剂直接地提供（例如可被目标微生物利用而不被其他微生物利用的营养物质），间接地提供（例如通过利用抑制非目标微生物来减少对营养物质的竞争），或者同时直接和间接地提供。

根据本发明的干培养基可按以下方式施加到薄膜培养装置的一个或多个表面。可将培养基的组分溶解于溶剂（例如水）中。接着可将所得的溶液涂覆到该装置的一个或多个表面上。然后让涂层干燥，从而在该已用培养基溶液涂覆的装置的表面上留下干燥的培养基。涂层可以任何合适的方式进行干燥，包括但不限于空气干燥和加热。

干培养基的每种组分的量至少部分地由至少以下两个因素决定：(1)该组分在培养基溶液中的浓度，和(2)涂覆到培养装置的给定表面积上的溶液的量（涂覆重量）。合适的涂覆重量可在约0.45mg/cm²至约2.5mg/cm²的范围内。在一些实施例中，培养基营养物质可与指示剂分开涂覆。在这种实施例中，培养基营养物质的涂覆重量可在约1.6mg/cm²至约2.5mg/cm²的范围内。在一个实施例中，营养物质涂层的涂覆重量为约2.1mg/cm²。指示剂涂层的涂覆重量可在约0.45mg/cm²至约0.84mg/cm²的范围内。在一个实施例中，指示剂涂层的涂覆重量为约0.62mg/cm²。

另外的实施例可包括过氧化氢指示体系的组分。

虽然图1-4所示的实施例具有附接到装置的覆盖片，但在本发明范围内还设想到，含粉末的实施例可在储存和温育过程中不进行覆盖，而是仅仅放在无菌环境中。

薄膜培养板装置的以上描述不排除培养装置的另外实施例。例如，检测产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法可包括对培养基接种样品，其中在培养基中存在过氧化氢指示剂，温育培养基以产生可检测的生色反应，并且其中培养基任选地是包含在传统培养皿中的琼脂。

捕集元件

本发明的培养板装置可与捕集元件一起使用来检测样品中存在的产生葡萄糖氧化酶的微生物。本文所用的“捕集元件”指用于捕集和保持样品中存在的微生物的制品。在一些实施例中，可将捕集元件与本文所公开的薄膜培养板装置暂时接触。例如，可将样品捕集在表面过滤器的一侧上，并在已经水化培养板装置后，使过滤器的该侧与薄膜培养板装置的生长区域接触，从而将样品材料转移至生长区域。然后从该装置移除该表面过滤器，然后温育该装置。可将捕集元件（例如膜式过滤器）的尺寸进行设计以允许其能被放置进本发明的薄膜培养板装置中，并且在某些优选的实施例中，该捕集元件在温育期间保持在该薄膜培养板装置中持续足够的一段时间以允许目标微生物的至少一次细胞分裂。将捕集元件放置进培养板装置中可使捕集元件与培养板装置中的胶凝剂和/或营养培养基（如果存在的话）接触，从而让微生物生长和/或增殖。在一些实施例中，在将捕集元件放置进培养板装置中之前将该培养板装置水化（例如用无菌液体或未知的液体样品接种）。在一些实施例中，在将捕集元件放置进培养板装置中之后将该培养板装置水化。

可对捕集装置针对它们与某些类型的样品的适合性进行选择。例如，可将微孔膜过滤器用作捕集元件以截留液体样品中存在的微生物。可使液体样品通过过滤器，从而微生物可被截留在其上。微生物可通过例如物理俘获或者特异性（例如抗原-抗体或受体-配体相互作用）或非特异性（疏水吸附）化学相互作用进行截留。本发明的微孔膜在存在于薄膜培养板装置中时，应该允许对溶血反应进行观察。优选的微孔膜过滤器在润湿时会变成基本上透明的。

参考图4所示的实施例，试验样品可包含液体接种物和/或捕集元件426如微孔过滤器（例如过滤膜）或擦拭装置。捕集元件426可由多种膜和薄膜构造而成，且可用于捕集微生物。在一些实施例中，捕集元件426可提供表面，微生物菌落可在该表面上通过本发明的方法和装置进行培育、检测和/或计数。特别合适的是已通常用于从大的流体样品分离小的微生物群体（如霉菌）的已知微孔过滤器。已知这种过滤器被放在琼脂培养基的表面上并进行温育，以便对被过滤的微生物进行计数和评估。合适的过滤器包括HAWG系列，例如可得自MilliporeCorp(Marlborough,MA)的HAWG047S6型HA过滤器。本文描述的微生物过滤器通常相对较薄并且可以任何所需的二维形状（例如矩形、圆盘（包括部分的圆盘）等等）提供。

