CN1902323A - 检测和/或鉴定微生物的介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测和/或鉴定样品中存在的微生物的介质，包含一种培养基和至少一种底物，该底物能够被样品中至少一种非游离的微生物特异性第一酶水解成标记的产物，其特征在于还包含至少一种针对至少一种第二酶的抑制剂，该第二酶与第一酶不同或相同，但游离在所述样品中且不是来源于微生物。该发明优选适用于生物医学诊断领域或食品微生物学，更特别地适用于细菌学和真菌学。

Description

检测和/或鉴定微生物的介质
本发明的技术领域属于通过生物化学过程的微生物分析，特别是通过接种反应介质检测和鉴定微生物。
本发明的兴趣特别集中在微生物，例如特别是在医学环境或工业环境中作为病原体或质量指标的细菌或酵母的检测和鉴定上。
目前已经存在大量检测这些微生物的介质。具体而言，本发明的检测是基于使用特定的对于待检测微生物的一种酶特异性的底物。通常，酶的合成底物由对于要显示的酶活性特异性的第一部分和作为标记的、通常显色或发荧光的第二部分组成。通过选择这些底物，依据是否存在反应可以表征微生物的特性。
因此，在细菌的情况下，一般经常通过揭示苷酶(osidase)类型的酶活性如β-葡糖苷酸酶活性或β-半乳糖苷酶活性来证明大肠杆菌菌株。类似地，通过证明β-葡萄糖苷酶活性来检测利斯特氏菌属(Listeria)细菌。
氨肽酶活性也可被用来揭示细菌的群、属或种。因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使从革兰氏阳性细菌中区分革兰氏阴性细菌成为可能。
最后也提到检测酯酶活性，特别是用来证明沙门氏菌属(salmonella)细菌。这是因为沙门氏菌属细菌含有能够水解显色合成底物例如生靛蓝底物的非特异性酯酶。在检测沙门氏菌属细菌，更特别地是具有酯酶活性的细菌时，这些细菌的检测和/或鉴定通常是在分离琼脂或液体介质上进行的，这使检测和/或鉴定怀疑为具有酯酶活性的细菌的菌群成为可能。
然而，当取某些样品，特别是粪便样品时，可观察到对于待检测微生物非特异性的、游离在样品中的(称为“游离酶”)、接下来能够与显色底物反应的酶的存在。具体地说，这些“游离酶”可以存在于生物样品如粪便样品中，他们可以来源于消化道、肝和胰腺的细胞，因此可以在通过这些器官的生物样品中能找到他们。游离酶也存在于待分析的食物样品如家禽肝中；在这种情况下，酶来源于肝细胞。这导致不能确定的可疑阳性出现：一些实际上没有被污染的样品被认为受到了污染，而这会对接下来的诊断产生很大的影响。因此，在通过证明酯酶类型的酶活性来检测沙门氏菌属细菌时，没有污染沙门氏菌属细菌的粪便样品可能包含能够水解培养基中存在的底物的“游离”酯酶，这会导致通常是沙门氏菌属细菌特异性的洋红色的显现。
因此本发明计划通过限制由样品中微生物非特异性的游离酶存在引起的假阳性来改进当前所售的微生物检测介质。令人惊讶的是，本发明的发明者已经证实使用某些化合物可以抑制样品中的游离酶，而对非游离酶即来源于待检测微生物中的酶没有抑制。
为实现这一目的，本发明涉及一种用于检测样品，例如特别是生物或食物样品中存在的微生物的介质，其包含一种培养基和至少一种底物，该底物能够被样品中非游离的并且对所述微生物特异性的至少一种第一酶水解成标记的产物，其特征在于还包含至少一种针对至少一种游离在所述样品中但不是来源于待检测微生物的笫二酶的抑制剂。笫二酶可以不同于所述的第一酶或与第一酶相同。
为实现本发明，术语“微生物”包括细菌，酵母，和更通常地为一般肉眼看不见的能够在实验室中繁殖和使用的单细胞生物。
依据本发明的一个优选实施方案，微生物是革兰氏阴性或阳性细菌，或酵母。
作为革兰氏阴性细菌，可提及下列属的细菌：假单胞菌(Pseudomonas)，埃希氏菌(Escherichia)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，肠杆菌(Enterobacter)，克雷伯氏菌(Klebsiella)，沙雷氏菌(Serratia)，变形菌(Proteus)，弯曲杆菌(Campylobacter)，嗜血菌(Haemophilus)，摩根氏菌(Morganella)，弧菌(Vibrio)，耶尔森氏菌(Yersinia)，不动杆菌(Acinetobacter)，布兰汉氏球菌(Branhamella)，奈瑟氏球菌(Neisseria)，伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)，柠檬酸杆菌(Citrobacter)，哈夫尼菌(Hafnia)，爱德华氏菌(Edwardsiella)和军团菌(Legionella)。
作为革兰氏阳性细菌，可提及下列属的细菌：肠球菌(Enterococcus)，链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，芽孢杆菌(Bacillus)，利斯特氏菌(Listeria)，梭菌(Clostridium)，分枝杆菌(Mycobacteria)和棒杆菌(Corynebacteria)。