取决于膜中的孔隙的大小，这种过滤器以不同的效率分离微生物。微生物通常被平均孔径小于约1μm，小于约0.8μm，优选小于约0.45μm，更优选等于或小于约0.2μm的过滤器捕集。通过利用重力的常规方法或通过真空辅助的方法，使用合适尺寸的漏斗或和圆盘进行过滤。膜式过滤器优选用镊子进行无菌处理。膜式过滤器可由使用者用市售的材料制成，或者在无菌包装中作为单独的实体或作为本发明的试剂盒的部件提供。

擦拭装置可作为捕集元件与本发明的培养板装置一起使用。本文所用的“擦拭装置”是被构造成用于接触表面以获取分布在该表面上的微生物样品的制品。擦拭装置可包括多孔非织造材料。擦拭材料的非限制性例子包括纸（例如滤纸、纤维素膜过滤器）、合成的非织造材料（例如尼龙或聚酯非织造材料）、聚合物膜或陶瓷膜（例如聚碳酸酯膜、氧化锆膜）和微结构化薄膜（例如含微通道的薄膜，如美国专利No.7,223,364中描述的那些，该专利以引用方式全文并入本文）。在一些实施例中，含微通道的薄膜具有让流体（和溶质或小颗粒）从薄膜的一个主表面通向另一个主表面的通孔。擦拭装置可包含化学品（例如表面活性剂）以改善可润湿性，或包含试剂（例如区分染剂），只要所述化学品或试剂不会不利地影响对生色底物的反应的检测。一般而言擦拭装置包含的化学物质的量不会实质上抑制微生物在本文所述的接种和温育条件下的生长。在一些实施例中，捕集元件实质上是透明的，或者当湿润时变得实质上是透明度，从而使得区分性反应（如溶血）透过捕集元件显现出来。

合适的捕集元件包括一个颗粒或多个颗粒。捕集元件可包括用于将捕集元件结合到微生物的手段。颗粒的非限制性例子包括微球体、微珠等。这种粒子可为树脂粒子，例如琼脂糖、乳胶、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、纤维素、多糖、或它们的组合，或者为无机粒子，例如二氧化硅、氧化铝、或它们的组合。这种粒子可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或非磁性的。这种粒子可为胶体大小，例如约100nm至约10微米(μm)。这种粒子的非限制性例子包括以商品名DYNABEADS(Invitrogen,Inc.(Carlsbad,CA))和BIO-ADEMBEADS(Ademtech(Pessac,France))出售的超顺磁性聚合物粒子。可将颗粒捕集元件掺入到其他结构如微孔膜中。

有多种手段用于将捕集元件（例如颗粒）结合到微生物。在一些实施例中，用于将捕集元件结合到微生物的手段可包括表面分子或者能促进非特异性吸附的性质。例如，捕集元件的至少一部分在其表面上可具有这样的分子，它们在适当的条件（例如高pH或低pH）下变得带正电荷或带负电荷，且非特异性地吸附到与微生物表面缔合的带互补电荷的分子。

除此之外，或者作为另外一种选择，捕集元件（例如聚苯乙烯颗粒）的至少一部分可具有非特异性吸附到与微生物表面缔合的疏水分子的疏水表面。在一些实施例中，用于将捕集元件结合到微生物的手段可包括能通过受体-配体相互作用特异性结合微生物的分子。这种特异性的受体-配体相互作用是本领域公知的，包括例如抗体和它们的相应抗原之间的相互作用、凝集素和它们的相应碳水化合物结合伴侣之间的相互作用、噬菌体蛋白和它们的相应噬菌体受体之间的相互作用，等等。应理解，用于将颗粒结合到微生物的手段也可与薄膜或非织造物（例如过滤器）捕集元件以及颗粒状捕集元件联用。

检测样品中产生葡萄糖氧化酶的微生物的方法

可目视或通过仪器完成培养基中产生葡萄糖氧化酶的微生物的检测。生色底物的反应的目测不限于任何特定的光照条件，并且可在环境光条件下完成。使用放大可任选地进一步有助于目测。

用于对培养装置中的微生物菌落计数的自动系统在本领域中是已知的。此类自动系统通常包括：成像系统、确定菌落计数的图像分析算法以及显示和任选储存及操作菌落计数数据和图像的数据管理系统。用于计数琼脂板上的菌落的示例性系统由Synbiosis(Cambridge,UK)以商品名PROTOCOL出售并且在美国专利No.6,002,789中有所描述。

用于计数PETRIFILM板上的菌落的系统在美国专利No.5,403,722；7,298,885；和7,298,886中有所描述，每个专利以引用方式并入本文中。

图5是示出了成像系统570的内部操作的框图。如图5所示，培养装置582设置在成像系统内的焦平面中（例如在平台上，未示出）。根据本发明，成像装置592可包括用于培养装置582的前照明和/或背照明的多色照明系统（未示出），以及捕获培养装置582的图像的单色线扫描器或面扫描器。在一些实施例中，例如，成像装置592可采取二维单色照相机的形式。

一般而言，在用一种或多种不同的照明颜色对培养装置582进行照明期间，成像装置592捕获该培养装置或其至少一部分的图像。在一些实施例中，可以多种照明持续时间或强度产生同一培养装置582的多个图像，并可选择该多个图像中的一个或多个进行分析。在一些实施例中，可将对培养装置582的第一侧面和第二侧面进行选择性照明用于产生该培养装置的多个图像，并选择其中一个或多个图像进行分析。选择图像进行分析可基于例如各个图像的色对比度和/或目标分辨率性质。用于确定图像的色对比度和目标分辨率性质的方法是本领域知道的，在例如美国专利No.6,243,286中有公开，将该专利以引用方式全文并入本文。

处理器594控制成像装置592的操作。图5中还示出了可任选的显示器576，其可从处理器594接收图像以供操作员目视观察。在操作时，处理器594控制成像装置592以对培养装置582进行照明并获取图像。处理器594接收代表来自成像装置592的扫描图像的数据。在一些实施例中，处理器594可从多个图像中选择图像，用于分析和/或显示。处理器594分析培养装置582的至少一张图像并且可产生分析结果，例如产生葡萄糖氧化酶的生物体的菌落计数或确定样品中存在或不存在产生葡萄糖氧化酶的生物体。分析结果（例如定性或定量结果）可显示在显示器576上、存储在可任选的数据存储器598中、或由主计算机（未显示）通过可任选的通信端口595收取。

本发明的试剂盒

本发明提供的试剂盒包括培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂、支持产生葡萄糖氧化酶的生物体的生长和鉴别的培养基、以及生色指示剂体系。在一些实施例中，所述培养装置可包含支持产生葡萄糖氧化酶的生物体的生长和鉴别的培养基和/或生色指示剂。

在一些实施例中，该试剂盒包括支持产生葡萄糖氧化酶的生物体的生长和鉴别的脱水培养基。在一些实施例中，该脱水培养基包含生色指示剂。

在一些实施例中，该试剂盒包括支持产生葡萄糖氧化酶的生物体的生长和鉴别的液体培养基。在一些实施例中，该液体培养基包含生色指示剂。

本发明的试剂盒可另外包括帮助样品的制备和/或接种的样品制备附属物。样品制备附属物的非限制性例子包括稀释剂、缓冲液、样品获取装置（例如拭子、海绵、刮刀）和吸管。

在进一步描述本发明的实施例时，提供第一种方法用于检测产生葡萄糖氧化酶的微生物，该方法包括以下步骤：

(a)给培养基接种样品，其中培养基包含含有辣根过氧化物酶和至少一种生色底物的过氧化氢指示剂，并且其中样品被怀疑含有产生葡萄糖氧化酶的微生物；

(b)在允许产生葡萄糖氧化酶的微生物生长的条件下温育培养基；以及

(c)检查培养基以确定是否存在产生葡萄糖氧化酶的微生物。

提供第二种方法，其可具有第一种方法的所有特征。在第二种方法中，培养基可以是液体培养基、半固体培养基、固体培养基、或重构干培养基。

提供第三种方法，其可具有第一或第二种方法的所有特征。在第三种方法中，在允许产生葡萄糖氧化酶的微生物生长的条件下温育培养基的步骤包括在温度约30℃时温育接种的培养基。

提供第四种方法，其可具有第一至第三种方法的所有特征。在第四种方法中，将接种的培养基温育约24小时。

提供第五种方法，其可具有第一至第四种方法的所有特征。在第五种方法中，生色底物包含在存在辣根过氧化物酶和产生葡萄糖氧化酶的生长微生物的情况下产生可检测信号的化合物。

提供第六种方法，其可具有第五种方法的所有特征。在第六种方法中，可检测信号包括化学发光信号、荧光信号、颜色变化、电导率变化或任何上述的任何组合。

提供第七种方法，其可具有第五种方法的所有特征。在第七种方法中，所述至少一种生色底物包括选自以下的化合物：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、4-氨基安替比林(4-AAP)以及它们的组合。

提供第八种方法，其可具有第七种方法的所有特征。在第八种方法中，所述至少一种生色底物还包括3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐(TOOS)。