作为酵母，可提及下列属的酵母：念珠菌(Candida)，隐球酵母(Cryptococcus)，糖酵母(Saccharomyces)和丝孢酵母(Trichosporon)。
根据本发明的一个优选实施方案，微生物是优选属于沙门氏菌属的细菌或优选属于念珠菌属的酵母。
为实现本发明，术语“培养基”指包含微生物生存和/或生长所必需的所有成分的介质。在实践中，本领域技术人员可以依据在本领域技术人员范围内众所周知的标准选择靶微生物的培养基。就细菌而言，例如，述及下列类型的选择性培养基：MacConkey、Columbia ANC、PALCAM，以及胰胨豆胨(trypcase soy)营养培养基类型的非选择性培养基。就酵母而言，作为培养基可以述及庆大霉素-氯霉素Sabouraud培养基或Sabouraud培养基。
本发明培养基可以含有可选的其他添加剂如：蛋白胨，一种或多种生长因子，碳水化合物，一种或多种选择性试剂，缓冲液，一种或多种凝胶形成试剂等。培养基可以是现用的凝胶液体，即准备接种到试管或烧瓶中，或培养皿上的液体。
为实现本发明，术语“底物”选自能够被水解成可直接或间接检测微生物的产物的任何一种底物。优选地，这种底物包括：
Figure A20048000847100071
对于待揭示的酶活性特异性的第一部分。该第一部分能够与对于待检测微生物特异性的第一酶发生反应，也能够与第二酶发生反应。
Figure A20048000847100072
作为标记物的第二部分，下文称为标记物部分，该第二部分可以发荧光或显色。
对于荧光底物，特别提及基于7-羟基香豆素或氨基香豆素的底物，基于9-羟基-3-异吩唑酮，或基于荧光素的底物。对于更适合于固相支持物(滤膜，琼脂，电泳凝胶)的显色底物，特别提及基于吲哚酚和其衍生物的底物，基于羟基喹啉或秦皮乙素和其衍生物的底物，它们使得能够检测苷酶和酯酶活性。也提及基于硝基酚、硝基苯胺及其衍生物的底物，在基于硝基酚的底物的情况下可检测苷酶和酯酶活性，在基于硝基苯胺的底物的情况下可检测肽酶活性。最后也提及基于萘酚，萘胺和其衍生物的底物，这使得通过萘酚检测苷酶和酯酶活性，通过萘胺检测肽酶活性成为可能。这种底物特别使检测酶活性如苷酶，肽酶，酯酶等的活性成为可能，但并不意味着本发明仅局限于此。
术语“样品”意味着要检测微生物存在的任何一种类型的样品。这种样品可以是生物或食物样品。更特别地，样品可以来源于血样品，尿样品，粪便样品，食物样品等，但并不意味着本发明仅局限于这些样品。
术语“第一酶”指样品中非游离的酶，即来源于待检测微生物中的酶。更特别地，这种酶可以是苷酶，肽酶，酯酶，硫酸酯酶，磷酸酯酶等，但并不意味着本发明仅局限于这些酶。这种酶可以将底物水解成标记的产物。
术语“第二酶”指不同于第一酶或与第一酶相同但游离在样品中的酶，即，非来源于待检测微生物的酶。这种第二酶能够与底物反应导致假阳性的出现。更特别地，这种酶可以是苷酶，肽酶，酯酶，硫酸酯酶，磷酸酯酶等，但并不意味着本发明仅局限于这些酶。
依据本发明的一个优选实施方案，所述的第一酶是酯酶。优选地，抑制剂是属于有机磷酸酯家族，具有分子式(I)的化合物
其中
●R1是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
●R2是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
●R3是空，或烷基，芳香基或NO2基团。
根据本发明，术语“芳香基”特别指C6-C10的芳香环，特别是苯基，苯甲基，1-萘基或2-萘基。
术语“烷基”指C1-C6的烷基，即具有1到6个碳原子的直链或支化的烷基。作为实例提及的烷基有甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，异戊基和己基。
根据本发明的一个优选实施方案，抑制剂是分子式为(I)的化合物，其中
Figure A20048000847100082
R1和R2是乙基，
Figure A20048000847100083
R3是NO2基团。
这种化合物是具有下列分子式的O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯：
根据本发明的一个优选实施方案，抑制剂是分子式为(I)的化合物，其中
R1和R2是甲基，
R3是NO2基团。
这种化合物是具有下列分子式的O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯：
Figure A20048000847100093
根据本发明的另一个优选实施方案，抑制剂是分子式为(I)的化合物，其中
Figure A20048000847100094
R1和R2是氯乙基，
Figure A20048000847100095
R3是下式的环
使用点线可以显现本发明分子式(I)化合物中所述环的位置。
这种化合物是具有下列分子式的O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯：