提供第九种方法，其可具有第七或第八种方法的所有特征。在第九种方法中，检查培养基以确定产生葡萄糖氧化酶的微生物是否存在，包括检测红色菌落。

提供第十种方法，其可具有第一至第九种方法的所有特征。第十种方法包括计数产生葡萄糖氧化酶的微生物菌落的步骤。

提供第十一种方法，其可具有第一至第十种方法的所有特征。第十一种方法包括提供与过氧化氢指示剂组合的β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的步骤，以及检测β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反应的步骤。

提供第十二种方法，其可具有第十一种方法的所有特征。第十二种方法包括通过检测β-D-吡喃木糖苷酶与β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反应来区分微生物的步骤。

提供第十三种方法，其可具有第十一和第十二种方法的所有特征。在第十三种方法中，β-D-吡喃木糖苷酶生色底物可以是对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷(NXP)。

提供第十四种方法，其可具有第一至第十三种方法的所有特征。在第十四种方法中，培养基是琼脂。

现将参考以下非限制性实例对本发明作进一步说明。所有的份数和百分数均以重量份表示，除非另有指明。

实例

除非另外指明，否则这些实施例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。所有微生物培养物均购自美国模式培养物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)。除非另外指明，否则所使用的溶剂和其他试剂均获自Sigma-AldrichChemicalCompany(Milwaukee,WI)。

材料

无菌去离子水是指通过使用购自MilliporeCorporation(Bedford,MA)的MILLI-Q获得的18兆欧姆无菌去离子水。

酵母菌和霉菌计数板以商品名3MPETRIFILM^TM酵母菌和霉菌计数板得自3MMicrobiology(3MCenterBldg.275-5W-05,St.Paul,MN55144-1000,USA)。

实例1-17和比较例C1-C6（包括来自葡萄的液体）

如下制备储备试剂溶液：

A0：10mLpH7.4经过滤除菌的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)

B：将44mgBCIP溶解在2.4mL的0.1NNaOH中，然后用PBS稀释至10mL以制备4.4mg/mL的BCIP溶液

C：将11mg4-氨基安替比林(4-AAP)溶解在5mLPBS中以制备2.2mg/mL的4-AAP溶液

F0：10mL经过滤除菌的50mMN-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸钠盐(TES)

G：将33mg4-AAP溶解在15mLTES中以制备2.2mg/mL的4-AAP溶液。

H：将11mg3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸(TOOS)溶解在10mLTES中以制备1.1mg/mL的TOOS溶液。

然后将这些储备试剂溶液合并以制备5种另外的板水化溶液（所得浓度在括号中给出）：

D0：各5mL的A0和B(2.2mg/mLBCIP)

E0：各5mL的B和C(2.2mg/mLBCIP,1.1mg/mL4-AAP)

I0：各5mL的F0和G(1.1mg/mL4-AAP)

J0：各5mL的G和H(1.1mg/mL4-AAP,0.55mg/mLTOOS)

K0：各5mL的G和H+110mg对硝基-β-D-吡喃木糖苷(NXP)(1.1mg/mL4-AAP,0.55mg/mLTOOS,11mg/mLNXP)

向每种溶液D0、E0、I0、J0和K0添加20μL的5mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)溶液以提供约10μg/mL的HRP浓度。

在SewardStomacher400Circulator（得自SewardLaboratorySystemsInc.(Bohemia,NY))上以235rpm对100.8g红色无籽葡萄（购自当地杂货店）的样品进行两次匀浆，每次45秒。用无菌去离子水将5mL所得液体的样品(pH4.2)稀释至50mL，然后将1.1mL加入到每种溶液A0、D0、E0、F0、I0、J0和K0（包含添加的HRP）中以分别制备溶液A、D、E、F、I、J和K。所述溶液汇总于表1中：

表1.

如下制备5种曲霉菌悬浮液：从深冻储液（-80℃）重构黑曲霉(ATCC#6275)、炭黑曲霉(ATCC#6277)和巴西曲霉(ATCC#16404)。用无菌水将这三种生物体稀释至10³个生物体/mL。还制备两种混合溶液：炭黑曲霉+黑曲霉和炭黑曲霉+巴西曲霉。每种混合物含有10³个生物体/mL（对于每种生物体而言，5×10²个生物体/mL）。

向6个3MPETRIFILM^TM酵母菌和霉菌计数板（得自3M公司(St.Paul,MN)）的每个中加入1mL的溶液A。类似地，为表1中的每种溶液D、E、F、I、J和K准备6个3MPETRIFILM^TM酵母菌和霉菌计数板，得到总共42个板。对于每组的6个板，对5个板分别接种炭黑曲霉、巴西曲霉、黑曲霉、炭黑曲霉+黑曲霉和炭黑曲霉+巴西曲霉的悬浮液。每组中的第6个板用作对照（没有加入微生物）。通过如下方式进行接种：将50μL的特定重构曲霉菌悬浮液（或混合悬浮液）加入到950μL表1的适当溶液中以制备含有大约50个生物体的1mL测试悬浮液。接种后，将板置于设定为30℃的培养箱中。以各种时间间隔观察板并且在标准HewlettPackardSCANJETADF文件扫描仪(HewlettPackardCompany(PaloAlto,CA))上记录图像并且保存为JPEG文件。通过检查确定菌落计数。将分别对炭黑曲霉、巴西曲霉和黑曲霉的单菌种样品的菌落计数制成表2-4。

表2.含有炭黑曲霉和HRP的样品的菌落计数。

实例	溶液	21h	24h	26h	42h	48h	72h
								C1	A（PBS对照）	0	0	0	13	14	14
1	D（添加BCIP）	12	13	13	14	15	14
								2	E（添加BCIP+4-AAP）	19	22	22	20	20	21
C2	F（TES对照）	0	0	0	21	22	20
								3	I(4-AAP)	19	19	19	19	19	19
4	J(4-AAP+TOOS)	16	17	16	17	17	17
								5	K(4-AAP+TOOS+NXP)	12	17	17	16	15	17

表2中的结果显示，在存在葡萄汁的情况下，通过加入若干种葡萄糖氧化酶敏感试剂中的一种可在24小时内检测出炭黑曲霉。用不含这些试剂的缓冲溶液制备的板（比较例C1和C2）在26小时内未显示可见菌落。

表3.含有巴西曲霉和HRP的样品的菌落计数。

实例	溶液	21h	24h	26h	42h	48h	72h
								C3	A（PBS对照）	0	0	0	10	10	9
6	D（添加BCIP）	0	9	9	9	11	11
								7	E（添加BCIP+4-AAP）	1	5	10	16	15	15
C4	F（TES对照）	0	0	0	22	22	24
								8	I(4-AAP)	18	18	18	18	18	18
9	J (4-AAP+TOOS)	22	22	21	19	20	22
								10	K (4-AAP+TOOS+NXP)	31	38	40	41	38	42

表3中的结果显示，在存在葡萄汁的情况下，通过加入若干种葡萄糖氧化酶敏感试剂中的一种可在24小时内检测出巴西曲霉。用不含这些试剂的缓冲溶液制备的板（比较例C3和C4）在26小时内未显示可见菌落。

表4.含有黑曲霉和HRP的样品的菌落计数。

实例	溶液	21h	24h	26h	42h	48h	72h
								C5	A(PBS)	0	0	0	18	18	16
11	D（添加BCIP）	0	18	18	18	21	20
								12	E（添加BCIP+4-AAP）	0	2	7	10	11	10
C6	F(TES)	0	0	0	11	11	15
								13	I(4-AAP)	1	15	15	18	18	18
14	J(4-AAP+TOOS)	0	14	16	16	16	16
								15	K(4-AAP+TOOS+NXP)	0	1	3	8	8	8

表4的结果显示，在存在葡萄汁的情况下，通过加入若干种葡萄糖氧化酶敏感试剂中的一种可在24-26小时内检测出黑曲霉。用不含这些试剂的缓冲溶液制备的板（比较例C5和C6）在26小时内未显示可见菌落。

对于用溶液“I”（TES缓冲液、HRP/4-AAP指示剂）制备的板，表5中示出所有5种曲霉菌悬浮液和对照的结果。这些结果表明4-AAP的加入有利于提早计数所有这三种生物体。通过不含有添加生物体的对照样品证明不存在假阳性，所述对照样品在所有时间点为0。

表5.用HRP/4-AAP指示剂（溶液“I”）的菌落计数。

实例	21h	24h	26h	42h	48h	72h
							对照	0	0	0	0	0	0
3（炭黑曲霉）	19	19	19	19	19	19
							8（巴西曲霉）	18	18	18	18	18	18
13（黑曲霉）	1	15	15	18	18	18
							16（炭黑曲霉+黑曲霉）	7	16	16	18	18	18
17（炭黑曲霉+巴西曲霉）	7	7	7	7	7	7

由单独加入4-AAP获得的菌落在24小时的时间点被染成红色，并且这些菌落也被3MPETRIFILM^TM板读取器装置（PETRIFILM^TMPLATEREADERdevice(PPR)；得自3M公司(St.Paul,MN)）识别，从而实现自动计数。在随后的时间点，自动判读不够成功。表6示出由直接（视觉）观察确定的24小时菌落计数与由PPR确定的计数的比较。