Figure A20048000847100097
抑制剂也可以是上述分子的衍生物。
检测介质中O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯或其衍生物的浓度优选为0.1-15mg/l，更优选为1-10mg/l。
检测介质中O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯或其衍生物的浓度优选为0.1-100mg/l，更优选为10-50mg/l。
检测介质中O，O-二-(2-氯乙基)O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸盐或其衍生物的浓度优选为1-1000mg/l，更优选为30-100mg/l。
根据本发明的一个优选实施方案，所述的第一酶是苷酶，优选为葡萄糖苷酶，更优选为α-葡萄糖苷酶。本领域技术人员在选择葡萄糖苷酶抑制剂时可以参照出版物Le Merrer等人，1997，Bioorganic & Medical Chemistry，Vol 5，(3)，pp519-533。
优选的抑制剂是粟精胺，即分子式(II)的化合物：
Figure A20048000847100101
或这种化合物的衍生物。
粟精胺衍生物特别描述在出版物Sondergaard等人，Chem Eur J 2001，7No 11中。
检测介质中粟精胺或其衍生物的浓度优选为0.5-30g/l，更优选为1-10g/l。
根据本发明的一个优选实施方案，所述的底物是一种显色底物，优选为吲哚酚酯或其衍生物，更优选为具有下述分子式(III)的吲哚酚酯
其中n为1到12，W，X，Y，Z选自氢，溴，氯，氟和碘。更优选地，底物是5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯(Magenta C8，CAS No.209347-94-4)或5-溴-3-吲哚酚壬酸酯(Biosynth)。
本发明也涉及检测和/或鉴定微生物的方法，包括：
●将要鉴定的微生物接种到上述的检测介质上，
●孵育接种有所述待鉴定的微生物的检测介质，和
●检测被水解成标记的产物的底物以确定所述微生物是否存在。
可以采用本领域技术人员熟知的任何一种接种技术接种微生物，例如特别是细菌或酵母。类似地，孵育优选在使微生物生长和待检测的酶活性最大的温度下进行，本领域技术人员根据要检测的酶活性很容易作出选择。例如，孵育优选在36-38℃之间进行。
本发明涉及上述检测和/或鉴定介质用于鉴定微生物的用途。
本发明还涉及分子式(I)的化合物在抑制游离酶，优选为上述样品中游离酯酶中的用途
Figure A20048000847100111
其中R1是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R2是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R3是空，或烷基，芳香基或NO2基团。
本发明还涉及分子式(II)的化合物
在抑制游离酶，优选为游离苷酶，优选为游离葡萄糖苷酶，更优选为上述样品中游离α-葡萄糖苷酶中的用途。
下面给出的实施例进一步解释本发明，但不限制本发明。这些实施例有助于更清楚地理解本发明。
实施例1：在鉴定沙门氏菌时，用O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯抑制样品中的游离酯酶
该实施例中所给出的实验的目的是确定O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯(Paraoxonethyl；Riedel-de Han，St Quentin Fallavier，法国)对(在污染了沙门氏菌的粪便样品中)的游离酯酶的抑制效应。
检测介质的制备：用含有下列成分的粉状介质制备250ml检测介质：
蛋白胨           6.25g/l
Tris             0.16g/l
乳糖             6g/l
胆汁盐           1.5g/l
氯化钠           5g/l
琼脂             14g/l
100℃熔解后，将介质于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后向介质中加入添加剂：Magenta C8(500mg/l；B-7102，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；X-葡萄糖苷(75mg/l；B-7250，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；头孢磺啶(10mg/L；C4786，Sigma，St Quentin Fallavier，法国)和各种不同浓度的抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯(Paraoxonethyl；CAS No.311-45-5；36186，Riedel-deHa n，St Quentin Fallavier，法国；0；1；5或10mg/l)。