表6.24小时时的菌落计数，比较对于相同样品表5中的直接（视 觉）观察与用板读取器装置(PPR)获得的计数。

实例	直接（视觉）观察	PPR
			对照	0	0
3（炭黑曲霉）	19	29
			8（巴西曲霉）	18	19
13（黑曲霉）	15	17
			16（炭黑曲霉+黑曲霉）	16	20
17（炭黑曲霉+巴西曲霉）	7	13

在YM板上使用4-AAP而没有其他另外的生色底物引起所有三种生物体形成染成红色的小菌落。为了区别它们，更多复合试剂混合物是有益的。例如，2mg/mLBCIP溶液（溶液D，无4-AAP）能够在48小时内迅速辨别巴西曲霉，产生具有黑色中心和边缘的深蓝色小菌落。黑曲霉和炭黑曲霉菌落都比巴西曲霉色浅，炭黑曲霉比黑曲霉小并且具有较暗的边缘。联合使用2mg/mLBCIP与1mg/mL4-AAP（溶液E）能够在72小时时清楚地辨别所有三个菌种，黑曲霉菌落呈现带放射状蓝菌丝的黑色椭圆形，巴西曲霉具有带弥散蓝色背景的显著较大的红色树枝状菌丝结构，并且炭黑曲霉具有蓝色着色程度最低的红色菌丝（也注意到炭黑曲霉菌落具有不规则、锯齿状形状）。

实例18-25和比较例C7-C8

如下制备四种储备溶液：

AA：50mMN-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)

XX：50mMTES中2mg/mL4-氨基安替比林(4-AAP)和1mg/mL3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸(TOOS)

YY：50mMTES中2mg/mL4-AAP

ZZ：50mMTES中20mg/mL对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(NXP)。

将储备溶液按如下方式组合以制备五种板水化溶液：

BB0：将XX和AA混合在一起得到50mMTES中1mg/mL4-AAP和0.5mg/mLTOOS

CC0：将YY和AA混合在一起得到50mMTES中1mg/mL4-AAP

DD：将两种ZZ溶液与两种AA溶液混合得到50mMTES中10mg/mLNXP

EE0：将XX和ZZ混合在一起得到50mMTES中1mg/mL4-AAP、0.5mg/mLTOOS和10mg/mLNXP

FF0：将YY和ZZ混合在一起得到50mMTES中1mg/mL4-AAP和10mg/mLNXP

将适当量的5mg/mLHRP储备溶液加入到溶液BB0、CC0、EE0和FF0中以使得HRP在这些样品中的浓度为10μg/mL。具有HRP的样品分别标记为BB、CC、EE和FF。这些测试溶液汇总于表7。

表7.

从深冻储液（-80℃）重构炭黑曲霉(ATCC#6277)、巴西曲霉(ATCC#9642)、棘孢曲霉(A.aculeatus)(ATCC#56925)、尼崎青霉(ATCC#28686)和黄曲霉(A.flavus)(ATCC#9643)。用无菌去离子水将五种生物体稀释至10³个生物体/mL。通过如下方式进行接种：将50μL的特定重构生物体悬浮液加入到950μL的表7的每种测试溶液BB-FF中以制备每种含有大约50个生物体的1mL测试悬浮液。比较例使用这些相同的生物体，但是用对照溶液AA进行。将板在28-30℃下温育，并在多个时间点对其进行观察和成像。产生葡萄糖氧化酶的生物体炭黑曲霉和巴西曲霉的结果汇总于表8中。

表8.

实例	生物体	溶液	时间	特征
					C7	炭黑曲霉	AA（仅缓冲液）	41h	暗蓝色菌落
18	炭黑曲霉	BB(HRP+4-AAP+TOOS)	24h	紫色斑点
					19	炭黑曲霉	CC(HRP+4-AAP)	24h	红色小菌落
20	炭黑曲霉	EE(HRP+4-AAP+TOOS+NXP)	24h	紫色斑点
					21	炭黑曲霉	FF(HRP+4-AAP+NXP)	24h	红色小菌落
C8	巴西曲霉	AA（仅缓冲液）	41h	暗蓝色菌落
					22	巴西曲霉	BB(HRP+4-AAP+TOOS)	24h	紫色斑点
23	巴西曲霉	CC(HRP+4-AAP)	24h	红色小菌落
					24	巴西曲霉	EE(HRP+4-AAP+TOOS+NXP)	24h	紫色斑点
25	巴西曲霉	FF(HRP+4-AAP+NXP)	24h	红色小菌落

在24小时，用溶液BB(4-AAP+TOOS)和EE时，炭黑曲霉和巴西曲霉都产生紫色斑点，而用溶液CC和FF时则产生红色小菌落。在此时，没有其他生物体产生可见的菌落。在41和48小时之间，在使用对照溶液AA培养炭黑曲霉和巴西曲霉的比较例C7和C8中出现暗蓝色菌落。类似地，在32小时，产生葡萄糖氧化酶的生物体尼崎青霉在溶液BB和EE中开始显示紫色斑点，在溶液CC和FF中开始显示红色菌落，而用溶液AA和DD时，仅在47和66小时之间才开始出现菌落。这证明了产生葡萄糖氧化酶的生物体的早期检测。

相反地，在41小时，棘孢曲霉菌落在所有六种溶液中开始出现，并且在47小时，黄曲霉在所有六种溶液中开始出现。虽然颜色随试剂溶液发生一定程度变化（在4-AAP存在时为轻紫色并且在其不存在时为蓝色/绿色），但是这些菌落的形态学和生长速率大部分不取决于溶液。这证明在这些试剂存在时检测出不产生葡萄糖氧化酶的菌落的时间并不比不存在这些试剂时早。

甚至在48小时时，巴西曲霉和炭黑曲霉的菌落仍难以可靠地彼此区分开。然而，在更长时间的情况下，用溶液BB和EE时所形成的紫色斑点逐渐展开并褪色，留下小的中心。用溶液DD(NXP)时，此中心在两种情况下都是红色，但是对于溶液EE(4-AAP/TOOS/NXP)而言，炭黑曲霉产生红色中心，巴西曲霉产生暗紫色中心。因此，在更长时间的情况下，通过附加使用β-D-吡喃木糖苷酶的底物，仍然可区别紧密相关的产生葡萄糖氧化酶的生物体。

实例26和27-据报道产生赭曲霉毒素A的生物体的比较

测试据报道产生赭曲霉毒素A的两种生物体的分离株：赭曲霉(A.ochraceus)(ATCC#22947)和塔宾曲霉(ATCC#76608)。塔宾曲霉是黑色组曲霉的亚群，与黑曲霉和炭黑曲霉密切相关，并且可能涉及意大利酿酒葡萄的感染（Appl.Environ.Microbiology,72,680-685(2006)（《应用与环境微生物学》，第72卷，第680-685页，2006年））。也测试两种另外的生物体：巴西曲霉(ATCC#9642)和日本曲霉(A.japonicus)(ATCC#52036)。日本曲霉既不产生葡萄糖氧化酶也不产生赭曲霉毒素A，但据报道其感染葡萄。

用无菌去离子水将四种生物体稀释至10³个生物体/mL。用50mMTES缓冲液（对于比较例，表9中的TES）制备每种生物体的两个板，并且用50mMTES缓冲液（表9中的4-AAP/TOOS）中的1.0mg/mL4-AAP/0.5mg/mLTOOS/10μg/mLHRP制备两个板。通过如下方式进行接种：将50μL的特定重构生物体悬浮液加入到950μL的TES或4-AAP/TOOS溶液中以制备每种含有大约50个生物体的1mL测试悬浮液。将板在28-30℃下温育，并在多个时间点对其进行观察和成像。多个时间点的菌落计数（两个板的平均值）示于表9中。

表9.菌落计数，对比产生赭曲霉毒素（但不产生葡萄糖氧化酶） 的赫曲霉与产生葡萄糖氧化酶的生物体巴西曲霉和塔宾曲霉。包括不 产生赭曲霉毒素和葡萄糖氧化酶的日本曲霉用于比较。

在TOOS/4-AAP存在时，两种生物体（巴西曲霉和塔宾曲霉）产生有色斑点比TOOS/4-AAP不存在时早（早约24小时）。不论TOOS/4-AAP存在与否，产生赫曲霉毒素A但不产生葡萄糖氧化酶的霉菌赫曲霉的菌落与日本曲霉的菌落在大约相同的时间出现。这证明了产生葡萄糖氧化酶的生物体的早期检测。

实例28-32-低温温育和检测

测试了已知产生葡萄糖氧化酶的五种生物体的分离株：炭黑曲霉（实例28）、巴西曲霉（实例29）、塔宾曲霉（ATCC#76608；实例30）、尼崎青霉（ATCC#28686；实例31）和绳状青霉（ATCC#11797；实例32）。用无菌盐(145nMNaCl)悬浮液将每种生物体的深冻（-80℃）储液稀释至10³个生物体/mL。制备三种试剂溶液：50mmolTES缓冲液（表10中的TES）、50mmolTES中的0.5mg/mLTOOS/1.0mg/mL4-AAP/10μg/mLHRP（表10中的4-AAP/TOOS）和50mmolTES中的1.0mg/mL4-AAP/10μg/mLHRP（表10中的4-AAP）。实例编号如前面实例所述进行标记。每种生物体的三个板通过如下方式制备：取50μL的这些稀释液并将其加入到950μL的所述测试溶液中以制备含有大约50个生物体的1mL测试溶液。将板在室温下温育，并在多个时间点对其进行观察和成像。在19-20℃下，插入到堆叠的板中的热电偶一直测量整个温育过程的温度。在指定时间点的菌落计数示于表10中。