将获得的各种检测介质倒入培养皿中。
沙门氏菌的接种：将10μl粪便放在培养皿中，这种粪便悬浮液与10μl沙门氏菌悬浮液(0.5McF)混合或不与之混合，并在培养皿中分成3份。根据本方案使用申请人所收集的各种盐和各种沙门氏菌菌株。将培养皿于37℃孵育24小时。采用半定量标准读出粪便沉积点(“沉积”栏)和沙门氏菌菌落(“菌落”栏)的着色情况：
0＝没有着色
0.5＝微着色
1＝弱着色
2＝强着色
所得到的结果显示在表1中。
               O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯浓度(单位mg/l)
       0          1        5       10
  菌株   粪便编号   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落
  无   A   1   0   0.5   0   0   0   0   0
  B   0   0   0   0   0   0   0   0
  肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)   A   1   2   0.5   2   0   2   0   2
  B   0   2   0   2   0   2   0   2
  甲型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaParatyphi A)   A   1   2   0.5   1   0   1   0   1
  B   0   2   0   1   0   1   0   1
  伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)   A   1   1   0.5   1   0   1   0   1
  B   0   1   0   1   0   1   0   1
表1：鉴定沙门氏菌时抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯对粪便样品中游离酯酶活性的抑制效果
如表1所示，当抑制剂存在时，粪便沉积点的着色被降低，而不论抑制剂是否存在细菌菌落仍保持着色。因此粪便中游离的主要存在于粪便沉积点的酶(在本发明中称为“游离的第二酶”)很明显被抑制剂所抑制，而来源于细菌的主要存在于沙门氏菌菌落中的酶(在本发明中称为“非游离的第一酶”)不被抑制。
当在没有菌株的情况下放置粪便时所观察到的沉积点着色证明了与样品中游离酶相关的反应的存在，其中游离酶不是来源于沙门氏菌的污染。
这些结果证明，“游离酶”存在导致的非特异性酶反应在抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯存在时受到极大的抑制，而这限制了检测出假阳性。
实施例2：在鉴定沙门氏菌时，用O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯抑制样品中的游离酯酶
该实施例中所给出的实验的目的是确定O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯(Paraoxon methyl；Riedel-de Han，St Quentin Fallavier，法国)对污染了沙门氏菌粪便中的游离酯酶的抑制效应。
检测介质的制备：用含有下列成分的粉状介质制备250ml检测介质：
蛋白胨               6.25g/l
Tris                 0.16g/l
乳糖                 6g/l
胆汁盐               1.5g/l
氯化钠               5g/l
琼脂                 14g/l
100℃熔解后，将介质于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后向介质中加入添加剂：Magenta C8 (500mg/l；B-7102，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；X-葡萄糖苷(75mg/l；B-7250，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；头孢磺啶(10mg/L；C4786，Sigma，St Quentin Fallavier，法国)和各种不同浓度的抑制剂O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯(Paraoxonmethyl；CAS No.950-35-6；Riedel-de Ha n，St Quentin Fallavier，法国；5，10，或25mg/l)。