表10.低温（19-20℃）温育所得的菌落计数。

从表10的数据明显看出，与之前实例中在28-30℃下的生长速率相比，在19-20℃下生物体的生长速率显著变缓。然而，加入过氧化氢指示剂时曲霉菌落在2天内便出现，而非未加过氧化氢指示剂时的4天。使用试剂溶液时两种产生葡萄糖氧化酶的青霉菌种的菌落在3天内便出现，而非未加试剂溶液时的5天。该数据证明由于加入了葡萄糖氧化酶敏感试剂，在较低温育温度下（19-20℃，此时生物体生长比在30℃更慢）的检测时间缩短。

现已参照发明人所预见的若干具体实施例描述了本发明，可为这些实施例提供授权的描述。本发明的非实质修改形式，包括非当前所预见的修改形式，仍可构成其等同物。因此，本发明的范围不应受本文所述的细节和结构的局限，而是仅受以下权利要求书及其等同物的限定。

Claims (15)

1.一种区分黑曲霉(Aspergillusniger)、炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、尼崎青霉(Penicilliumamagasakiense)和绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)中的一种或多种的方法，所述方法包括：

提供

包含冷水可溶性胶凝剂的薄膜培养装置，

支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基，其中所述培养基包含葡萄糖，

包含辣根过氧化物酶和第一种生色底物的过氧化氢指示剂，其中所述第一种生色底物包含4-氨基安替比林、3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐或其组合，

第二种生色底物，其包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、β-D-吡喃木糖苷酶生色底物或其组合，以及

怀疑含有所述微生物的样品；

在所述培养装置中将预定体积的所述样品、所述培养基、所述过氧化氢指示剂和所述第二种生色底物合并；

温育所述培养装置；以及

检测所述第一种生色底物和所述第二种生色底物的反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述薄膜培养装置包含所述培养基。

3.一种区分黑曲霉(Aspergillusniger)、炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、尼崎青霉(Penicilliumamagasakiense)和绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)中的一种或多种的方法，所述方法包括：

提供

包含冷水可溶性胶凝剂的薄膜培养装置，

支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基，其中所述培养基包含葡萄糖，

包含辣根过氧化物酶和第一种生色底物的过氧化氢指示剂，其中所述第一种生色底物包含4-氨基安替比林、3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐或其组合，

第二种生色底物，其包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、β-D-吡喃木糖苷酶生色底物或其组合，以及

怀疑含有所述微生物的样品；

将预定体积的样品和所述培养基合并以形成第一混合物；

在所述培养装置中将所述第一混合物、所述过氧化氢指示剂和所述第二种生色底物合并；

温育所述培养装置；以及

检测所述至少一种生色底物的反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在与所述过氧化氢指示剂合并之前温育所述第一混合物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中温育所述培养装置包括有氧地温育所述培养装置。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在开始温育所述培养装置的48小时内所述第一种生色底物的所述反应是可检测的。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在开始温育所述培养装置的24小时内所述第一种生色底物的所述反应是可检测的。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一种生色底物是4-氨基安替比林，并且所述第二种生色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一种生色底物是3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二种生色底物包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和所述β-D-吡喃木糖苷酶生色底物二者。

11.根据权利要求10所述的方法，该方法还包括通过检测β-D-吡喃木糖苷酶与所述β-D-吡喃木糖苷酶生色底物的反应来区分所述微生物。

12.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

包含冷水可溶性胶凝剂的薄膜培养装置；

支持产生葡萄糖氧化酶的微生物的生长的培养基；

包含辣根过氧化物酶和第一种生色底物的过氧化氢指示剂，其中所述第一种生色底物包含4-氨基安替比林、3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羟基丙磺酸钠盐或其组合，以及

第二种生色底物，其包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、β-D-吡喃木糖苷酶生色底物或其组合。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述培养基包含所述过氧化氢指示剂。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述培养装置包含所述培养基、所述过氧化氢指示剂或两者。

15.根据权利要求12所述的试剂盒，其还包括样品制备附属物，其选自样品稀释剂、缓冲液、样品采集装置和吸管。