将获得的各种检测介质倒入培养皿中。
沙门氏菌的接种：采用实施例1的方法将培养皿进行接种，孵育和读取。
所获得的结果显示在表2中。
                    O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯浓度(单位mg/l)
        0         5           10         25
  菌株   粪便编号   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落
  无   C   2   0   1   0   0.5   0   0   0
  D   2   0   1   0   1   0   0   0
  伤寒沙门氏菌   C   2   0.5   1   0.5   0.5   1   0   0.5
  D   2   0.5   1   0.5   1   0.5   0   0.5
  肠炎沙门氏菌   C   2   2   1   2   0.5   2   0   2
  D   2   2   1   2   1   2   0   2
表2：鉴定沙门氏菌时抑制剂O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯对样品中游离酯酶活性的抑制效果
如表2所示，当抑制剂存在时，粪便沉积点的着色被降低，而不论抑制剂是否存在细菌菌落仍保持着色。因此粪便中游离的酶很明显被抑制剂所抑制，而来源于细菌的酶不被抑制。
这些结果表明，“游离酶”存在导致的非特异性酶反应在抑制剂O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯存在时受到极大的抑制，而这限制了检测出假阳性。
实施例3：在鉴定沙门氏菌时，用O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯抑制样品中的游离酯酶
该实施例中所给出的实验的目的是确定O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯(Haloxon；Sigma，St Quentin Fallavier，法国)对污染了沙门氏菌的样品(粪便)中的游离酯酶的抑制效应。
检测介质的制备：用各种不同浓度的O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯(Haloxon；CAS No.321-55-1；R276995，Sigma，St Quentin Fallavier，法国；0；1；10；100或1000mg/l)代替O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，根据实施例1中的方法制备250ml实施例1中的介质。
将获得的各种选择介质倒入培养皿中。
沙门氏菌的接种：采用实施例1的方法将培养皿进行接种，孵育和读取。
所获得的结果显示在表3中。
         O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯浓度(单位：mg/l)
        0       1           10           100       1000
  菌株   粪便编号   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落
  无   A   2   0   1   0   1   0   0.5   0   0   0
  B   2   0   1   0   0.5   0   0   0   0   0
  肠炎沙门氏菌   A   2   2   1   2   1   2   0.5   2   0   2
  B   0   2   0   2   0   2   0   2   0   2
  甲型副伤寒沙门氏菌   A   2   2   1   2   1   2   0.5   1   0   0.5
  B   0   2   0   2   0   2   0   1   0   0.5
  伤寒沙门氏菌   A   2   1   1   1   1   1   0.5   1   0   1
  B   0   1   0   1   0   1   0   1   0   1
表3：鉴定沙门氏菌时抑制剂O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯对样品中游离酯酶活性的抑制效果
如表3所示，当抑制剂存在时，粪便沉积点的着色被降低，而不论抑制剂是否存在细菌菌落仍保持着色。因此粪便中游离的酶很明显被抑制剂所抑制，而来源于细菌的酶不被抑制。这些结果证明，因“游离酶”存在而导致的非特异性酶反应在抑制剂O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯存在时受到极大的抑制，而这限制了检测出假阳性。
实施例4：在鉴定酵母时，用O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯抑制样品中的游离酯酶
该实施例中所给出的实验的目的是证明O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯对污染了念珠菌的粪便中的游离酯酶的抑制效应。
检测介质的制备：用含有下列成分的粉状介质制备250ml检测介质：
蛋白胨               10g/l
葡萄糖               1g/l
Tris                 0.16g/l
琼脂                 14g/l
100℃熔解后，将介质于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后向介质中加入添加剂：MagentaC8(500mg/l；B-7102，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；X-葡萄糖苷(75mg/l；B-7250，BIOSYNTH，Staad，瑞士)；头孢磺啶(10mg/L；C4786，Sigma，St Quentin Fallavier，法国)，和酯酶抑制剂：
Figure A20048000847100161
二乙基-对硝基苯基磷酸酯：5mg/l
Figure A20048000847100162
二甲基-对硝基苯基磷酸酯：25mg/l或
O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯：75mg/l
将获得的各种选择介质倒入培养皿中。
念珠菌属的酵母的接种：将10μl粪便放在培养皿中，这种粪便悬浮液与10μl念珠菌悬浮液混合或不与之混合，在培养皿中分成3份。根据本方案使用申请人所收集的各种粪便和各种念珠菌菌株。将培养皿于37℃孵育24小时。
采用半定量标准读出粪便沉积点和念珠菌菌落的着色情况：
0＝没有着色
0.5＝微着色
1＝弱着色
2＝强着色
所得到的结果显示在表4中。
Figure A20048000847100171
表4：在鉴定念珠菌时，抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯对样品中游离酯酶活性的抑制效果
如表4所示，当各种抑制剂存在时，粪便沉积点的着色被降低，而不论抑制剂是否存在酵母菌落仍保持着色。因此粪便中游离的酶很明显被抑制剂所抑制，而来源于酵母的酶不被抑制。
这些结果证明，因“游离酶”存在导致的非特异性酶反应在抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯存在时受到极大的抑制，而这限制了检测出假阳性。
实施例6：在鉴定细菌时，用粟精胺抑制样品中游离的α-葡萄糖苷酶
该实施例中所给出的实验的目的是确定粟精胺对污染了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株的样品(粪便)中的游离α-葡萄糖苷酶的抑制效应。
检测介质的制备：用各种不同浓度的粟精胺(0；1；2；4和8g/l)代替O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，根据实施例1中的方法制备250ml实施例1中的介质。
将获得的各种检测介质倒入培养皿中。
金黄色葡萄球菌菌株的接种：采用实施例1的方法将培养皿进行接种，孵育和读取。
所获得的结果显示在表6中。
                                        粟精胺浓度(g/l)
       0           1           2           4          8
  菌株   粪便编号   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落   沉积   菌落
  无   A   2   0   1   0   1   0   0.5   0   0   0
  B   1   0   0.5   0   0.5   0   0   0   0   0
  1号金黄色葡萄球菌   A   2   2   2   2   1   2   1   2   1   1
  2号金黄色葡萄球菌   B   2   2   2   2   1   2   0.5   2   0   1
表6：在鉴定金黄色葡萄球菌菌株时粟精胺对样品中游离的α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果
如表6所示，当粟精胺存在时，粪便沉积点的着色被降低，而不论抑制剂是否存在细菌菌落仍保持着色。因此粪便中游离的酶很明显被抑制剂所抑制，而来源于细菌的的酶不被抑制。
这些结果证明，因“游离酶”存在导致的非特异性酶反应在抑制剂粟精胺存在时受到极大的抑制，而这限制了检测出假阳性。
需要注意的是对实施例1-6的一种改变在于将抑制剂加入到样品介质中，而不是直接加入到培养基中。
实施例7：根据本发明鉴定至少一种第二酶的抑制剂的方法
这种方法在于实施实施例1或2的实验，不同之处为：
I)用适合于待检测微生物的培养基代替所述的培养基(包含酶底物)；
II)用含有待检测微生物并能够与包含在介质中的一种或多种酶底物产生寄生反应的样品代替粪便样品；
III)用各种浓度的待测的潜在抑制剂代替抑制剂O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯，O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯或粟精胺。

Claims (19)

1.一种检测和/或鉴定样品中存在的微生物的介质，包含培养基和至少一种底物，该底物能够被样品中至少一种非游离的所述微生物特异性第一酶水解成标记的产物，其特征在于还包含至少一种针对至少一种第二酶的抑制剂，该第二酶与第一酶不同，或相同，但游离在所述样品中且不是来源于微生物。
2.根据权利要求1的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述微生物是细菌。
3.根据权利要求2的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述的细菌属于沙门氏菌属。
4.根据权利要求1的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述微生物是酵母。
5.根据权利要求4的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述的酵母属于念珠菌属。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述的第一酶是酯酶。
7.根据权利要求6的检测和/或鉴定介质，其特征在于抑制剂是分子式为(I)的化合物，
其中R1是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R2是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R3是空，或烷基，芳香基或NO2基团。
8.根据权利要求7的检测和/或鉴定介质，其特征在于抑制剂是O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯和/或O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯和/或O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯和/或这些分子的至少一种衍生物。
9.根据权利要求8的检测和/或鉴定介质，其特征在于检测介质中O，O-二乙基-对硝基苯基磷酸酯或其衍生物的浓度为0.1-15mg/l，优选为1-10mg/l。
10.根据权利要求8的检测和/或鉴定介质，其特征在于检测介质中O，O-二甲基-对硝基苯基磷酸酯或其衍生物的浓度为0.1-100mg/l，优选为10-50mg/l。
11.根据权利要求8的检测和/或鉴定介质，其特征在于检测介质中O，O-二-(2-氯乙基)-O-(3-氯-4-甲基香豆素-7-基)磷酸酯或其衍生物的浓度为1-1000mg/l，优选为30-100mg/l。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述的第一酶是苷酶，优选为葡萄糖苷酶。
13.根据权利要求12中任一项所述的检测和/或鉴定介质，其特征在于抑制剂是分子式为(II)的化合物或这种化合物的衍生物：
14.根据权利要求13的检测和/或鉴定介质，其特征在于检测介质中分子式为(II)的化合物或其衍生物的浓度优选为1-10g/l，更优选为2-8g/l。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的检测和/或鉴定介质，其特征在于所述的底物是显色底物，优选为吲哚酚酯或其衍生物。
16.检测和/或鉴定微生物的方法，包括
●将待鉴定的微生物接种到权利要求1-15中任一项所述的检测介质中，
●孵育接种了待鉴定的微生物的检测介质，和
●检测被水解成标记的产物的底物以确定微生物是否存在。
17.权利要求1-15中任一项所述的检测和/或鉴定介质在鉴定微生物中的用途。
18.分子式为(I)的化合物抑制样品中游离酶的用途，
Figure A2004800084710003C2
其中R1是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R2是氢原子，或烷基，芳香基或卤素基团，
R3是空，或烷基，芳香基或NO2基团。
19.分子式为(II)的化合物抑制样品中游离酶的用途
Figure A2004800084710004C1
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